ПРИМЕНЕНИЕ РАЗАГИЛИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОБОНЯТЕЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ Российский патент 2016 года по МПК A61K31/135 A61P25/16 A61P25/28 

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительным патентным заявкам США №№ 61/437212, поданной 28 января 2011 г., и 61/400464, поданной 27 июля 2010 г., содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки.

В тексте данной заявки приведены ссылки на различные публикации, опубликованные патентные заявки и патенты. Полное содержание данных документов включено в настоящую заявку посредством ссылок с целью более полного описания современного уровня техники в области, к которой относится данное изобретение.

Уровень техники изобретения

Обонятельная дисфункция может возникать в результате различных причин, и может глубоко влиять на качество жизни пациента. Исследования показали, что обонятельная дисфункция затрагивает по меньшей мере 1% населения в возрасте до 65 лет, и значительно более 50% населения старше 65 лет. Обоняние обеспечивает восприятие аромата еды и напитков и, кроме того, служит в качестве системы раннего предупреждения для обнаружения вредных факторов окружающей среды, таких как испорченные продукты, утечка природного газа, дым или загрязнители воздуха. Утрата или искажение восприятия запаха может отрицательно влиять на пищевые предпочтения, потребление пищи и аппетит (1), что в свою очередь отрицательно скажется на здоровье пациентов.

Три специализированные нейронные системы присутствуют в носовой полости у людей. Они представляют собой 1) основную обонятельную систему (черепной нерв I, CN I), 2) тройничную соматосенсорную систему (черепной нерв V, CN V), 3) концевой нерв (nervus terminalis) (черепной нерв 0, CN 0). CN I опосредует восприятие запаха. Он отвечает за определение запаха. CN V опосредует соматосенсорные ощущения, включая жжение, охлаждение, раздражение и щекотку. CN 0 представляет собой ганглиозное нервное сплетение. Он охватывает большую часть слизистой оболочки носа перед прохождением сквозь решетчатую пластину и вхождением в передний мозг вдоль медиальной стороны обонятельного тракта. У людей точная функция концевого нерва неизвестна (1).

Обонятельный нейроэпителий представляет собой псевдомногослойный цилиндрический эпителий. Специализированные обонятельные эпителиальные клетки являются единственной группой нейронов, способных к регенерации. Обонятельный эпителий находится в верхней части поверхности каждой ноздри, включая решетчатую пластину, верхнюю носовую раковину, верхнюю перегородку и секции средней носовой раковины. В нем находятся сенсорные рецепторы основной обонятельной системы и некоторые свободные нервные окончания CN V. Обонятельный эпителий теряет свою общую однородность постнатально, и уже в первые несколько недель жизни появляются метапластические островки эпителия дыхательного типа. Степень метаплазии возрастает на протяжении всей жизни. Предполагается, что этот процесс является результатом вредного воздействия факторов окружающей среды, например, вирусов, бактерий и токсинов (1).

Есть 6 различных типов клеток обонятельного нейроэпителия: 1) биполярные сенсорные рецепторные нейроны, 2) микровиллярные клетки, 3) поддерживающие клетки, 4) шаровидные базальные клетки, 5) горизонтальные базальные клетки, 6) клетки, выстилающие железы Боумена. В обонятельном нейроэпителии взрослого человека существует примерно 6000000 биполярных нейронов. Они представляют собой тонкие дендритные клетки с булавами, содержащими реснички, на одном конце и длинными центральными отростками на другом конце, образующими волокна обонятельного нерва. Обонятельные рецепторы расположены на реснитчатых дендритных концах. Немиелинизированные аксоны сливаются в 40 нервных пучков, называемых обонятельными нитями, которые находятся в чехле из клеток типа шванновских. Нити проходят через решетчатую пластину, попадая в переднюю черепную ямку, и составляют CN I. Микровиллярные клетки находятся вблизи поверхности нейроэпителия, но точные функции этих клеток неизвестны. Поддерживающие клетки также находятся на поверхности эпителия. Они прочно связаны с нейронами и микровиллярными клетками. Они также выпускают микроворсинки в слизь. Их функции включают изоляцию рецепторных клеток друг от друга, регулирование состава слизи, дезактивацию пахучих веществ и защиту эпителия от посторонних веществ. Базальные клетки расположены рядом с базальной мембраной и являются клетками-предшественниками, от которых происходят другие типы клеток. Железы Боумена являются основным источником слизи в области обонятельного эпителия (1).

Рецепторы для пахучих веществ находятся на ресничках рецепторных клеток. Каждая рецепторная клетка экспрессирует ген рецептора одного пахучего вещества. В настоящее время известно примерно 1000 классов рецепторов. Обонятельные рецепторы связаны с регуляторным белком, связывающим гуаниновые нуклеотиды, Golf. При стимуляции он может активировать аденилатциклазу с образованием вторичного мессенджера цАМФ, и последующие события приводят к деполяризации клеточной мембраны и распространению сигнала. Хотя каждая рецепторная клетка экспрессирует только один тип рецепторов, каждая клетка электрофизиологически реагирует на широкий, но ограниченный диапазон стимулов. Это означает, что один рецептор воспринимает ряд молекулярных субстанций (1).

Обонятельная луковица находится поверх решетчатой пластины в основании лобной доли в передней черепной ямке. В нее входят тысячи первичных аксонов от обонятельных рецепторных нейронов. В обонятельной луковице эти аксоны образуют синапсы с гораздо меньшим числом нейронов второго порядка, образующих обонятельный тракт и простирающихся до обонятельной коры. Обонятельная кора включает лобные и височные доли, таламус и гипоталамус (1).

Обонятельные расстройства можно классифицировать следующим образом: 1) аносмия: неспособность воспринимать качественные обонятельные ощущения (то есть, отсутствие обонятельной функции), 2) частичная аносмия: способность воспринимать некоторые, но не все, запахи, 3) гипосмия или микросмия: сниженная чувствительность к запахам, 4) гиперосмия: аномально острая восприимчивость запахов, 5) дизосмия (какосмия или паросмия): искаженное или извращенное восприятие запахов или стимуляция запахами, 6) фантосмия: дизосмические ощущения, воспринимаемые в отсутствии ароматического стимула (она же обонятельная галлюцинация), 7) обонятельная агнозия: неспособность узнавать воспринимаемый запах (1).

Также полезно подразделять обонятельную дисфункцию на три основных класса: 1) проводящие или транспортные нарушения из-за обструкции носовых ходов (например, хроническое назальное воспаление, полипоз и так далее), 2) нейросенсорные нарушения в результате повреждения нейроэпителия (например, вирусная инфекция, токсины воздуха и так далее), 3) центральные обонятельные нейронные нарушения вследствие повреждения центральной нервной системы (например, опухоли, массы, влияющие на обонятельный тракт, нейродегенеративные заболевания и так далее). Эти категории не являются взаимоисключающими. Например: вирусы могут вызывать повреждение обонятельного нейроэпителия и они могут также транспортироваться в центральную нервную систему через обонятельный нерв, вызывая повреждение центральных элементов обонятельной системы (1).

Этиология в большинстве случаев обонятельной дисфункции может быть установлена на основании тщательного опроса пациента о природе, времени, начале, продолжительности и характере ее симптомов. Важно определить степень обонятельной способности до ее утраты. Следует искать любое историческое определение предшествующих событий, таких как травмы головы, инфекции верхних дыхательных путей или токсическое воздействие. Флуктуации функции и временные улучшения с локальными спазмами сосудов, как правило, свидетельствуют о причинах, связанных с обструкцией, а не с нейронами. Должны быть выявлены медицинские состояния, часто связанные с обонятельной дисфункцией, такие как эпилепсия, рассеянный склероз, болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера. Также нужно внимательно изучить любую историю болезни придаточных пазух носа и аллергических симптомов, включая любые предыдущие случаи хирургического лечения заболевания придаточных пазух носа. Кроме того, у пациентов, которые жалуются на потерю вкуса, при количественном обонятельном тестировании, как правило, выявляют обонятельные нарушения (1).

В данном документе раскрыто, что разагилин эффективно лечит обонятельную дисфункцию. Разагилин, R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндан, является мощным ингибитором второго поколения для моноаминоксидазы (MAO) B (Finberg et al. Pharmacological properties of the anti-Parkinson drug rasagiline; modification of endogenous brain amines, reserpine reversal, serotonergic and dopaminergic behaviours, Neuropharmacology (2002) 43(7): 1110-8). Разагилина мезилат в виде 1-мг таблеток имеется в продаже для лечения идиопатической болезни Паркинсона под торговой маркой азилект® от Teva Pharmaceuticals Industries, Ltd. (Петах-Тиква, Израиль) и H. Lundbeck A/S (Копенгаген, Дания).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу лечения симптома обонятельной дисфункции у субъекта, страдающего от обонятельной дисфункции, включающему:

a) определение субъекта как страдающего от обонятельной дисфункции; и

b) периодическое введение определенному таким образом субъекту количества R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли, эффективного для лечения субъекта.

Настоящее изобретение также относится к способу снижения темпов прогрессирования обонятельной дисфункции у субъекта без болезни Паркинсона, страдающего от обонятельной дисфункции, включающему периодическое введение субъекту количества R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли, эффективного для снижения темпов прогрессирования обонятельной дисфункции у субъекта без болезни Паркинсона.

Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования потери обонятельной функции у субъекта без болезни Паркинсона, включающему периодическое введение субъекту количества R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли, эффективного для ингибирования потери обонятельной функции у субъекта без болезни Паркинсона.

Краткое описание фигур

Фигура 1: Влияние разагилина на порог обнаружения запаха у мышей дикого типа (ДТ) и мутантных мышей.

Фигура 2: Влияние разагилина по краткосрочную обонятельную память.

Фигура 3: Влияние разагилина на способность мышей ДТ и мутантных мышей различать между знакомым и новым социальным запахом.

Фигура 4: Влияние разагилина на способность мышей ДТ и мутантных мышей различать между двумя близкими несоциальными запахами.

Фигура 5: Тест на предпочтение запаха у мышей ДТ и мутантных мышей, не получавших или получавших разагилин.

Фигура 6: Влияние разагилина на исследование объекта у мышей ДТ и мутантных мышей, не получавших или получавших разагилин.

Фигура 7: Влияние разагилина на различение объекта/запаха у мышей ДТ и мутантных мышей, не получавших или получавших разагилин.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу лечения симптома обонятельной дисфункции у субъекта, страдающего от обонятельной дисфункции, включающему:

a) определение субъекта как страдающего от обонятельной дисфункции; и

b) периодическое введение определенному таким образом субъекту количества R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли, эффективного для лечения субъекта.

В варианте осуществления данного способа субъект является субъектом без болезни Паркинсона.

Настоящее изобретение также относится к способу снижения темпов прогрессирования обонятельной дисфункции у субъекта без болезни Паркинсона, страдающего от обонятельной дисфункции, включающему периодическое введение субъекту количества R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли, эффективного для снижения темпов прогрессирования обонятельной дисфункции у субъекта без болезни Паркинсона.

Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования потери обонятельной функции у субъекта без болезни Паркинсона, включающему периодическое введение субъекту количества R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли, эффективного для ингибирования потери обонятельной функции у субъекта без болезни Паркинсона.

В варианте осуществления данного способа количество R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли составляет от 0,01 мг до 5 мг в сутки.

В другом варианте осуществления способа количество R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли составляет 0,5 мг в сутки.

В еще одном варианте осуществления способа количество R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли составляет 2 мг в сутки.

В еще одном варианте осуществления способа количество R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли составляет 1 мг в сутки.

В еще одном варианте осуществления способа R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндан вводят в виде свободного основания.

В еще одном варианте осуществления способа фармацевтически приемлемая соль R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана представляет собой эзилат, мезилат, сульфат, цитрат или тартрат.

В еще одном варианте осуществления способа фармацевтически приемлемая соль представляет собой мезилатную соль.

В еще одном варианте осуществления способа фармацевтически приемлемая соль представляет собой цитратную соль.

В еще одном варианте осуществления способа обонятельная дисфункция выбрана из группы, состоящей из аносмии, частичной аносмии, гипосмии, гиперосмии, дизосмии, фантосмии и обонятельной агнозии.

В еще одном варианте осуществления способа обонятельная дисфункция вызвана состоянием, выбранным из группы, состоящей из травмы головы, инфекции верхних дыхательных путей, токсического воздействия, эпилепсии, рассеянного склероза, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, болезни придаточных пазух носа, болезни Аддисона, синдрома Тернера, синдрома Кушинга, гипотиреоза, псевдогипопаратиреоза, синдрома Калмана и новообразования.

В еще одном варианте осуществления способа количество R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли сформулировано в виде перорального, парентерального, ректального или трансдермального препарата.

Применительно ко всем диапазонам, раскрытым в данном документе, имеется в виду, что все сотые, десятые доли и целые единицы количеств в диапазоне конкретно раскрыты как часть изобретения. Таким образом, например, количества от 0,01 мг до 50 мг означает, что 0,02, 0,03,..., 0,09; 0,1, 0,2,..., 0,9; и 1, 2,..., 49 мг включены в качестве вариантов осуществления данного изобретения.

При описании в данном документе, пациент с болезнью Паркинсона (PD) является пациентом, у которого была диагностирована любая из следующих пяти стадий PD, описанных Hoehn и Yahr (Hoehn M.M., Yahr M.D., Parkinsonism: onset, progression and mortality. Neurology 1967, 17:427-42).

Стадия I: (легкая или ранняя стадия болезни): Симптомы затрагивают только одну сторону тела.

Стадия II: Обе стороны тела затронуты, но поза остается нормальной.

Стадия III: (умеренная болезнь): Обе стороны тела затронуты, и наблюдается легкий дисбаланс при стоянии или ходьбе. Тем не менее, человек остается независимым.

Стадия IV: (прогрессирующая болезнь): Обе стороны тела затронуты, и имеется лишающая трудоспособности неустойчивость при стоянии или ходьбе. Человеку на этой стадии требуется существенная помощь.

Стадия V: Имеет место тяжелая болезнь на последней стадии. Человек прикован к кровати или к креслу.

Используемый в данном документе термин «пациент без болезни Паркинсона» относится к пациенту, у которого не была диагностирована ни одна из пяти стадий PD, описанных Hoehn и Yahr.

Используемый в данном документе термин «симптом обонятельной дисфункции» означает одно или более из следующего:

a) сниженный порог обнаружения запаха;

b) сниженная краткосрочная обонятельная память;

c) сниженная способность различать социальный запах;

d) сниженная способность различать несоциальный запах.

Используемый в данном документе термин «угасание функции» означает ухудшение симптома обонятельной дисфункции у пациента, страдающего от обонятельной дисфункции, с течением времени.

Используемый в данном документе термин «снижение темпов прогрессирования обонятельной дисфункции» означает снижение темпов прогрессирования угасания функции у пациента, страдающего от обонятельной дисфункции, по сравнению с темпом прогрессирования у пациента, страдающего от обонятельной дисфункции и не получающего разагилин, за определенный период времени.

Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемая соль» разагилина включает цитратные, таннатные, малатные, мезилатные, малеатные, фумаратные, тартратные, эзилатные, п-толуолсульфонатные, бензоатные, ацетатные, фосфатные и сульфатные соли. Для получения фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей соединений по изобретению можно проводить реакцию свободного основания с нужными кислотами в присутствии подходящего растворителя общепринятыми методами.

Используемым в данном документе примером препарата разагилина немедленного высвобождения является таблетка азилект®, содержащая разагилина мезилат.

Разагилин также можно использовать в виде свободного основания. Способ производства основания разагилина описан в PCT публикации WO 2008/076348, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый» носитель или эксципиент означает носитель или эксципиент, который подходит для использования в организме людей или животных без нежелательных побочных эффектов (таких как токсичность, раздражение и аллергические реакции) с разумным соотношением пользы и риска.

Конкретные примеры фармацевтически приемлемых носителей и эксципиентов, которые можно использовать для изготовления пероральных лекарственных форм по настоящему изобретению, описаны, например, в патенте США № 6126968, выданном Peskin et al. 3 октября 2000 г. Методы и композиции для получения лекарственных форм, полезных по настоящему изобретению, описаны, например, в следующих литературных источниках: 7 Modern Pharmaceutics, главы 9 и 10 (Banker & Rhodes, Editors, 1979); Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (Lieberman et al., 1981); Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 2е издание (1976); Remington's Pharmaceutical Sciences, 17е издание (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985); Advances in Pharmaceutical Sciences (David Ganderton, Trevor Jones, Eds., 1992); Advances in Pharmaceutical Sciences том 7. (David Ganderton, Trevor Jones, James McGinity, Eds., 1995); Aqueous Polymeric Coatings for Pharmaceutical Dosage Forms (Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Series 36 (James McGinity, Ed., 1989); Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, том 61 (Alain Rolland, Ed., 1993); Drug Delivery to the Gastrointestinal Tract (Ellis Horwood Books in the Biological Sciences. Series in Pharmaceutical Technology; J. G. Hardy, S. S. Davis, Clive G. Wilson, Eds.); Modern Pharmaceutics Drugs and the Pharmaceutical Sciences, том 40 (Gilbert S. Banker, Christopher T. Rhodes, Eds.).

Фармацевтические лекарственные формы можно получать в виде медикаментов для перорального, парентерального, ректального или трансдермального введения. Подходящие формы для перорального введения включают таблетки, спрессованные или покрытые оболочкой пилюли, драже, саше, твердые или мягкие желатиновые капсулы, подъязычные таблетки, сиропы и суспензии; для парентерального введения по изобретению предложены ампулы или флаконы, содержащие водный или неводный раствор или эмульсию; для ректального введения по изобретению предложены суппозитории с гидрофильными или гидрофобными наполнителями; для местного применения предложены мази; и для трансдермальной доставки по изобретению предложены подходящие системы доставки, известные в данной области.

Таблетки могут содержать подходящие связывающие вещества, скользящие вещества, разрыхлители, красители, ароматизаторы, обеспечивающие текучесть вещества, способствующие плавлению вещества, стабилизаторы, солюбилизаторы, антиоксиданты, буферные вещества, хелатирующие вещества, наполнители и пластификаторы. Например, для перорального введения в стандартной лекарственной форме таблетки или капсулы компонент активного лекарственного средства можно объединять с пероральным нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как желатин, агар, крахмал, метилцеллюлоза, дикальцийфосфат, сульфат кальция, маннит, сорбит, микрокристаллическая целлюлоза и тому подобное. Подходящие связывающие вещества включают крахмал, желатин, природные сахара, например, кукурузный крахмал, природные и синтетические камеди, например, гуммиарабик, трагакант или альгинат натрия, повидон, карбоксиметилцеллюлозу, полиэтиленгликоль, воски и тому подобное. Антиоксиданты включают аскорбиновую кислоту, фумаровую кислоту, лимонную кислоту, яблочную кислоту, галловую кислоту, а также их соли и сложные эфиры, бутилгидроксианизол, эдетовую кислоту. Скользящие вещества, используемые в этих лекарственных формах, включают олеат натрия, стеарат натрия, бензоат натрия, ацетат натрия, стеариновую кислоту, стеарилфумарат натрия, тальк и тому подобное. Разрыхлители включают, без ограничения, крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановую камедь, кроскармеллозу натрия, крахмалгликолят натрия и тому подобное, подходящие пластификаторы включают триацетин, триэтилцитрат, дибутилсебацинат, полиэтиленгликоль и тому подобное.

Один тип пероральных лекарственных форм по настоящему изобретению относится к препаратам замедленного высвобождения. Такие препараты могут состоять из кислотоустойчивого эксципиента, который предохраняет лекарственную форму или ее части от контакта с кислой средой желудка. Кислотоустойчивый эксципиент может покрывать разагилин в форме таблетки, капсулы или желатиновой капсулы с энтеросолюбильным покрытием. Энтеросолюбильное покрытие, в контексте данного изобретения, представляет собой покрытие, которое предотвращает растворение активного ингредиента в желудке. Конкретные примеры фармацевтически приемлемых носителей и эксципиентов, которые можно использовать для изготовления таких препаратов замедленного высвобождения, описаны, например, в международной публикации патентной заявки № WO 06/014973, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

Другой тип пероральных лекарственных форм по настоящему изобретению относится к быстрораспадающимся препаратам, которые обеспечивают способ избежать абсорбции разагилина в желудке и устраняют необходимость глотания таблеток, благодаря абсорбции разагилина в организме до попадания в желудок. Такая абсорбция разагилина может происходить при контакте со щечной, подъязычной, глоточной и/или пищеводной слизистыми оболочками. Для осуществления этого были разработаны быстро распадающиеся препараты, которые быстро расходятся во рту для обеспечения максимального контакта разагилина со щечной, подъязычной, глоточной и/или пищеводной слизистыми оболочками. Конкретные примеры фармацевтически приемлемых носителей и эксципиентов, которые можно использовать для изготовления таких быстрораспадающихся препаратов, описаны, например, в международной публикации патентной заявки № WO 03/051338, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

Другие фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают трансдермальные пластыри. Трансдермальные пластыри представляют собой лекарственные клейкие пластыри, которые помещают на кожу для доставки медленно высвобождаемой дозы лекарственного средства через кожу в кровоток. Широкий спектр фармацевтических препаратов может быть доставлен через трансдермальные пластыри. Некоторые фармацевтические препараты должны быть объединены с другими веществами, например, спиртом, чтобы повысить их способность проникать в кожу. Трансдермальные пластыри имеют несколько важных компонентов, включая поверхностный слой для защиты пластыря при хранении, лекарственное средство, клей, оболочку (для контроля высвобождения лекарственного средства из резервуара) и подложку для защиты пластыря от воздействий внешней среды. Двумя наиболее распространенными типами трансдермальных пластырей являются матричный и резервуарный (Wikipedia; и Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20е издание, 2000).

В пластырях резервуарного типа лекарственное средство скомбинировано с нелетучей инертной жидкостью, такой как минеральное масло, тогда как в пластырях матричного типа лекарственное средство диспергировано в липофильной или гидрофильной полимерной матрице, такой как акриловые или виниловые полимеры. Клейкие полимеры, такие как полиизобутилен, используют для удержания пластыря неподвижно на коже. (Stanley Scheindlin, (2004) «Transdermal Drug Delivery: PAST, PRESENT, FUTURE», Molecular Interventions, 4: 308-312).

Основным ограничением для трансдермальной доставки лекарственных средств является присущее коже барьерное свойство. Вещества, способствующие проникновению, часто добавляют к трансдермальным препаратам лекарственных средств для того, чтобы нарушить поверхность кожи и способствовать более быстрой доставке лекарственного средства. Типичные способствующие проникновению вещества включают высококипящие спирты, диолы, сложные эфиры жирных кислот, растворители на основе олеиновой кислоты и глицеридов, и их, как правило, добавляют в концентрации от одного до 20 процентов (по весу). (Melinda Hopp, «Developing Custom Adhesive Systems for Transdermal Drug Delivery Products», Drug Delivery).

Данное изобретение будет более понятным из следующих далее описаний экспериментов. Однако специалист в данной области легко поймет, что конкретные обсуждаемые методы и результаты всего лишь иллюстрируют изобретение, описанное более полно в формуле изобретения, которая прилагается к нему.

Подробное описание экспериментов

Дизайн исследования

11-месячные самцы мышей дикого типа (ДТ) и мышей, избыточно экспрессирующих альфа-синуклеин (мутантов), получали дозу 3 мг/кг массы тела разагилина в питьевой воде в течение восьми недель. Обонятельные тесты были начаты через четыре недели после начала приема разагилина. Количество мышей в каждой группе лечения представлено в таблице ниже.

мыши лечение вода разагилин контроль 21 18 мутанты 19 20

Мыши, избыточно экспрессирующие альфа-синуклеин

Трансгенные мыши, избыточно экспрессирующие альфа-синуклеин под промотором Thy1 (Thy1-aSyn), обладают высоким уровнем экспрессии альфа-синуклеина во всем мозге, но у них не происходит потери нигростриатных допаминовых нейронов до 8 месяцев. Таким образом, такие мыши являются полезными для моделирования доклинических стадий PD, в частности, обонятельной дисфункции, которая часто наступает на несколько лет раньше начала основных двигательных симптомов PD и включает нарушения обнаружения, различения и идентификации запахов. Избыточной экспрессии альфа-синуклеина достаточно для вызывания обонятельных нарушений у мышей, аналогичных тем, которые наблюдаются у пациентов с PD (2).

В процессе исследования проводили следующие обонятельные тесты:

1. Тест на различение социального запаха

2. Тест на различение несоциального запаха

3. Тест на обнаружение запаха

4. Тест на краткосрочную обонятельную память

В процессе исследования проводили следующие контрольные тесты:

1. Тест на исследование объекта

2. Тест на различение объекта/запаха

3. Предпочтение запаха

Пример 1: Определение порога обнаружения запаха

Этот эксперимент был разработан для определения того, оказывает ли разагилин положительный эффект на порог обнаружения запаха у животных, проверяемых на обонятельную функцию (фигура 1A). Порог обнаружения запаха представляет собой самую низкую концентрацию (разведение 10^-8; 10^-6; 10^-4 в воде), при которой мыши способны обнаруживать новый запах. При обнаружении нового запаха мыши будут тратить больше времени на его обнюхивание. Порог обнаружения измеряли как процент времени обнюхивания нового запаха от всего времени обнюхивания.

Результаты:

Результаты эксперимента представлены в таблицах 1a-1d. Анализ проводили при помощи 2-факторного ANOVA с последующим апостериорным критерием Бонферрони (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

Таблица 1a
Порог обнаружения запаха у мышей ДТ, не получавших лечение Группа лечения
(n=10) % времени обнюхивания запаха при концентрации Мыши Генотип Лечение 10^-8 10^-6 10^-4 2 ДТ Вода 48,3 51,4 61,4 6 ДТ Вода 48,1 74,5 74,6 13 ДТ Вода 51,3 63,2 66,2 17 ДТ Вода 35,8 77,7 68,1 20 ДТ Вода 59,0 60,8 65,5 24 ДТ Вода 45,7 67,8 54,6 26 ДТ Вода 52,2 68,7 68,5 27 ДТ Вода 59,5 53,3 41,2 31 ДТ Вода 49,7 60,1 67,4 35 ДТ Вода 53,5 71,9 55,0 Среднее 50,3 64,9 62,2 SEM 2,2 2,8 3,0

Таблица 1b
Порог обнаружения запаха у мышей ДТ, получавших разагилин Группа лечения
(n=9) % времени обнюхивания запаха при концентрации: Мыши Генотип Лечение 10^-8 10^-6 10^-4 1 ДТ Разагилин 38,4 44,4 70,2 5 ДТ Разагилин 49,3 61,0 74,5 9 ДТ Разагилин 48,3 56,1 74,4 12 ДТ Разагилин 45,9 51,9 41,9 14 ДТ Разагилин 52,7 83,5 86,4

18 ДТ Разагилин 43,3 61,1 68,7 23 ДТ Разагилин 39,1 82,5 56,0 33 ДТ Разагилин 46,6 46,2 57,4 38 ДТ Разагилин 40,4 64,9   Среднее 44,9 61,3 66,2 SEM 1,7 4,7 4,9

Таблица 1c
Порог обнаружения запаха у α-syn мутантов, не получавших лечение Группа лечения
(n=10) % времени обнюхивания запаха при концентрации: Мыши Генотип Лечение 10^-8 10^-6 10^-4 3 Мутант Вода 46,0 58,0 72,5 7 Мутант Вода 47,9 48,1 66,9 10 Мутант Вода 53,7 39,5 64,8 11 Мутант Вода 33,3 48,1 50,3 16 Мутант Вода 49,9 40,9 55,7 19 Мутант Вода 47,6 56,2 65,7 22 Мутант Вода 57,2 41,3 61,9 29 Мутант Вода 58,4 40,8 67,0 32 Мутант Вода 44,9 68,1 55,8 36 Мутант Вода 50,9 51,7 72,0 Среднее 49,0 493 63,2 SEM 23 3,0 23

Таблица 1d
Порог обнаружения запаха у α-syn мутантов, получавших разагилин Группа лечения
(n=9) % времени обнюхивания запаха при концентрации: Мыши Генотип Лечение 10^-8 10^-6 10^-4 4 Мутант Разагилин 43,7 60,2 73,6

8 Мутант Разагилин 50,1 74,8 86,6 15 Мутант Разагилин 40,9 50,0 62,2 21 Мутант Разагилин 41,4 50,8 66,6 25 Мутант Разагилин 64,4 54,1 57,7 28 Мутант Разагилин 58,3 56,9 67,4 30 Мутант Разагилин 50,5 60,2 60,7 34 Мутант Разагилин 38,8 80,6 55,7 37 Мутант Разагилин 49,8 62,8 62,7 Среднее 48,7 61,1 65,9 SEM 2,8 3,5 3,2

Обсуждение:

Приведенные выше результаты демонстрируют, что разагилин улучшал порог восприятия запаха у α-syn мутантов от 10^-4 до 10^-6 (фигура 1B). Данные на фигуре 1B анализировали при помощи 2-факторного ANOVA, при этом эффект концентрации p<0,001; нет эффекта группы p>0,05; нет зависимости концентрация*группа p>0,05; и апостериорного критерия Бонферрони (*p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001). На фигуре 1B показано, что мутантам требуется более высокая концентрация (10^-4) для обнаружения запаха по сравнению с контролями (10^-6), и что разагилин улучшает порог обнаружения запаха у мутантов.

Приведенные выше результаты также демонстрируют, что при концентрации 10^-6 разагилин улучшал способность к обнаружению запаха у α-syn мутантов (фигура 1C). Данные на фигуре 1C анализировали при помощи 2-факторного ANOVA с апостериорным критерием Бонферрони, *p<0,05, **p<0,01; при 10-8: нет эффекта генотипа и лечения, нет зависимости генотип*лечение; при 10^-6: нет эффекта лечения, эффект лечения и зависимость генотип*лечение p<0,05; и при 10-4: нет эффекта генотипа и лечения, нет зависимости генотип*лечение. На фигуре 1C показано, что при концентрации 10^-6 не получавшие лечение мутанты не воспринимают запах, и разагилин улучшает способность обнаруживать запах у мутантов.

Пример 2: Краткосрочная обонятельная память

Данный эксперимент был предназначен для оценки эффекта разагилина на способность мутантных животных запоминать новый запах на протяжении короткого временного интервала в 1 минуту, 1 минуту 30 секунд или 2 минуты (фигура 2A). Основополагающим принципом являлось то, что, если мыши затратят меньше времени, обнюхивая запах во время T2 (второе предъявление запаха), то их краткосрочная обонятельная память не нарушена. Тестируемым параметром был процент времени обнюхивания при T2, рассчитанный как время обнюхивания при T2 из общего времени обнюхивания при T1 (первое предъявление) и T2.

Результаты:

Результаты эксперимента представлены в таблицах 2a-2d. Анализ проводили при помощи 2-факторного ANOVA с последующим апостериорным критерием Бонферрони, или при помощи непараметрического критерия Крускала-Уоллиса, при отсутствии нормального распределения.

Таблица 2a
Краткосрочная обонятельная память у мышей ДТ, не получавших лечение Группа лечения
(n=10) % времени обнюхивания во время T2 после интервала: Мыши Генотип Лечение 1 мин 1,5 мин 2 мин 2-2 ДТ Вода 35,4 25,9 37,1

2-6 ДТ Вода 36,6 20,1 19,6 2-13 ДТ Вода 46,7 53,5 19,6 2-17 ДТ Вода 12,9 28,6 37,2 2-20 ДТ Вода 8,8 39,1 34,8 2-24 ДТ Вода 46,8 42,7 33,8 2-26 ДТ Вода 41,0 33,6 36,1 2-27 ДТ Вода 11,2 35,6 27,0 2-31 ДТ Вода 8,0 26,5 39,7 2-35 ДТ Вода 24,0 19,3 35,5 Среднее 27,1 32,S 32,0 SEM S,0 3,4 2,3

Таблица 2b
Краткосрочная обонятельная память у мышей ДТ, получавших разагилин Группа лечения
(n=9) % времени обнюхивания во время T2 после интервала: Мыши Генотип Лечение 1 мин 1,5 мин 2 мин 2-1 ДТ Разагилин 18,8 8,6 19,9 2-5 ДТ Разагилин 44,9 23,4 59,2 2-9 ДТ Разагилин 47,6 20,4 25,5 2-12 ДТ Разагилин 2,3 34,4 27,9 2-14 ДТ Разагилин 7,6 19,4 33,3 2-18 ДТ Разагилин 3,3 29,8 58,3 2-23 ДТ Разагилин 28,0 32,5 31,6 2-33 ДТ Разагилин 13,2 41,4 41,0 2-38 ДТ Разагилин 12,7 10,4 36,0 Среднее 19,8 24,5 37,0 SEM 5,6 3,7 4,6

Таблица 2c
Краткосрочная обонятельная память у α-syn мутантов, не получавших лечение Группа лечения 2
(n=10) % времени обнюхивания во время T2 после интервала: Мыши Генотип Лечение 1 мин 1,5 мин 2 мин 2-3 Мутант Вода 2,6 36,8 30,6 2-7 Мутант Вода 13,7 23,3 48,9 2-10 Мутант Вода 18,3 23,2 55,6 2-11 Мутант Вода 24,0 23,1 67,1 2-16 Мутант Вода 38,1 36,8 57,4 2-19 Мутант Вода 46,0 31,0 45,9 2-22 Мутант Вода 18,6 29,0 50,3 2-29 Мутант Вода 21,4 75,6 32,6 2-32 Мутант Вода 27,5 33,9 30,1 2-36 Мутант Вода 19,5 44,3 34,0 Среднее 23,0 35,7 45,2 SEM 3,9 5,0 4,1

Таблица 2d
Краткосрочная обонятельная память у α-syn мутантов, получавших разагилин Группа лечения 2
(n=9) % времени обнюхивания во время T2 после интервала: Мыши Генотип Лечение 1 мин 1,5 мин 2 мин 2-4 Мутант Разагилин 19,1 28,6 52,8 2-8 Мутант Разагилин 22,9 40,9 44,1 2-15 Мутант Разагилин 20,1 27,7 25,7 2-21 Мутант Разагилин 30,1 19,2 51,8 2-25 Мутант Разагилин 26,4 25,2 22,7 2-28 Мутант Разагилин 37,8 23,3 38,1 2-30 Мутант Разагилин 16,7 26,6 67,2 2-34 Мутант Разагилин 13,4 20,2 56,8 2-37 Мутант Разагилин 17,9 27,5 44,4

Среднее 22,7 26,6 44,8 SEM 2,5 2,1 4,8

Обсуждение:

Приведенные выше результаты демонстрируют, что разагилин имеет положительный эффект на краткосрочную обонятельную память мышей ДТ и α-syn мутантов, в частности, при 1,5-минутном интервале (фигуры 2B и C).

Данные на фигуре 2B анализировали при помощи 2-факторного ANOVA, при этом эффект ITI p<0,001; нет эффекта группы p>0,05; нет зависимости ITI*группа p>0,05; и при помощи апостериорного критерия Бонферрони (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001). На фигуре 2B показано, что при ITI в 2 минуты, у мутантов и мышей ДТ-разагилин наблюдалась сниженная краткосрочная обонятельная память по сравнению с мышами ДТ-вода.

Данные на фигуре 2C анализировали при помощи 2-факторного ANOVA с последующим апостериорным критерием Бонферрони, *p>0,05 при 1 минуте и 2 минутах, и при помощи непараметрического критерия Крускала-Уоллиса при 1,5 минутах; при 1 минуте: нет эффекта генотипа и лечения, нет зависимости генотип*лечение; при 1,5 минутах: нет статистически значимых различий между группами, p>0,05, эффект лечения p<0,05, нет эффекта генотипа и нет зависимости генотип*лечение; и при 2 минутах: эффект генотипа p<0,05, нет эффекта генотипа и нет зависимости генотип*лечение. На фигуре 2C показано, что при 1,5 минутах разагилин имел положительный эффект на краткосрочную обонятельную память как у мышей ДТ, так и у мутантов.

Пример 3: Различение социального запаха

Данный эксперимент был предназначен для оценки эффекта разагилина на способность мышей различать между знакомым социальным запахом (F) и новым социальным запахом (N) (фигура 3A). Мыши, способные различать между запахами, будут проводить больше времени, обнюхивая новый запах. Эксперимент был дополнительно подразделен по двум уровням интенсивности запаха:

Слабая интенсивность: два дня пропитки запахом

Сильная интенсивность: семь дней пропитки запахом

Тестируемым параметром был процент времени обнюхивания нового запаха от общего времени обнюхивания.

Результаты:

1. Различение слабых социальных запахов:

Результаты эксперимента представлены в таблицах 3a-3d. Анализ проводили при помощи непараметрического критерия Крускала-Уоллиса, и критерий Манна-Уитни использовали в качестве апостериорного критерия (***p<0,001).

Таблица 3a
Различение слабых социальных запахов мышами ДТ, не получавшими лечение Мыши (n=21) Генотип Лечение время обнюхива-ния F время обнюхива-ния N общее время обнюхивания % времени обнюхивания N 1-2 ДТ Вода 2,9 7,3 10,2 71,4 1-6 ДТ Вода 17,6 39,3 56,9 69,1 1-13 ДТ Вода 1,7 6,1 7,8 78,2 1-17 ДТ Вода 12,0 4,2 16,2 25,7 1-20 ДТ Вода 4,3 21,5 25,8 83,5

1-24 ДТ Вода 8,0 6,1 14,1 43,3 1-26 ДТ Вода 3,9 15,6 19,5 80,0 1-27 ДТ Вода 3,5 10,8 14,3 75,3 1-31 ДТ Вода 12,4 42,7 55,1 77,6 1-35 ДТ Вода 2,4 13,8 16,2 85,3 2-2 ДТ Вода 3,8 13,4 17,2 77,9 2-6 ДТ Вода 7,1 60,8 67,9 89,5 2-16 ДТ Вода 2,2 13,7 15,9 86,2 2-19 ДТ Вода 2,6 8,9 11,5 77,3 2-20 ДТ Вода 8,4 31,1 39,5 78,8 2-22 ДТ Вода 5,3 46,6 51,9 89,8 2-24 ДТ Вода 6,3 15,9 22,2 71,6 2-28 ДТ Вода 1,4 61,9 63,2 97,8 2-31 ДТ Вода 4,8 17,6 22,4 78,5 2-34 ДТ Вода 4,0 12,4 16,4 75,6 2-35 ДТ Вода 12,5 25,7 38,2 67,3 Среднее 6,0 22,6 28,7 75,2 SEM 0,9 3,9 4,2 3,4

Таблица 3b
Различение слабых социальных запахов мышами ДТ, получавшими разагилин Мыши (n=18) Генотип Лечение время обнюхива-ния F время обнюхива-ния N общее время обнюхивания % времени обнюхивания N 1-1 ДТ Разагилин 2,9 4,2 7,1 59,2 1-S ДТ Разагилин 8,5 10,7 19,1 55,9 1-9 ДТ Разагилин 2,2 60,0 62,2 96,5 1-12 ДТ Разагилин 1,9 7,4 9,3 79,2 1-14 ДТ Разагилин 6,3 3,7 10,0 37,2 1-18 ДТ Разагилин 4,8 6,2 11,0 56,4 1-23 ДТ Разагилин 5,8 21,6 27,4 78,8 1-33 ДТ Разагилин 7,9 7,1 15,0 47,4

1-38 ДТ Разагилин 7,3 21,6 28,9 74,7 2-1 ДТ Разагилин 3,6 36,2 39,8 91,0 2-5 ДТ Разагилин 4,5 16,8 21,3 78,9 2-17 ДТ Разагилин 2,8 7,6 10,4 73,0 2-18 ДТ Разагилин 39,8 56,5 96,3 58,7 2-23 ДТ Разагилин 3,9 17,2 21,1 81,5 2-29 ДТ Разагилин 2,1 18,1 20,2 89,6 2-33 ДТ Разагилин 6,7 2,9 9,6 30,5 2-36 ДТ Разагилин 4,8 36,7 41,5 88,4 2-37 ДТ Разагилин 6,2 7,2 13,4 53,6 Среднее 6,8 19,0 25,8 68,4 SEM 2,0 4,1 53 4,5

Таблица 3c
Различение слабых социальных запахов α-syn мутантами, не получавшими лечение Мыши (n=19) Генотип Лечение Время обнюхива-ния F Время обнюхива-ния N Общее время обнюхивания % время обнюхивания N 1-3 Мутант Вода 3,6 4,9 8,5 58,0 1-7 Мутант Вода 3,8 3,8 7,6 50,3 1-10 Мутант Вода 3,0 6,1 9,1 66,8 1-11 Мутант Вода 2,2 3,3 5,5 60,6 1-16 Мутант Вода 2,6 4,8 7,4 64,7 1-19 Мутант Вода 6,3 6,7 12,9 51,5 1-22 Мутант Вода 2,6 14,0 16,6 84,3 1-29 Мутант Вода 3,2 3,7 6,9 53,4 1-32 Мутант Вода 2,4 2,6 5,1 51,9 1-36 Мутант Вода 6,3 1,0 7,3 13,6 2-3 Мутант Вода 5,0 4,7 9,7 48,2 2-7 Мутант Вода 11,6 60,2 71,8 83,9 2-11 Мутант Вода 4,6 3,4 8,0 42,6 2-12 Мутант Вода 5,0 9,8 14,8 66,2

2-13 Мутант Вода 5,3 4,3 9,6 45,0 2-26 Мутант Вода 4,2 4,9 9,1 53,9 2-27 Мутант Вода 3,0 3,7 6,7 55,1 2-39 Мутант Вода 5,3 6,5 11,8 54,9 2-40 Мутант Вода 6,1 5,6 11,7 47,9 Среднее 4,5 8,1 12,6 55,4 SEM 0,5 3,0 3,4 3,5

Таблица 3d
Различение слабых социальных запахов α-syn мутантами, получавшими разагилин Мыши (n=20) Генотип Лечение Время обнюхива-ния F Время обнюхива-ния N Общее время обнюхивания % время обнюхивания N 1-4 Мутант Разагилин 1,0 6,4 7,4 86,4 1-8 Мутант Разагилин 3,3 8,3 11,6 71,3 1-1S Мутант Разагилин 2,8 5,8 8,6 67,8 1-21 Мутант Разагилин 3,1 5,8 8,9 65,5 1-25 Мутант Разагилин 3,6 6,6 10,2 64,7 1-28 Мутант Разагилин 2,4 3,5 5,9 59,6 1-30 Мутант Разагилин 3,1 6,6 9,7 68,3 1-34 Мутант Разагилин 2,2 4,9 7,2 68,8 1-37 Мутант Разагилин 2,7 14,6 17,3 84,3 2-4 Мутант Разагилин 5,2 9,1 14,3 63,6 2-8 Мутант Разагилин 2,5 12,9 15,4 83,8 2-9 Мутант Разагилин 3,4 8,4 11,8 71,1 2-10 Мутант Разагилин 2,4 12,0 14,4 83,3 2-14 Мутант Разагилин 2,0 1,6 3,6 44,4 2-15 Мутант Разагилин 3,2 11,4 14,6 78,0 2-21 Мутант Разагилин 3,4 6,6 10,0 65,9 2-25 Мутант Разагилин 5,8 14,5 20,3 71,4 2-30 Мутант Разагилин 2,1 6,8 8,9 76,5 2-32 Мутант Разагилин 5,1 10,8 15,9 67,9

2-38 Мутант Разагилин 2,5 6,9 9,4 73,4 Среднее 3,1 8,2 11,3 70,8 SEM 0,3 0,8 0,9 2,2

2. Различение сильных социальных запахов:

Результаты эксперимента представлены в таблицах 3e-3h. Анализ проводили при помощи 2-факторного ANOVA.

Таблица 3e
Различение сильных социальных запахов мышами ДТ, не получавшими лечение Мыши (n=21) Генотип Лечение Время обнюхива-ния F Время обнюхива-ния N Общее время обнюхивания % время обнюхивания N 1-2 ДТ Вода 4,4 10,1 14,5 69,8 1-6 ДТ Вода 9,5 16,6 26,0 63,7 1-13 ДТ Вода 3,2 7,0 10,2 68,9 1-17 ДТ Вода 7,9 27,2 35,0 77,5 1-20 ДТ Вода 10,2 27,7 37,9 73,2 1-24 ДТ Вода 8,7 15,6 24,4 64,2 1-26 ДТ Вода 13,2 49,8 63,1 79,0 1-27 ДТ Вода 0,2 76,7 76,9 99,7 1-31 ДТ Вода 3,9 68,1 72,0 94,6 1-35 ДТ Вода 3,4 7,4 10,7 68,8 2-2 ДТ Вода 4,0 21,4 25,4 84,3 2-6 ДТ Вода 6,8 14,2 21,0 67,6 2-16 ДТ Вода 3,9 13,6 17,5 111 2-19 ДТ Вода 2,8 12,5 15,3 82,0 2-20 ДТ Вода 5,4 10,0 15,4 65,1 2-22 ДТ Вода 6,1 14,6 20,7 70,5 2-24 ДТ Вода 7,8 8,9 16,7 53,4 2-28 ДТ Вода 8,2 56,1 64,3 87,2 2-31 ДТ Вода 11,6 31,2 42,8 72,9 2-34 ДТ Вода 2,5 10,8 13,3 81,4

2-35 ДТ Вода 3,5 22,5 26,0 86,6 Среднее 6,0 24,9 30,9 75,6 SEM 0,7 4,5 4,6 2,4

Таблица 3f
Различение сильных социальных запахов мышами ДТ, получавшими разагилин Мыши (n=18) Генотип Лечение Время обнюхива-ния F Время обнюхива-ния N Общее время обнюхивания % время обнюхивания N 1-1 ДТ Разагилин 4,0 26,1 30,0 86,8 1-S ДТ Разагилин 5,9 36,2 42,2 86,0 1-9 ДТ Разагилин 1,9 20,8 22,6 91,8 1-12 ДТ Разагилин 2,1 11,7 13,9 84,7 1-14 ДТ Разагилин 1,2 45,7 46,8 97,5 1-18 ДТ Разагилин 4,7 6,0 10,7 56,4 1-23 ДТ Разагилин 5,3 34,1 39,5 86,5 1-33 ДТ Разагилин 2,8 60,9 63,7 95,6 1-38 ДТ Разагилин 8,9 36,6 45,5 80,4 2-1 ДТ Разагилин 4,7 28,8 33,5 86,0 2-5 ДТ Разагилин 5,1 14,1 19,2 73,3 2-17 ДТ Разагилин 4,5 21,0 25,5 82,5 2-18 ДТ Разагилин 21,4 25,1 46,5 54,0 2-23 ДТ Разагилин 5,9 37,9 43,8 86,5 2-29 ДТ Разагилин 3,2 48,7 51,9 93,8 2-33 ДТ Разагилин 0,9 3,9 4,8 81,1 2-36 ДТ Разагилин 6,7 60,4 67,1 90,0 2-37 ДТ Разагилин 1,7 12,1 13,8 87,7 Среднее 5,0 29,5 34,5 83,4 SEM 1,1 4,0 4,3 2,8

Таблица 3g
Различение сильных социальных запахов α-syn мутантами, не получавшими лечение Мыши (n=19) Генотип Лечение Время обнюхива-ния F Время обнюхива-ния N Общее время обнюхивания % время обнюхивания N 1-3 Мутант Вода 4,0 1,6 5,6 29,2 1-7 Мутант Вода 2,4 2,7 5,0 53,1 1-10 Мутант Вода 1,5 4,2 5,7 73,6 1-11 Мутант Вода 2,4 3,3 5,6 58,0 1-16 Мутант Вода 2,5 3,7 6,1 60,1 1-19 Мутант Вода 1,8 2,7 4,5 60,5 1-22 Мутант Вода 5,0 10,2 15,2 67,3 1-29 Мутант Вода 2,9 4,0 6,9 58,3 1-32 Мутант Вода 4,6 13,8 18,4 74,9 1-36 Мутант Вода 2,8 3,4 6,3 55,0 2-3 Мутант Вода 5,6 6,7 12,3 54,4 2-7 Мутант Вода 7,5 24,4 31,9 76,5 2-11 Мутант Вода 2,4 9,6 12,0 79,9 2-12 Мутант Вода 2,0 10,3 12,3 83,8 2-13 Мутант Вода 5,8 5,3 11,1 47,7 2-26 Мутант Вода 6,5 2,5 9,0 27,7 2-27 Мутант Вода 4,4 3,4 7,8 43,5 2-39 Мутант Вода 4,7 4,5 9,2 49,1 2-40 Мутант Вода 1,4 2,1 3,5 60,0 Среднее 3,7 6,2 9,9 58,6 SEM 0,4 1,3 1,5 3,5

Таблица 3h
Различение сильных социальных запахов α-syn мутантами, получавшими разагилин Мыши (n=20) Генотип Лечение Время обнюхива-ния F Время обнюхива-ния N Общее время обнюхивания % время обнюхивания N 1-4 Мутант Разагилин 3,66 3,36 7,0 47,9 1-8 Мутант Разагилин 6,98 6,04 13,0 46,4 1-15 Мутант Разагилин 2,28 4,87 7,2 68,1 1-21 Мутант Разагилин 1,62 3,21 4,8 66,5 1-25 Мутант Разагилин 2,96 6,47 9,4 68,6 1-28 Мутант Разагилин 2,60 5,92 8,5 69,5 1-30 Мутант Разагилин 5,02 12,57 17,6 71,5 1-34 Мутант Разагилин 2,00 5,65 7,7 73,9 1-37 Мутант Разагилин 3,12 8,64 11,8 73,5 2-4 Мутант Разагилин 2,1 4,3 6,4 66,7 2-8 Мутант Разагилин 5,0 36,0 41,0 87,8 2-9 Мутант Разагилин 2,2 5,3 7,4 70,9 2-10 Мутант Разагилин 3,0 18,1 21,1 85,8 2-14 Мутант Разагилин 3,0 5,2 8,2 63,4 2-15 Мутант Разагилин 1,8 4,0 5,8 69,6 2-21 Мутант Разагилин 2,4 6,8 9,2 74,0 2-25 Мутант Разагилин 1,8 5,3 7,0 74,9 2-30 Мутант Разагилин 3,3 7,1 10,4 68,4 2-32 Мутант Разагилин 4,5 29,8 34,3 86,9 2-38 Мутант Разагилин 3,6 7,1 10,7 66,2 Среднее 3,1 9,3 12,4 70,0 SEM 0,3 2,0 2,1 2,3

Обсуждение:

Различение при слабой интенсивности социального запаха:

Приведенные выше результаты демонстрируют, что разагилин улучшает различение слабого социального запаха у α-syn мутантных мышей (фигура 3B). Данные на фигуре 3B анализировали при помощи критерия Крускала-Уоллиса (p<0,001) и апостериорного критерия Манна-Уитни (***p<0,001). На фигуре 3B показано, что у мутантов нарушена способность различать «слабый» социальный запах и разагилин улучшает способность мутантов различать социальный запах.

Различение при сильной интенсивности социального запаха:

Приведенные выше результаты демонстрируют, что разагилин улучшает различение сильного социального запаха у мышей ДТ и α-syn мутантных мышей (фигура 3C). Данные на фигуре 3C анализировали при помощи 2-факторного ANOVA, при этом эффект генотипа p<0,001; эффект лечения p<0,001; нет зависимости генотип*лечение p>0,05; и апостериорного критерия Бонферрони **p<0,01, ***p<0,001.

На фигуре 3C показано, что у мутантов нарушена способность различать «сильный» социальный запах и разагилин улучшает способность мышей различать сильный социальный запах.

Пример 4: Различение несоциального запаха

Данный эксперимент был предназначен для оценки эффекта разагилина на способность мышей различать между двумя близкими несоциальными запахами. В данном эксперименте запах лимона служил в качестве знакомого запаха (F), а запах лайма - в качестве нового запаха (N) (фигура 4A). Мыши, способные различать между запахами, будут проводить больше времени, обнюхивая новый запах. Тестируемым параметром был процент времени обнюхивания нового запаха от общего времени обнюхивания.

Результаты:

Результаты эксперимента представлены в таблицах 4a-4d. Анализ проводили при помощи 2-факторного ANOVA и апостериорного критерия Бонферрони.

Таблица 4a
Различение несоциальных запахов мышами ДТ, не получавшими лечение Мыши (n=20) Генотип Лечение Время обнюхива-ния F Время обнюхива-ния N Общее время обнюхивания % время обнюхива-ния N 1-2 ДТ Вода 1,5 12,6 14,1 89,4 1-6 ДТ Вода 3,7 49,9 53,6 93,1 1-16 ДТ Вода 12,0 32,8 44,8 73,2 1-19 ДТ Вода 14,8 41,6 56,4 73,8 1-20 ДТ Вода 6,5 10,9 17,4 62,5 1-22 ДТ Вода 11,6 22,8 34,4 66,2 1-24 ДТ Вода 3,0 10,8 13,8 78,2 1-28 ДТ Вода 5,6 43,0 48,6 88,5 1-31 ДТ Вода 10,0 46,6 56,6 82,3 1-35 ДТ Вода 7,0 52,2 59,2 88,2 2-2 ДТ Вода 19,7 14,0 33,7 41,6 2-6 ДТ Вода 3,7 22,3 25,9 85,8 2-13   Вода 3,7 3,6 7,3 49,2 2-17 ДТ Вода 10,0 22,7 32,7 69,6 2-20 ДТ Вода 4,6 19,1 23,6 80,6 2-24 ДТ Вода 2,8 32,5 35,3 92,2 2-26 ДТ Вода 5,2 14,4 19,6 73,7 2-27 ДТ Вода 1,7 8,2 10,0 82,5 2-31 ДТ Вода 13,9 54,0 67,9 79,6 2-35 ДТ Вода 4,5 20,6 25,1 81,9 Среднее 7,3 26,7 34,0 76,6 SEM 1,1 3,6 4,1 3,0

Таблица 4b
Различение несоциальных запахов мышами ДТ, получавшими разагилин Мыши (n=18) Генотип Лечение Время обнюхива-ния F Время обнюхива-ния N Общее время обнюхивания % время обнюхивания N 1-1 ДТ Разагилин 2,6 25,4 28,0 90,6 1-5 ДТ Разагилин 3,1 11,1 14,2 78,1 1-17 ДТ Разагилин 34,2 24,2 58,4 41,5 1-18 ДТ Разагилин 6,2 37,4 43,6 85,8 1-23 ДТ Разагилин 3,6 59,6 63,2 94,3 1-29 ДТ Разагилин 28,9 52,1 81,0 64,3 1-33 ДТ Разагилин 3,8 4,3 8,1 53,0 1-36 ДТ Разагилин 27,1 44,5 71,6 62,2 1-37 ДТ Разагилин 18,4 31,3 49,7 63,0 2-1 ДТ Разагилин 14,1 24,8 39,0 63,7 2-5 ДТ Разагилин 3,3 19,4 22,8 85,3 2-9 ДТ Разагилин 1,2 6,6 7,8 85,2 2-12 ДТ Разагилин 13,8 10,4 24,2 43,0 2-14 ДТ Разагилин 6,2 30,6 36,8 83,3 2-18 ДТ Разагилин 15,9 33,0 48,9 67,4 2-23 ДТ Разагилин 11,9 40,4 52,3 77,3 2-33 ДТ Разагилин 0,3 65,6 65,9 99,6 2-38 ДТ Разагилин 19,1 29,8 48,9 61,0 Среднее 11,9 30,6 42,5 72,1 SEM 2,4 4,1 5,1 4,0

Таблица 4c
Различение несоциальных запахов α-syn мутантами, не получавшими лечение Мыши (n=19) Генотип Лечение Время обнюхива-ния F Время обнюхива-ния N Общее время обнюхивания % время обнюхива-ния N 1-3 Мутант Вода 2,0 1,7 3,7 46,2 1-7 Мутант Вода 9,4 14,3 23,7 60,3 1-11 Мутант Вода 5,9 6,7 12,6 53,2 1-12 Мутант Вода 2,4 2,4 4,8 49,7 1-13 Мутант Вода 9,1 5,2 14,3 36,3 1-26 Мутант Вода 6,6 6,6 13,2 49,9 1-27 Мутант Вода 6,0 5,3 11,3 46,8 1-39 Мутант Вода 4,0 3,0 7,0 42,5 1-40 Мутант Вода 4,7 5,9 10,6 55,8 2-3 Мутант Вода 4,6 2,6 7,1 35,9 2-7 Мутант Вода 5,1 4,0 9,1 44,2 2-10 Мутант Вода 5,9 2,6 8,4 30,5 2-11 Мутант Вода 2,8 2,4 5,2 46,2 2-16 Мутант Вода 5,6 1,8 7,4 24,2 2-19 Мутант Вода 2,4 6,9 9,3 73,8 2-22 Мутант Вода 5,8 4,0 9,7 40,7 2-29 Мутант Вода 1,9 3,1 5,0 61,6 2-32 Мутант Вода 4,7 5,7 10,4 54,8 2-36 Мутант Вода 3,7 2,1 5,9 36,3 Среднее 4,9 4,5 9,4 46,8 SEM 0,5 0,7 1,1 2,7

Таблица 4d
Различение несоциальных запахов α-syn мутантами, получавшими разагилин Мыши (n=20) Генотип Лечение Время обнюхива-ния F Время обнюхива-ния N Общее время обнюхивания % время обнюхивания N 1-4 Мутант Разагилин 3,2 6,6 9,8 67,4 1-8 Мутант Разагилин 6,0 22,2 28,1 78,8 1-9 Мутант Разагилин 2,1 5,1 7,2 71,1 1-10 Мутант Разагилин 2,7 13,3 16,0 83,1 1-14 Мутант Разагилин 5,3 5,8 11,1 52,3 1-15 Мутант Разагилин 1,6 2,3 3,9 59,1 1-21 Мутант Разагилин 2,3 11,2 13,5 83,0 1-25 Мутант Разагилин 4,5 7,8 12,3 63,6 1-30 Мутант Разагилин 1,8 3,4 5,2 65,1 1-32 Мутант Разагилин 13,7 70,0 83,7 83,6 1-38 Мутант Разагилин 2,1 8,2 10,3 79,4 2-4 Мутант Разагилин 4,9 9,4 14,4 65,7 2-8 Мутант Разагилин 4,9 4,2 9,1 46,3 2-15 Мутант Разагилин 3,0 16,6 19,6 84,6 2-21 Мутант Разагилин 2,8 4,4 7,1 61,3 2-25 Мутант Разагилин 2,7 6,6 9,3 71,4 2-28 Мутант Разагилин 0,7 9,2 9,9 92,7 2-30 Мутант Разагилин 4,4 5,5 9,9 55,6 2-34 Мутант Разагилин 1,8 3,6 5,3 67,0 2-37 Мутант Разагилин 3,0 8,4 11,4 73,5 Среднее 3,7 11,2 14,8 70,2 SEM 0,6 3,3 3,8 2,7

Обсуждение:

Приведенные выше результаты демонстрируют, что разагилин улучшает различение двух близких несоциальных запахов у α-syn мутантных мышей (фигура 4B). Данные на фигуре 4B анализировали при помощи 2-факторного ANOVA, при этом эффект генотипа p<0,001; эффект лечения p<0,01; зависимость генотип*лечение p<0,001; и апостериорного критерия Бонферрони, ***p<0,001. На фигуре 4B показано, что у мутантов нарушена способность различать 2 близких несоциальных запаха и разагилин улучшает способность различать 2 близких несоциальных запаха.

Пример 5: Тест на предпочтение запаха

Данный эксперимент являлся контрольным тестом для определения того, может ли особенность мышей или лечение разагилином мешать предпочтению запаха между лаймом и лимоном. Сравнивали периоды времени, которое мыши проводили, обнюхивая лимон и лайм. Тестируемыми параметрами были процент времени обнюхивания лимона от общего времени обнюхивания и процент времени обнюхивания лайма от общего времени обнюхивания.

Результаты:

Результаты представлены в таблицах 5a-5d. Анализ проводили при помощи критерия Крускала-Уоллиса для сравнения % времени обнюхивания между группами мышей, и критерия Стьюдента для проведения сравнения для каждой группы % времени обнюхивания лайма и лимона.

Таблица 5a
Предпочтение запаха у мышей ДТ, не получавших лечение Группа лечения Время обнюхивания (с) % Время обнюхивания Мыши (n=21) Генотип Лечение Лимон Лайм Общее Лимон Лайм 1-2 ДТ Вода 8,5 17,3 25,8 33,0 67,0 1-6 ДТ Вода 39,9 38,5 78,4 50,9 49,1

1-16 ДТ Вода 45,3 40,0 85,3 53,1 46,9 1-19 ДТ Вода 45,4 54,5 99,9 45,4 54,6 1-20 ДТ Вода 21,2 21,6 42,8 49,5 50,5 1-22 ДТ Вода 13,1 11,1 24,2 54,1 45,9 1-24 ДТ Вода 16,6 9,7 26,3 63,2 36,8 1-28 ДТ Вода 100,7 89,0 189,7 53,1 46,9 1-31 ДТ Вода 15,6 55,0 70,6 22,1 77,9 1-34 ДТ Вода 6,8 8,4 15,2 44,7 55,3 1-35 ДТ Вода 42,9 32,0 74,9 57,3 42,7 2-2 ДТ Вода 4,1 4,4 8,4 48,3 51,7 2-6 ДТ Вода 11,8 15,7 27,5 43,0 57,0 2-13 ДТ Вода 4,7 3,2 7,9 59,5 40,5 2-17 ДТ Вода 20,4 18,6 39,0 52,3 47,7 2-20 ДТ Вода 11,7 8,0 19,7 59,5 40,5 2-24 ДТ Вода 10,0 7,3 17,3 58,1 41,9 2-26 ДТ Вода 10,1 13,1 23,2 43,4 56,6 2-27 ДТ Вода 7,5 11,1 18,5 40,3 59,7 2-31 ДТ Вода 25,7 26,8 52,5 49,0 51,0 2-35 ДТ Вода 34,2 29,3 63,5 53,8 46,2 Среднее 23,6 24,5 48,1 49,2 50,8 SEM 4,9 4,7 9,3 2,1 2,1

Таблица 5b
Предпочтение запаха у мышей ДТ, получавших разагилин Группа лечения Время обнюхивания (с) % Время обнюхивания Мыши (n=18) Генотип Лечение Лимон Лайм Всего Лимон Лайм 1-1 ДТ Разагилин 23,2 14,4 37,6 61,7 38,3 1-5 ДТ Разагилин 10,3 6,9 17,2 59,9 40,1 1-17 ДТ Разагилин 12,5 14,2 26,7 47,0 53,0 1-18 ДТ Разагилин 106,9 33,5 140,4 76,1 23,9 1-23 ДТ Разагилин 46,8 80,7 127,5 36,7 63,3 1-29 ДТ Разагилин 31,9 15,1 47,0 67,9 32,1

1-33 ДТ Разагилин 3,6 4,3 7,9 45,7 54,3 1-36 ДТ Разагилин 54,9 96,8 151,7 36,2 63,8 1-37 ДТ Разагилин 20,6 13,5 34,1 60,4 39,6 2-1 ДТ Разагилин 32,1 10,3 42,4 75,8 24,2 2-5 ДТ Разагилин 3,9 7,5 11,4 33,9 66,1 2-9 ДТ Разагилин 6,0 6,5 12,4 47,9 52,1 2-12 ДТ Разагилин 6,5 8,7 15,2 42,7 57,3 2-14 ДТ Разагилин 32,2 37,7 70,0 46,1 53,9 2-18 ДТ Разагилин 20,1 13,5 33,6 59,9 40,1 2-23 ДТ Разагилин 21,8 15,1 37,0 59,1 40,9 2-33 ДТ Разагилин 14,2 10,5 24,7 57,5 42,5 2-38 ДТ Разагилин 18,0 30,4 48,4 37,2 62,8 Среднее 25,9 23,3 49,2 52,9 47,1 SEM 5,8 6,1 10,5 3,1 3,1

Таблица 5c
Предпочтение запаха у α-syn мутантов, не получавших лечение Группа лечения Время обнюхивания (с) % Время обнюхивания Мыши (n=19) Генотип Лечение Лимон Лайм Всего Лимон Лайм 1-3 Мутант Вода 1,8 2,1 3,9 46,5 53,5 1-7 Мутант Вода 3,2 4,1 7,3 43,5 56,5 1-11 Мутант Вода 4,0 1,6 5,6 71,6 28,4 1-12 Мутант Вода 2,9 3,3 6,2 47,1 52,9 1-13 Мутант Вода 4,9 5,4 10,3 47,2 52,8 1-26 Мутант Вода 6,9 7,4 14,3 48,1 51,9 1-27 Мутант Вода 6,1 6,2 12,3 49,8 50,2 1-39 Мутант Вода 10,7 11,1 21,8 49,0 51,0 1-40 Мутант Вода 2,2 1,6 3,8 56,9 43,1 2-3 Мутант Вода 2,8 3,6 6,4 44,4 55,6 2-7 Мутант Вода 4,0 2,7 6,7 60,3 39,7 2-10 Мутант Вода 2,5 2,6 5,2 49,0 51,0 2-11 Мутант Вода 4,2 5,3 9,6 44,3 55,7

2-16 Мутант Вода 5,0 5,6 10,7 47,2 52,8 2-19 Мутант Вода 4,3 6,3 10,6 40,9 59,1 2-22 Мутант Вода 2,6 2,6 5,2 49,8 50,2 2-29 Мутант Вода 7,9 8,4 16,2 48,6 51,4 2-32 Мутант Вода 8,4 7,5 15,9 52,9 47,1 2-36 Мутант Вода 5,5 6,2 11,7 47,2 52,8 Среднее 4,7 4,9 9,7 49,7 50,3 SEM 0,5 0,6 1,1 1,6 1,6

Таблица 5d
Предпочтение запаха у α-syn мутантов, получавших разагилин Группа лечения Время обнюхивания (с) % Время обнюхивания Мыши (n=19) Генотип Лечение Лимон Лайм Всего Лимон Лайм 1-4 Мутант Разагилин 6,3 3,9 10,2 61,8 38,2 1-8 Мутант Разагилин 6,4 8,7 15,1 42,4 57,6 1-9 Мутант Разагилин 4,7 3,7 8,4 55,9 44,1 1-10 Мутант Разагилин 2,5 4,9 7,4 33,5 66,5 1-14 Мутант Разагилин 7,9 4,5 12,4 63,7 36,3 1-15 Мутант Разагилин 2,6 4,6 7,2 36,2 63,8 1-21 Мутант Разагилин 6,5 7,5 14,0 46,5 53,5 1-25 Мутант Разагилин 13,0 3,4 16,4 79,3 20,7 1-30 Мутант Разагилин 5,7 6,0 11,7 48,5 51,5 1-32 Мутант Разагилин 10,0 63,0 73,0 13,7 86,3 1-38 Мутант Разагилин 6,2 6,9 13,1 47,3 52,7 2-4 Мутант Разагилин 6,8 4,2 11,0 62,1 37,9 2-8 Мутант Разагилин 4,0 5,6 9,6 41,3 58,7 2-15 Мутант Разагилин 7,8 7,0 14,9 52,7 47,3 2-21 Мутант Разагилин 5,4 8,4 13,9 39,2 60,8 2-25 Мутант Разагилин 7,2 7,6 14,8 48,5 51,5 2-28 Мутант Разагилин 6,9 7,3 14,2 48,6 51,4 2-30 Мутант Разагилин 2,9 4,9 7,8 37,0 63,0 2-34 Мутант Разагилин 5,9 8,3 14,2 41,3 58,7

2-37 Мутант Разагилин 4,2 4,4 8,6 48,8 51,2 Среднее 6,1 8,7 14,9 47,4 52,6 SEM 0,6 2,9 3,1 3,1 3,1

Обсуждение:

Приведенные выше результаты демонстрируют, что отсутствовала разница в предпочтении запаха между лимоном и лаймом. Для каждого запаха не было разницы в проценте времени обнюхивания между группами (фигура 5B). Данные на фигуре 5B анализировали для сравнения групп при помощи критерия Крускала-Уоллиса p>0,05, а сравнение лимон/лайм для каждой группы проводили при помощи критерия Стьюдента (p>0,05). На фигуре 5B показано, что для каждой группы: нет различия в предпочтении запаха между лимоном/лаймом, и для каждого запаха: нет различия в % времени обнюхивания между группами.

Пример 6: Тест на исследование нового объекта

Данный эксперимент являлся контрольным тестом для определения того, имеет ли разагилин эффект на уровень исследования нового объекта. Тестируемым параметром был процент времени исследования нового объекта от общего времени испытания.

Результаты:

Результаты представлены в таблицах 6a-6d. Анализ проводили при помощи критерия Крускала-Уоллиса и апостериорного критерия Манна-Уитни.

Таблица 6a
Исследование нового объекта мышами ДТ, не получавшими лечение Мыши (n=10) Генотип Лечение Время исследования (с) % Времени при исследовании нового объекта 2 ДТ Вода 88,0 29,3 6 ДТ Вода 109,6 36,5 16 ДТ Вода 111,8 37,3 19 ДТ Вода 110,5 36,8 20 ДТ Вода 96,7 32,2 22 ДТ Вода 114,8 38,3 24 ДТ Вода 108,7 36,2 28 ДТ Вода 91,1 30,4 31 ДТ Вода 116,1 38,7 35 ДТ Вода 112,4 37,5 Среднее 106,0 35J SEM 3,2 1,1

Таблица 6b
Исследование нового объекта мышами ДТ, получавшими разагилин Мыши (n=9) Генотип Лечение Время исследования (с) % Времени при исследовании нового объекта 1 ДТ Разагилин 98,0 32,7 5 ДТ Разагилин 98,4 32,8 17 ДТ Разагилин 105,6 35,2 18 ДТ Разагилина 115,1 38,4 23 ДТ Разагилин 100,0 33,3 29 ДТ Разагилин 113,4 37,8 33 ДТ Разагилин 99,8 33,3 36 ДТ Разагилин 110,5 36,8 37 ДТ Разагилин 109,1 36,4 Среднее 105,5 35,2 SEM 2,2 0,7

Таблица 6c
Исследование нового объекта α-syn мутантами, не получавшими лечение Мыши (n=9) Генотип Лечение Время исследования (с) % Времени при исследовании нового объекта 3 Мутант Вода 20,6 6,9 7 Мутант Вода 91,6 30,5 11 Мутант Вода 44,0 14,7 12 Мутант Вода 61,9 20,6 13 Мутант Вода 106,0 35,3 26 Мутант Вода 102,8 34,3 27 Мутант Вода 55,4 18,5 39 Мутант Вода 116,0 38,7 40 Мутант Вода 108,1 36,0 Среднее 78,5 26,2 SEM 113 3,8

Таблица 6d
Исследование нового объекта α-syn мутантами, получавшими разагилин Мыши (n=11) Генотип Лечение Время исследования (с) % Времени при исследовании нового объекта 4 Мутант Разагилин 60,6 20,2 8 Мутант Разагилин 103,5 34,5 9 Мутант Разагилин 67,6 22,5 10 Мутант Разагилин 43,5 14,5 14 Мутант Разагилин 73,6 24,5 15 Мутант Разагилин 69,4 23,1 21 Мутант Разагилин 106,1 35,4 25 Мутант Разагилин 85,8 28,6 30 Мутант Разагилин 53,1 17,7

32 Мутант Разагилин 108,2 36,1 38 Мутант Разагилин 101,4 33,8 Среднее 79,3 26,4 SEM 6,9 2,3

Обсуждение:

Приведенные выше результаты демонстрируют, что разагилин не оказывает влияния на исследование нового объекта животными ДТ и мутантными животными (фигура 6B). Данные на фигуре 6B анализировали при помощи критерия Крускала-Уоллиса (p<0,05) и апостериорного критерия Манна-Уитни (*p<0,05). На фигуре 6B показано, что у мутантов нарушена способность к исследованию нового объекта по сравнению с мышами ДТ и разагилин не оказывает влияния на исследование нового объекта.

Пример 7: Различение нового объекта/запаха

Данный эксперимент являлся контрольным тестом для определения способности различать объект/запах у мутантных мышей и животных, получавших разагилин. Цель состояла в том, чтобы определить, является ли неспособность различать запах специфичной для обонятельной функции (фигура 7A).

Тестируемым параметром был процент времени исследования нового объекта/запаха от общего времени исследования.

Результаты:

Результаты представлены в таблицах 7a-7d. Анализ проводили при помощи 2-факторного ANOVA и апостериорного критерия Бонферрони.

Таблица 7a
Исследование нового объекта/запаха мышами ДТ, не получавшими лечение Группа лечения Время исследования (с) % Времени при исследовании нового объекта Мыши (n=10) Генотип Лечение Знакомый объект Новый объект Всего 2 ДТ Вода 2,2 72,0 74,2 97,0 6 ДТ Вода 3,7 81,2 84,8 95,7 13 ДТ Вода 2,5 14,7 17,2 85,7 17 ДТ Вода 1,9 104,6 106,5 98,2 20 ДТ Вода 3,9 18,1 22,0 82,4 24 ДТ Вода 1,4 92,5 93,9 98,5 26 ДТ Вода 6,9 21,6 28,5 75,8 27 ДТ Вода 4,9 48,7 53,6 90,9 31 ДТ Вода 7,2 48,7 55,9 87,1 35 ДТ Вода 1,5 66,8 68,3 97,8 Среднее 3,6 56,9 60,5 90,9 SEM 0,7 10,1 9,7 2,5

Таблица 7b
Исследование нового объекта/запаха мышами ДТ, получавшими разагилин Группа лечения Время исследования (с) % Времени при исследовании нового объекта Мыши (n=9) Генотип Лечение Знакомый объект Новый объект Всего 1 ДТ Разагилин 1,1 108,3 109,4 99,0 5 ДТ Разагилин 2,0 78,6 80,6 97,5 9 ДТ Разагилин 2,8 70,9 73,7 96,3 12 ДТ Разагилин 0,7 92,6 93,3 99,2 14 ДТ Разагилин 11,6 70,2 81,8 85,8 18 ДТ Разагилин 0,4 103,9 104,3 99,7 23 ДТ Разагилин 6,6 65,9 72,6 90,9

33 ДТ Разагилин 1,6 92,9 94,5 98,4 38 ДТ Разагилин 0,4 81,6 82,0 99,5 Среднее 3,0 85,0 88,0 96,2 SEM 1,3 5,1 4,4 1,6

Таблица 7c
Исследование нового объекта/запаха α-syn мутантами, не получавшими лечение Группа лечения Время исследования (с) % Времени при исследовании нового объекта Мыши (n=10) Генотип Лечение Знакомый объект Новый объект Всего 3 Мутант Вода 3,3 13,0 16,3 79,7 7 Мутант Вода 2,8 34,2 37,0 92,4 10 Мутант Вода 2,8 36,6 39,4 92,9 11 Мутант Вода 2,7 8,2 11,0 75,3 16 Мутант Вода 2,3 7,3 9,7 75,8 19 Мутант Вода 1,0 55,7 56,6 98,3 22 Мутант Вода 4,4 18,5 22,9 81,0 29 Мутант Вода 1,9 31,1 33,0 94,2 32 Мутант Вода 2,0 14,2 16,2 87,4 36 Мутант Вода 4,7 16,9 21,6 78,2 Среднее 2,8 23,6 26,4 85,5 SEM 0,4 4,9 4,7 2,7

Таблица 7d
Исследование нового объекта/запаха α-syn мутантами, получавшими разагилин Группа лечения Время исследования (с) % Времени при исследовании нового объекта Мыши (n=9) Генотип Лечение Знакомый объект Новый объект Всего 4 Мутант Разагилин 2,8 41,7 44,5 93,7 8 Мутант Разагилин 3,0 25,8 28,8 89,7

15 Мутант Разагилин 12,2 75,2 87,5 86,0 21 Мутант Разагилин 2,7 58,4 61,0 95,6 25 Мутант Разагилин 0,5 57,2 57,8 99,1 28 Мутант Разагилин 2,8 67,0 69,8 96,0 30 Мутант Разагилин 1,8 42,7 44,5 95,9 34 Мутант Разагилин 4,4 60,3 64,7 93,2 37 Мутант Разагилин 2,5 10,2 12,7 80,7 Среднее 3,6 48,7 52,4 92,2 SEM 1,1 6,9 7,5 1,9

Обсуждение:

Приведенные выше результаты демонстрируют, что мутантные мыши проявляют аналогичную способность различать объект/запах в сравнении с контролем, это означает, что неспособность различать запах, очевидно, является специфичной для обонятельной функции. Данные на фигуре 7B анализировали при помощи 2-факторного ANOVA, при этом эффект генотипа p<0,05; эффект лечения p<0,05; нет зависимости генотип*лечение; и апостериорного критерия Бонферрони *p<0,05. Данные на фигуре 7B свидетельствуют о том, что способность к различению у мутантов, безусловно, вследствие его эффекта на улучшение различения запаха. На фигуре 7B показано, что мутанты способны различать новый объект/запах и что лечение разагилином улучшает способность к различению у мутантов практически до уровней животных ДТ.

Пример 8: Исследование эффекта разагилина на обонятельную дисфункцию.

Данный эксперимент предназначен для изучения эффекта разагилина на обонятельную дисфункцию в соответствии с процедурами, описанными для двух трансгенных мышиных моделей для исследования потери обоняния. (Lane et al., «Development of transgenic mouse models for the study of human olfactory dysfunction», Am J Rhinol, 2005, May-Jun; 19(3): 229-35.)

Каждая модель демонстрирует, что разагилин эффективен для лечения симптомов обонятельной дисфункции у мышей.

Результаты исследования также показывают, что разагилин эффективен для снижения темпов прогрессирования обонятельной дисфункции у мышей.

Результаты исследования также показывают, что разагилин эффективен для уменьшения угасания функции у мышей.

Литература:

1. Grand Rounds Presentation, UTMB, Dept. of Otolaryngology, «Olfactory Dysfunction and Disorders», http://www.utmb.edu/otoref/grnds/Olfactory-2003-1126/Olfactory-2003-1126.htm.

2. Fleming S.M., Tetreault N.A., Mulligan C.K., Hutson C.B., Masliah E., Chesselet M.F., «Olfactory deficits in mice overexpressing human wildtype alpha-synuclein», Eur J Neurosci. 2008 Jul; 28(2): 247-56.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к неврологии, и касается лечения обонятельной дисфункции. Для этого вводят разагилин или его фармацевтически приемлемую соль в терапевтически эффективном количестве. Это обеспечивает эффективное лечение обонятельной дисфункции, в том числе не обусловленной болезнью Паркинсона. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 7 ил., 33 табл., 8 пр.

1. Способ лечения симптома обонятельной дисфункции у субъекта без болезни Паркинсона, страдающего от обонятельной дисфункции, включающий:
a) определение субъекта как страдающего от обонятельной дисфункции и
b) периодическое введение определенному таким образом субъекту количества R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли, эффективного для лечения субъекта.

2. Способ снижения темпов прогрессирования обонятельной дисфункции у субъекта без болезни Паркинсона, страдающего от обонятельной дисфункции, включающий периодическое введение субъекту количества R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли, эффективного для снижения темпов прогрессирования обонятельной дисфункции у субъекта без болезни Паркинсона.

3. Способ ингибирования потери обонятельной функции у субъекта без болезни Паркинсона, включающий периодическое введение субъекту количества R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли, эффективного для ингибирования потери обонятельной функции у субъекта без болезни Паркинсона.

4. Способ по п. 1, в котором количество R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли составляет от 0,01 мг до 5 мг в сутки.

5. Способ по п. 4, в котором количество R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли составляет 0,5 мг в сутки.

6. Способ по п. 4, в котором количество R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли составляет 2 мг в сутки.

7. Способ по п. 4, в котором количество R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли составляет 1 мг в сутки.

8. Способ по п. 1, в котором R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндан вводят в виде свободного основания.

9. Способ по п. 1, в котором фармацевтически приемлемая соль R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана представляет собой эзилат, мезилат, сульфат, цитрат или тартрат.

10. Способ по п. 9, в котором фармацевтически приемлемая соль представляет собой мезилатную соль.

11. Способ по п. 9, в котором фармацевтически приемлемая соль представляет собой цитратную соль.

12. Способ по п. 1, в котором обонятельная дисфункция выбрана из группы, состоящей из аносмии, частичной аносмии, гипосмии, гиперосмии, дизосмии, фантосмии и обонятельной агнозии.

13. Способ по п. 1, в котором количество R(+)-N-пропаргил-1-аминоиндана или его фармацевтически приемлемой соли сформулировано в виде перорального, парентерального, ректального или трансдермального препарата.