СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ КОНТАМИНАЦИИ ВИРУСАМИ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ИММУНОПЕРОКСИДАЗНЫМ МЕТОДОМ Российский патент 2017 года по МПК C12N7/00 C12N1/00 C12R1/93 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к ветеринарной биотехнологии, а именно к обнаружению артефактов (вирусов) в культуре клеток «непрямым» иммунопероксидазным методом.

Контаминация культур клеток вирусами представляет проблему как для научных исследований в вирусологии и биотехнологии, так и при производстве различных биопрепаратов (диагностикумов и вакцин).

Источником заражения культур клеток могут быть среды, реактивы, сыворотки, персонал лаборатории и др. Диагностикумы, изготовленные из контаминированного сырья, могут давать ложные результаты исследования. В лабораторной практике известны случаи контаминации перевиваемых культур клеток вирусом диареи нецитопатогенного биотипа.

Известен способ выявления контаминации культур клеток вирусом диареи крупного рогатого скота в полимеразноцепной реакции (ПЦР) (1).

Известен также способ выявления контаминации культуры клеток вирусом диареи в реакции иммунофлуоресценции, для чего монослой клеток промывают фосфатно-буферным раствором pH 7,2 и фиксируют ацетоном. Клетки инкубируют с иммуноглобулинами мышей против ВД-БС, мечеными ФИТЦ, взятыми в рабочем разведении в течение 45 мин при 37°C. После этого клетки отмывают фосфатно-буферным раствором 3-4 раза, после чего исследуют под люминесцентным микроскопом. О наличии вируса ВД-БС судят по желто-зеленой флуоресценции в клетках (2).

В задачу исследований входило - разработать специфический, чувствительный, не требующий специального оборудования способ обнаружения контаминации культур клеток вирусом диареи крупного рогатого скота.

Сущность предложенного способа состоит в следующем.

Лунки планшета с выросшим монослоем культуры клеток 3-4 раза отмывают фосфатно-буферным раствором (pH 7,2-7,4), фиксируют ацетоном, отмывают буфером, наносят на монослой специфическую сыворотку в рабочем разведении 1:64 - 1:128 в объеме 0,10-0,12 мл, инкубируют 1,5-2 ч при температуре 36-37°C, отмывают, наносят 0,10-0,12 мл антивидового иммуноферментного коньюгата, состоящего из меченных пероксидазой хрена антител к иммуноглобулинам специфической сыворотки крови крупного рогатого скота, инкубируют при тех же условиях, отмывают и после добавления субстратной смеси 0,10-0,12 мл проводят учет результатов реакции через 30-40 минут на наличие вируса под световым микроскопом. Способ можно также проводить на предметных стеклах.

Пример 1

На первом этапе реакции лунки планшета отмывали от ростовой среды фосфатным буфером pH 7,2, фиксировали ацетоном. Затем на монослой клеток наносили автоматической пипеткой по 0,1 мл гипериммунную сыворотку к вирусу диареи в титре 1:64, инкубировали в термостате 1,5 ч при 36°C, затем отмывали от несвязавшихся антител и вносили 0,10-0,12 мл антивидовой иммуноферментный коньюгат, состоящий из антивидовых иммуноглобулинов, меченных пероксидазой хрена. Планшет инкубировали в термостате при 36°C - 1,5 ч и вновь отмывали фосфатно-буферным раствором. Затем наносили по 0,1 мл субстратной смеси, состоящей из раствора 5-аминосалилициловой кислоты и перекиси водорода. Планшет просматривали под световым микроскопом. Результат учитывали через 30 мин по появлению в цитоплазме клеток образовавшегося реакционного продукта от коричневого до светло-коричневого цвета.

В качестве контроля вместо гипериммунной сыворотки применяли отрицательную сыворотку.

Для контроля реакции при том же режиме обрабатывали культуру клеток неконтаминированную вирусом диареи.

Проведено 7 опытов по разработке способа выявления контаминации культуры клеток вирусом диареи крупного рогатого скота иммунопероксидазным методом с положительным результатом.

В контрольных препаратах окрашивание отсутствовало.

Пример 2

Реакцию проводили аналогично примеру 1.

На первом этапе реакции лунки планшета отмывали от ростовой среды фосфатным буфером pH 7,2, фиксировали ацетоном. Затем на монослой клеток наносили автоматической пипеткой по 0,1 мл гипериммунную сыворотку к вирусу диареи в титре 1:128, инкубировали в термостате 2 ч при 37°C, затем отмывали от несвязавшихся антител и вносили антивидовой иммуноферментный коньюгат, состоящий из антивидовых иммуноглобулинов, меченных пероксидазой хрена. Планшет инкубировали в термостате при 37°C 2 ч и вновь отмывали фосфатно-буферным раствором. Затем наносили по 0,1 мл субстратной смеси, состоящей из раствора 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода. Планшет просматривали под световым микроскопом. Результат учитывали через 40 мин по появлению в цитоплазме клеток образовавшегося реакционного продукта от коричневого до светло-коричневого цвета. Контроль аналогичен примеру 1.

Проведено 5 опытов по выявлению контаминации культуры клеток вирусом диареи крупного рогатого скота иммунопероксидазным методом с положительным результатом.

В контрольных препаратах окрашивание отсутствовало.

Предложенный способ чувствителен и специфичен, в лабораторных условиях выявляет нецитопатогенные штаммы вируса диареи. Прост в исполнении, не трудоемок, не требует специального оборудования.

Предложенный способ, используя набор специфических сывороток к различным возбудителям, позволяет значительно сократить время на выявление контаминации культуры клеток.

Совершенствование системы контроля, направленного на предотвращение биологического загрязнения, является чрезвычайно важным этапом в производстве биологических препаратов (вакцин, диагностикумов и др.).

Предложенный способ выявления контаминации культур клеток вирусом диареи крупного рогатого скота иммунопероксидазным методом испытан с положительным результатом в 2014 году в лаборатории вирусологии ФГБНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко.

В связи с вышеизложенным проблема совершенствования системы контроля скрытой контаминации вирусами клеточных линий, используемых в лабораторной практике и биологической промышленности, направлена на предотвращение биологического загрязнения и является чрезвычайно важным этапом в производстве вакцин и диагностикумов. Этот способ может быть использован в целях сертификации на отсутствие вирусов во вновь поступающих культурах клеток.

Способ практически легко осуществим для контроля клеточных культур на содержание в них вирусов и рекомендуется для широкого использования как в научно-исследовательских и практических вирусологических лабораториях, так и в производстве при изготовлении диагностикумов и вакцин.

Источники информации

1. Информационный бюллетень, «Клеточные культуры». М.: ВИЭВ, 2011, вып. 27, стр. 80-88.

2. Российский ветеринарный журнал. «Сельскохозяйственные животные», М.: 2013, 1, стр. 15-18.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ выявления контаминации вирусами культуры клеток иммунопероксидазным методом, включающий взаимодействие антигена с мечеными антителами в неинфицированной культуре клеток и учет результатов реакции по интенсивности окрашивания образовавшегося комплекса под микроскопом. При этом в реакции используют планшеты с анализируемой культурой клеток, контаминированной вирусом диареи, и после внесения в лунки планшета специфической гомологичной сыворотки по 0,10-0,12 мл в разведении 1:64 - 1:128 инкубируют, отмывают, далее вносят по 0,10-0,12 мл антивидовой иммуноферментный коньюгат, состоящий из меченных пероксидазой хрена антител против глобулинов сыворотки крови крупного рогатого скота, инкубируют, отмывают, вносят субстратную смесь, состоящую из 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода, и через 30-40 минут проводят учет результатов под световым микроскопом по образованию коричневого окрашивания в вируссодержащих клетках. Изобретение позволяет усовершенствовать систему контроля скрытой контаминации вирусами клеточных линий, используемых в лабораторной практике и биологической промышленности. Изобретение позволяет предотвратить биологическое загрязнение и является чрезвычайно важным этапом в производстве вакцин и диагностикумов. Этот способ может быть использован в целях сертификации на отсутствие вирусов во вновь поступающих культурах клеток. Изобретение является практически легко осуществимым, доступным способом контроля клеточных культур на содержание в них вирусов и может быть рекомендовано для широкого использования как в научно-исследовательских и практических вирусологических лабораториях, так и в производстве при изготовлении диагностикумов и вакцин. 2 пр.

Способ выявления контаминации вирусами культуры клеток иммунопероксидазным методом, включающий взаимодействие антигена с мечеными антителами в неинфицированной культуре клеток и учет результатов реакции по интенсивности окрашивания образовавшегося комплекса под микроскопом, при этом в реакции используют планшеты с анализируемой культурой клеток, контаминированной вирусом диареи, и после внесения в лунки планшета специфической гомологичной сыворотки по 0,10-0,12 мл в разведении 1:64 - 1:128 инкубируют, отмывают, далее вносят по 0,10-0,12 мл антивидовой иммуноферментный коньюгат, состоящий из меченных пероксидазой хрена антител против глобулинов сыворотки крови крупного рогатого скота, инкубируют, отмывают, вносят субстратную смесь, состоящую из 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода, и через 30-40 минут проводят учет результатов под световым микроскопом по образованию коричневого окрашивания в вируссодержащих клетках.