Способ стимуляции репаративного ангиогенеза и регенерации соединительной ткани, при её повреждении, методом генной терапии с использованием видоспецифичных генов белковых факторов vegf и fgf2, в ветеринарии, и генетическая конструкция для реализации заявленного способа Российский патент 2017 года по МПК A61K31/7088 A61K48/00 A61P19/00 C12N15/86 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а также биохимии, а конкретно к лекарственным препаратам, содержащим генетический материал, для создания генно-терапевтического лекарственного препарата для лечения повреждений и заболеваний, вызванных повреждением соединительной ткани (в данном случае препарат был применен для лечения сухожилия и связки) при травмах опорно-двигательного аппарата и ортопедических заболеваний у животных. В заявленном техническом решении способ и генетическая конструкция реализована на примере видоспецифичных генов для применения при лечении лошади домашней (Equus ferus caballus). Способ может быть использован для стимуляции репаративного ангиогенеза и регенерации соединительной ткани, при ее повреждении, в ветеринарной медицине и медицине человека, с оговоркой, что в каждом конкретном случае будут использованы видоспецифичные для конкретно вида животного гены белковых факторов, указанных в заявленном способе.

На дату подачи заявленного технического решения существует проблема повышения эффективности лечения травм соединительной ткани и/или заболеваний опорно-двигательного аппарата человека и животных. Особенно, решение указанной проблемы представляется актуальным как для спортивных лошадей, так и для других млекопитающих, имеющих специфические особенности жизнедеятельности, например несущих повышенную физическую нагрузку, и связанные с высоким риском травмирования сухожилий и/или связок или других видов соединительной ткани, т.к. в заявленном техническом решении заложена общая идея способа проведения стимуляции репаративного ангиогенеза и регенерации соединительной ткани, методом генной терапии, для всех животных имеющих соединительную ткань в составе своего организма, а как частный случай для лечения сухожилий и/или связок, которые, как известно, являются одним из видов соединительной ткани [17].

Заявителем проведен анализ существующего уровня техники по научной и патентной информации в области лечения травм и заболеваний опорно-двигательного аппарата животных и в особенности млекопитающих, а именно более детально лошадей и выявлен ряд аналогов.

Традиционно в лечении травм и заболеваний опорно-двигательного аппарата используются общеизвестные методы, например иммобилизация гипсовыми и полимерными повязками, с предоставлением животному отдыха от физических нагрузок, хирургическое лечение (остеосинтез, сшивание поврежденных связок и сухожилий).

Кроме указанных методов для улучшения качества лечения и ускорения реабилитации также традиционно применяют нестероидные противовоспалительные средства, глюкокортикостероиды, физиотерапию (лазеротерапия, магнитотерапия, массаж) [1]. А также хирургическое лечение, которое часто не дает желаемого результата и сопряжено с рисками анестезии и длительным послеоперационным периодом восстановления.

Применение существующих терапевтических и физиотерапевтических методик малоэффективно и не приводит к долгосрочному положительному эффекту [2, 3].

Из исследованного уровня техники выявлены другие методики лечения повреждений соединительной ткани, а именно сухожилий и связок. Например метод регенерации соединительной ткани с использованием аутологичных мезенхимных стволовых клеток (МСК). Сущность этого известного метода заключается во введении в зону повреждения выращенных из подкожной жировой клетчатки мезенхимных стволовых клеток (МСК), аутологичных клеток лошади, которые после выращивания в лаборатории на искусственных средах, вводят в зону повреждения соединительной ткани (сухожилия и связки). При этом указанным методом восстановления сухожилий и связок достигается значительный положительный результат [5, 6]. Однако указанный метод имеет существенные недостатки, которые накладывают существенные ограничения в применении, т.к. для его реализации требуется производить стерильный забор ткани подкожной жировой клетчатки у самого животного, например у лошади, далее следует транспортировать ткань в клеточную лабораторию для выращивания клеток МСК, после чего их (выращенные клетки) следует транспортировать обратно в клинику, где проводят инъекцию этих клеток в зону повреждения соединительной ткани животного. При этом, следует обратить внимание на то, что выращивание клеток МСК довольно длительная процедура по времени и занимает порядка 1-2 недели, что также является ограничительным фактором данного метода, кроме указанного необходимо иметь собственно лабораторию для выращивания МСК лошади и не все организации и практикующие врачи смогут себе это позволить, что также делает процедуру неприменимой в условиях только медицинской клиники и ведет к существенному удорожанию процедуры лечения лошади.

Из исследованного уровня техники выявлена широко известная PRP-терапия (тромбоцитотерапия) - этот метод заключается в использовании аутологичной (собственной) крови лошади и занимает порядка 1-2 часов, указанный метод отличается от предыдущего тем, что в указанном случае производят забор крови животного, а не подкожной жировой клетчатки (как в предыдущем методе). Тромбоцитотерапия может быть проведена как в условиях стационара, так и на выезде и занимает порядка 30-40 минут. Однако для ее проведения требуется специализированное оборудование: центрифуги, стерильные специальные емкости для отбора крови, разделения форменных элементов крови друг от друга и обогащения плазмы крови тромбоцитами при центрифугировании. Эта методика также успешно применяется и приводит к существенному восстановлению ткани сухожилия и связки, после ее применения [6, 8, 9]. Несмотря на то что данная методика проще в исполнении, чем метод описанный выше с применением МСК, но этот метод приводит к более слабо выраженной и более длительной регенерации соединительной ткани (сухожилий и связок) лошади, и по эффективности значительно уступает методике с применением МСК. Главным недостатком указанного метода является необходимость забора довольно большого объема крови лошади, порядка 600-1000 мл, и необходимость наличий специального оборудования - центрифуги для разделения элементов крови и обогащения тромбоцитами плазмы крови.

Известен способ стимулирования репаративного ангиогенеза с применением аналогичной генетической конструкции, с теми же генами белковых факторов VEGF и FGF2, но видоспецифичных для человека [16]. Сущностью указанного способа является генетическая конструкция на основе двухкассетной плазмиды pBudk-VEGF-FGF2, одновременно экспрессирующей комбинацию двух генов: ангиогенного фактора роста кровеносных сосудов VEGF и фактора роста фибробластов FGF2, видоспецифичных в данном случае для человека. При этом, указанный способ применяется исключительно для стимуляции репаративного ангиогенеза и является достаточно близким к заявленному способу по достигаемому результату именно и только в области ангиогенеза. Также известно применение этих белковых факторов для регенерации нервной ткани человека [19].

Недостатками данных способов является использование именно генов белковых факторов роста кровеносных сосудов VEGF и фактора роста фибробластов FGF2 видоспецифичных для человека. Также эти способы отличается от предложенного нами по точке применения. Использование этой конструкции приводило к выраженному сильному ангиогенезу и восстановлению трофического кровобращения в тканях у людей, больных хронической ишемией нижних конечностей. Однако применение данной генетической конструкции приведенным способом не представляется возможным при лечении повреждений у других животных.

Из исследованного заявителем уровня техники в качестве прототипа, по наибольшему количеству совпадающих признаков и достигаемому техническому результату, выбран способ стимулирования регенерации связки и кости с помощью генетических конструкций [10], сущность известного способа является то, что способ осуществляется посредством генетической конструкции, а именно когда в область поврежденной ткани вводят вектор на основе двухкассетной плазмиды pBudk-VEGF-BMP2, одновременно экспрессирующей комбинацию двух генов, а именно ангиогенного фактора роста кровеносных сосудов VEGF и костного морфогенного белка ВМР2, в данном случае видоспецифичных для собаки, которые приводят к увеличению эффективности восстановления повреждения связок и костей. Известный способ отличается от заявленного тем, что в нем использован ген белкового фактора ВМР2, а в заявленном способе использован ген другого фактора, а именно FGF2. При этом следует акцентировать, что указанный прототип предназначен исключительно для лечения связок и костей и только для повреждений в которых обязательно присутствует костная ткань. Кроме указанных, недостатков известного способа является то, что указанная генетическая конструкция несет гены видоспецифичные для собаки, вследствие чего она не применима для использования в организме любых других животных кроме как у собаки, вследствие риска возникновения негативных иммунных реакций. Из выше приведенных недостатков известного способа, наиболее существенным является не возможность его применения при повреждении тканей, в которых отсутствует поврежденная костная ткань, в противном случае негативным эффектом применение данной конструкции в известном способе может быть спонтанное (неконтролируемое) образование костной ткани и как следствие рост костной ткани в месте где ее (костной ткани) в норме не должно быть.

В отношении недостатков свойственным известному способу с применением указанной генетической конструкции, является содержание в своем составе генов факторов ответственных за регенерацию и формирование одновременно соединительной и костной ткани. Наличие фактора ВМР2 может приводить к остеофикации соединительной ткани (сухожилий и связок) - по данным литературы [4], что делает невозможным применение фактора ВМР2 для регенерации только сухожилий и связок, а также других участков тканей, не содержащих в своем составе костной ткани.

Целью заявленного технического решения является устранение недостатков прототипа и создание способа стимуляции репаративного ангиогенеза и регенерации соединительной ткани, при ее повреждении, методом генной терапии с использованием видоспецифичных генов белковых факторов VEGF и FGF2, в медицине, а именно;

- обеспечение полного восстановление поврежденной ранее ткани,

- обеспечение применения способа и препарата для регенерации широкого спектра (для всех типов) соединительной ткани,

- повышение эффективности и технологичности процедуры излечения лошади посредством использования заявленного технического решения.

Заявленный способ, в целом обеспечивает возможность реализации принципиально нового подхода к стимуляции репаративного ангиогенеза и регенерации соединительной ткани посредством генно-терапевтического подхода, связанного с использованием видоспецифичных (для конкретного вида животного) генов белковых факторов VEGF и FGF2. В конечном счете, реализация заявленного технического решения обеспечивает универсальную возможность по созданию новой генетической конструкции, и подход по ее применению в медицине с целью стимуляции репаративного ангиогенеза и регенерации соединительной ткани, при ее повреждении, у любого вида животного.

Дополнительными целями вытекающими из реализованных выше целей заявленного технического решения являются:

- значительное сокращение временного интервала излечения лошади,

- снижение материальных затрат на излечение.

По статистике, около 40% лошадей, выступающих на соревнованиях, ежегодно получают травмы соединительной ткани сухожилий и связок. При этом нередко повреждение сухожилия и/или связки спортивной лошади приводит к окончанию ее спортивной карьеры. В лучшем случае предстоит длительное 9-12 месяцев восстановление сухожилия и связки традиционными известными методами [18]. Заявителем достигнуто увеличение скорости регенерации соединительной ткани сухожилия и связки с использованием заявленного технического решения (с помощью генно-терапевтического подхода) в 2,5 раза при высоком функциональном качестве регенерированной ткани. Реальный клинический случай проведенный на спортивной лошади показал факт того, что после проведенного заявителем лечения заявленным генно-терапевтическим препаратом, успешно выступила на соревнованиях уже через 4-х месяцев после проведения однократной терапии.

Сущность заявленного технического решения заключается в способе стимуляции репаративного ангиогенеза и регенерации соединительной ткани, при ее повреждении и/или заболевании, в ветеринарии, заключающийся в том, что его выполняют введением в организм лошади генно-инженерной ДНК-конструкции, в которую клонированы гены, кодирующие экспрессию видоспецифичных для лошади белковых факторов, а именно сосудистого эндотелиального фактора роста изоформы 164 (VEGF164) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2). Способ по п. 1 характеризуется тем, что генно-инженерая ДНК-конструкция выполнена в виде плазмидной конструкций, способ по п. 1. характеризуется тем, что генно-инженерная ДНК-конструкция выполнена в виде вирусного вектора либо вирусных частиц, способ по п. 1. характеризуется тем, что генно-инженерная ДНК-конструкция выполнена в виде двухкассетной экспрессионной плазмиды pBud, экспрессирующий антиогенный фактор (сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF164) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2) лошади, способ по п. 1-4, отличающийся тем, что для реализации способа используют фармацевтическую композицию, содержащую генетическую ДНК-конструкцию в эффективном количестве и фармацевтически допустимые вспомогательные вещества, а также возможно вирусы, микроорганизмы или клетки, генетическая ДНК-конструкция SEQ ID NO: 1 характеризующаяся тем, что для реализации способа по п. 1 используют двухкассетную экспрессионную плазмидную ДНК-конструкцию, созданную на базе вектора pBudCE4.1, в котором клонированы видоспецифично кодон-оптимизированные гены, кодирующие экспрессию видоспецифичных для лошади домашней (Equus ferus caballus) белковых факторов, а именно сосудистого эндотелиального фактора роста изоформы 164 (VEGF164) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2).

Заявленное техническое решение поясняется Фиг. 1-8, соответственно, где на Фиг. 1-4 показана эффективность применения заявленного технического решения. А на Фиг. 5-8 поэтапно показ процесс применения заявленного способа на конкретном клиническом случае лечения повреждения соединительной ткани связки спортивной лошади.

Где:

Фиг. 5 - Фото ультразвукового исследования конечности.

Фиг. 6 - Схема места повреждения медиальной ножки поддерживающей связки.

Фиг. 7 - Фото процесса набора в шприц раствора препарата генетической ДНК-конструкции для введения в поврежденную связку.

Фиг. 8 - Фото введения препарата в поврежденную связку.

Дополнительные материалы к заявке - последовательность генетической ДНК-конструкции SEQ ID NO: 1 на 3 листах (расшифровка генетической последовательности нуклеотидов генетической плазмидной ДНК-конструкции).

Далее представлено детальное описание Фиг. 1-4.

На Фиг. 1 - фото электрофореза плазмидной ДНК в 0,8% агарозном геле: 1 - препарат плазмидной ДНК pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2, 2 - плазмидная ДНК после рестрикции SacI и EcoRI, 3 - ДНК маркер ThermoScientific (кол-во пар оснований цепи ДНК, соответствующее каждому бэнду маркера указано справа от каждого бэнда). Из приведенной фотографии видно, что super coil форма плазмидной ДНК идет при электрофорезе примерно на уровне 3500 пар оснований (далее п. о.) линейного маркера, что соответствует ее молекулярной массе (дорожка 1). После рестрикции, наибольший фрагмент идет на уровне 5000 п. о. примерно, что доказывает соответствие молекулярной массе созданной генетической плазмидной ДНК-конструкции дорожка 2). Данная фотография является свидетельством того, что заявителем получена требуемая ДНК-конструкция.

На Фиг. 2 - фото иммунофлуоресцентного анализа экспрессии VEGF164 и FGF2 в клетках линии HEK 293 FT через 48 часов после трансфекции, где:

А - контроль: клетки НЕК 293 FT без проведения трансфекции плазмидной ДНК, ядра окрашены DAPI (синие, локализация показана белой стрелкой).

Д - контрольная экспрессия EGFP (зеленый, локализация показана белой стрелкой) в клетках НЕК 293 FT, трансфицированных pEGFPN2, ядра окрашены DAPI (синие, локализация показана белой стрелкой).

Б, В, Г - клетки НЕК 293 FT, трансфицированные pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2:

Б - окрашивание с помощью первичных антител кролика к VEGF и вторичных антител осла к иммуноглобулину G кролика, конъюгированных с флуоресцентной меткой Alexa fluor 555 (красный, локализация показана белой стрелкой), ядра окрашены DAPI (синие, локализация показана белой стрелкой).

В - окрашивание с помощью первичных антител кролика к FGF2 и вторичных антител осла к иммуноглобулину G кролика, конъюгированных с флуоресцентной меткой Alexa fluor 488 (зеленый, локализация показана белой стрелкой), ядра окрашены DAPI (синие, локализация показана белой стрелкой).

Г - совместное наложение окрашиваний VEGF (красный, локализация показана белой стрелкой) и FGF2 (зеленый, локализация показана белой стрелкой), ядра клеток окрашены DAPI (синие, локализация показана белой стрелкой).

Указанное фото является подтверждением успешного проведения иммунофлуоресцентного анализа экспрессии VEGF164 и FGF2 в клетках животных. Это служит свидетельством, что требуемые белковые факторы, с созданной ДНК-конструкции, успешно экспрессируются, соответственно обнаруживаются в клетках, и является подтверждением полной функциональной активности созданной плазмидной ДНК-конструкции.

На Фиг. 3 - фото анализа экспрессии белков VEGF164 и FGF2 методом иммуноблоттинга в клетках линии HEK293FT после трансфекции. Электрофорез в 12% SDS-PAGE геле по методу Лэммли. Антитела к актину (42 кДа), VEGF (21 кДа) и FGF2 (18 кДа). М - маркер GE LifeSciences RPN756E; Еc - клетки HEK293FT, трансфицированные pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2; Contr - нетрансфицированные клетки.

Указанное фото (также как и предыдущее, сделанное другим методом) дополнительно подтверждает экспрессию белковых факторов VEGF164 и FGF2 с созданной ДНК-конструкции в клетках животных. Что также подтверждает полную функциональную активность созданной ДНК-конструкции.

На Фиг. 4 - приведено фото ультразвуковых снимков (УЗИ-исследования) ткани поврежденного сухожилия (медиальной ножки поддерживающей связки лошади) до применения препарата pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2 и после применения препарата соответственно.

Где:

А - До применения препарата pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2: поперечная и продольная проекции медиальной ножки поддерживающей связки в зоне ЗС лошади на ультразвуковом снимке (стрелка показывает анэхогенную и гипоэхогенную зону повреждения).

Б - Поперечная и продольная проекции здоровой латеральной ножки поддерживающей связки зоне 3С этой же лошади на ультразвуковом снимке (состояние в норме)

В - Поперечная и продольная проекции медиальной ножки поддерживающей связки в зоне 3С лошади на ультразвуковом снимке на 112 сутки после применения препарата pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2 (стрелка показывает явно уменьшенную гипоэхогенную зону повреждения).

На данной фотографии показана ультразвуковая картина структуры соединительной ткани поврежденной, в норме, и после применения препарата созданной нами ДНК-конструкции. В части фотографии (В) показано значительное уплотнение структуры связки за счет новообразованной ткани в зоне бывшего повреждения, через 112 дней после применения препарата. Новообразованная структура ткани затянула собой зону повреждения, и регенерированная связка практически не отличается от нормальной здоровой ткани. Из чего следует эффективное действие созданного генно-терапевтического препарата в организме животного в условиях реального клинического применения, т.е. обеспечивается именно регенерация ткани, а не заживление повреждения путем образования соединительнотканного рубца.

Реализацию данного способа осуществляли посредством создания конкретной генно-терапевтической конструкции pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2 с целью применения именно в организме лошади домашней (Equus ferus caballus). На примере регенерации соединительной ткани сухожилия и связки. Данная полученная генетическая конструкция обладает высокой эффективностью в отношении стимуляции репаративного ангиогенеза и регенерации соединительной ткани.

В заявленном техническом решении используется генетическая конструкция (в данном случае искусственная плазмидная ДНК-конструкция), экспрессирующая одновременно кодон-оптимизированные гены vegfl64 и fgf2 белковых факторов VEGF164 и FGF2 видоспецифичных (в данном случае) для лошади. Конструкция может применяться для терапии самостоятельно по п. 1, либо быть использована в составе фармацевтической композиции по п. 2, в медицине для стимуляции репаративного ангиогенеза и регенерации соединительной ткани (в данном случае сухожилия и связки), при ее повреждении и заболевании опорно-двигательного аппарата у животного (в данном случае лошади). Принцип: получают генно-инженерную конструкцию на основе двухкассетной экспрессионной плазмиды pBud, экспрессирующей ангиогенный фактор (сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF164) и фактор роста фибробластов 2 (FGF2) лошади. Полученная конструкция самостоятельно в виде стерильного раствора в воде или в физиологическом растворе, либо в составе фармацевтической композиции вводится непосредственно в область повреждения, за этим следует спонтанная самопроизвольная трансфекция клеток окружения и экспрессия в них генов vegf и fgf2, после процессинга с мРНК этих генов, синтезируются белки факторов VEGF164 и FGF2, проявляющие свою нормальную биологическую активность. Преимущества метода: генно-инженерная конструкция pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2 обладают высокой биобезопасностью за счет использования плазмидной ДНК, которая не встраивается в геном клетки. Белковые препараты обладают короткой продолжительностью действия за счет их быстрого расщепления протеазами организма, в то время как плазмидная ДНК внедряется в собственные клетки организма в зоне повреждения, заставляя их самих относительно продолжительно вырабатывать терапевтические белки, постоянно поддерживая их высокие концентрации. Объединение генов vegf и fgf2 в одной плазмиде позволяет осуществлять одновременную стимуляцию ангио- и тендиногенеза (регенерация сухожилий и связок), влияя на один из важных аспектов регенерации соединительной ткани - рост кровеносных сосудов, на который положительное влияние оказывает фактор VEGF. Видоспецифичность для лошади генно-инженерной конструкции позволяет минимизировать нежелательные негативные иммунологические реакции, которые могут возникать при использовании не видоспецифичных для лошади факторов из-за различии в строении белков лошади и других животных. Что не позволяет использовать ранее апробированные и успешно применяющиеся для лечения человека препараты в области ветеринарной медицины лошади [11]. К представляемому изобретению наиболее близко совокупности совпадающих признаков и достигаемым техническим результатам относится композиция для стимулирования регенерации связки и кости с помощью генетических конструкций [10], и методы с использованием мезенхимных стволовых клеток, стволовых клеток красного костного мозга и плазмы крови обогащенной тромбоцитами [6, 8].

Таким образом, использование pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2 обеспечивает реализацию цели заявленного технического решения - стимуляцию репаративного ангиогенеза и регенерацию соединительной ткани (сухожилий и связок), при ее повреждении, методом генной терапии с использованием видоспецифичных генов белковых факторов VEGF и FGF2, обладающих проангиогенным и протендиногенным действием, доставляемых в составе генно-инженерной ДНК-конструкции. Работы по использованию прямой генной терапии, с использованием генно-инженерных конструкций, в частности плазмидной ДНК с генами экспрессирующими факторы VEGF164 и FGF2 в терапевтическом ангиогенезе и для регенерации ткани сухожилия и связки у лошади не проводятся нигде в мире, и до этого не проводились. А также, в настоящее время в литературе отсутствуют данные о разработке генотерапевтических препаратов на основе видоспецифичных генов vegf и fgf2 для ветеринарного применения. Следует отметить, что заявителем, из исследованного уровня техники по базам данных РФ и зарубежным базам данных не выявлены запатентованные способы лечения, основанные на регенеративном восстановлении соединительной ткани (сухожилий и связок) у лошади при ортопедических повреждениях.

Более детально, сущность заявленного технического решения заключается в том, что способ стимуляции регенерации сухожилий и связок при ортопедическом повреждении и заболеваниях опорно-двигательного аппарата у лошади, заключается в том, что для стимуляции используется генетическая конструкция по п. 1 либо по п. 2, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:l, экспрессирующая одновременно гены vegfl64 и fgf2, являющиеся видоспецифичными для лошади, которые могут быть использованы в составе фармацевтической композиции по п.2, и применены в ветеринарной медицине для лечения травм и заболеваний опорно-двигательного аппарата у лошади.

В заявленном техническом решении «Способ стимуляции репаративного ангиогенеза и регенерации соединительной ткани, при ее повреждении, методом генной терапии с использованием видоспецифичных генов белковых факторов VEGF и FGF2, в медицине, и генетическая конструкция для реализации заявленного способа», а именно в генетической ДНК-конструкции использованы гены белковых факторов VEGF и FGF2, видоспецифичные для лошади. Что, при применении данной конструкции, обеспечивает возможность ускорения процесса репаративного ангиогенеза в процессе регенерации соединительной ткани сухожилий и связок. Процесс ангиогенеза при регенерации соединительной ткани сухожилия и связки является процессом необходимым для регенерации, и представляет собой первый этап регенерации повреждения сухожилия и связки при котором вновь сформированные в процессе ангиогенеза кровеносные капилляры которые обеспечивают доставку в зону повреждения питательных веществ, кислорода и олигопотентных клеток предшественников соединительной ткани, из которых в последствии дифференцируются клетки зрелой ткани сухожилий и связок. Таким образом, использование ангиогенного фактора VEGF в нашей конструкции, способствует ускорению регенерации сухожилий и связок и приводит к образованию новой полноценной ткани, аналогичной по структуре и функциональности здоровой ткани, т.е. обеспечивается регенерация ткани, а не заживление повреждения путем образования соединительнотканного рубца.

Далее заявителем приводится описание известных свойств белковых факторов использованных для реализации заявленного технического решения.

-VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста. У лошади VEGF-A164 (его аналог у человека VEGF-A165), преобладающий член семейства белков VEGF, секретируется различными клетками и является гепарин-связывающей гомодимерной молекулой на дисульфидных связях массой 34-42 кДа. Ген vegfl64a у лошади - в 20 хромосоме и содержит 13410 пар нуклеотидов. Экспрессия vegf регулируется гипоксией. Биологические эффекты VEGF реализуются через мембранные рецепторы. VEGF стимулирует синтез ДНК и пролиферацию клеток, вовлечен в антиапоптотические сигнальные пути. VEGF является хемоаттрактантом для эндотелиальных клеток, поэтому он играет роль в процессах миграции и инвазии. VEGF так же является хемоаттрактантом для гладкомышечных клеток, моноцитов, макрофагов и полиморфоядерных клеток, участвующих в процессе заживления раны. VEGF повышает проницаемость сосудистой стенки в месте травмы, что усиливает формирование грануляционной ткани. VEGF способствует пролиферации и миграции эндотелиоцитов, стимулируя ангиогенез, а также привлекает предшественников эндотелиоцитов из костного мозга, стимулирует деятельность перицитов и стабилизирует формирующиеся сосуды [12].

-FGF2 (он же bFGF или BFGF - basic fibroblast growth factor) - фактор роста фибробластов 2, основной тип фактора из семейства факторов роста фибробластов. Стимулирует пролиферацию клеток, регенерацию нервной, мышечной и соединительной ткани. Имеет сайт связывания гепарина. Ген FGF2 у лошади располагается в 2 хромосоме и содержит 54428 пар нуклеотидов (NCBI Reference Sequence: ХМ_005607924.1) и имеет 5 экзонов. мРНК имеет 525 нуклеотидов (последовательность GenBank: НМ769759.1). Этот фактор проявляет широкий спектр митогенной, и ангиогенной активности, а также является нейротрофическим фактором, который экспрессируется на низком уровне во многих тканях и типах клеток, с наиболее высокой его концентрацией в нервной ткани мозга и гипофиза. FGF2 вовлечен во множество физиологических и патологических процессов, включая развитие конечностей организма и формирование соединительной ткани, ангиогенезис, заживление ран при повреждении, и рост опухолей [13]. В нормальной ткани FGF2 присутствует в базальной мембране эпителия и в субэндотелиальном внеклеточном матриксе кровеносных сосудов. Он остается мембраносвязанным до тех пор, пока не происходит образования сигнального пептида. Была выдвинута гипотеза, что во время заживления ран и развития опухолей, действие гепаринсульфат деградирующих ферментов активирует FGF2, что опосредует формирование новых кровеносных сосудов, запуская процесс ангиогенеза. Кроме того, этот фактор синтезируется и секретируется адипоцитами. Также в ходе изучения свойств FGF2 было показано, что FGF действует на преостеобласты, усиливая их пролиферацию, после связывания фактора с FGF рецептором-1 и активации фосфоинозитид-3 киназы [14].

Цели достигнуты за счет того, что получают экспрессионную плазмидную ДНК pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2, содержащую последовательности кДНК, кодирующие видоспецифичные для лошади гены vegf сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF164) и fgf2 фактора роста фибробластов 2, соединенные в единую конструкцию. Использование данного препарата пДНК следует в форме суперскрученной формы плазмидной ДНК (super coil формы плазмидной ДНК), для наиболее эффективного попадания пДНК генной конструкции в клетки и ядра клеток, где она будет экспрессироваться. Для этого существуют различные методики выделения пДНК, которые дают выход преимущественно super coil формы (более 95-98% от общей выделенной плазмидной ДНК).

Для достижения высокой биологической безопасности экспрессии трансгена оптимально использование плазмидной ДНК для доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки, т.к. она не встраивается в геном.

Основные элементы последовательности конструкции:

Промотор CMV 11-627 Последовательности Козак 695-698 и 4439-4442 Сайты Gateway а«В1 и atfBII 670-694 и 1888-1911 Ген есfgf2 699-1887 Ген устойчивости к канамицину 2189-3231 Промотор EF1-α 3247-4414 Сайты рестрикции HindIII и XbaI 4433-1438 и 5016-5021

Ген ecvegf164 4443-5015

Первый этап

Для создания конструкции используют экспрессионный вектор pBudCE4.1 (Invitrogen, Catalog #V532-20, США), в качестве основы, в котором последовательность гена устойчивости к зеоцину и его промотор заменены на последовательность гена устойчивости к канамицину.

Кодонную оптимизацию состава генов vegf и fgf2 проводят, например, с использованием алгоритма OptimumGene или другого. В качестве матрицы для кодонной оптимизации берут нуклеотидные последовательности мРНК генов vegfl64 лошади (GenBank: NM_001081821) и fgf2 лошади (GenBank: НМ769759.1).

Синтез de novo нуклеотидной последовательности кодон оптимизированных последовательностей кДНК vegf164 лошади и fgf2 лошади осуществляют, на оборудовании ДНК-синтезаторе. Субклонирование генов кДНК в векторную плазмиду pBud4.1CE осуществляют с применением генно-инженерных методик молекулярно клонирования генных ДНК-конструкций, в соответствии с их стандартными протоколами. В результате получили плазмиду pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2 несущую комбинацию генов факторов (ecVEGF164 и ecFGF2), видоспецифичных для лошади.

Проводили электрофоретический анализ пДНК в 0,8% агарозном геле в 0,04 М трис-ацетатном буфере (рН 7,5-7,8) при силе тока 80 мА (обычный метод горизонтального агарозного электрофореза). Результаты фиксировали, например, с помощью системы визуализации Molecular Imager® Gel Doc™ System (BioRad). Для анализа размеров полученных ДНК-фрагментов использовали ДНК-маркер GenRuler Mix (ThermoScientific). Результаты электрофоретического анализа представлены на рисунке 1.

Второй этап

Функциональную активность генетической конструкции подтверждают анализом экспрессии трансгенов vegfl64 и fgf2 in vitro после трансфекции клеток, например, линии HEK-293FT (Invitrogen) генетической конструкцией pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2, видоспецифичной для лошади, с использованием трансфекционного агента, например, TurboFect (Thermo Fisher Scientific Inc.) согласно рекомендациям производителя. Анализ экспрессии рекомбинантных белков проводят с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (VEGF и FGF2), иммуноблоттинга (VEGF и FGF2) и иммуноферментного анализа (VEGF).

Для иммунофлуоресцентного анализа клетки линии HEK-293FT трансфицируют генетическими конструкциями с помощью TurboFect, результат оценивают через 48 часов с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, например, AxioObserver Zl (Carl Zeiss, Германия). Показали положительную реакцию с поликлональными антителами кролика к VEGF и FGF2. Результаты флуоресцентной микроскопии представлены на рисунке 2.

Иммуноблоттинг с клеточными лизатами через 48 часов после трансфекции проводят по системе Laemmli в денатурирующих условиях (SDS-PAGE). Электрофорез в полиакриламидном геле проводят в 12% разделяющем и 7% концентрирующем геле на приборе, например, Mini-PROTEAN® 3 Cell (Bio-Rad, США) при 150V. Перенос белков из геля на поливинилиденфторидную мембрану осуществляют, например, на приборе Trans-Blot® SDSemi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad, США) при 15W 30 минут.Визуализацию иммунного преципитата проводят с помощью хемилюминесцентного субстрата Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad, США). Результаты фиксируют с помощью BioRadChemiDOC. Показали наличие выраженных полосок, соответствующих ожидаемым молекулярным массам белков актина (42 кДа) (контроль), VEGF164 (21 кДа) и FGF2 (18 кДа). Результаты иммуноблоттинга представлены на рисунке 3.

Методом иммуноферментного анализа количественно оценивают экспрессию рекомбинантного VEGF в супернатантах клеток линии НЕК-293А, трансфицированных пДНК конструкцией pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2 с помощью трансфекцирующего агента TurboFect. Супернатанты собирают через 24 часа после трансфекции. Клеточный детрит удаляют центрифугированием в течение 1 минуты при максимальных оборотах. Супернатант разводят в 10 раз и используют для иммуноферментного определения концентрации VEGF. Концентрацию VEGF в культуральной среде определяют, например, с помощью набора VEGF-ИФА-БЕСТ А-8784 (Вектор, Россия) согласно рекомендациям производителя. Оптическую плотность определяют, например, с использованием многофункционального микропланшетного ридера Infinite М200Рго (Тесап) в двухволновом режиме: основной фильтр 450 нм, референс фильтр 655 нм. Исходя из прямой пропорциональности между величиной оптической плотности и концентрацией VEGF в стандартных образцах, вычисляют концентрацию VEGF в исследуемых образцах, по калибровочной кривой.

Экспрессия VEGF клетками НЕК-293А, трансфицированными pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2, составила 490±60 пг/мл, в контрольном образце - 26±5 пг/мл (отрицательный контроль).

Таким образом, показана экспрессия белков VEGF164 и FGF2 с полученной генетической конструкции pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2 после трансфекции ею клеток млекопитающих.

Третий этап

Функциональная активность и эффективность технического решения исследована на клиническом примере, в условиях медицинской клиники. Регенеративное действие препарата на соединительную ткань (в данном случае сухожилия и связки) было исследовано на примере ортопедического повреждения у успешной выездковой 13-летней чистокровной лошади. Мерин с хромотой неизвестного происхождения, которая длилась более 10 дней. При клиническом осмотре животного можно было заметить хромоту на переднюю левую конечность, как на твердом, так и на мягком грунте. Это было заметно как на шагу, так и на рыси. Степень хромоты лошади оценили 3/5 (проводилась 5-балльная методика классификации хромоты лошади, предложенная Американской ассоциацией конских ветеринаров-практиков (ААЕР - American Association of Equine Practitioners) [15]. Проба на сгибание путового сустава - явно положительная (+++). При рыси на кругу (на корде) выявили усиление хромоты на переднюю левую конечность. Диагностическая четырехточечная проводниковая блокада пальмарных пальцевых нервов на уровне путового сустава была положительна, из чего можно сделать вывод что причина хромоты животного лежит в путовой области. При пальпации лошади можно было заметить утолщение, отек с внутренней стороны путовой области. Рентгенологическое исследование не показывало изменений на костной и суставной части путовой области лошади. Ультразвуковое исследование лошади проводилось в соответствии с принятыми методами (поперечная и продольная проекции). Был поставлен окончательный диагноз: десмит медиальной ножки поддерживающей связки 2 степени.

Подготовку и введение препарата проводили из сухого лиофилизированного препарата pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2. Сухой препарат в дозе 5 мг хранился при температуре -20С (в морозилке холодильника). Примерно за 12 часов до введения препарат поставили на разморозку при +4°С в холодильник. При этом сухой препарат в пробирке растворили по инструкции 1 мг/мл в физиологическом растворе 0,9% NaCl (т.е. на 5 мг препарата соответственно добавили 5 мл стерильного физраствора). Растворенный препарат поставили на ночь при +4°С в холодильник, периодически перемешивая покачиванием и переворачиванием. Перед самим введением в поврежденную связку, растворенный препарат нагревали до температуры +37°С. От общего объема препарата набирали 3.5 мл и под ультразвуковым контролем и при асептических условиях ввели в поврежденную связку. Набранный объем использовали для обкалывания самого места поврежденной связки и прилегающих здоровых тканей. Обкалывание инъекциями на удалении примерно 1 см друг от друга для равномерного и гарантированного распределения препарата по всей поврежденной ткани. Для лечения повреждения связки применяли только однократное введение препарата. После введения препарата на конечность поставили плотную повязку и предоставили лошади строгий покой в течение 2-х дней, а потом назначили шаговую нагрузку в течение 3-х недель.

На 112 сутки после введения препарата лошадь была осмотрена в клинике. При клиническом осмотре животного хромота на левую грудную конечность отсутствовала при движении по твердому и мягкому грунту, как на шагу, так и на рыси. При ультразвуковом исследовании медиальной ножки в зоне 3С можно заметить, что структура медиальной ножки приближена к нормальной ткани связки. Структура связки была достаточно однородная на всем ее протяжении, места частичного повреждения связки почти не визуализировались. Параллельность сухожильных волокон практически соответствовала норме. По сравнению с тканью связки протяженность гипоэхогенной зоны «коллагеного шрама» в продольном и поперечном размере уменьшилась и составляла 0.25 см². Ультрасонографическое изображение соответствовало практически полному восстановлению поддерживающей связки, т.к. на фото констатируется значительное уменьшение гипоэхогенной зоны в области бывшего повреждения (полное восстановление функции связки). Основываясь на изложенном выше возможно констатировать факт практической реализации в промышленности заявленного технического решения.

Результаты клинического применения препарата pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2 представлены на Фиг. 4.

Таким образом, плазмидная конструкция pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2 не оказывает никакого негативного воздействия при введении ее в организм лошади, в частности в сухожилия и связки, но при этом оказывает положительный эффект на процессы регенерации соединительной ткани.

Приведенный принцип генной терапии генами белковых факторов VEGF164-FGF2 может быть применен в генно-терапевтическом подходе в широком смысле слова, а именно могут быть созданы генно-терапевтические препараты на основе вирусных векторов и вирусных частиц. А также комбинации их и плазмидных вариантов векторов с клетками и клеточными препаратами, для полчения генно-клеточного терапевтического препарата и композиции.

Полученная генно-инженерная конструкция может быть использована самостоятельно как терапертический препарат в виде стерильного раствора в воде или физиологическом растворе. Либо в составе фармацевтических композиций для получения готовых лекарственных форм.

Возможно нанесение полученных конструкций на твердотельные носителя для имплантации в зону повреждения.

Фармацевтическая композиция может содержать трансфицирующий реагент для in vivo трансфекции.

Фармацевтические композиции для стимуляции ангио- и тендиногенеза (регенерации сухожилия и связки) у лошади могут содержать генно-инженерную конструкцию pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2 в эффективных количествах и фармацевтически допустимые вспомогательные вещества.

Растворы, содержащие генно-инженерную конструкцию pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2, для последующего получения фармацевтических композиций и готовых лекарственных форм могут быть получены стандартными молекулярно-генетическими методами выделения и очистки ДНК, известных специалисту в области биотехнологии.

Готовые лекарственные формы pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2 должны быть пригодны для проведения генной терапии и не должны приводить к существенному изменению свойств самого плазмидного ДНК препарата при продолжительном хранении. Возможными готовыми лекарственными формами могут выступать замороженный или жидкий раствор, лиофилизат раствора, различные твердотельные носители с лиофилизированным покрытием.

Предпочтительными вариантами готовой лекарственной формы являются жидкий раствор или лиофилизат, поскольку они могут храниться в стандартных холодильниках при температуре от -20°С до +4°С, и помимо растворения не требуют значительного времени и манипуляций для подготовки препарата к введению.

Также предпочтительным вариантом готовой лекарственной формы могут являться твердотельные носители с лиофилизированным покрытием плазмидной ДНК, которые могут быть использованы для замещения тканевого дефекта.

Для получения лиофилизата в качестве вспомогательных веществ могут быть использованы криопротектанты и наполнители, такие как: сахароза, лактоза, трегалоза, маннитол, сорбитол, глюкоза, раффиноза, поливинилпирролидон или их сочетания. В качестве стабилизатора рН может быть использован цитрат натрия, фосфат натрия, Трис-НС1, Трис-ацетат, глицин и другие аминокислоты. Лиофилизат предполагается получать из изотонического раствора очищенной плазмидной ДНК с концентрацией 0,1 до 10 мг/мл, криопротектором и стабилизатором рН (рН 7,0-9,0) и хранить при температуре от +2°С до +8°С.

Способ применения фармацевтической композиции заключается во введении ее животному соответствующего вида таким способом и в таком количестве, которые обеспечат лечебный эффект в зависимости от нозологической формы и медицинских показаний.

Фармацевтическая композиция может вводиться местно внутрисухожильно, или в место повреждения соединительной ткани животного, при помощи инъекции, имплантации твердотельных носителей, в виде генно-клеточной трансплантации после in vitro обработки различных аутологичных клеток, например мезенхимных, сосудисто-стромальной фракции, миобластов, остеобластов, хондробластов, тендинобластов, фибробластов и др. Могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как в результате исследований заявителем не обнаружены технические решения, обладающие совокупностью заявленных признаков, приводящих к реализации поставленных целей. Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как для специалиста в указанной области техники полученные технические результаты не являются очевидными.

Заявленное техническое решение может быть реализовано в любой медицинской клинике, либо на выезде в полевых или домашних условиях с использованием стандартных процедур, оборудования и расходных материалов, что доказывает соответствие заявленного технического решения критерию «промышленная применимость», кроме указанного в материалах заявки представлены Фото 1-4, и цветные фотографические изображения полученные в процессе реализации способа на повреждении соединительной ткани лошади домашней.

Литература

1. Foerner, J.J. Orthopedic-Surgery in the Racehorse / J.J.Foerner, C.W. Mcilwraith // Veterinary Clinics of North America-Equine Practice. - 1990. - Vol. 6, №1. - P. 147-177.

2. Jha, A. Why are fractures often fatal for racehorses? / A.Jha // The Guardian. - 2006.

3. Zekas, L.J.. Results of treatment of 145 fractures of the third metacarpal/metatarsal condyles in 135 horses (1986-1994) / Zekas, L.J., Bramlage, L.R., Embertson, R.M., Hance, S.R. // Equine Vet J. - 1999. - Vol. 31, №4. - P. 309-313.

4. Marie PJ, Debiais F, (2002). "Regulation of human cranial osteoblast phenotype by FGF-2, FGFR-2 and BMP-2 signaling". Histol. Histopathol. 17 (3): 877-85.

5. Geburek F, Lietzau M, Effect of a single injection of autologous conditioned serum (ACS) on tendon healing in equinenaturally occurring tendinopathies. Stem Cell Res Ther. 2015 Jun 26; 6:126.

6. Kovac M.: Новые методы диагностики и лечения заболеваний сухожилий лошади. Конный мир 1-2, 2009.

7. Kovac М.: Регенеративная медицина в лечении ортопедических заболевания лошадей. Конный мир, 3, 2012.

8. Ковач М.: Ортопедические заболевание лошадей. Современные методы диагностики и лечения. Королевский издательский дом, 2013.

9. Ковач М. Применение плазмы, обогащенной тромбоцитами при лечении повреждения сухожилия глубокого сгибателя пальца. Современная ветеринарная медицина, 1, 25-34,2014.

10. Случай применения генных конструкций с vegf и bmp2 в ветеринарии при восстановлении передней крестообразной связки у собаки крупной породы / Е.Ю. Закирова, Н.Н. Васин, М.Н. Журавлева, А.А. Ризванов // Гены и клетки. - 2014. - Том 9, №2. - С. 93-95.

11. Chirino, A.J. Minimizing the immunogenicity of protein therapeutics / AJ.Chirino, M.L. Ary, S.A. Marshall // Drug Discov Today. - 2004. - Vol.9, №2. - P. 82-90.

12. Byrne, A.M.. Angiogenic and cell survival functions of vascular endothelial growth factor (VEGF) / A.M. Byrne, D.J. Bouchier-Hayes, J.H. Harmey // J Cell Mol Med. - 2005. - Vol. 9, №4. - P. 777-794.

13. Lee TJ, Jang J, Kang S, Jin M, Shin H, Kim DW, Kim BS (Jan 2013). "Enhancement of osteogenic and chondrogenic differentiation of human embryonic stem cells by mesodermal lineage induction with BMP-4 and FGF2 treatment". Biochemical and Biophysical Research Communications 430 (2): 793-7.

14. Kühn MC, Willenberg HS, Schott M, Papewalis C, Stumpf U, Flohé S, Scherbaum WA, Schinner S (Feb 2012). "Adipocyte-secreted factors increase osteoblast proliferation and the OPG/RANKL ratio to influence osteoclast formation". Molecular and Cellular Endocrinology349 (2): 180-8.

15. Mitchell JS. Lameness and performance evaluation in ambulatory practice. Vet Clin North Am Equine Pract.; 28(l):101-15.2012

16. Первые результаты клинического применения прямой генной терапии VEGF и bFGF при лечении пациентов с хронической ишемией нижних конечностей. М.В. Плотников, А.А. Ризванов, Р.Ф. Масгутов, М.О. Мавликеев, И.И. Салафутдинов, И.М. Газизов, Ю.Д. Романова, И.И. Шамсутдинова, А.А. Богов, А.В. Максимов, А.П. Киясов. Практическая медицина. - 2013. - Т.2., №1-2 (69). - С. 123-125.

17. Кузнецов С., Мушкамбаров Н., "Гистология, цитология и эмбриология". Медицинское информационное агентство. ISBN 5-89481-238-0; 2007 г.

18. Электронный ресурс: http://socialvet.ru/blog/vet-horses/2743.html

19. Патент РФ (RU 2558294) «Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида, способ стимуляции регенерации периферического нерва, способ лечения поврежденного нерва человека».

Предложенная группа изобретений относится к области медицины и ветеринарии. Предложен способ стимуляции репаративного ангиогенеза и регенерации соединительной ткани при ее повреждении и/или заболевании введением в организм лошади генно-инженерной ДНК-конструкции, в которую клонированы гены, кодирующие экспрессию видоспецифичных для лошади белковых факторов VEGF164 и FGF2. Предложена генетическая ДНК-конструкция SEQ ID NO: 1 для реализации вышеуказанного способа. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективные средства и методы стимуляции репаративного ангиогенеза и регенерации соединительной ткани. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 пр.

1. Способ стимуляции репаративного ангиогенеза и регенерации соединительной ткани, при ее повреждении и/или заболевании, в ветеринарии, заключающийся в том, что его выполняют введением в организм лошади генно-инженерной ДНК-конструкции, в которую клонированы гены, кодирующие экспрессию видоспецифичных для лошади белковых факторов, а именно - сосудистого эндотелиального фактора роста изоформы 164 (VEGF164) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2).

2. Способ по п. 1, характеризуется тем, что генно-инженерая ДНК-конструкция выполнена в виде плазмидной конструкций.

3. Способ по п. 1, характеризуется тем, что генно-инженерная ДНК-конструкция выполнена в виде вирусного вектора либо вирусных частиц.

4. Способ по п. 1, характеризуется тем, что генно-инженерная ДНК-конструкция выполнена в виде двухкассетной экспрессионной плазмиды pBud, экспрессирующей ангиогенный фактор (сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF164) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2) лошади.

5. Способ по пп. 1-4, отличающийся тем, что для реализации способа используют фармацевтическую композицию, содержащую генетическую ДНК-конструкцию в эффективном количестве и фармацевтически допустимые вспомогательные вещества, а также возможно вирусы, микроорганизмы или клетки.

6. Генетическая ДНК-конструкция SEQ ID NO: 1, характеризующаяся тем, что для реализации способа по п. 1 используют двухкассетную экспрессионную плазмидную ДНК-конструкцию, созданную на базе вектора pBudCE4.1, в котором клонированы видоспецифично кодон-оптимизированные гены, кодирующие экспрессию видоспецифичных для лошади домашней (Equus ferus caballus) белковых факторов, а именно - сосудистого эндотелиального фактора роста изоформы 164 (VEGF164) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2).