ПРИМЕНЕНИЕ АДАМАНТАНСОДЕРЖАЩИХ ИНДОЛОВ И ИХ ГИДРОХЛОРИДОВ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗ И БЛОКАТОРОВ NMDA-РЕЦЕПТОРОВ Российский патент 2017 года по МПК C07D209/86 C07D209/88 C07D471/04 A61K31/403 A61K31/437 A61K31/435 A61P25/00 

Изобретение относится к применению химических соединений в области медицины и может быть использовано при производстве лекарственных препаратов для улучшения памяти и когнитивных функций, ослабленных, в том числе при деменциях различного происхождения, особенно вследствие нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (БА).

Исследования последнего десятилетия показали, что ослабление памяти и когнитивных функций, как и некоторые другие нейропатологические расстройства, тесно связаны с дисфункцией в холинергических и глутаматергических нейромедиаторных системах [Mufson, Е. J., Counts, S. Е., Perez, S. Е. & Ginsberg, S. D. Cholinergic system during the progression of Alzheimer's disease: therapeutic implications. Expert review of neurotherapeutics 2008, 8, 1703-1718; Cacabelos, R., Takeda, M. & Winblad, B. The glutamatergic system and neurodegeneration in dementia: preventive strategies in Alzheimer's disease. International journal of geriatric psychiatry 14, 3-47 (1999)].

Перспективным современным подходом к терапии комплексных, мультифакторных заболеваний, к которым относятся нейродегенеративные расстройства, в том числе болезнь Альцгеймера (БА), является создание мультитаргетных лигандов, взаимодействующих с несколькими мишенями, ответственными за патогенез.

Дефицит центрального ацетилхолина играет важную роль в развитии ослабления памяти и расстройств когнитивных функций - основного симптома болезни Альцгеймера (БА) и деменций другого происхождения. Применение ингибиторов ацетилхолинэстеразы (АХЭ) - основного фермента, гидролизующего нейромедиатор ацетилхолин, повышает концентрацию ацетилхолина и приводит к умеренным улучшениям памяти и когнитивных функций пациентов, страдающих БА [Wilkinson, D. G., Francis, Р. Т., Schwam, Е. & Payne-Parrish, J. Cholinesterase inhibitors used in the treatment of Alzheimer's disease: the relationship between pharmacological effects and clinical efficacy. Drugs & aging, 2004, 21, 453-478].

Эти соединения, однако, вызывают нежелательные побочные эффекты, такие как тошнота и рвота. Ингибирование бутирилхолинэстеразы (БХЭ) также способствует улучшению памяти и когнитивных функций при деменциях различного происхождения [Martinez A, Castro A. Novel cholinesterase inhibitors as future effective drugs for thetreatment of Alzheimer's disease. Expert Opin. Investig. Drugs, 2006, 15, 1-12], Ингибирование БХЭ особенно продуктивно при прогрессе заболеваний, когда активность АХЭ снижена и ее функции по гидролизу ацетилхолина принимает на себя БХЭ [Lane, R. М., Potkin, S. G. & Enz, A. Targeting acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in dementia. Int J Neuropsychopharmacol. 2006, 9, 101-124]. Селективные ингибиторы БХЭ, как показали исследования последних лет, повышают уровень ацетилхолина в мозге и улучшают когнитивные функции у грызунов, не оказывая при этом классических побочных эффектов ингибиторов АХЭ [Greig NH, Utsuki Т, Ingram DK, Wang Y, Pepeu G, Scali C, Yu QS, Mamczarz J, Holloway HW, Giordano T, Chen D, Furukawa K,

Sambamurti K, Brossi A, Lahiri DK. Selective butyrylcholinesterase inhibition elevates brain acetylcholine, augments learning and lowers Alzheimer beta-amyloid peptide in rodent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102 (47), 17213-17218].

Известно, что некоторые индол-содержащие соединения (карбазолы, гамма-карболины) обладают способностью ингибировать холинэстеразы, при этом их активность и селективность зависят существенно от структуры заместителей и структуры соединения в целом [Kumar NS, Mukherjee PK, Bhadra S, Saha BP, Pal ВС. Acetylcholinesterase inhibitory potential of a carbazole alkaloid, mahanimbine, from Murraya koenigii. Phytother. Res. 2010, 24(4), 629-631; Akrami H, Mirjalili BF, Khoobi M, Moradi A, Nadri H, Emami S, Foroumadi A, Vosooghi M, Shafiee A. 9H-Carbazole Derivatives Containing the N-Benzyl-1,2,3-triazole Moiety as New Acetylcholinesterase Inhibitors. Arch Pharm (Weinheim). 2015, 348(5), 366-374].

Однако перечисленные соединения обладают недостаточным терапевтическим действием и не нашли своего применения в терапевтических целях.

В качестве соединений, обладающих способностью ингибировать холинэстеразы, в терапии БА в настоящее время используют производное пиперидина донепезил (арисепт), карбамат ривастигмин (экселон) и алкалоид галантамин [Wilkinson D.G., Francis Р.Т., Schwam, Е., Payne-Parrish, J. Cholinesterase inhibitors used in the treatment of Alzheimer's disease: the relationship between pharmacological effects and clinical efficacy. Drugs & aging 2004, 21, 453-478].

В то же время современные подходы к лечению ослабления памяти и нарушения когнитивных функций требуют применения лекарственных средств более широкого спектра действия, учитывающих мультифакторную природу таких заболеваний. Кроме того, одним из недостатков применяемых для лечения БА ингибиторов холинэстераз является их способность ингибировать карбоксилэстеразу (КЭ), которая гидролизует многочисленные лекарственные препараты со сложноэфирными группами, что приводит к нежелательным лекарственным взаимодействиям. [Tsurkan L.G, Hatfield M.J., Edwards С.С., Hyatt J.L., Potter P.M. Inhibition of human carboxylesterases hCE1 and hiCE by cholinesterase inhibitors. Chem. Biol. Interact. 2013, 203, 226-230].

Известно применение в клинической практике в качестве лекарственного препарата для улучшения памяти и когнитивных функций при лечении болезни Альцгеймера блокаторов NMDA рецепторов, в качестве которого используют мемантин, относящийся к группе адамантансодержащих соединений. [Lipton SA. Paradigm shift in neuroprotection by NMDA receptor blockade: memantine and beyond. Nat Rev Drug Discov. 2006, 5(2), 160-170]

Однако мемантин взаимодействует только с участком связывания МК-801 NMDA рецептора, что также не отвечает современным требованиям применения лекарственных средств более широкого спектра действия, учитывающих мультифакторную природу таких заболеваний.

Предлагаемое изобретение решает задачу расширение арсенала мультитаргетных средств, которые могут быть использованы в качестве новых препаратов, сочетающих в себе свойства ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA рецепторов, взаимодействующих с несколькими мишенями, ответственными за улучшение памяти и когнитивных функций, ослабление которых имеет различное происхождение.

Настоящее изобретение относится к применению в качестве в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов адамантансодержащего индола или его гидрохлорида, общей формулы 1,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄: могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, F, О, Br, (С₁-С₆) алкил, (С₁-С₆) алкокси;

R₅, R₆ могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, (С₁-С₆) алкил, ONO₂;

X представляет СН₂СН(ОН)СН₂ или СН₂СН₂С(O);

Z = нет, Cl;

R₇, R₈, R₉, R₁₀ могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, F, О, Br, (С₁-С₆) алкил, C₁-С₆) алкокси;

R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄, R₁₅, R₁₆, R₁₇, R₁₈ могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, (С₁-С₆) алкил.

Среди соединений формулы 1 предпочтительными в качестве в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов являются следующие 2 группы соединений, которые могут быть представлены формулами 1.1 и 1.2, приведенными ниже.

В частности, первой группой предпочтительных соединений формулы 1 являются адамантансодержащий индол или его гидрохлорид общей формулы 1.1,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, Z, Y имеют значения, определенные выше для формулы 1.

В рамках адамантансодержащих индолов и их гидрохлоридов группы 1.1 наиболее предпочтительными в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов являются адамантансодержащий карбазол или его гидрохлорид общей формулы 1.1.1,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R, Z, R₇, R₈, R₉, R₁₀ имеют значения, определенные выше для формулы 1.

В рамках подгруппы 1.1.1 наиболее предпочтительными являются

1-(адамантан-1-иламино)-3-карбазол-9-ил-пропан-2-ол - соединение 1;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-дибром-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 2;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-дихлор-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол соединение 3;

3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-1-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол соединение 4;

1-(3,6-дибромкарбазол-9-ил)-3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-пропан-2-ол - соединение 5

3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-1-(3,6-дихлоркарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 6;

1-(адамантан-1-иламино)-3-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 7;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-дибром-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 8;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-дихлор-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 9;

3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-1-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 10;

1-(3,6-дибромкарбазол-9-ил)-3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 11;

3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-1-(3,6-дихлоркарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 12.

Второй подгруппой наиболее предпочтительных в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов являются адамантансодержащий тетрагидрокарбазол или его гидрохлорид общей формулы 1.1.2,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, Z, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ имеют значения, определенные выше для формулы 1

Предпочтительными соединениями этой подгруппы являются:

1-(адамантан-1-иламино)-3-(1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 13;

1-(3,5-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 14;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(6-метил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 15;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(6-метил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 16;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 17;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 18;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-диметил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 19;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(3,6-диметил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 20;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 21;

1-(3,5-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 22;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(6-метил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 23;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(6-метил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 24;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 25;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 26;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-диметил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 27;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(3,6-диметил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 28;

Третьей подгруппой соединений формулы 1.1 наиболее предпочтительными в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов являются адамантансодержащий гамма-карболин или его гидрохлорид общей формулы 1.1.3,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, Z, R₁₅, R₁₆, R₁₇, R₁₈ имеют значения, определенные выше для формулы 1.

Предпочтительными соединениями этой подгруппы являются:

1-(адамантан-1-ил)-3-(2,8-диметил-3,4-дигидро-1Н-пиридо[4,5-b]индол-5-ил)-пропан-2-ол - соединение 29;

1-(адамантан-1-ил)-3-(2,8-диметил-3,4-дигидро-1Н-пиридо[4,5-b]индол-5-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 30.

Второй группой предпочтительных соединений формулы 1 являются адамантансодержащий индол или его гидрохлорид общей формулы 1.2,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, Z, Y имеют значения, определенные выше для формулы 1.

Среди соединений формулы 1.2 предпочтительными в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов являются следующие 3 подгруппы соединений, которые могут быть представлены формулами 1.2.1, 1.2.2 и 1.2.3, приведенными ниже.

Первую подгруппу предпочтительных адамантансодержащих индолов группы 1.2 составляют адамантансодержащий карбазол общей формулы 1.2.1,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀ имеют значения, определенные выше для формулы 1.

Предпочтительными соединениями этой подгруппы являются:

N-(адамантан-1-ил)-3-карбазол-9-ил-пропионамид - соединение 31;

N-(3,5-диметил-адамантан-1-ил-3-карбазол-9-ил)-пропионамид - соединение 32.

Вторую подгруппу предпочтительных в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов адамантансодержащих индолов группы 1.2 составляют адамантансодержащий карбазол общей формулы 1.2.2,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄, имеют значения, определенные выше для формулы 1.

Предпочтительным соединением в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1.2.2 является

N-адамантан-1-ил-3-(3,4-дигидро-1H-карбазол-9-ил-пропионамид - соединение 33.

Третью подгруппу предпочтительных в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов адамантансодержащих индолов группы 1.2 является адамантансодержащий карбазол общей формулы 1.2.3.

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, Z, R₁₅, R₁₆, R₁₇, R₁₈ имеют значения, определенные выше для формулы 1.

В качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1.2.3 предпочтительно применяют одно из следующих соединений

1-(адамантан-1-ил)-3-(2,8-диметил-3,4-дигидро-1Н-пиридо[4,5-b]индол-5-ил)-пропионамид - соединение 34;

1-(адамантан-1-ил)-3-(2,8-диметил-3,4-дигидро-1Н-пиридо[4,5-b]индол-5-ил)-пропионамид гидрохлорид - соединение 35.

Таким образом, техническим эффектом предлагаемой группы соединений является обнаружение у известных соединений свойств мультитаргетных препаратов, сочетающих в себе свойства ингибиторов бутирилхолинэстеразы с IC₅₀ порядка 10^-6 М (IC₅₀ - концентрация соединения, которая требуется для снижения активности фермента на 50%) при слабом ингибировании ацетилхолинэстеразы, и блокаторов NMDA рецепторов с величинами IC₅₀ того же порядка (IC₅₀ - концентрация соединения, которая требуется для уменьшения связывания меченного лиганда с рецептором на 50%), что позволяет использовать их в качестве препаратов, существенно усиливающих память и когнитивных функции.

Ранее было показано, что соединения, к которым относятся соединения формулы 1, обладают как свойством стабилизации микротрубочек и могут быть предназначены для лечения и предупреждения заболеваний, связанных с нарушениями системы микротрубочек (заявка на изобретение №2015146079, приоритет от 27.10.15), так и свойством цитопротекции и могут быть предназначены для лечения и предупреждения заболеваний, связанных с увеличением цитозольной концентрации кальция (заявка на изобретение №2015146080, приоритет от 27.10.15)

В результате проведенных биологических испытаний обнаружено новое, ранее не известное свойство соединений общей формулы 1: способность ингибировать холинэстеразы (АХЭ и БХЭ) и блокировать NMDA рецепторы (как МК-801, так и участок связывания ифенпродила), что не вытекает из структуры самого соединения.

Стратегия рационального дизайна мультитаргетных препаратов основывается на связывании через линкер двух фармакофоров, проявляющих активность в отношении двух различных молекулярных мишеней [Youdim М.В., Buccafusco J.J. Multi-functional drugs for various CNS targets in the treatment of neurodegenerative disorders. Trends Pharmacol. Sci. 2005, 26, 27-35; Zhang H.Y. One-compound-multiple-targets strategy to combat Alzheimer's disease. FEBS Lett. 2005, 579, 5260-5264].

Однако подбор пар фармакофоров не является предсказуемым и зависит от структуры новой молекулы в целом. Сохранение свойств обеих составляющих частей в новой молекуле зависит как от структуры каждой из частей, так и от структуры линкера.

Таким образом, обнаружение новых неожиданных свойств соединения формулы 1, придает всему изобретению соответствие критериям «новизна» и «изобретательский уровень». Синтез соединений 1 проводят известными способами, описанными в заявках на изобретение №2015146079 и №2015146080, что придает всему изобретению соответствие критерию «промышленная применимость».

В таблице 1 приведены данные, характеризующие ингибиторную активность конъюгатов общей формулы 1 в отношении АХЭ, БХЭ и КЭ и их действие на связывание меченых лигандов [3H]MK-801 и [3H]ифенпродила с различными участками NMDA рецептора.

На Фиг. 1 приведены зависимости ингибиторной активности соединения 10 в отношении БХЭ от концентрации субстрата, полученные для 3-х возрастающих концентраций ингибитора.

Производные адамантансодержащих замещенных индолов общей формулы 1, обладающие заявленными свойствами, можно получить (заявка на изобретение №2015146079, приоритет от 27.10.15), путем объединения через заявляемый молекулярный спейсер (коньюгации) индольной и аминоадамантановой составляющих, соответствующих заявляемому составу. Процесс получения соединений общей формулы 1.1 проводят нагреванием эквимольной смеси соответствующих замещенных индолов и аминоадамантанов в растворителе (этанол, пропанол, изо-пропанол) при температуре 79-90°C в течение 2-6 часов. Для получения гидрохлоридов адамантансодержащих индолов соответствующие адамантансодержащие индолы растворяют в 10%-ом растворе HCl в изопропаноле.

Процесс получения соединений общей формулы 1.2 проводят нагреванием эквимольной смеси соответствующих замещенных индолов и аминоадамантанов в диметилсульфоксиде или диметилфорамиде в присутствии катализатора, выбранного из ряда: метилат натрия, третбутилат калия, гидроокись калия или фторид цезия цезия, при температуре 100-140°C в течение 2-12 часов.

Ниже приведены результаты биологических испытаний соединений общей формулы 1, которые иллюстрируют, но не исчерпывают настоящее изобретение.

Пример 1. Определение ингибиторной активности соединений общей формулы 1 в отношении ацетилхолинэстеразы, бутирилхолинэстеразы и карбоксилэстеразы.

Препараты ферментов: Для кинетических исследований используют коммерческие препараты («Sigma», США) ацетилхолинэстеразы эритроцитов человека (АХЭ, КФ 3.1.1.7), бутирилхолинэстеразы сыворотки лошади (БХЭ, КФ 3.1.1.8) и карбоксилэстеразы печени свиньи (КЭ, КФ 3.1.1.1), которая имеет высокую гомологию, сходное строение активного центра и близкую ингибиторную специфичность с карбоксилэстеразой печени человека hCE-1 [Satoh Т., Hosokawa М. The mammalian carboxylesterases: from molecules to functions. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1998, 38, 257-288].

Определение активности ферментов: Активность АХЭ и БХЭ определяют методом Эллмана (λ 412 нм) [Ellman G.L et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity, Biochem. Pharmacol. 1961, 7, 88-95] с использованием в качестве субстрата ацетилтиохолина (1 мМ) и бутирилтиохолина (1 мМ), соответственно; условия определения: 0.1 М фосфатный буфер pH 7.5, 25°C. Активность КЭ определяют спектрофотометрически по выделению 4-нитрофенола (λ 405 нм), субстрат - 4-нитрофенилацетат (1 мМ); условия определения: 0.1 М фосфатный буфер pH 8.0, 25°C [Sterri S.H. et al. A radiochemical assay method for carboxylesterase, and comparison of enzyme activity towards the substrates methyl [1-¹⁴C] butyrate and 4-nitrophenyl butyrate, Biochem. Pharmacol. 1985, 34(15), 2779-2785]. Измерения проводят на микропланшетном спектрофотометре FLUOStar Optima (Labtech, Germany).

Определение величин IC₅₀ для ингибирования АХЭ, БХЭ и КЭ.

Первичную оценку ингибиторной активности соединений проводят путем определения степени ингибирования ферментов при концентрации соединения 20 мкМ, затем для наиболее активных соединений определяют величины IC₅₀ - концентрации соединения, которые требуются для снижения активности фермента на 50%. Для определения IC₅₀ ингибирования АХЭ, БХЭ и КЭ образец соответствующего фермента инкубируют с исследуемым соединением (концентрация ДМСО 2 об. %) в течение 10 минут, затем определяют остаточную активность фермента. Диапазон концентраций исследуемого соединения составляет 1×10^-12 - 1×10^-4 М. Каждый эксперимент проводят в трипликате. Измерения проводят в 96-луночных планшетах на микропланшетном спектрофотометре FLUOStar Optima (BMG Labtech, Germany). Вычисление IC₅₀ проводят с использованием программы Origin 6.1. (см. Таблицу 1).

Как видно из Таблицы 1, и соединения группы 1.1 и соединения группы 1.2 демонстрируют высокую селективность в отношении БХЭ по сравнению с АХЭ. Данные о слабой ингибиторной активности соединений в отношении карбоксилэстеразы, которая гидролизует многие лекарственные препараты, содержащие сложноэфирные группы [Imai Т. Human carboxylesterase isozymes: catalytic properties and rational drug design. Drug Metab Pharmacokinet. 2006, 21(3), 173-185], указывают на отсутствие нежелательных лекарственных взаимодействий при терапевтическом применении заявляемых соединений.

Пример 2. Определение механизма ингибирования БХЭ соединением общей формулы 1 и расчет кинетических констант ингибирования.

Для выяснения механизма ингибирования определяют зависимость остаточной активности БХЭ от концентрации ингибитора при различных концентрациях субстрата. Данные анализируют в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка. Механизм ингибирования определяют из анализа зависимостей 1/V=f(1/S), полученных для трех возрастающих концентраций ингибитора. Вычисление кинетических констант ингибирования K_i (конкурентная составляющая) и αK_i (неконкурентная составляющая) проводят с использованием программы Origin 6.1.

Пересечение прямых зависимостей 1/V=f(1/S) у соединения 10 (Фиг. 1), полученных для разных концентраций ингибитора, в левом верхнем квадранте свидетельствуют о смешанном типе ингибирования БХЭ исследуемым соединением. Определены константы ингибирования БХЭ соединением 10, которые составляют K_i=2.11±0.17 мкМ (конкурентная компонента) и αK_i=8.48±0.38 мкМ (неконкурентная компонента).

Пример 3. Определение связывания соединений общей формулы 1 с NMDA рецепторами.

Радиоактивные лиганды: Использовались два радиоактивных лиганда: [³Н]MK-801 (дизоцилпин) с удельной активностью 210 Ки/моль, связывающийся со всеми выделенными NMDA рецепторами, и [³H]ифенпродил с удельной активностью 79 Ки/моль, связывающийся только с NMDA рецепторами, содержащими NR2B субъединицы (меченые лиганды получены из Института молекулярной генетики РАН).

Методика приготовления препарата мембран головного мозга для радиолигандного анализа.

Мембранный препарат для радиолигандного анализа готовили по известному методу [Nowak G., Trullas R., Layer R.T., Skolnick P., Paul I.A. Adaptive changes in the N-methyl-D-aspartate receptor complex after chronic treatment with imipramine and 1-aminocyclopropanecarboxylic acid. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1993, 265, 1380-1386]. Ткань гиппокампа измельчали в гомогенизаторе Поттера («тефлон-стекло») в буфере №1 (5 мМ HEPES/4.5 мМ Трис буфера, pH 7.6), содержащего 0.32 М сахарозы, в соотношении 1 г ткани: 10 мл буфера. Гомогенат разбавляли буфером для исследования №2 (5 мМ HEPES/4.5 мМ Трис буфера, pH 7.6) в соотношении 1:50 и центрифугировали 10 мин при 1000 g. Затем отбирали супернатант и вновь центрифугировали 20 мин при 25000 g. Осадок гомогенизировали в буфере №2 в соотношении 1:50 и центрифугировали 20 мин при 8000 g. Супернатант и его мягкий, зыбкий надосадочный слой отбирали и центрифугировали 20 мин при 25000 g. Полученный осадок суспендировали в буфере №3 (5 мМ HEPES/4.5 мМ Трис буфера, pH 7.61, 1 мМ Na₄EDTA), и суспензию вновь центрифугировали. Такая процедура отмывки проводится четыре раза, причем при последней отмывке Na₄EDTA исключается из состава. Конечный осадок ресуспендировали в буфере №2 в соотношении 1:5 и хранили в жидком азоте. Реакционная смесь (конечный объем 0.5 мл) содержит 200 мкл буфера №2, 50 мкл 50 нМ р-ра меченого лиганда и 250 мкл белковой суспензии. Неспецифическое связывание определяется в присутствии 50 мкл 1 М немеченого лиганда.

Проведение исследований

Радиолигандное связывание меченных соединений с препаратами мембран мозга проводили по методам [Zhou L.M., Gu Z.Q., Costa A.M., Yamada K.A., Mansson P.E., Giordano Т., Skolnick P., Jones K.A. (2S,4R)-4-methylglutamic acid (SYM 2081): a selective, high-affinity ligand for kainate receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997, 280, 422-427; Coughenour L.L., Barr B.M. Use of trifluoroperazine isolates a [(3)H]Ifenprodil binding site in rat brain membranes with the pharmacology of the voltage-independent ifenprodil site on N-methyl-D-aspartate receptors containing NR2B subunits. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001, 296, 150-159].

Реакционная смесь инкубируется при комнатной температуре в течение 2 ч. По окончании инкубации пробы фильтруются через стекловолокнистые фильтры GF/B (Whatman), предварительно смоченные в 0.3% полиэтиленамине в течение 2 часов при 4°C. Каждая пробирка промывается один раз холодным буфером №2, затем фильтры промываются три раза тем же объемом буфера. Фильтры сушатся на воздухе до полного высыхания и переносятся в сцинтилляционные флаконы, в которые добавляется по 5 мл сцинтилляционной жидкости, содержащей 4 г дифенилоксазола (РРО), 0.2 г дифенилоксазоилбензола (РОРОР) и 1 л толуола. Радиоактивность определяли на сцинтилляционном счетчике TriCarb2800 TR (PerkinElmer, Packard, США) с эффективностью счета около 65%.

Влияние изучаемых соединений на связывание [³Н]MK-801 или [³Н]ифенпродила с мембранами гиппокампа крысы характеризовали величинами IC₅₀. Определение IC₅₀ (концентрация соединения, которая требуется для уменьшения связывания меченного лиганда с рецептором на 50%) проводили путем добавления в инкубационную среду 50 мкл исследуемых соединений в диапазоне концентраций 10^-7-10^-3 М. По результатам ингибирования рассчитывали IC₅₀ для изученных соединений с помощью программы GraphPadPrism 4 Demo (см. Таблицу 1).

В случаях, когда ингибирование исследуемыми веществами в концентрации 100 мкМ не превышало 50%, значение величины IC₅₀ не определялось (н/о).

В Таблице 1 представлены данные о блокаде соединениями ифенпродильного сайта и сайта связывания МК-801 NMDA-рецепторов.

Как видно из Таблицы 1, и соединения группы 1.1 и соединения группы 1.2 обладают кроме способности блокады сайта связывания МК-801, известной у соединения мемантин, относящегося к группе адамантанов, дополнительной способностью более эффективно блокировать участок связывания ифенпродила NMDA рецепторов, что усиливает когнитивно-стимулирующие свойства этих соединений по сравнению с соединениями, которые только блокируют сайт связывания МК-801 [Higgins G.A., Ballard Т.М., Enderlin М., Haman М., Kemp J.A. Evidence for improved performance in cognitive tasks following selective NR2B NMDA receptor antagonist pre-treatment in the rat. Psychopharmacology (Berl). 2005, 179(1), 85-98].

Таким образом, приведенные примеры подтверждают достижение заявляемого эффекта - обнаружение у адамантансодержащих индолов и их гидрохлоридов, общей формулы 1, преимуществ по сравнению с известными средствами, улучшающими память и когнитивные функции, за счет одновременного воздействия на несколько мишеней, ответственных за это назначение. При использовании данных соединений эффект достигается по двум механизмам - путем ингибирования холинэстераз и дополнительной блокады NMDA рецепторов, за счет связывания их как с участком МК-801, так и с участком ифенпродила. При этом они преимущественно ингибируют БХЭ, т.е. не должны вызывать характерных для ингибиторов АХЭ побочных эффектов и, слабо ингибируя карбоксилэстеразу, исключают нежелательные лекарственные взаимодействия при терапевтическом применении заявляемых соединений, что должно привести к усилению терапевтического эффекта и повышает их безопасность.

Изобретение относится к применению адамантансодержащих индолов и их гидрохлоридов общей формулы 1, в которой R₁, R₂, R₃, R₄ могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, F, Cl, Br, (С₁-С₆) алкил, (С₁-С₆) алкокси; R₅, R₆ могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, (С₁-С₆) алкил, ONO₂; X представляет СН₂СН(ОН)СН₂ или СН₂СН₂С(O); Z = нет, Cl; R₇, R₈, R₉, R₁₀ могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, F, Cl, Br, (C₁-C₆) алкил, (C₁-С₆) алкокси; R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄, R₁₅, R₁₆, R₁₇, R₁₈ могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, (С₁-С₆) алкил, в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов, и могут быть использованы в качестве новых препаратов, взаимодействующих с несколькими мишенями, ответственными за улучшение памяти и когнитивных функций, ослабление которых имеет различное происхождение, в том числе при деменциях различного происхождения, особенно вследствие нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (БА). 14 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 3 пр.

,

1. Применение адамантансодержащих индолов или их гидрохлоридов общей формулы 1 в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов

в которой

R₁, R₂, R₃, R₄ могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, F, Cl, Br, (C₁-C₆) алкил, (C₁-C₆) алкокси;

R₅, R₆ могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, (С₁-С₆) алкил, ONO₂;

X представляет СН₂СН(ОН)СН₂ или СН₂СН₂С(O);

Z = нет, Cl;

где R₇, R₈, R₉, R₁₀ могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, F, Cl, Br, (C₁-С₆) алкил, (C₁-С₆) алкокси;

R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄, R₁₅, R₁₆, R₁₇, R₁₈ могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, (С₁-С₆) алкил.

2. Применение соединений по п. 1, в котором в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1 берут адамантансодержащие индолы и их гидрохлориды общей формулы 1.1

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, Z, Y имеют значения, определенные выше для формулы 1.

3. Применение соединений по п. 2, в котором в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1.1 берут адамантансодержащие карбазолы и их гидрохлориды общей формулы 1.1.1

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, Z, R₇, R₈, R₉, R₁₀ имеют значения, определенные выше для формулы 1.

4. Применение соединений по п. 3, в котором в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1.1.1 берут одно из следующих соединений:

1-(адамантан-1-иламино)-3-карбазол-9-ил-пропан-2-ол;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-дибром-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-дихлор-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол;

3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-1-карбазол-9-ил-пропан-2-ол;

1-(3,6-дибромкарбазол-9-ил)-3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-пропан-2-ол;

3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-1-(3,6-дихлоркарбазол-9-ил)-пропан-2-ол;

1-(адамантан-1-иламино)-3-карбазол-9-ил-пропан-2-ол гидрохлорид;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-дибром-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-дихлор-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид;

3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-1-карбазол-9-ил-пропан-2-ол гидрохлорид;

1-(3,6-дибромкарбазол-9-ил)-3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-пропан-2-ол гидрохлорид;

3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-1-(3,6-дихлоркарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид.

5. Применение соединений по п. 2, в котором в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1.1 берут адамантансодержащие тетрагидрокарбазолы и их гидрохлориды общей формулы 1.1.2

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, Z, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ имеют значения, определенные выше для формулы 1.

6. Применение соединений по п. 5, в котором в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1.1.2 берут одно из следующих соединений:

1-(адамантан-1-иламино)-3-(1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол;

1-(3,5-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(6-метил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(6-метил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-диметил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(3,6-диметил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид;

1-(3,5-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(6-метил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(6-метил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-диметил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорида;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(3,6-диметил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид.

7. Применение соединений по п. 2, в котором в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1.1 берут адамантансодержащие гамма-карболины и их гидрохлориды общей формулы 1.1.3

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, Z, R₁₅, R₁₆, R₁₇, R₁₈ имеют значения, определенные выше для формулы 1.

8. Применение соединений по п. 7, в котором в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1.1.3 берут одно из следующих соединений:

1-(адамантан-1-ил)-3-(2,8-диметил-3,4-дигидро-1Н-пиридо[4,5-b]индол-5-ил)-пропан-2-ол;

1-(адамантан-1-ил)-3-(2,8-диметил-3,4-дигидро-1Н-пиридо[4,5-b]индол-5-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид.

9. Применение соединений по п. 1, в котором в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1 берут адамантансодержащие индолы и их гидрохлориды формулы 1.2

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, Z, Y имеют значения, определенные выше для формулы 1.

10. Применение соединений по п. 9, в котором в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1.2 берут адамантансодержащие карбазолы общей формулы 1.2.1

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀ имеют значения, определенные выше для формулы 1.

11. Применение соединений по п. 10, в котором в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1.2.1 берут одно из следующих соединений:

N-адамантан-1-ил-3-карбазол-9-ил-пропионамид;

N-(3,5-диметил-адамантан-1-ил-3-карбазол-9-ил)-пропионамид.

12. Применение соединений по п. 9, в котором в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1.2 берут адамантансодержащие тетрагидрокарбазолы общей формулы 1.2.2

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ имеют значения, определенные выше для формулы 1.

13. Применение соединений по п. 12, в котором в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1.2.2 берут

N-адамантан-1-ил-3-(3,4-дигидро-1H-карбазол-9-ил)-пропионамид.

14. Применение соединений по п. 9, в котором в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1.2 берут адамантансодержащие гамма-карболины и их гидрохлориды общей формулы 1.2.3

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₁₅, R₁₆, R₁₇, R₁₈ имеют значения, определенные выше для формулы 1.

15. Применение соединений по п. 14, в котором в качестве ингибиторов холинэстераз и блокаторов NMDA-рецепторов формулы 1.2.3 берут одно из следующих соединений:

1-(адамантан-1-ил)-3-(2,8-диметил-3,4-дигидро-1Н-пиридо[4,5-b]индол-5-ил)-пропионамид;

1-(адамантан-1-ил)-3-(2,8-диметил-3,4-дигидро-1Н-пиридо[4,5-b]индол-5-ил)-пропионамид гидрохлорид.