СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ НЕКРОБАКТЕРИОЗА ЖИВОТНЫХ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/531 A61K39/114 C12P21/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных.

Известен способ получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных, включающий приготовление питательных сред, посевного материала, культивирования Fusobacterium necrophorum для получения бактериальной массы, выделение из нее антигенной фракции с последующей сенсибилизацией формализованных эритроцитов и получения целевого продукта их отмывкой (Заявка на изобретение РФ №2003120464/13, МПК С12Р 21/00, G01N 33/555, С12Р 21/00, C12R 1:01; опубл. 27.02.2005, бюл. №6).

Недостатком указанного способа является недостаточный срок хранения эритроцитарного антигена.

Техническим результатом изобретения является увеличение срока хранения целевого продукта при сохранении его специфической активности.

Технический результат достигается в способе получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных, включающий приготовление питательных сред, посевного материала, культивирования Fusobacterium necrophorum для получения бактериальной массы, выделение из нее антигенной фракции с последующей сенсибилизацией формализованных эритроцитов и получения целевого продукта их отмывкой тем, что антигенную фракцию получают культивированием производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с последующим отделением бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ и ресуспендированием 0,8-1,2% раствором дезмола до концентрации 4-10 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 55-65 мин при температуре 93-98°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 1,5-3,0 тыс. g, в течение 20-30 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3-0,4% и инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 9-12%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 40-46°C в течение 1,5-2 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры и отмывкой.

Технический результат также достигается в способе получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных тем, что полученную бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ отделяют центрифугированием при 15000-20000 тыс. g, в течение 20-30 мин.

Технический результат также достигается в способе получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных тем, что в качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты баранов, или крупного рогатого скота, или лошадей.

Технический результат также достигается в способе получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных тем, что отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,2-0,3% формалина или 0,1-0,2М фосфатно-буферным раствором с рН 7,2-7,4, содержащим 0,2-0,3% формалина, методом отстоя или центрифугированием при 1,5-3,0 тыс. g, в течение 20-30 мин до полного просветления.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизны».

Все режимы способа осуществимы в промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

Впервые предложен способ эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных, где антигенную фракцию получают культивированием производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с последующим отделением бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ и ресуспендированием раствором дезмола в определенных условиях, что позволило существенно увеличить срок хранения целевого продукта при сохранении его специфической активности, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культуру F. necrophorum подобранного штамма выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 18 ч в анаэробных условиях при 37°C. В процессе культивирования определяют оптическую плотность бактериальной суспензии и рН. Микробную массу осаждают из суспензии в сепараторной центрифуге при 15000 g. Осадок, содержащий бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, ресуспендируют 0,8% раствором дезмола до концентрации 4 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 55 мин при температуре 93°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 1,5 тыс. g, в течение 20 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3% и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 9%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 40°C в течение 1,5 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры. В качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты баранов.

Отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,2% формалина или 0,1М фосфатно-буферным раствором с рН 7,2, содержащим 0,2% формалина, методом отстоя до полного просветления.

Пример 2. Культуру F. necrophorum подобранного штамма выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 24 ч в анаэробных условиях при 38°C. В процессе культивирования определяют оптическую плотность бактериальной суспензии и рН. Микробную массу осаждают из суспензии в сепараторной центрифуге при 20000 g. Осадок, содержащий бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, ресуспендируют 1,2% раствором дезмола до концентрации 10 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 65 мин при температуре 98°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 3,0 тыс. g, в течение 30 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3-0,4% и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 12%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 46°C в течение 2 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры. В качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты баранов.

Отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,3% формалина или ОДМ фосфатно-буферным раствором с рН 7,4, содержащим 0,3% формалина, методом отстоя до полного просветления.

Пример 3. Культуру F. necrophorum подобранного штамма выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 18 ч в анаэробных условиях при 37°C. В процессе культивирования определяют оптическую плотность бактериальной суспензии и рН. Микробную массу осаждают из суспензии в сепараторной центрифуге при 15000 g. Осадок, содержащий бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, ресуспендируют 0,8% раствором дезмола до концентрации 4 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 55 мин при температуре 93°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 1,5 тыс. g, в течение 20 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3% и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 9%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 40°C в течение 1,5 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры. В качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты крупного рогатого скота.

Отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,2% формалина или 0,1М фосфатно-буферным раствором с рН 7,2, содержащим 0,2% формалина, центрифугированием при 1,5 тыс. g, в течение 20 мин до полного просветления.

Пример 4. Культуру F. necrophorum подобранного штамма выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 24 ч в анаэробных условиях при 38°C. В процессе культивирования определяют оптическую плотность бактериальной суспензии и рН. Микробную массу осаждают из суспензии в сепараторной центрифуге при 20000 g. Осадок, содержащий бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, ресуспендируют 1,2% раствором дезмола до концентрации 10 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 65 мин при температуре 98°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 3,0 тыс. g, в течение 30 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3-0,4% и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 12%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 46°C в течение 2 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры. В качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты крупного рогатого скота.

Отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,3% формалина или 0,2М фосфатно-буферным раствором с рН 7,4, содержащим 0,3% формалина, центрифугированием при 3,0 тыс. g, в течение 30 мин до полного просветления.

Пример 5. Культуру F. necrophorum подобранного штамма выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 18 ч в анаэробных условиях при 37°C. В процессе культивирования определяют оптическую плотность бактериальной суспензии и рН. Микробную массу осаждают из суспензии в сепараторной центрифуге при 15000 g. Осадок, содержащий бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, ресуспендируют 0,8% раствором дезмола до концентрации 4 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 55 мин при температуре 93°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 1,5 тыс. g, в течение 20 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3% и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 9%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 40°C в течение 1,5 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры. В качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты лошадей.

Отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,2% формалина или ОДМ фосфатно-буферным раствором с рН 7,2, содержащим 0,2% формалина, методом отстоя до полного просветления.

Пример 6. Культуру F. necrophorum подобранного штамма выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 24 ч в анаэробных условиях при 38°C. В процессе культивирования определяют оптическую плотность бактериальной суспензии и рН. Микробную массу осаждают из суспензии в сепараторной центрифуге при 20000 g. Осадок, содержащий бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, ресуспендируют 1,2% раствором дезмола до концентрации 10 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 65 мин при температуре 98°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 3,0 тыс. g, в течение 30 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3-0,4% и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 12%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 46°C в течение 2 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры. В качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты лошадей.

Отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,3% формалина или 0,2М фосфатно-буферным раствором с рН 7,4, содержащим 0,3% формалина, методом отстоя до полного просветления.

Пример 7. Эффективность эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных определяют на белых мышах через 2 года хранения эритроцитарного антигена, полученного согласно примерам 1-6 и прототипа. 50 животных заражают титрованной культурой возбудителя в дозе 10 ЛД₅₀ гомологичного штамма в объеме 0,2 мл под кожу корня хвоста. Диагностику некробактериоза определяют в капельной реакции непрямой гемагглютинации (КРНГА) эритроцитарного антигена на предметном стекле с сывороткой крови исследуемого животного, полученной через 14 суток после их заражения культурой возбудителя. В результате исследования при диагностике эритроцитарным антигеном, полученным согласно примерам 1-6, у всех 50 животных было определено наличие некробактериоза (т.е. подтверждено 100%-ное заражение), в то время при использовании для диагностики эритроцитарного антигена, полученного согласно прототипу, через 2 года хранения, наличие некробактериоза подтвердилось лишь у 20 животных, т.е. только в 40% случаев было подтверждено наличие некробактериоза.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет получать эритроцитарный антиген для диагностики некробактериоза животных, обладающий более длительным сроком хранения с сохранением высокой специфичности.

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано при получении эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных. Для этого получают антигенную фракцию путем культивированием производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с последующим отделением бактериальной массы и ресуспендированием 0,8-1,2% раствором дезмола до концентрации 4-10 млрд/мл микробных тел. Далее прогревают в течение 55-65 мин при температуре 93-98°C и смесь центрифугируют при 1,5-3,0 тыс. g, в течение 20-30 мин. К супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3-0,4% и инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 суток. Затем к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 9-12%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 40-46°C в течение 1,5-2 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры и отмывкой. Использование данного способа - получение эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных - позволяет увеличить срок хранения целевого продукта при сохранении его специфической активности. 3 з.п. ф-лы, 7 пр.

1. Способ получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных, включающий приготовление питательных сред, посевного материала, культивирования Fusobacterium necrophorum для получения бактериальной массы, выделение из нее антигенной фракции с последующей сенсибилизацией формализованных эритроцитов и получения целевого продукта их отмывкой, отличающийся тем, что антигенную фракцию получают культивированием производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с последующим отделением бактериальной массы штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ и ресуспендированием 0,8-1,2% раствором дезмола до концентрации 4-10 млрд/мл микробных тел, прогревают в течение 55-65 мин при температуре 93-98°C, далее реакционную смесь центрифугируют при 1,5-3,0 тыс. g, в течение 20-30 мин, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3-0,4% и инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 суток, далее к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 9-12%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 40-46°C в течение 1,5-2 ч с последующим охлаждением до их комнатной температуры и отмывкой.

2. Способ получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных по п. 1, отличающийся тем, что полученную бактериальную массу штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ отделяют центрифугированием при 15000-20000 тыс. g, в течение 20-30 мин.

3. Способ получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных по п. 1, отличающийся тем, что в качестве формализованных эритроцитов используют формализованные эритроциты баранов, или крупного рогатого скота, или лошадей.

4. Способ получения эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных по п. 1, отличающийся тем, что отмывку целевого продукта проводят физиологическим раствором, содержащим 0,2-0,3% формалина или 0,1-0,2 М фосфатно-буферным раствором с рН 7,2-7,4, содержащим 0,2-0,3% формалина, методом отстоя или центрифугированием при 1,5-3,0 тыс. g, в течение 20-30 мин до полного просветления.