СПОСОБ ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI ПО ИХ ВЛИЯНИЮ НА ЦИСТООБРАЗУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ TETRAHYMENA PYRIFORMIS Российский патент 2017 года по МПК C12Q1/02 C12N1/20 C12N1/10 C12R1/01 

Изобретение относится к области микробиологии и касается определения цитотоксических свойств культур возбудителя мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) при взаимодействии с ресничными инфузориями (Tetrahymena pyriformis).

Способ позволяет получать объективные данные о цитотоксичности штаммов В. pseudomallei, основывающиеся на определении динамики индуцированного микроорганизмом, ассоциированным с клетками Т. pyriformis, инцистирования с простой количественной оценкой инцистирующей активности.

Возбудитель мелиоидоза - внутриклеточный патоген человека и многочисленных видов животных, который может выживать и размножаться в фагоцитарных и нефагоцитарных клетках млекопитающих. Известные способы изучения in vitro его цитотоксичности для клеток хозяина, как правило, предполагают использование различных культур клеток-макрофагов и перевиваемых клеточных линий [Jones A.L., Beveridge Т.J, Woods D.Е. Intracellular survival of Burkholderia pseudomallei // Infect. Immun. - 1996 - V. 64. P. 782-790; Harley V.S., Dance D.A., Drasar D.S., Tovey G. Effects of Burkholderia pseudomallei and other Burkholderia species on eukaryotic cellsin tissue culture // Microbios - 1998 - V. 96, P. 71-93; Welkos S.L., Klimkol C.P., Kern S.J., Bearss J.J., Bozuel J.A., Bernhards R.C., Trevino S.R., Waag D.M., Amemiya K., Worsham P.L., Cote С.K. Characterization of Burkholderia pseudomallei strains using a murine intraperitoneal infection model and in vitro macrophage assays // PLOS ONE DOI:10.1371/journal.pone.0124667. April 24, 2015].

Полезными и одновременно простыми моделями для этого могут быть простейшие (амебы, цилиарные инфузории), участвующие в сохранении и распространении во внешней среде многих микроорганизмов [Denoncourt А.М., Paquet V.Е., Charette S.J. Potential role of bacteria packaging by protozoa in the persistence and transmission of pathogenic bacteria // Front. Microbiol. 5:240. 10.3389/fmicb.2014.00240].

Установлено, что В. pseudomallei в природных резервуарах также оппортунистически инвазирует простейших Acantamoeba spp., размножается и выживает в них [Inglis Т.J & Sagripanti Jose-Luis. Enviromental factors that affect the survival and persistence of Burkholderia pseudomallei // Applied and Environmental Microbiol. - 2006. - V. 72 (11), Р. 6865-6875].

В экспериментах in vitro показано, что в сокультуре с Acantamoeba spp. возбудитель мелиоидоза захватывается клетками амеб, размножается в них и после непродолжительного внутриклеточного пребывания элиминируется во внешнюю среду [Inglis Т.J, Rigby P., Robertson Т.А., Dutton N.S., Henderson М., Chang В. J. Interaction between Burkholderia pseudomallei and Acantamoeba spp. results in coiling phagocytosis, endamebic bacterial survival, and escape//Infect. Immun. - 2000 - V. 68. P. 1681-1686]. Цитотоксическое действие микроорганизма на клетки амеб в цитируемой работе определяется по микроскопической картине изменений, наблюдающихся в клетках трофозоитов - образованию фагоцитарных вакуолей, изменению в структуре трофозоитов, их разрушению с выходом микроорганизма во внеклеточное пространство.

Метод оценки цитотоксичности В. pseudomallei, описанный Inglis (2000), является наиболее близким аналогом предлагаемого способа.

Однако цилиарная инфузория Т. pyriformis, будучи другим видом простейших, отличается от амеб по ряду физиологических свойств (подвижности, механизмом поглощения бактерий, формированию фагоцитарных вакуолей и т.д.), что позволяет наблюдать при взаимодействии с ней другой характер цитотоксического действия. К полезным свойствам этой модели необходимо отнести ее способность легко поддерживаться в аксеническом состоянии, культивироваться в среде, обеспечивающей эффективный рост исследуемого микроорганизма. При этом цитотоксическое действие В. pseudomallei на клетки тетрахимен легко выявляется при световой микроскопии.

Целью изобретения является разработка чувствительного количественного метода определения цитотоксичности культур В. pseudomallei по способности микроорганизма оказывать влияние на цистообразующую активность Т. pyriformis, а также расширение выбора моделей для определения цитотоксичности.

Способ предназначен для исследования у В. pseudomallei механизмов выживания в клетках Т. pyriformis как возможной эукариотической модели, альтернативной клеткам млекопитающих и одновременно - модели хозяина этого микроорганизма во внешней среде.

Поставленная цель достигается при исследовании морфологических изменений клеток и популяции тетрахимен, которое позволяет установить способность В. pseudomallei оказывать влияние на цистообразующую активность этого вида простейших по динамике инцистирования тетрахимен, ассоциированных с В. pseudomallei, в сравнении с их спонтанным инцистированием в аналогичных условиях культивирования. Для оценки цитотоксичности различных штаммов рассчитывается показатель инцистирующей активности в виде отношения количества образующихся цист к общему числу клеток тетрахимен в каждый исследуемый отрезок времени.

Предлагаемый способ включает в себя следующие этапы:

1) выращивание тетрахимен в питательной среде в количестве, необходимом для проведения эксперимента (не менее 10⁴ кл/мл); выращивание и адаптация микроорганизма к условиям роста, оптимальным для тетрахимен (инкубирование в LB при 28°С);

2) моделирование взаимодействия В. pseudomallei с простейшими в сокультуре;

3) ежедневный учет результатов взаимодействия клеток тетрахимен и микроорганизма с использованием световой микроскопии.

Аксеническую культуру Т. pyriformis выращивают в LB бульоне, количество клеток подсчитывают в камере Горяева. Культуру высевают на плотную питательную среду для контроля возможной микробной контаминации. В случае обнаружения на питательной среде роста микрофлоры культуру тетрахимен пересевают в LB бульон с канамицином (250 мкг/мл) или цефтазидимом (1000 мкг/мл) и через 24 ч проводят повторную проверку аксеничности. Количество тетрахимен в культуре подсчитывают в камере Горяева.

Культуру возбудителя мелиоидоза выращивают на плотной питательной среде LB в течение 24 ч. Бактерии суспендируют в стерилизованной автоклавированием речной воде для получения взвеси, содержащей 1×10⁹ м. к/мл по отраслевому стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО 42-28-85 П), и соединяют с тетрахименами в соотношении 100:1 (10⁶ м. к./мл бактерий и 10⁴ кл/мл тетрахимен) в LB бульоне в объеме 4 мл.

Сокультуры инкубируют в климатической камере при температуре 28°С на протяжении срока наблюдения (от 24 ч до 8-10 суток). Контролем является культура Т. pyriformis в бульоне в концентрации 10⁴ кл/мл и культура возбудителя мелиоидоза в концентрации 10⁶ м.к./мл.

Обеззараженные в течение 1 ч 10% формалином образцы сокультур помещают в камеру Горяева и просматривают в световом микроскопе, увеличение ×400, регистрируя изменения морфологии отдельных клеток тетрахимен и популяционного состава (соотношения трофозоитов и цист). Параллельно исследуют контрольные образцы Т. pyriformis для определения изменений, спонтанно происходящих в популяции простейших.

Примеры конкретного использования

Пример 1. Оценка морфологических изменений в структуре клеток Т. pyriformis, ассоциированной с В. pseudomallei

Через 24 ч от начала совместного инкубирования культуры Т. pyriformis и В. pseudomallei при световой микроскопии в клетках тетрахимен отчетливо визуализируется появление пищеварительных (эндоцитозных) вакуолей. Тетрахимены увеличиваются в размере, приобретают форму более округлых клеток, наполненных вакуолями (рисунок 1Б). Через 48-72 ч световая микроскопия выявляет значительно увеличенные в размере клетки тетрахимен, содержащие множество вакуолей и расположенные в них и в цитоплазме трофозоитов, а также вне их клетки микроорганизма (рисунок 1В). В культуре Т. pyriformis, не содержащей буркхольдерий, трофозоиты имеют типичную для тетрахимен слегка удлиненную форму клеток с зернистой цитоплазмой и расположенными по периметру ресничками (рисунок 1А). На 2-3 сутки в сокультуре с микроорганизмом тетрахимены начинают образовывать цисты. Клетки трофозоитов утрачивают подвижность, характерную структуру и приобретают плотную оболочку (рисунок 1Г). В течение последующих дней наблюдается увеличение количества цист и их постепенное разрушение (рисунок 1Д).

Таким образом, при взаимодействии с В. pseudomallei клетки тетрахимен в течение первых 24-48 ч подвергаются морфологическим изменениям, характерным для этапа поглощения микроорганизма и интернирования его эндоцитозными вакуолями инфузорий. На 2-3 сутки структура трофозоитов изменяется и они начинают превращаться в цисты. Цистированные клетки тетрахимен имеют типичную морфологию, которая позволяет при световой микроскопии их легко идентифицировать.

Пример 2. Определение динамики инцистирования Т. pyriformis в сокультуре с В. pseudomallei

Отобранные в интервале времени от 24 ч до 8-10 суток образцы сокультур отдельных штаммов после обеззараживания просматривают в камере Горяева при световой микроскопии и подсчитывают количество трофозоитов и цист (в каждый временной промежуток анализируют не менее 3 проб). Полученные количественные показатели в расчете на 1 мл культуры представляют в виде гистограмм (рисунок 3А, Б, В), сравнивая их с контрольными показателями спонтанного инцистирования культуры тетрахимен (рисунок 2).

Количественные показатели цистообразующей активности тетрахимен рассчитывают по отношению количества образующихся цист к общему числу клеток тетрахимен в каждый исследуемый отрезок времени (таблица 1).

Как видно из представленных данных, динамика инцистирования Т. pyriformis в сокультуре с В. pseudomallei, независимо от штамма, отличается от спонтанного инцистирования, как по показателям инцистирующей активности, так и по времени образования цист. В аксенической культуре процесс инцистирования Т. pyriformis занимает более 30 суток, при этом через 30 суток (срок наблюдения) цисты формируют около 60-70% клеток (рисунок 2). На рисунке 3 (А, Б, В) показано, что динамика инцистирования тетрахимен в сокультуре с В. pseudomallei имеет другие, в отличие от спонтанного инцистирования, временные параметры, а также штаммовые различия, коррелирующие с вирулентностью штаммов для экспериментальных животных. Наиболее выраженной цитотоксичностью по индуцирующему действию на цистообразование инфузорий обладает штамм В. pseudomallei 110 PAS, выделенный после пассирования в организме золотистых хомячков. Полное инцистирование всех трофозоитов (показатель, равный 1) при взаимодействии с этим штаммом определяется уже через 3 суток. Все остальные исследованные штаммы распределяются от В. pseudomallei VPA и 107 до В. pseudomallei 110 по степени повышения цитотоксичности и вирулентности (таблица 1, 2).

Таким образом, предлагаемый способ обладает достоверностью, необходимой для сравнительной характеристики цитотоксических свойств различных штаммов, он прост в исполнении и позволяет проводить определение цитотоксичности в физиологических условиях, моделирующих взаимодействие микроорганизма с клетками Т. pyriformis, которые можно варьировать в зависимости от поставленной цели и коррелируют с определением вирулентности на животных.

Способ может найти применение для изучения у возбудителя мелиоидоза механизмов внутриклеточного выживания, обеспечивающих его персистирование во внешней среде и в организме хозяев; изучения факторов патогенности и процессов адаптации к различным неблагоприятным условиям; роли механизмов адаптации, ответственных за резистентность В. pseudomallei во внешней среде, в формировании длительного сохранения в макроорганизме; установления экологической роли свободноживущих простейших в циркуляции возбудителя в природных очагах мелиоидоза.

Изобретение относится к области микробиологии. Способ предусматривает культивирование Tetrahymena pyriformis на LB- бульоне с антибиотиками в количестве, необходимом для проведения эксперимента. Культивируют Burkholderia pseudomallei на среде LB. Burkholderia pseudomallei соединяют с Tetrahymena pyriformis в соотношении 100:1 с получением сокультуры и инкубируют при 28°С в климатической камере в исследуемый отрезок времени с подсчетом количества трофозоитов и образующихся цист в камере Горяева после их предварительного обеззараживания 10% формалином. Выявляют различия в динамике цистообразования Tetrahymena pyriformis в сокультуре с Burkholderia pseudomallei в сравнении с контролем. Цитотоксичность исследуемых штаммов определяют по количественному показателю, который рассчитывают как отношение количества образующихся цист к общему числу клеток тетрахимен в каждый исследуемый отрезок времени. При этом штаммы с высокой цитотоксичностью вызывают образование и разрушение цист в более ранние сроки по сравнению со штаммами со сниженной вирулентностью. Изобретение позволяет повысить чувствительность метода. 3 ил., 2 табл., 2 пр.

Способ оценки цитотоксичности штаммов возбудителя мелиоидоза Burkholderia pseudomallei по их влиянию на цистообразующую активность Tetrahymena pyriformis, включающий совместное культивирование В. pseudomallei с простейшими и последующий учет результатов, отличающийся тем, что для более точного количественного определения токсического воздействия исследуемого штамма В. pseudomallei на клетки тетрахимен предварительно получают аксеническую тест-культуру цилиарной инфузории Т. pyriformis, для чего клетки тетрахимен выращивают в LB с цефтазидимом и канамицином, культуру высевают на плотную питательную среду для контроля возможной микробной контаминации и, в случае обнаружения на питательной среде роста микрофлоры, культуру тетрахимен повторно пересевают в LB бульон с антибиотиками, проводя через 24 ч повторную проверку аксеничности, определяют в полученной культуре тетрахимен концентрацию клеток, подсчитывая их в камере Горяева, затем соединяют их с В. pseudomallei в соотношении 1:100 в LB, инкубируют сокультуры при температуре 28°C в климатической камере в течение 8-10 суток и каждые 24 ч регистрируют изменения морфологии клеток и изменения популяционного состава тетрахимен по формированию эндоцитозных вакуолей, изменению количества трофозоитов, образованию цист и разрушению цист, с подсчетом количества трофозоитов и цист в камере Горяева при световой микроскопии образцов сокультур, предварительно обеззараженных в течение 1 ч 10% формалином и выявляют различия в динамике цистообразования тетрахимен в сокультуре с В. pseudomallei в сравнении с контролем спонтанного инцистирования простейших в аналогичных условиях культивирования, сравнивая цитотоксичность исследуемых штаммов по количественному показателю инцистирующей активности тетрахимен, который рассчитывают как отношение количества образующихся цист к общему числу клеток тетрахимен в каждый исследуемый отрезок времени, при этом штаммы с высокой цитотоксичностью вызывают образование и разрушение цист в более ранние сроки по сравнению со штаммами со сниженной вирулентностью.