3D биопринтинг солид органоидов Рулонный Пористый Скаффолд Российский патент 2025 года по МПК C12N5/07 

Способ относится к тканевой инженерии, биотехнологиям и биомедицине для биопечати микробиологическими объектами, создания устойчивых трехмерных биологических тканей и органоидов согласно САПР модели множеством типов многослойных клеток одновременно с высокой плотностью и точностью.

Известен способ биопечати, представленный группой под руководством Tim B.F Woodfield: «Integrated System for 3D Assembly of Bio-scaffolds and Cells», Toronto, Ontario, Canada, August 21-24, 2010 с помощью выдавливания плунжером сфероидов диаметром ~1 300 мкм.

Известен способ биопечати одиночными тканевыми сфероидами >500 мкм по одному из 96-ти луночной плашки с не адгезивным дном, переносом и нанизывая их на стержни, реализованный в устройстве (№ WO2012176751A1 по классу C12M33/04, 27.12.2012).

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ с обратимым встраиванием суспендированных гидрогелей (FRESH) в произвольной форме, предложенный Hinton и соавт. (Hinton, TJ. et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels / Hinton TJ, Jallerat Q, Palchesko RN, Park JH, Grodzicki MS, Shue HJ, Ramadan MH, Hudson AR, Feinberg AW// Sci Adv. 2015. 1(9): e1500758).

Этот метод печати, основанный на встраивании печатного гидрогеля во вторичный гидрогель, который служит временной термообратимой и биосовместимой опорой, позволяет использовать мягкие материалы, которые разрушились бы при печати на воздухе.

Недостатками известных способов трёхмерной биопечати являются большие затраты материала, возможность образования излишков питательной среды на приемной поверхности, что может препятствовать расчётному встраиванию одиночных тканевых сфероидов. Не все типы клеток способны сформировать большой сфероид и с увеличением его размеров вероятность живых клеток в центре уменьшается. Низкая скорость биопечати и точность, разрушения сфероидов при трении, слабые механические свойства получаемых конструкций, искажения из-за реологических особенностей гелевой среды.

Технический результат изобретения: увеличение скорости биопринтинга, множества одновременно используемых типов клеток, точность и прочность формирования тканей и органоидов.

Технический результат достигается тем, что биообъекты, ткани и органоиды для инкубации формируют послойно, согласно 3D САПР модели, с помощью систем сматывания, наматывания, натяжения, наполнения различными типами клеток через головки струйных принтеров. При помещении больших клеток в пористую ленту скаффолд система лазерной перфорации выжигает границы между её соседними отверстиями. Для каждого вида клеток используются собственные головки струйных принтеров и клетки помещаются в поддерживающую водорастворимую пористую ленту скаффолд, удерживающую их в расчётных положениях, в процессе её перематывания из рулона в рулон, с питательной жидкостью, содержащую слой фильтрирующий клетки и полностью отделяемый после её заполнения, с контролем толщины, под управлением синхронизирующей системы, управляющей системой сматывания, наматывания, натяжения и наполнения различными типами клеток, выполненной с возможностью её равномерного натяжения, бокового выравнивания, контроля скорости вращения рулонов при разгоне, намотке с постоянной скоростью и замедлении, исключая скольжение с помощью систем учёта позиционирования и совмещения слоёв. Толщина наматываемого слоя формируемого объекта поддерживается высотой полос из несжимаемого материала на границах сторон пористой ленты скаффолда, ограничивающих форму наматываемого рулона.

Система наполнения клетками содержит механизм поддержки их температур при распылении через неподвижные головки струйных принтеров, установленные по всей ширине перематываемой пористой ленты скаффолда, контролирующий точность и корректирующий механизм, вакуумное устройство и ёмкость для удаления избыточной жидкости.

Направляющие, натяжные, тянущие системы (3) и (4) пористой ленты скаффолда регулируют её равномерное натяжение, боковое выравнивание, скорости вращения рулонов (1) и (2) при разгоне, намотке и замедлении исключая скольжение.

Система лазерной перфорации (5) поддерживающей пористой ленты скаффолда при необходимости заполнения клетками больших размеров, чем поры, выжигает их границы до необходимой величины.

Система наполнения пористой ленты скаффолда различными типами клеток (6) капает биочернила через собственные неподвижные головки струйных принтеров для каждого их вида, установленные по всей её ширине, удаляет избыточную жидкость биочернил с помощью дренажной системы (8) и вакуумного устройства (9) в ёмкость (10).

После помещения необходимых клеток соответствующих трёхмерной САПР модели формируемой ткани, органа в пористую ленту скаффолд, к ним добавляется питательная жидкость из ёмкости (7), лишняя влага с поверхности, не вошедшая в поры, перемещается дренажной системой (11) в ёмкость (10).

Формирование объекта происходит в стерильном, фильтрируемом объёме с контролируемыми температурой и газовой средой системой автономного регулирования климата (14).

Фильтрующий слой наматывается в рулон (15).

Полностью сформированный объект внутри рулона пористой ленты скаффолда готов для инкубации.

Следующие фигуры иллюстрируют последовательность 3D биопечати ветвистого трубчатого объекта подобного кровеносным сосудам в рулоне.

Фиг. 1 представляет схему устройства для реализации предложенного способа. Поддерживающая пористая лента скаффолд перематывается из рулона (1) в рулон (2) с помощью направляющих, натяжных, тянущих систем (3) и (4). В процессе перемотки пористая лента скаффолд выжигается системой лазерной перфорации (5) и заполняется с помощью системы наполнения различными типами клеток (6) и в соответствии с САПР моделью. Избыточная жидкость удаляется дренажной системой (8) с помощью вакуумного устройства (9) в ёмкость (10). Когда поры ленты скаффолда заполнены клетками к ним добавляется питательная жидкость из ёмкости (7). Избыточная питательная жидкость удаляется дренажной системой (11). Система контроля точности наматывания (13) синхронизирует системы (3) и (4) по данным системы учёта позиционирования и совмещения слоёв (12). Система автономного регулирования климата (14) фильтрует и контролирует стерильность, требуемые температуры, давление необходимых газов в наматываемом рулоне. Фильтрирующий слой ленты скаффолд поддерживает формируемый объект и мотается в рулон (15).

Фиг. 2 начало наматывания рулона пористой ленты скаффолда.

Фиг. 3 заполнение поддерживающей пористой ленты скаффолда необходимыми клетками формируемого объекта.

Фиг. 4 полностью сформированный объект внутри растворяющегося рулона поддерживающего скаффолда.

Фиг. 5 очищенный сформированный объект.

Фиг. 6 демонстрирует ряд выжигания лазером (16) импульсами (17) направляемыми отражателем (18) границ между соседними отверстиями в поддерживающей пористой ленте скаффолд (19) перемещаемой на фильтрирующем слое ленты скаффолд (20).

Фиг. 7 изображает последовательность наполнения пор ленты скаффолда большими клетками ~∅20−30 мкм: а) поры ленте скаффолд (19) перед заполнением клетками и питательной жидкостью, б) поры в процессе заполнения, в) поры полностью заполнены, избыточная вода проходит сквозь отверстия в фильтрирующем слое ленты скаффолд (20).

Фиг. 8 показывает последовательность наполнения пор ленты скаффолда клетками ∅10−15 мкм: а) поры ленте скаффолд (19) перед заполнением клетками и питательной жидкостью, б) поры в процессе заполнения, в) поры полностью заполнены, избыточная вода проходит сквозь отверстия в фильтрирующем слое ленты скаффолд (20).

Пример №1

Поддерживающая пористая лента скаффолд шириной 132 мм наматывается из рулона (1) в рулон (2) диаметром 155 мм с помощью направляющих, натяжных, тянущих систем (3) и (4). Перед печатью большими клетками~∅20−30 мкм в поддерживающей пористой ленте скаффолд границы между соседними отверстиями ~42×42 мкм² на площади ~84×84 мкм² выжигаются лазером системы (5) для образования одного отверстия площадью ~79×79 мкм². Далее стандартная струйная печатающая головка Kyocera «KJ4B-0360» системы (6) выпускает капли объемом 84 пл, на частоте 12 кГц, ширине 102,66 мм с точностью 360 dpi (точка~71×71 мкм) в соответствии с САПР моделью. Необходимая текучесть биочернил различных типов клеток ~∅20−30 мкм достигается плотностью 1 клетка в ~1000 пл и печать одной клетки требует капнуть ~12 капель объемом 84 пл (шар ~∅50 мкм) уменьшив максимальную скорость ленты 50 м/мин (833 мм/с) до 4,2 м/мин (70 мм/с).

Избыточная жидкость удаляется дренажной системой (8) с помощью вакуумного устройства (9) в ёмкость (10). Когда поры ленты скаффолда заполнены клетками к ним добавляется питательная жидкость из ёмкости (7). Когда поры ленты скаффолда заполнены клетками к ним добавляется питательная жидкость из ёмкости (7). Избыточная питательная жидкость удаляется дренажной системой (11). Система контроля точности наматывания (13) синхронизирует системы (3) и (4) по данным системы учёта позиционирования и совмещения слоёв (12). Система автономного регулирования климата (14) фильтрует и контролирует стерильность, требуемые температуры, давление необходимых газов в наматываемом рулоне. Фильтрирующий слой ленты скаффолд поддерживает формируемый объект и мотается в рулон (15).

Пример №2

Поддерживающая пористая лента скаффолд шириной 143 мм перематывается из рулона (1) в рулон (2) диаметром 155 мм с помощью направляющих, натяжных, тянущих систем (3) и (4). Для печати клетками ~∅10−15 мкм в отверстиях поддерживающей пористой ленты скаффолд площадью ~42×42 мкм² в соответствии с САПР моделью, точностью 1200 dpi (точка 21×21 мкм) стандартная струйная печатающая головка Kyocera «KJ4B-1200» системы (6) выпускает капли объемом 5 пл, на частоте 64 кГц, ширине 112,44 мм. Необходимая текучесть биочернил различных типов клеток ~∅10−15 мкм достигается плотностью 1 клетка в ~1000 пл и печать одной клетки требует капнуть ~200 капель объемом 5 пл (шар ~∅21 мкм), уменьшив максимальную скорость протягивания ленты 80 м/мин (1,33 м/с) до 0,4 м/мин (~6,7 мм/с).

Избыточная жидкость удаляется дренажной системой (8) с помощью вакуумного устройства (9) в ёмкость (10). Когда поры ленты скаффолда заполнены клетками к ним добавляется питательная жидкость из ёмкости (7). Когда поры ленты скаффолда заполнены клетками к ним добавляется питательная жидкость из ёмкости (7). Избыточная питательная жидкость удаляется дренажной системой (11). Система контроля точности наматывания (13) синхронизирует системы (3) и (4) по данным системы учёта позиционирования и совмещения слоёв (12). Система автономного регулирования климата (14) фильтрует и контролирует стерильность, требуемые температуры, давление необходимых газов в наматываемом рулоне. Фильтрирующий слой ленты скаффолд поддерживает формируемый объект и мотается в рулон (15).

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен способ создания трехмерных микробиологических объектов, в котором ткани и органоиды для инкубации формируют множеством типов клеток через головки струйных принтеров в перематываемой из рулона в рулон биорезорбируемой поддерживающей пористой ленте скаффолд согласно 3D САПР модели под контролем систем автономного регулирования климата, заполнения и совмещения слоев. Изобретение позволяет увеличить скорость биопринтинга, точность и прочность формирования тканей и органоидов, использовать множество различных типов клеток. 2 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 пр.

1. Способ послойного изготовления трехмерных биообъектов, в котором ткани и органоиды для инкубации формируют, согласно 3D САПР модели, с помощью систем сматывания, наматывания, натяжения, наполнения, различными типами клеток через головки струйных принтеров, отличающийся тем, что для помещения больших клеток в пористой ленте скаффолде система лазерной перфорации выжигает границы между её соседними отверстиями, для каждого вида клеток используются собственные головки струйных принтеров и клетки помещаются в поддерживающую водорастворимую пористую ленту скаффолд, удерживающую их в расчётных положениях в процессе её перематывания из рулона в рулон с питательной жидкостью, содержащую слой фильтрирующий клетки и полностью отделяемый после её заполнения, с контролем толщины, под управлением синхронизирующей системы, управляющей системой сматывания, наматывания, натяжения и наполнения различными типами клеток, выполненной с возможностью её равномерного натяжения, бокового выравнивания, контроля скорости вращения рулонов при разгоне, намотке с постоянной скоростью и замедлении, исключая скольжение с помощью систем учёта позиционирования и совмещения слоёв, толщина наматываемого слоя формируемого объекта поддерживается высотой полос из несжимаемого материала на границах сторон пористой ленты скаффолда, ограничивающих форму наматываемого рулона.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что система наполнения клетками содержит механизм поддержки их температур при распылении через неподвижные головки струйных принтеров, установленные по всей ширине перематываемой пористой ленты скаффолда, контролирующий точность и корректирующий механизм, вакуумное устройство и ёмкость для удаления избыточной жидкости.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что система автономного регулирования климата выполнена с возможностью фильтрации и контроля стерильности, требуемых температур, давления необходимых газов в наматываемом рулоне.