СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ КОКСИЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ Российский патент 2011 года по МПК A61K39/395 

Способ получения коксиеллезной сыворотки для реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) относится к методам лабораторной диагностики коксиеллеза (Ку-лихорадки) крупного рогатого скота и может быть использован в ветеринарной медицине.

Известны способы получения диагностических сывороток при бруцеллезе, лептоспирозе животных путем гипериммунизации кроликов, используемые для РНИФ, ранее описанные в рефератах российских патентных документов за 1994-2007 г.г. (№№2257581, 2005.07.27, 95117746, 1997.10.10).

Однако у известных способов присутствует ряд недостатков:

1. Длительные сроки гипериммунизации.

2. Невысокие титры образующихся в крови кроликов антител.

3. Низкая активность полученных сывороток.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ получения микоплазмозных сывороток для РНИФ путем гипериммунизации кроликов по схеме D.Shimmel (1967) в модификации Новиковой Н.Н. (2002), (Новикова Н.Н. Экспресс-методы диагностики ассоциативного урогенитального микоплазмоза плотоядных: дис... канд. вет. наук.: 16.00.03. / Н.Н.Новикова; - Новосибирск - 2002. - С.55-60), который проводится следующим образом:

1. Для гипериммунизации используются трехсуточные культуры микоплазм (M.fermentans, M.canis, M.laidlawii, U.urealyticum). Культуральную жидкость центрифугируют при 6 тыс.оборотах /мин в течение часа. Осадок после трехкратного ресуспендирования в физиологическом растворе и последующего центрифугирования доводят до концентрации 1,7 млрд микробных тел в 1 мл по бактериальному стандарту мутности.

2. Гипериммунизацию проводят на 12 кроликах (по 3 головы на каждый штамм) весом 2,5-3 кг. Суть гипериммунизации состоит в дробном внутривенном введении антигена кроликам каждые три дня с двукратным применением иммуностимулятора левамизола подкожно.

Таблица 1 Схема гипериммунизации кроликов культурами микоплазм Время введения, сут 1 4 7 10 13 16 20 24 Доза антигена, млрд м.т. 0,85 1,7 1,7 1,7 3,4 3,4 3,4 3,4 Левамизол, мл 1 1 - - - - - -

Динамику синтеза антител изучают на 7, 14, 21 и 30 сутки после первого введения антигена в реакции непрямой иммунофлуоресценции, которую ставят на предметных стеклах по стандартной методике, учет реакции проводят в крестах, свечение менее чем на два креста считают отрицательным. В качестве антигенов в РНИФ применяют 1 млрд взвеси микоплазм, инактивированных на водяной бане при 70°С - 30 мин. На 30-е сутки всех кроликов тотально обескровливают и получают микоплазмозные диагностические сыворотки.

Таблица 2 Динамика синтеза антител у кроликов, гипериммунизированных культурами Сроки взятия крови (дни) Титр антител 7-й день 1:40 14-й день 1:160 21-й день 1:320 30-й день 1:640

Наиболее высокий уровень антител регистрируется на 21-30 дни после гипериммунизации, который колеблется в пределах 1:320-1:640 соответственно (табл.2).

Цель нашего изобретения - получение коксиеллезной сыворотки для диагностики коксиеллеза крупного рогатого скота в реакции непрямой иммунофлуоресценции путем гипериммунизации кроликов.

Поставленная цель достигается при соблюдении ряда приемов:

1. Получение антигена из вакцины Ку-риккетсиозной сухой живой М-44 производства НИИЭиМ им. Н.Ф.Гамалеи.

2. Гипериммунизация кроликов путем дробного внутривенного введения антигена каждые три, четыре дня с применением иммуностимулятора левамизола.

Описание метода получения сыворотки:

Для гипериммунизации используется антиген, полученный из вакцинного штамма С.burnetii М-44. Вакцину разводили стандартным разбавителем и прогревали на водяной бане при +70° в течение 30 минут с целью инактивации возбудителя.

Затем стерильным физиологическим раствором доводили до концентрации 1,7×10⁹ микробных тел в 1 мл по ОСМ ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Гипериммунизацию проводили на 2 кроликах породы шиншилла весом 2,5-3 кг по схеме, указанной в таблице 3.

Титры антител учитывали на 7, 14, 21 и 30 сутки после введения антигена в РНИФ, антиген для которой готовили из этого же штамма и использовали после прогревания в водяной бане при 70°С в течение 30 мин в концентрации 0,85 млрд м.т., т.к. было установлено, что при данной концентрации антигена реакция более демонстративна. Из полученной гипериммунной сыворотки готовили ряд последовательных двукратных разведений на физиологическом растворе, начиная с 1:10. Разведения делали микродозатором в пластиковых планшетах.

Постановка РНИФ

Реакцию непрямой иммунофлуоресценции ставили по следующей методике. На чистые тщательно обезжиренные без царапин предметные стекла наносили параллельно друг другу несколько капель антигена. Антигены высушивали и фиксировали над пламенем спиртовки. Затем на каждую каплю антигена наносили равную по объему каплю сыворотки из каждого разведения, начиная с последнего. Одновременно ставили контроль:

1) антиген+сыворотка положительная;

2) антиген+сыворотка отрицательная;

3) антиген+физиологический раствор.

Стекла выдерживали во влажной камере при 37-38°С в течение 50-60 минут для образования комплекса антиген - антитело. После чего их промывали дистиллированной водой от не связавшихся антител, подсушивали и наносили в красящем титре (подобранном опытным путем) ослиный антикроличий глобулин, меченный ФИТЦ. Затем стекла помещали на 15-20 минут во влажную камеру при температуре 37-38°С. По истечении этого времени мазки промывали дистиллированной водой, просушивали и просматривали в люминесцентном микроскопе при увеличении ×1500.

Интенсивность свечения оценивали в крестах:

1) очень яркая люминесценция по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с телом клетки - ++++;

2) яркая люминесцирующая периферия клетки - +++;

3) слабое свечение периферии клетки - ++ или +;

4) при отрицательной реакции люминесценция клеток отсутствует.

За положительный результат принимали яркое специфическое свечение контуров микробов в виде ободков с оценкой в 3 и 4 креста; сомнительные результаты оценивали в 2 креста при наличии слабого свечения контуров клеток.

При этом высокий уровень антител регистрировали на 30 сутки после начала гипериммунизации, который доходил до уровня 1:1280 (табл.4).

Таблица 4 Динамика синтеза антител у кроликов, гипериммунизированных коксиеллезным антигеном Сроки взятия крови (дни) Титр антител 1 кролик 2 кролик 7-й день 1:40 1:40 14-й день 1:160 1:320 21-й день 1:320 1:640 30-й день 1:1280 1:1280

Контроль на чувствительность, специфичность и активность коксиеллезной сыворотки в РНИФ.

Для изучения чувствительности, видовой специфичности и активности использовали кроличьи коксиеллезные сыворотки в разведениях: 1:10, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, 1:2560, 1:5120, коксиеллезный антиген, полученный вышеописанным способом и гетерологичные антигены (табл.5). Сыворотка, полученная путем гипериммунизации кроликов коксиеллезным антигеном, с разведениия 1:10 была строго специфична к коксиеллезному антигену с высоким уровнем активности антител в титре 1:1280.

Таблица 5 Чувствительность, специфичность и активность коксиеллезной кроличьей сыворотки в РНИФ Антигены Разведения коксиеллезной сыворотки 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 Коксиеллезный М-44 + + + + + + + + + - - Микоплазмозный - - - - - - - - - - - Бруцеллезный - - - - - - - - - - - Хламидиозный - - - - - - - - - - - Листериозный - - - - - - - - - - - Лептоспирозный - - - - - - - - - - - ИРТ-ПВ - - - - - - - - - - -

Приемущество данного способа получения противококсиеллезной сыворотки в более высоких диагностических титрах антител и возможность использования полученной сыворотки для диагностики коксиеллеза крупного рогатого скота в РНИФ.

Способ относится к области ветеринарной медицины. Способ включает гипериммунизацию кроликов антигеном с предусмотренным по схеме введением иммуностимулятора левамизола в первый и четвертый день гипериммунизации, изучение динамики синтеза антител на 7, 14, 21 и 30 сутки, обескровливание кроликов и получение сыворотки. При этом в качестве антигена используют инактивированный нагреванием +70° в течение 30 минут вакцинный штамм C.burnetii M-44. Способ позволяет получить противококсиеллезную сыворотку с высокими диагностическими титрами антител, а также повысить точность диагностики коксиеллеза крупного рогатого скота. 5 табл.

Способ получения сыворотки для диагностики коксиеллеза крупного рогатого скота в реакции непрямой иммунофлуоресценции, включающий гипериммунизацию кроликов антигеном с предусмотренным по схеме введением иммуностимулятора левамизола в первый и четвертый день гипериммунизации, изучение динамики синтеза антител на 7, 14, 21 и 30 сут, обескровливание кроликов и получение сыворотки, отличающийся тем, что в качестве антигена используется инактивированный нагреванием +70° в течение 30 мин вакцинный штамм C.burnetii M-44.