Способ получения гипериммунной сыворотки крови кролика к диметилсульфоксид-антигену Yersinia pseudotuberculosis с использованием в качестве адьюванта гидроксиапатита Российский патент 2021 года по МПК A61K35/16 A61K39/395 A61B10/00 A61P37/04 G01N33/49 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к производству гипериммунных сывороток, и может быть использовано в ветеринарии для индикации возбудителей псевдотуберкулёза и кишечного иерсиниоза.

Наиболее распространённым промышленными способом получения гипериммунных сывороток к энтеробактериям, в т. ч. из рода Yersinia, является многократная иммунизация кроликов клетками бактерий с последующей адсорбцией неспецифических антител. Данный способ не предусматривает использования адъювантов [1].

Однако целые клетки бактерий содержат большое количество "балластных" веществ, создающих излишнюю нагрузку на иммунную систему животных-продуциентов. К тому же после адсорбции наряду с уменьшением неспецифических реакций снижается также активность взаимодействия сыворотки со специфическим антигеном.

Способы получения иерсиниозных гипериммунных сывороток с использованием отдельных антигенных фракций бактерий требуют применения адъювантов, стимулирующих процесс антителообразования: масляных, минеральных и т. п.

Наиболее эффективными являются способы, предусматривающие использование при гипериммунизации адъювантов Фрейнда: неполного (НАФ) и полного (ПАФ). НАФ является масляным адъювантом и стимулирует преимущественно гуморальный иммунитет. ПАФ помимо масляной основы содержит микобактерии, которые позволяют ему дополнительно стимулировать клеточный иммунитет.

Однако несмотря на высокую эффективность, недостатком масляных адъювантов является повышенная местная воспалительная реакция, сопровождающаяся образованием болезненных уплотнений в подкожной клетчатке животного, что затрудняет проведение многократных подкожных иммунизаций [2, 3].

Перспективным является использование в качестве адъюванта гидроксиапатита (ГАП). Преимуществом данного адъюванта является отсутствие значительных местных воспалительных реакций при его подкожном введении, а также не токсичность для организма в отличие от соединений алюминия (гидрата окиси алюминия, алюмокалиевых квасцов). Последние широко используются в качестве адъювантов при вакцинациях, однако даже двукратные их инъекции негативно действуют на центральную нервную систему [4, 5, 6].

ГАП представляет собой не растворимый в воде белый порошок с сорбирующими свойствами и высоким содержанием кальция и фосфора (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂). Он может быть получен: как природный минерал, а также при термической переработке костей животных или химическим синтезом. Нами при гипериммунизации кроликов был использован биогенный ГАП [7].

В связи с выше изложенными данными, нами предлагается способ гипериммунизации кроликов диметилсульфоксид-антигеном (ДА) псевдотуберкулёзного микроба с использованием в качестве адъюванта ГАП.

ДА имеет родовую специфичность, т. е. является общим для Yersinia pseudotuberculosis (Y. pseudotuberculosis) и Yersinia enterocolitica (Y. enterocolitica) [8, 9].

Ранее нами проводилось использование ГАП для получения гипериммунных сывороток к видоспецифичным дезинтегрированным мембранам (ДМ) псевдотуберкулёзного микроба по схеме иммунизации, сходной с приводимой в данном патенте, что может служить прототипом [10].

Технической задачей изобретения является получение гипериммунной сыворотки крови кролика к ДА Y. pseudotuberculosis с использованием в качестве адъюванта ГАП.

Поставленная задача решается многократной подкожной иммунизацией кроликов ДА Y. pseudotuberculosis в смеси с ГАП, последующим взятием крови у иммунизированных животных и отделением из неё сыворотки, содержащей специфические иерсиниозные антитела.

Отличием от прототипа является то, что для получения гипериммунной сыворотки ГАП используется в качестве адъюванта совместно с ДА псевдотуберкулёзного микроба, а в прототипе – с ДМ псевдотуберкулезного микроба.

Предложенный способ осуществляется следующим образом. Гипериммунную сыворотку получают многократной (не менее 5 раз) иммунизацией кролика ДА псевдотуберкулёзного микроба в смеси с ГАП. Для одной иммунизации кролику-самцу породы "Шиншилла" массой 2-3 кг подкожно вдоль спины в 4-5 точки вводят 1 мл смеси раствора ДА и 1%-ной взвеси ГАП в соотношении 1:1. Доза ДА Y. pseudotuberculosis для одной иммунизации кролика составляет 2 мг. Интервал между последующими иммунизациями ─ 2 недели. Кровь для использования берут из ушной вены перед 6 и последующими иммунизациями в объёме 5-10 мл. Рельефность сосудистой сети на месте взятия крови увеличивается обработкой ксилолом, остатки которого во избежание раздражения кожи немедленно удаляются тампоном, смоченным 70%-м этиловым спиртом. Кровь забирается в пробирки с активатором кровяного сгустка и отстаивается в течение часа при комнатной температуре для отделения сыворотки от сгустка. Отобранная сыворотка освобождается от отдельных эритроцитов центрифугированием при 3 тыс. об./минуту 15 минут. Из полученной сыворотки делают ликвоты, которые хранят до использования в замороженном виде. Также сыворотку можно леофилизировать.

Для пояснения практической реализации способа ниже приводится соответствующий пример.

Пример

Получали гипериммунные сыворотки крови кроликов к ДА Y. pseudotuberculosis с использованием в качестве адъюванта ГАП различной концентрации (1%, 5%, 20%). Иммунизацию проводили по выше описанной схеме.

1%-ную взвесь ГАП готовили на дистиллированной воде, гомогенизировали на УЗ-бани, разливали в герметично закрытые флаконы и автоклавировали при 121 С° 30 минут. Хранили препарат при комнатной температуре весь период гипериммунизации (3-4 месяца) и перед использованием его тщательно перемешивали встряхиванием флакона [10].

Для получения ДА проводили выращивание Y. pseudotuberculosis на мясопептонном агаре при 26 °С в течение трёх суток. Отмывали, полученную бактериальную массу двух кратно физиологическим раствором. Из отмытых микробных клеток готовили ацетоновый порошок. Для его получения бактериальные клетки заливали ацетоном в соотношении 1:3, инкубировали на шейкере при 37 °С 1,5 часа, осаждали центрифугированием и удаляли ацетон. Заливку ацетоном, инкубацию, центрифугирование и удаление ацетона повторяли двух кратно. Убитую ацетоном бактериальную массу оставляли при комнатной температуре с доступом воздуха до полного высушивания. Ацетоновый порошок заливали диметилсульфоксидом в соотношении 1:6, инкубировали на шейкере при 37 °С 40 минут, осаждали центрифугированием и удаляли осадок. Супернатант диализировали против 0,01 М карбонатного буферного раствора с рН 9,4 в течение 10 часов при комнатной температуре с четырёхкратной сменой диализирующей жидкости. Готовый ДА леофилизировали. Соотношение белков и углеводов в ДА составило 30:1. ДА использовали для иммунизации в дозе 2 мг/кролика [8, 9].

Полученные гипериммунные сыворотки крови изучали в непрямом твёрдофазном иммуноферментном анализе (ИФА) [11]. Результаты исследований отражены в таблице.

Таблица ─ Результаты исследования сывороток крови кроликов, иммунизированных ДА Y. pseudotuberculosis (ДА Y.p.) с различными концентрациями ГАП

Иммунизации ДА Y.p 2мг ДА Y.p 2мг + ГАП 1% ДА Y.p 2мг + ГАП 5% ДА Y.p 2мг + ГАП 20% Перед иммунизацией ─ ─ ─ ─ 1 1:800 1:6400 1:3200 1:1600 2 1:3200 1:25600 1: 12800 1:6400 3 1:3200 1:51200 1:25600 1:12800 4 1:6400 1:102400 1:51200 1:25600 5 1:12800 1:204800 1:102400 1:25600

Как видно из таблицы, использование для гипериммунизации кроликов ДА Y. pseudotuberculosis в сочетании с ГАП позволяет получать сыворотки с высоким содержанием специфических антител. Оптимальная концентрация взвеси ГАП при гипериммунизации составляет 1%.

Список использованной литературы

1. Научные основы производства диагностических препаратов (Сыворотки для идентификации энтеробактерий) / В.В. Смирнов, В.Я. Чаплинский, З.М. Андреева, Л.Б. Богоявленская. – Киев: "Наукова думка", 1980. – 196 с.

2. Семакова, А.П. Адъювантные технологии в создании современных вакцин / А.П. Семакова, Н.И. Микшис // Пробл. особо опасных инф. – 2016. – Вып. 2. – С. 28-35. doi: 10.21055/0370-1069-2016-2-28-35.

3. Адъюванты в современной вакцинологии / Е.Ю. Исаенко, Е.М. Бабич, И.В. Елисеева, Л.А. Ждамарова, В.И. Белозерский, С.А. Колпак // J. Annals of Mechnikov Institute. – 2013. – № 4. – С. 5-21.

4. Пат. 2529959 Российская Федерация, C12N 15/863 МПК Иммунологический адъювант на основе наночастиц для вакцин против высокопатогенных штаммов вируса гриппа / О.И. Киселев, М.И. Дюков; заявитель и патентообладатель ООО "Нанолек". – № 2013145222/10; заявл. 09.10.2013; опубл. 10.10.2014, Бюл. № 28.

5. Пат. 2546861 Российская Федерация, A61K 35/76 МПК Вакцина против гриппа / А.В. Сульдин, А.Н. Доронин; заявитель и патентообладатель ООО "Нанолек". – № 2014124690/10; заявл. 18.06.2014; опубл. 10.04.2015, Бюл. № 10.

6. Shaw, C.A. Aluminum hydroxide injections lead to motor deficits and motor neuron degeneration / C.A. Shaw and M.S. Petrikc // J Inorg Biochem. – 2009. – Vol. 103(11) – 1555. doi:10.1016/j.jinorgbio.2009.05.019.

7. Пат. 2642634 Российская Федерация, С01В 25/32 МПК Способ переработки костей для получения гидроксиапатита / А.В. Пивоваров, О.Д. Муктаров; заявитель и патентообладатель ООО "ВестИнТех". – № 2017110631; заявл. 29.03.2017; опубл. 25.01.2018, Бюл. № 3.

8. Иващенко, С.В. Получение антител к диметилсульфоксид-антигену Yersinia pseudotuberculosis / С.В. Иващенко, В.Э. Маниесон // Новости науки в АПК: научно-практический журнал: в 2 т. – Ставрополь: АГРУС Ставропольского ГАУ, 2018. – № 2(11). – Т. 1. – С. 340-343.

9. Manieson, V.E. Comparative evaluation of Yersinia dimethyl-sulfoxide antigens and antibodies obtained from it / V.E. Manieson, S.V. Ivashchenko // IOP Conf. Series: Earth and Environmental Science. – 2020. – Vol. 421. – 052028 doi:10.1088/ 1755-1315/421/5/052028.

10. Действие гидроксиапатита на динамику синтеза псевдотуберкулёзных антител / С.В. Иващенко, Ч.К. Гонури, А.В. Пивоваров, О.Д. Муктаров, В.Ю. Казаков // Актуальные проблемы ветеринарной медицины, пищевых и биотехнологий: Материалы междунар. науч.-практич. конф. / Под ред. А.В. Молчанова, В.В. Строгова. – Саратов: Саратовский ГАУ, 2019. – С. 45-49.

11. Hornbeck, P. Enzyme-linked immunosorbent assays / P. Hornbeck, S.E. Winston and S.A. Fuller // Current Protocols in Molecular Biology. – 2001. – № 15. – С. 11.2.1-22.

Изобретение относится к фармацевтики, а именно к способу получения гипериммунной сыворотки крови кролика к диметилсульфоксид-антигену Yersinia pseudotuberculosis. Способ получения гипериммунной сыворотки крови кролика к диметилсульфоксид-антигену Yersinia pseudotuberculosis заключается в многократной не менее 5 раз иммунизации кролика смесью диметилсульфоксид-антигена псевдотуберкулёзного микроба и гидроксиапатита с последующим взятием крови у иммунизированного животного и отделением из неё сыворотки, содержащей специфические иерсиниозные антитела, причем для одной иммунизации кролику массой 2-3 кг подкожно вдоль спины в 4-5 точек вводят 1 мл смеси раствора диметилсульфоксид-антигена и 1%-ной взвеси гидроксиапатита в соотношении 1:1, кроме того, доза диметилсульфоксид-антигена Y. pseudotuberculosis для одной иммунизации кролика составляет 2 мг, интервал между последующими иммунизациями – 2 недели. Вышеописанный способ позволяет получить гипериммунную сыворотку крови кролика с высоким содержанием специфических антител к диметилсульфоксид-антигену Y. pseudotuberculosis с использованием в качестве адъюванта ГАП. 1 табл., 1 пр.

Способ получения гипериммунной сыворотки крови кролика к диметилсульфоксид-антигену Yersinia pseudotuberculosis, заключающийся в многократной не менее 5 раз иммунизации кролика смесью диметилсульфоксид-антигена псевдотуберкулёзного микроба и гидроксиапатита с последующим взятием крови у иммунизированного животного и отделением из неё сыворотки, содержащей специфические иерсиниозные антитела, причем для одной иммунизации кролику массой 2-3 кг подкожно вдоль спины в 4-5 точек вводят 1 мл смеси раствора диметилсульфоксид-антигена и 1%-ной взвеси гидроксиапатита в соотношении 1:1, кроме того, доза диметилсульфоксид-антигена Y. pseudotuberculosis для одной иммунизации кролика составляет 2 мг, интервал между последующими иммунизациями – 2 недели.