СИСТЕМА СОЗДАНИЯ БИОИНЖЕНЕРНЫХ МОДЕЛЕЙ ТКАНЕЙ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2017 года по МПК C12M3/00 C12M1/04 C12M1/12 C12M1/36 C12N5/07 

Область техники

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, тканевой инженерии и медико-биологическим исследованиям и предназначено для создания многокомпонентных аналогов тканей млекопитающих, а также для изучения биоинженерных конструкций/органотипических культур, культивируемых в условиях физиологических (20-70 мм рт. ст.) и «гипоксических» значений парциального давления кислорода (ниже 20 мм рт. ст.), при которых возможно стимулирование клеточной пролиферации, ангиогенеза, синтеза гормонов, ростовых факторов, белков внеклеточного матрикса и многих других процессов, а также происходит формирование некоторых видов тканей, например, поверхностных слоев кожи.

Уровень техники

Современный уровень техники позволяет размножать клетки млекопитающих, культивировать органотипические культуры и создавать биоинженерные модели тканей животных и человека в условиях обновления питательной среды, а в некоторых случаях в условиях гипоксии. Способ культивирования, в основу которого положен проточный метод снабжения питательной средой культивируемых клеточных конструкций, обеспечивающий постоянное поступление питательной среды и удаление продуктов клеточного метаболизма, описан в патентах (RU 2340662, US 6911201). Однако эти системы предусматривают наращивание суспензионных клеточных культур, а не культивирование прикрепляемых на биополимерных носителях клеток, а также не позволяют культивировать биоинженерные клеточные конструкции и органотипические культуры при физиологических и «гипоксических» значениях парциального давления кислорода.

Использование «гипоксического» газового состава представляет еще один подход для получения клеточного материала. Такой способ используется для стимуляции пролиферативной активности и поддержания в недифференцированном состоянии мультипотентных стромальных клеток. В патентах (РФ 2331670, РФ 2351649, РФ 2418066, РФ 2418066, РФ 2484133, РФ 2525143) описаны способы использования гипоксических условий культивирования для наращивания мультипотентных стромальных клеток различного происхождения в максимально короткие сроки. В описанных системах не предусматривается использование различных газовых составов, а также не используется проточный метод снабжения питательной средой культивируемых клеточных конструкций и удаления продуктов клеточного метаболизма.

В ряде патентов представлены системы, позволяющие моделировать патологические процессы, происходящие в организме человека. В патенте US 8257947 описана система, позволяющая моделировать ишемическое повреждение в нейронах. В патенте US 8912006 предложен способ культивирования фибробластов в гипоксических условиях для стимуляции синтеза белков внеклеточного матрикса. В этих системах технически не предусмотрено удаление продуктов клеточного метаболизма в процессе культивирования.

В качестве прототипа выбрана система культивирования биоинженерных конструкций, представленная в патенте (РФ 2525139 от 10.08.2014), состоящая из герметично закрываемой камеры с внутренней емкостью для децеллюляризации и рецеллюляризации биологических тканей, к которой через систему штуцеров подключены оксигенатор и емкости с необходимыми растворами и питательными средами. Система снабжена предохранительными и электромагнитными клапанами, логистическим контроллером, перистальтическим насосом, редуктором регулятором, соединительными элементами в виде штуцеров, системой дренажа отработанной среды, коммуникационной системой, шейкером и нагревательным элементом, выполненным в виде водяной бани.

Система предназначена для создания тканеинженерного органа, поэтому в ней используется камера большого объема, позволяющая вмещать целые органы человека, что требует большого объема газа для ее заполнения, не содержит средств для подготовки определенного газового состава в камере и питательной среде, что является необходимым условием при культивировании клеток млекопитающих in vitro, а также не предусматривает использование различных газовых составов, позволяющих стимулировать те или иные физиологические процессы в биоинженерных конструкциях, не позволяет выращивать клетки и создавать биоинженерные модели тканей животных и человека в условиях, приближенных к тем, в которых они развивались естественно.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявленного изобретения является расширение технологических возможностей системы, а именно, диапазона изучаемых и культивируемых биологических материалов - органотипических и клеточных культур, биоинженерных моделей тканей животных и человека, в условиях, приближенных к тем, в которых они развивались естественно.

Технический результат заявленного изобретения достигается тем, что система создания биологических тканей содержит герметичную камеру для размещения биологических тканей, соединенную с системой дренажа отработанной среды, запорно-регулирующую аппаратуру, соединительные элементы, перистальтический насос, емкость для культуральной среды, средство для нагрева камеры, коммуникационную систему, средство для хранения и подачи газа, при этом средство для хранения газа представляет собой набор газовых баллонов с газовыми смесями азота, кислорода и двуокиси углерода заранее заданного состава, соединенных отдельными соединительными магистралями с редукторами, и коммуникационной системой, с измерителем скорости потока газа, емкостью для культуральной среды, насосом и, по крайней мере, с одной герметичной камерой для размещения биологических тканей.

При этом в качестве биологических тканей используют органотипические и клеточные культуры, биоинженерные модели тканей человека и животных,

между измерителем скорости потока газа и емкостью для культуральной среды установлен фильтр.

Совокупность приведенных выше существенных признаков приводит к тому, что предлагаемая система позволяет выращивать клетки и создавать биоинженерные модели тканей животных и человека в условиях, приближенных к тем, в которых они развивались естественно.

Краткое описание чертежей

Признаки и сущность заявленного изобретения поясняются в последующем детальном описании, иллюстрируемом чертежом.

На фигуре представлено схематическое устройство заявленной системы, где обозначено следующее:

1 - баллоны с газовыми смесями;

2 - редукторы;

3 - магистрали;

4 - коммуникационная система;

5 - магистрали;

6 - измеритель скорости потока газа;

7 - фильтр;

8 - сосуд для питательной среды;

9 - перистальтический насос;

10 - герметично закрывающиеся камеры;

11 -находящиеся в камерах клеточные/тканевые образцы;

12 - средство нагрева камеры;

13 - система дренажа отработанной среды;

14 - соединительные элементы;

15 – клапаны.

Осуществление изобретения

Система создания биологических тканей состоит из баллонов с газовыми смесями 1 с редукторами 2, снижающими давление газовой смеси на выходе из баллонов со стандартных значений, например, 150 атм (в начале использования баллона) до ≈0.2 атм. В качестве примера на фигуре показаны три баллона с различными составами углерода, азота и кислорода. Количество баллонов и состав газовых сред зависит от конкретных образцов биологических материалов. Баллоны 1 магистралями 3 в виде медных трубок соединены с коммуникационной системой 4 с регулирующими клапанами 15. Далее газовая смесь нужного состава по магистралям 5 через измеритель скорости потока (ротаметер) 6 и фильтр 7 поступает в сосуд для питательной среды 8. Магистрали 5 должны быть выполнены из стерильного материала, непроницаемого для кислорода и азота, например, из тайгона. Далее питательная среда с помощью перистальтического насоса 9 через регулирующие клапаны 15 и соединительные элементы 14 подается в герметичные камеры 10, в которых омывает находящиеся там растущие дифференцирующиеся клетки/ткани 11. Количество камер 10 может быть различным в зависимости от решаемых задач. В камерах 10 средством нагрева 12, представленным в виде мини термостата, поддерживается температура 37,0±0,2°С. Камеры 10 магистралями 5 соединены с системой дренажа отработанной среды 13. Вход питательной среды в герметичные камеры 10 и выход отработанной среды из камер осуществляют через соединительные элементы 14 - переходники Люэра для соединения тайгоновых трубок с иглами, которые через штуцеры и уплотнители из вакуумной резины вставляются в камеры 10.

Заявляемое устройство работает следующим образом.

Сбор системы осуществляется по представленной схеме. Образцы биологических материалов 11 - срезы ткани (до 500 мкм в толщину) или клетки, выделенные предварительно из органов человека или животных, иммобилизуют на биодеградируемом носителе и помещают в камеры 10, которые герметично закрывают. На фигуре, в качестве примера, показано использование 3-х камер. Система позволяет использовать от одной до нескольких камер. Их количество определяется необходимостью культивирования биологических образцов в разных газовых составах.

Производят барботирование культуральной среды газом в сосуде 8 (при барботировании питательной среды в ней устанавливается требуемый уровень оксигенации, соответствующий физиологическим или гипоксическим условиям нахождения клеток) и заполнение камер 10 газовой смесью из одного из баллонов 1. С помощью ротаметра 6 устанавливают скорость подачи газовой смеси (мл/час) и рассчитывают время, необходимое для полной замены газового состава в питательной среде 8 и камерах 10 на газовый состав из баллона1. Установленный фильтр 7 с порами 0,22 мкм предотвращает попадание микроорганизмов в питательную среду и обеспечивает стерилизацию газового состава, поступающего в систему. Для предотвращения поступления атмосферного газового состава трубки/магистрали 5, обеспечивающие поступление питательной среды в камеры и удаление из них, сделаны из тайгона - материала, непроницаемого для газов. Тайгоновые магистрали соединяются с иглами через переходники Люэра, и через отверстия штуцеров через уплотнители из вакуумной резины вставляются в камеры 10 (стерилизация всех компонентов осуществляется либо автоклавированием, либо обработкой 70% этанолом). Вакуумные уплотнители обеспечивают полную герметизацию системы. Для заполнения камер 10 барботированной культуральной средой включают перистальтический насос 9 со встроенным регулятором потока жидкости, при помощи которого устанавливают скорость поступления среды в камеры 10 (устанавливается в соответствии с метаболизмом помещенного объекта -1,25±0,5 мл/ч). Камеры 10 с выращиваемым объектом 11 помещают в мини-термостат 12 и культивируют при температуре 37°С.

Стандартным способом получения in vitro большого объема клеточного материала из биопсийных образцов тканей человека или животных является размножение энзиматически выделенных клеток в обычных условиях использования стандартного культурального инкубатора (21% O₂, 5% СO₂, 74% N₂ и влажности 90%). Культивирование в заявляемой системе стандартно проводится в тех же условиях. При этом в начале культивирования клеток они находятся в равновесном с воздухом напряжении кислорода (на высоте Москвы - 150 мм рт. ст.), которое по мере увеличения количества клеток снижается из-за более высокой скорости потребления клетками кислорода по сравнению со скоростью его диффузии к клеткам из находящегося над питательной средой воздуха. В тканях человека, за исключением хрящевой ткани, благодаря адекватному развитию системы кровоснабжения и способности сердца и сосудистой сети «поставлять» необходимое количество кислорода при различных режимах его потребления, парциальное давление кислорода строго поддерживается в диапазоне 20-60 мм рт. ст.

Предлагаемая система позволяет выращивать клетки и создавать биоинженерные модели тканей животных и человека в условиях, приближенных к тем, в которых они развивались естественно. Ее сущностью является подача к клеткам/тканям постоянного потока питательной среды с парциальными давлениями кислорода и углекислого газа, соответствующими имеющимся в тканях организма. Учитывая, что развитие или регенерация тканей в организме в определенных условиях происходит в ответ на создание гипоксических условий, разработанная система позволяет проводить полное моделирование, и таких воздействий путем снижения содержания кислорода в подаваемой в систему газовой смеси. Смеси с различным, заранее заданным газовым составом, которые создают в питательной среде физиологическое или гипоксическое парциальное давление кислорода, легко готовятся на заводах, изготовляющих разные газы, и один баллон с давлением в 150 атм обеспечит нужный и точный газовый состав в окружающей выращиваемые ткани среде в течение многих лет.

Физиологические/гипоксические условия выращивания клеток, культивирования органотипических культур и создания биоинженерных моделей тканей животных и человека в условиях постоянного обновления питательной среды с поддержанием в ней физиологического и «гипоксического» газового состава позволяют увеличить скорость клеточной пролиферации и тем самым ускорить получение необходимого клеточного материала, также стимулировать процессы, необходимые для формирования различных тканевых структур (например, поверхностных слоев кожи), ангиогенез, синтеза гормонов, ростовых факторов, белков внеклеточного матрикса и многие другие.

Для обеспечения работы системы используются предварительно подготовленные и проверенные газовые составы, обеспечивающие необходимое газовое микроокружение; поддерживается постоянный химический состав среды при культивировании и создании биоинженерных конструкций; значительное уменьшение объема культуральной камеры, в которой размещается биоинженерная/органотипичная культура, обеспечивает экономное расходование как питательной среды, так и газового состава, позволяющего использовать один баллон в течение нескольких лет.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет проводить выращивание тканей человека в контролируемых условиях, создаваемых непрерывным поступлением питательной среды и оттоком продуктов тканевого метаболизма, причем в поступающей питательной среде на каждом этапе роста создается газовый состав (аналогично составу крови), соответствующий требуемому, т.е. физиологическому для наращивания массы образца или гипоксическому для индукции в нем определенной тканевой структуры, аналогично тому, как это обеспечивается в тканях человека, в том числе при индукции развития одних тканей из других, например, образования сосудистой сети, а на коже - эпидермиса.

Изобретение относится к области биохимии. Предложена система создания биоинженерных моделей тканей животных и человека. Система содержит набор газовых баллонов с газовыми смесями азота, кислорода и двуокиси углерода заранее заданного состава. Каждый баллон соединен с коммуникационной системой, емкостью для культуральной среды, насосом и с нагреваемой герметичной камерой для размещения иммобилизованных на биодеградируемом носителе срезов тканей или клеток. Причём содержание кислорода в каждом баллоне составляет 1-5%. Изобретение обеспечивает воспроизводимость оптимальных условий самостоятельного образования клетками тканевых структур в условиях гипоксии. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Система создания биоинженерных моделей тканей животных и человека, содержащая набор газовых баллонов 1 с газовыми смесями азота, кислорода и двуокиси углерода заранее заданного состава с содержанием кислорода 1-5%, каждый из которых соединен через редуктор 2 соединительной магистралью 3 с коммуникационной системой 4, соединенной с измерителем скорости потока газа 6, емкостью для культуральной среды 8, насосом 9 и, по крайней мере, с одной нагреваемой герметичной камерой 10 для размещения иммобилизованных на биодеградируемом носителе срезов тканей или клеток 11, предварительно выделенных из органов человека или животных, соединенной с системой дренажа отработанной культуральной среды 13.

2. Система по п. 1, отличающаяся тем, что между измерителем скорости потока газа 6 и емкостью для культуральной среды 8 установлен фильтр 7 с размерами пор 0,22 мкм.