Изобретение относится к новым производным в ряду бензимидазола, а именно к неописанным ранее галогенидам 1-(4-трет-бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3H-бензимидазол-1-ил}этанона формулы 1:
где Hal - в том числе хлор или бром.
Изобретение относится к области медицины и биологически активным веществам, способным функционировать в качестве разрывателей поперечных сшивок (РПС) гликированных белков, и может быть использовано в первую очередь в комплексной терапии сахарного диабета и его осложнений. Протекающие при сахарном диабете патологические процессы в качестве одного из важнейших компонентов включают чрезвычайно деструктивную по своим последствиям неферментативную реакцию гликирования протеинов, приводящую к накоплению гликопротеинов. Последние ответственны за резкое снижение функциональных свойств эритроцитов и весьма серьезные сосудистые осложнения диабета. У больных сахарным диабетом гликированию, в ходе которого происходит сшивание протеиновых макромолекул с глюкозой, подвергаются в первую очередь долгоживущие структурные белки, особенно, в связи с повышенным уровнем глюкозы [1, 2]. Гликирование представляет собой довольно медленный процесс, на заключительном этапе которого происходит сшивка гликопротеидов с образованием меж- или внутримакромолекулярных связей гликированного белка.
Следует отметить, что гликирование белков, пептидов и других макромолекул связывают не только с диабетом, но и со старением, с нейродегенеративной амилоидной болезнью (болезнью Альцгеймера), а также с развитием катаракты.
Потеря функциональности белков вследствие их гликирования связана с тем, что образование в белках поперечных сшивок, как правило, приводит к значительному уменьшению их эластичности. В результате клетки крови, в частности эритроциты, сосуды, кожа становятся жесткими и в значительной мере теряют свою функциональность. У здоровых людей, по мере старения, этот процесс происходит довольно медленно, тогда как у больных сахарным диабетом, он резко ускоряется из-за повышенной концентрации глюкозы. Одним из последствий старения и диабета является также увеличение жесткости коллагеновой основы сердечно-сосудистой системы [3]. Крупные артерии теряют свою эластичность и становятся жесткими, что приводит к систолической гипертонии и в конечном итоге сердечной недостаточности. Неферментативное гликозилирование коллагеновой матрицы происходит постепенно, как в процессе старения, так и при диабете. Одним из последствий перекрестного связывания коллагена является сниженная восприимчивость к протеолитическому и химическому разложению. Это приводит к повышенному накоплению поперечно сшитого коллагена, потере его эластичности и, как результат, к ишемической болезни сердца (ИБС) [4]. Результаты многочисленных исследований подтверждают мнение, что инфаркт является итогом гликирования коллагеновой матрицы [4, 5].
Известно нормализующее действие на пораженное гликированием русло сердечно-сосудистой системы четвертичных азолиевых солей, в том числе хлорида N-фенацил-4,5-диметилтиазолия (препарат ALT-711, алагебриум), который снижает уровень конечных продуктов гликирования (КПГ) в кровеносных сосудах [5]. В ходе клинических испытаний алгебриума было показано, что препарат обладает хорошей переносимостью и вызывает увеличение эластичности сосудов у 93% пациентов старше 50 лет [4].
Наиболее близкими по структуре среди производных 2-метилбензимидазола являются гидробромиды 1-алкил-3-фенацилпроизводные 2-метилбензимидазола, обладающие противомикробной активностью [6], противоопухолевой активностью [7].
В ряду фенацилпроизводных 2-метилбензимидазола не известны соединения, проявляющие свойства разрушителей поперечных сшивок гликированных белков.
Техническим результатом изобретения является не описанное ранее соединение в ряду фенацилпроизводных 2-метилбензимидазола, проявляющее новое для данного ряда свойство разрушителей поперечных сшивок гликированных белков.
Технический результат достигается соединением формулы 1.
В качестве галогенидов 1-(4-трет-бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3H-бензимидазол-1-ил}этанона могут выступать, в том числе, хлорид или бромид.
Синтез соединений 1 заключается в алкилировании 2-метилбензимидазола 4-фторфеноксиэтилбромидом и последующей кватернизацией образующегося 1-(4-фторфенокси)этил-2-метилбензимидазола 2 2-замещенными 1-(4-трет-бутилфенил)этанонами при кипячении в нитрометане:
Ниже приведен пример синтеза бромида предлагаемого соединения.
Стадия 1. 1-(4-фторфенокси)этил-2-метилбензимидазол
К раствору 1.32 г (10 ммоль) 2-метилбензимидазола и 1.3 г (20 ммоль) КОН (в расчете на 85% содержание КОН) в 10 мл ДМСО порциями вносят 2.19 г (10 ммоль) 2-(4-фторфенокси)этилбромида так, чтобы температура реакционной массы не превышала 45°С. Смесь выдерживают 1 час при 45°С, затем температуру поднимают до 115°С и сразу охлаждают и выливают в 20 мл воды. Выпавшие слегка розоватые кристаллы 1-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метилбензимидазола отфильтровывают, промывают 5 мл воды. Выход 2.37 г (88%). Т. пл. 133-135°С (из изопропанола).
Спектр ЯМР 1Н (300 МГц), δ, м.д. (CDCl3): 2.33 (с, 3Н, СН3), 4.25 (т, 2Н, J = 4.2, ОСН2), 4.34 (т, 2Н, J = 4.3, NCH2), 6.70-6.77 (м, 2Н, Н-2'1, Н-6'), 6.89-6.95 (м, 2Н, Н-5, Н-6), 7.10-7.19 (м, 3Н, Н-3', Н-5', Н-4), 7.42 (д, 1H, J = 7.6, Н-7).
Найдено (%):N 10.12. C16H15FN2O. Вычислено (%): N 10.36.
Стадия 2. 1-(4-трет-Бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3H-бензимидазол-1-ил}этанона бромид
(1 цифрами со штрихом обозначены протоны феноксиэтильного заместителя в положении 1 бензимидазола, с двумя штрихами – фенильного в положении 3 бензимидазола)
К раствору 0.54 г (20 ммоль) 2-метил-1-[2-(4-фторфенокси)этил]бензимидазола в 15 мл нитрометана при 35°C прибавляют 0.53 мл (21 ммоль, 0.54 г) 2-6ром-1-(4-трет-бутилфенил)этанона, кипятят 1 час, охлаждают и отфильтровывают 0.90 г (87%) бромида 1-(4-трет-бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3H-бензимидазол-1-ил}этанона. Бесцветные кристаллы с т. пл. 208°C (из изопропанола). Спектр ЯМР 1H (600 МГц), δ, м.д. (ДМСО-d6): 1-34 (с, 9Н, C(СН3)3), 2.93 (с, 3H, CH3), 4.36 (т, 2Н, J=4.5, OCH2), 5.06 (т, 2Н, J=4.5, NCH2), 6.42 (с, 2Н, CCH2), 6.88-6.92 (м, 2Н, Н-3', 5'), 7.11 (т, 2Н, J=8.7, Н-2',6'), 7.60-7.70 (м, 4Н, Н-4, Н-5, Н-6, Н-7), 8.00 (д, J=8.1, 1Н, Н-3'' или Н-5''), 8.08 (д, 2Н, J=8.4, Н-2'',6''), 8.15 (д, 1H, J=8.1, H-5'' или H-3'').
Найдено (%): N 5.04. C28H30BrFN2O2. Вычислено (%): N 5.32.
Исследование биоактивности
Получение коллагена
Для получения коллагена крыс линии Вистар (масса тела 200±20 г) наркотизировали, после чего иссекали хвосты при температуре 4°C и вынимали коллагеновые волокна сухожилия хвоста, которые промывали физиологическим солевым раствором, удаляли ткани неколлагеновых волокон, трижды промывали дистиллированной деионизованной водой, разрезали на куски и при 4°C погружали в 0.1% раствор уксусной кислоты на одну неделю, в течение которой иммерсионную жидкость часто взбалтывали. Иммерсионную жидкость подвергали обработке на центрифуге при 8000 g в течение 30 минут и собирали супернатантный раствор коллагена. После разбавления измеряли содержание протеина. 96-луночный микропланшет (Costar) тщательно покрывали раствором коллагена в количестве 70 мкг/лунку при 4°C в течение 24 часов, затем пленкообразующий раствор удаляли. Пластины высушивали на воздухе, покрывали пленкой для сохранения свежести и хранили при 4°C до использования.
Получение конечных продуктов гликирования (гликированного бычьего сывороточного альбумина - БСА)
Раствор, содержащий 50 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) (V) (Roch) и 0.5 М глюкозы в 0.2 М забуференном фосфатом физиологическом растворе (фосфатный буферный раствор) (pH 7.4), инкубировали при 37°C в стерильных условиях в течение 3-4 месяцев для образования, таким образом, гликозилированного БСА. В то же время готовили негликозилированный БСА со свободным от глюкозы БСА. Затем БСА-AGE раствор диализировали против 0.01 М фосфатный буферный раствор (pH 7.4) для удаления непрореагировавшей глюкозы. Использовали флуоресцентное сканирование (Exi/Em (395/460 нм)).
Исследование активности бромида 1-(4-трет-бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3H-бензимидазол-1-ил}этанона (1)
Покрытый коллагеном из хвоста 96-луночный микропланшет тщательно обрабатывали фосфатным буферным раствором (pH 7.4) в течение 1 часа для нейтрализации кислого коллагена. Планшет блокировали Superblock (PIERCE) при 37°C в течение 1 часа и промывали фосфатным буферным раствором с Tween-20, трижды встряхивая в течение 1 минуты при каждом промывании. 100 мкл раствора гликированного белка добавляли в лунки в ряды 96-луночного планшета, маркированные как A, B, C и D, и раствор БСА такой же концентрации добавляли в лунки в ряды, маркированные как E, F, G и H. Лунки инкубировали при 37°C в течение 4 часов, чтобы обеспечить сшивание коллагена, и промывали фосфатным буферным раствором с tween-20 четыре раза при встряхивании в течение 1 минуты при каждом промывании. Испытываемое соединение добавляли к выполненным в четырех экземплярах лункам с гликированным белком и к выполненным в четырех экземплярах лункам с БСА в количестве 100 мкл/лунку. В первые три лунки в каждом ряду вместо вещества добавляли 100 мкл/лунку фосфатный буферный раствор или другой растворитель (например, ДМСО). Лунки инкубировали при 37°C в течение 16 часов и промывали фосфатным буферным раствором с tween-20, встряхивая в течение 1 минуты во время каждого промывания. В лунки добавляли антитела кролика против-БСА (1:500) 80 мкл/лунку и планшет инкубировали при 37°C в течение 50 минут. Далее в лунки добавляли 80 мкл/лунку меченных пероксидазой хрена козьих IgG против кроличьих (1:1000). Лунки инкубировали при 37°C в течение 50 минут. После добавляли субстрат 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) 100 мкл/лунку. Планшет инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 20 минут. Для прекращения реакции использовали 2М раствор H2SO4. В течение 10 минут после реакции регистрировали оптическую плотность при 450 нм на планшет-ридере TECAN M200Pro.
Для каждого определения вычисляли среднюю оптическую плотность (ОП).
Корректированная ОП = средняя ОП лунки с гликированным белком - средняя ОП лунки БСА.
Процент разрушения выражали в виде относительного уменьшения ОП:
[(средняя ОП лунки фосфатный буферный раствор - средняя ОП лунки исследуемого соединения)/средняя ОП лунки фосфатный буферный раствор] × 100%.
Обработка результатов выполняется в программе Microsoft Excel (Microsoft, США) с расчетом базовых статистических показателей: среднего арифметического M, стандартного отклонения s, стандартной ошибки среднего арифметического m. Статистическая обработка с применением парного t-критерия Стьюдента в программе Statistika 10.0 (StatSoft, США).
Результаты исследования
На фиг. 1 показана зависимость разрывающей активности бромида 1-(4-трет-бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3H-бензимидазол-1-ил}этанона (1) от его концентрации. По оси абсцисс - концентрация соединения 1, ммоль; по оси ординат - ингибирование флюоресценции, %; количество опытов - n=5. R2 - квадрат коэффициента корреляции для регрессионного уравнения (показывает статистическую значимость расчетов) = 0, 9402. IC50 (концентрация полумаксимального ингибирования) = 0.387 ммоль/л. Значение получают из уравнения регрессии (y=65.52x+24.655), связывающее эффект y с концентрацией x, при y=50. На фиг. 2 показана зависимость разрывающей активности препарата сравнения ALT-711 от его концентрации. По оси абсцисс - концентрация соединения ALT-711, ммоль/л; по оси ординат - ингибирование флюоресценции, %. (n=5). IC50 = 1.89 ммоль/л.
В таблице 1 приведены значения концентрация полумаксимального ингибирования (IC50) 1-(4-трет-бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3H-бензимидазол-1-ил}этанона бромида (1) в сравнении с референсным препаратом алагебриумом (ALT-711).
Как видно, для соединения 1 значение IC50 составляет 0,387 ммоль/л, что превосходит IC50 для ALT-711 в 4.9 раз.
Таким образом, производные бензимидазола обладают свойствами разрывателей поперечных сшивок гликированных белков, превосходя препарат сравнения алагебриум в 4.9 раза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ансари Н.А., Рашид З. //Биомедицинская химия. - 2010. - Т. 56. - №. 2. - С. 168-178.
2. Ли Сун и др. Патент РФ 2444517 (2012), Бюл. №7 (2012).
3. А.А. Спасов, А.И. Ращенко // Вестник ВолгГМУ. 2016. - Т. 57 - №1. - с. 12-15.
4. Vasan S., Foiles P., Founds H. // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 2003. - T. 419. - №. 1. - C. 89-96.
5. Kim J. et al. // European journal of pharmacology. - 2015. - T. 748. - C. 108-114. Singh R. et al. // Diabetologia. - 2001. - T. 44. - №. 2. - C. 129-146.
6. Воев В.Л. и др, Хим.-фарм. журнал, 1990. Т. 24, №11, с. 40-44.
7. Xiao-Liang Xu, Org. Biomol. Chem., 2015, V. 13, P. 1550; Jin-Mei Liu, RSC Advances, 2015, Issue78.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
9-Бензил-2-бифенилимидазо[1,2-а]бензимидазол и его фармацевтически приемлемые соли, проявляющие свойства разрушителей поперечных сшивок гликированных белков | 2016 |
|
RU2627769C1 |
1,3-Бис(4-метоксибензоил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-дион, обладающий разрывающей поперечные сшивки гликированных белков активностью | 2017 |
|
RU2643520C1 |
НАТРИЕВАЯ СОЛЬ 3-НИТРО-4-ОКСО-1,4-ДИГИДРОПИРАЗОЛО[5,1-с]-1,2,4-ТРИАЗИН-8-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ, ДИГИДРАТ | 2016 |
|
RU2641107C1 |
НАТРИЕВАЯ СОЛЬ ДИЭТИЛОВОГО ЭФИРА 4-ОКСО-1,4-ДИГИДРОПИРАЗОЛО[5,1-C]-1,2,4-ТРИАЗИН-3,8-ДИКАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ, МОНОГИДРАТ | 2015 |
|
RU2612300C1 |
ПРИМЕНЕНИЕ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ ГИДРАЗОНОВ В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИГЛИКИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ | 2016 |
|
RU2658819C2 |
Ингибиторы образования конечных продуктов гликирования на основе азопроизводных фенилсульфокислот | 2016 |
|
RU2634594C1 |
2-(5-НИТРОНИЛФУРАН-2-ИЛ)-5-МЕТИЛ-6-НИТРО-1,2,4-ТРИАЗОЛО[1,5-А]ПИРИМИДИН-7(4Н)-ОН И ЕГО СОЛИ | 2018 |
|
RU2716715C2 |
Бромиды производных бензимидазолия в качестве ингибиторов протеин-тирозинфосфатазы типа 1В (РТР1В) | 2018 |
|
RU2652112C1 |
Применение сульфасалазина в качестве ингибитора образования конечных продуктов гликирования | 2017 |
|
RU2680844C1 |
3-ГУАНИДИНОАЗОЛО[1,2,4,5]ТЕТРАЗИНЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИГЛИКИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ | 2017 |
|
RU2668971C1 |
Изобретение относится к области органической химии, а именно к галогенидам 1-(4-трет-бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3Н-бензимидазол-1-ил}этанона формулы 1, обладающим свойством разрывателей поперечных сшивок гликированных белков. Технический результат: получены новые галогениды, обладающие полезными биологическими свойствами. 3 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.
1. Галогениды 1-(4-трет-бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3Н-бензимидазол-1-ил}этанона формулы 1
2. Галогениды по п.1, обладающие свойством разрывателей поперечных сшивок гликированных белков.
3. Галогениды по п.1, где Hal - бром.
4. Галогениды по п.1, где Hal - хлор.
WO 2005042712 A2, 12.05.2005 | |||
СРЕДСТВО, ИНГИБИРУЮЩЕЕ Na+/H+-ОБМЕН, И ГАЛОГЕНИДЫ 1-ДИАЛКИЛАМИНОЭТИЛ-3-[ЗАМЕЩЕННЫЙ(ДИЗАМЕЩЕННЫЙ) ФЕНАЦИЛ]-2-АМИНОБЕНЗИМИДАЗОЛИЯ | 2013 |
|
RU2518741C1 |
Авторы
Даты
2017-11-09—Публикация
2016-12-12—Подача