АНТИ-ПОЛИУБИКВИТИНОВЫЕ АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2017 года по МПК C07K16/08 A61K39/395 

СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка согласно 35 U.S.С. §119 (е) заявляет приоритет Предварительной заявки США №61/515,729, поданной 5 августа 2011 г., которая включена путем ссылки в данное описание в полном объеме.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит Перечень последовательностей, который подан в формате ASCII через EFS-Web и, таким образом, включен путем ссылки в полном объеме. Копия указанного ASCII, созданная 6 августа 2012 г., носит название P4716R.1WO.txt, и ее размер составляет 128,429 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области анти-полиубиквитиновых антител, и, более конкретно, к анти-полиубиквитиновым антителам, которые не связываются специфично с моноубиквитином и которые являются специфичными в отношении линейного полиубиквитина, а также способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Убиквитин представляет собой белок небольшого размера, который играет ряд важных регуляторных ролей в широком спектре клеточных путей. Наиболее известные из них - это роль убиквитинов в разложении белка, причем ковалентное присоединение убиквитина к белку-мишени разрешает распознавание и уничтожение белка-мишени протеасомой 26S (см. Wilkinson, Semin. Cell Devel. Biol. 11(3): 141-148 (2000)). Ковалентное присоединение убиквитина, белка длиной 76 аминокислот, к белку-мишени представляет собой ферментный трехстадийный процесс (Pickart, Annu. Rev. Biochem. 70: 503-533 (2001)). Вначале убиквитин-активизирующий фермент Е1 образует тиоэфир убиквитин-E1 в ходе АТФ-зависимой реакции. Убиквитин переносится из тиоэфира убиквитин-Е1 к члену семейства убиквитин-конъюгирующего фермента (Е2). На третьей стадии, с помощью убиквитин-протеин лигазы (Е3) образуется изопептидная связь между карбоксильным концом убиквитина и ε-аминогруппой лизинового остатка белка-мишени. Ферменты под названием деубиквижназы удаляют убиквитиновые фрагменты с белков мишеней (Guterman and Glickman, Curr. Prot. Pep.Sci. 5: 201-210 (2004)).

Убиквитин содержит семь остатков лизина (Lys6, Lys11, Lys27, Lys33, Lys29, Lys48 и Lys63), и, таким образом, убиквитин сам по себе может служить белком-мишенью для убиквитинирования (Peng et al., Nat. Biotechnol. 21: 921-926 (2003); Pickart and Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8:610-616 (2004)). Молекула, полученная при убиквитинировании белка убиквитин, называется молекулой полиубиквитина и может содержать два или более фрагментов убиквитина. Убиквитинирование убиквитина теоретически может происходить по любому из семи остатков лизина (Peng et al., Nat. Biotechnol. 21: 921-926 (2003)), таким образом, что существуют различные виды полиубиквитинов, содержащие изопептидные связи при различных остатках лизина в пределах убиквитина. Сообщалось о полиубиквитиновых цепях с внутренними изопептидными связями при всех семи остатках лизина. Iwai and Tokunaga, EMBO Reports 10:706-713 (2009).

Недавно было обнаружено, что также образуются линейные цепи полиубиквитина, в которых С-концевой глицин убиквитина конъюгирован с α-аминогруппой N-концевого метионина другой молекулы убиквитина. Iwai and Tokunaga, EMBO Reports 10:706-713 (2009). Линейный полиубиквитин образуется посредством комплекса сборки линейной цепи убиквитина (КСЛЦУ), который состоит из двух RING белков «цинковых пальцев», HOIL-1L и HOIP. Tokunaga et al., Nat. Cell Biol. 11: 123-132 (2009). Считается, что генетически кодируемый, незакрепленный линейный полиубиквитин не существует в клетках, поскольку его С-конец уязвим к расщеплению изопептидазой Т. Iwai and Tokunaga, EMBO Reports 10:706-713 (2009). Данное наблюдение наводит на мысль о том, что сборка линейного полиубиквитина происходит на белке-субстрате посттрансляционно, и что конъюгированные линейные молекулы полиубиквитина являются потенциальными модуляторами активности и функции белка. Id. Например, показано, что линейное полиубиквитинирование эссенциального модулятора NF-κВ (НЭМО) играет роль в активации NF-κВ. Id.

Антитела, которые отличают линейный полиубиквитин от полиубиквитина с различным расположением связей при остатках лизина, были бы пригодными для дополнительного изучения роли линейных цепей полиубиквитина в разложении белка и регуляции, а также для нацеливания и модуляции линейного полиубиквитина в опосредованных линейным полиубиквитином путях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В изобретении предлагаются антитела против линейного полиубиквитина и способы их применения. В одном из вариантов изобретения предлагается выделенное антитело, которое специфично связывается с первым полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом, причем указанное антитело не связывается специфично со вторым полиубиквитином, содержащим лизиновую связь. В другом варианте изобретения предлагается выделенное антитело, которое специфично связывается с первым полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом, и со вторым полиубиквитином, содержащим лизиновую связь, причем указанное антитело не связывается специфично с моноубиквитином, и при этом антитело связывается со вторым полиубиквитином со значительно меньшей аффинностью связывания по сравнению с аффинностью связывания антитела с первым полиубиквитином.

В другом варианте изобретения предлагается выделенное антитело, которое специфично связывается с полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом, причем указанное антитело не связывается специфично с моноубиквитином. В одном из аспектов антитело содержит по меньшей мере одну гипервариабельную (HVR) последовательность, выбранную из HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-Н3 любой из SEQ ID NO:1, 4, 19 и 50-57; SEQ ID NO:2 и 58-63; SEQ ID NO:3, 5, 6, 20, 21 и 64-72; SEQ ID NO:7, 10, 13, 16, 22 и 73-81; SEQ ID NO:8, 11, 14, 17, 23, 24 и 82-86; и SEQ ID NO:9, 12, 15, 18 и 87-93, соответственно.

В другом аспекте антитело содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, причем HVR-L1 содержит последовательность аминокислот RASQX₁VX₂X₃X₄VA (SEQ ID NO:39), причем аминокислота X₁ выбрана из аминокислоты D, S и G, аминокислота Х₂ выбрана из S и D, аминокислота Х₃ выбрана из S, Т и N, и аминокислота Х₄ выбрана из А и S; причем HVR-L2 содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO:2; и при этом HVR-L3 содержит последовательность аминокислот QQX₅X₆X₇X₈X₉PX₁₀T (SEQ ID NO:40), причем аминокислота X₅ выбрана из S, Y и Н, аминокислота Х₆ выбрана из Y и F, аминокислота X₇ выбрана из Т, Y и А, аминокислота Х₈ выбрана из Т, Y и S, аминокислота Х₉ является необязательной, и, если она присутствует, представляет собой серин, и аминокислота Х₁₀ выбрана из Р и L.

В другом аспекте антитело содержит ни меньшей мере одну гипервариабельную (HVR) последовательность, выбранную из HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, причем HVR-H1 содержит последовательность аминокислот Х₁₁Х₁₂Х₁₃Х₁₄Х₁₅Х₁₆Х₁₇Х₁₈ (SEQ ID NO:41), и при этом аминокислота Х₁₁ выбрана из Т и N, аминокислота X₁₂ выбрана из F и I, аминокислота Х₁₃ выбрана из S, Т и Y, аминокислота Х₁₄ выбрана из N, D, S и Y, аминокислота X₁₅ выбрана из Т, Y, S и D, аминокислота X₁₆ выбрана из Y, D и S, аминокислота X₁₇ выбрана из I и М, и аминокислота X₁₈ выбрана из S и Н; причем HVR-H2 содержит последовательность аминокислот AX₁₉IX₂₀X₂₁X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅TX₂₆ (SEQ ID NO:42), аминокислота X₁₉ выбрана из S, G, W и E, аминокислота Х₂₀ выбрана из Т, S и Y, аминокислота X₂₁ выбрана из Р и S, аминокислота Х₂₂ выбрана из S и Y, аминокислота Х₂₃ выбрана из G, S и Y, аминокислота Х₂₄ выбрана из G и S, аминокислота Х₂₅ выбрана из S и Y, и аминокислота Х₂₆ выбрана из D и S, и HVR-H3 содержит последовательность аминокислот RX₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆X₃₇D (SEQ ID NO:43) причем аминокислота Х₂₇ выбрана из Т, Е и G, аминокислота Х₂₈ выбрана из W, А и Y, аминокислота Х₂₉ выбрана из L, G, V и S, аминокислота Х₃₀ выбрана из L, S и W, аминокислота Х₃₁ выбрана из R, K и Y, и аминокислота Х₃₂ выбрана из W, L, G и Y, аминокислота Х₃₃ выбрана из V, L, А и G, аминокислота Х₃₄ выбрана из М и F, и при этом аминокислоты Х₃₄, Х₃₅ и Х₃₆ присутствуют необязательно, и, если присутствуют, аминокислота Х₃₄ представляет собой S, аминокислота Х₃₅ выбрана из V и Р, и аминокислота Х₃₆ представляет собой А.

В другом аспекте антитело содержит по меньшей мере одну гипервариабельную последовательность (HVR), выбранную из HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, причем HVR-L1 содержит последовательность аминокислот RASQ Х₃₈Х₃₉Х₄₀Х₄₁Х₄₂Х₄₃А (SEQ ID NO:44), причем аминокислота Х₃₈ выбрана из D, А, Е, G, L, N, S, Т и V, аминокислота Х₃₉ выбрана из V, А, L и S, аминокислота Х₄₀ выбрана из S, F, G, L, R и V, аминокислота X₄₁ выбрана из Т, G, I, N, S и V, аминокислота Х₄₂ выбрана из А, Н, Q, R, S и Y, и аминокислота Х₄₃ выбрана из V и L, причем HVR-L2 содержит последовательность аминокислот SX₄₄X₄₅X₄₆X₄₇YX₄₈ (SEQ ID NO:45), причем аминокислота Х₄₄ выбрана из А и R, аминокислота Х₄₅ выбрана из S, K, Q и R, аминокислота Х₄₆ выбрана из F и Y, аминокислота Х₄₇ выбрана из L, А, F, G, Н, I, K, М, N, Р, R, S, V и Y, и аминокислота X₄₈ выбрана из S, А, D, F, G, Н, V, W и Y, и при этом HVR-L3 содержит последовательность QQ X₄₉X₅₀X₅₁X₅₂PPT (SEQ ID NO:46), причем аминокислота Х₄₉ выбрана из Н и S, аминикислота Х₅₀ выбрана из Y, K, N, Q, R, S, V и W, аминокислота X₅₁ выбрана из T, I, Q, R, S и V, и аминокислота Х₅₂ выбрана из Т, A, D, F, G, K, N, P, Q, R, S и V.

В другом аспекте антитело содержит по меньшей мере одну гипервариабельную последовательность (HVR), выбранную из HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, причем HVR-H1 содержит последовательность аминокислот X₅₃X₅₄X₅₅YX₅₆S (SEQ ID NO:47), причем аминокислота Х₅₃ выбрана из А, F, K, М, Q, R и S, аминокислота Х₅₄ выбрана из N и W, аминокислота Х₅₅ выбрана из Т, A, I, L, М и V, и аминокислота Х₅₆ выбрана из I, M и V, и при этом HVR-L2 содержит последовательность аминокислот AX₅₇X₅₈TPX₅₉SGX₆₀TX₆₁ (SEQ ID NO:48), причем аминокислота Х₅₇ выбрана из Т и S, аминокислота X₅₈ выбрана из I, S и V, аминокислота Х₅₉ выбрана из S и А, аминокислота Х₆₀ выбрана из S, H, I, L, М и Q, аминокислота Х₆₁ выбрана из D и N, причем HVR-H3 содержит последовательность аминокислот X₆₂WX₆₃X₆₄RWVX₆₅D (SEQ ID NO:49), и причем аминокислота Х₆₂ выбрана из S и Т, аминокислота Х₆₃ выбрана из L и Y, аминокислота Х₆₄ выбрана из L, I и V, аминокислота Х₆₅ выбрана из М и F.

В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1 или 4, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:2 и последовательность HVR-L3, выбранные из SEQ ID NO:3, 5 и 6, соответственно. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-H1, выбранную из SEQ ID NO:7, 10, 13 и 16, последовательность HVR-H2, выбранную из SEQ ID NO:11, 23 и 24, и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:12, соответственно. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1, выбранную из SEQ ID NO:1 и 50-56, последовательность HVR-L2, выбранную из SEQ ID NO:2 и 57-62, и последовательность HVR-L3, выбранную из SEQ ID NO:3 и 63-71, соответственно. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-H1, выбранную из SEQ ID NO:7 и 72-80, последовательность HVR-H2, выбранную из SEQ ID NO:8 и 81-85, и последовательность HVR-H3, выбранную из SEQ ID NO:9 и 86-92, соответственно.

В другом аспекте антитело содержит последовательности HVR-L1, HVR-L2, и HVR-L3, соответствующие указанным для клонов 1Е2, 1D8, 1F4 или 1А10 на Фиг.1А. В другом аспекте антитело содержит последовательности HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, соответствующие указанным для клонов 1Е2, 1D8, 1F4 или 1А10 на Фиг.1В. В другом аспекте антитело содержит последовательности HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, соответствующие указанным для клонов 1D8.3C2, 1D8.3F8 или 1D8.4F5 на Фиг.4А. В другим аспекте антитело содержит последовательности HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, соответствующие указанным для клонов 1D8.3C2, 1D8.3F8 или 1D8.4F5 на Фиг.4В.

В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:10, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:11 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:12. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:19, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:10, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:23 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:12. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:20, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:10, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:11 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:12. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:20, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:10, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:11 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:12. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:8 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:9. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность HVR-L2, выбранную из SEQ ID NO:2, 57 и 59, последовательность HVR-L3, выбранную из SEQ ID NO:3, 64 и 71, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:7 или 79, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:8 или 81, и последовательность HVR-L3, выбранную из SEQ ID NO:9, 86, 88 или 89. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:57, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:8 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:9. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:81 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:9. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность 11VR-L2 SEQ ID NO:57, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:81 и последовательность HVR-НЗ SEQ ID NO:9. В определенных аспектах любое из антител, описанных в данном описании, может содержать лейцин как первую аминокислоту после С-конца HVR-H3 (например, аминокислота, непосредственно смежная с С-концом HVR-Н3, как, например, 1Е3, -TWLLRVMDL (SEQ ID NO:96).

В другом аспекте антитело содержит последовательность аминокислот легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:25-28, 33-35, 94 и 193-195. В другом аспекте антитело содержит последовательность аминокислот тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:29-31, 36-38, 95 и 196-198.

В другом аспекте антитело содержит последовательности аминокислот легкой цепи и тяжелой цепи по меньшей мере на 95% идентичные последовательностям аминокислот из следующих комбинаций последовательностей: SEQ ID NO:25 и 29; SEQ ID NO:26 и 30; SEQ ID NO:27 и 31; SEQ ID NO:28 и 32; SEQ ID NO:33 и 36; SEQ ID NO:34 и 37; SEQ ID NO:35 и 38; SEQ ID NO:95 и 95; SEQ ID NO:193 и 196; SEQ ID NO:194 и 197; и SEQ ID NO:195 и 198.

В другом варианте изобретения предлагается выделенное антитело, причем указанное антитело связывается с таким же антигенным детерминантом на полиубиквитине, содержащем связь С-конца с N-концом, как любое из вышеперечисленных антител, и при этом антитело не связывается специфично с моноубиквитином. В другом варианте изобретения предлагается выделенное антитело, которое конкурирует с любым из вышеперечисленных антител за связывание с полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом, причем указанное антитело не связывается специфично с моноубиквитином. В другом варианте изобретения предлагается любое из вышеперечисленных выделенных антител, причем указанное антитело специфично связывается с полиубиквитинированным белком, содержащим связь С-конца с N-концом. В другом варианте изобретения предлагается любое из вышеперечисленных выделенных антител, причем указанное антитело модулирует по меньшей мере один опосредованный полиубиквитином путь передачи сигнала.

В одном из общих аспектов любое из вышеперечисленных антител представляет собой моноклональное антитело. В другом общем аспекте любое из вышеперечисленных антител представляет собой человеческое антитело. В другом общем аспекте любое из вышеперечисленных антител представляет собой гуманизированное антитело. В другом общем аспекте любое из вышеперечисленных антител представляет собой химерное антитело. В другом общем аспекте любое из вышеперечисленных антител представляет собой фрагмент антитела, который связывается с полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом.

В другом варианте изобретения предлагается выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая любое из вышеперечисленных антител. В другом варианте изобретения предлагается вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из вышеперечисленных антител. В другом варианте изобретения предлагается клетка-хозяин, содержащая выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из вышеперечисленных антител. В другом варианте изобретения предлагается клетка-хозяин, содержащая вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из вышеперечисленных антител.

В другом варианте изобретения предлагается способ продуцирования любого из вышеперечисленных антител, включающий культивирование заявленной выше клетки-хозяина в условиях, при которых вырабатывается антитело. В одном из аспектов способ дополнительно включает извлечение антитела из клетки-хозяина. В другом аспекте способ дополнительно включает очистку антитела.

В другом варианте изобретения предлагается иммуноконъюгат, содержащий любое из вышеперечисленных антител и цитотоксический агент. В другом варианте изобретения предлагается фармацевтический состав, содержащий любое из вышеперечисленных антител и фармацевтически приемлемый носитель. В одном из аспектов фармацевтический состав, дополнительно содержит дополнительный терапевтический агент. В одном из таких аспектов дополнительный терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент.

В другом варианте изобретения предлагается любое из вышеперечисленных антител для применения в качестве лекарственного средства. В другом варианте изобретения предлагается любое из вышеперечисленных антител для применения при лечении связанного с клеточным циклом заболевания или расстройства. В одном из аспектов связанное с клеточным циклом заболевание или расстройство выбрано из заболевания или расстройства, связанного с аберрантно ускоренным прогрессированием клеточного цикла и заболеванием или расстройством, связанным с аберрантно замедленным прогрессированием клеточного цикла. В одном из таких аспектов заболевание или расстройство, связанное с аберрантно ускоренным прогрессированием клеточного цикла, представляет собой рак. В другом таком аспекте, заболевание или расстройство, связанное с аберрантно замедленным прогрессированием клеточного цикла, выбрано из мышечного дегенеративного расстройства и нейродегенеративного расстройства.

В другом варианте изобретения предлагается применение любого из вышеперечисленных антител в производстве лекарственного средства. В одном из аспектов лекарственное средство применяется при заболевании или расстройстве, выбранном из рака, мышечного дегенеративного расстройства и нейродегенеративного расстройства. В другом варианте изобретения предлагается способ лечения индивидуума, страдающего заболеванием или расстройством, выбранным из рака, мышечного дегенеративного расстройства и нейродегенеративного расстройства, включающий введение указанному индивидууму эффективного количества любого из вышеперечисленных антител.

В другом варианте изобретения предлагается способ определения присутствия полиубиквитина или полиубиквитинированного белка в образце, в котором предполагают присутствие полиубиквитина или полиубиквитинированного белка, который включает обеспечение воздействия на образец по меньшей мере одним из вышеперечисленных антител и определение связывания по меньшей мере одного антитела с полиубиквитином или полиубиквитинированным белком в указанном образце. В другом варианте изобретения предлагается способ отделения полиубиквитинированного белка, содержащего связь С-конца с N-концом от полиубиквитинированного белка, не содержащего связи С-конца с N-концом, в образце, который включает приведение образца в контакт с по меньшей мере одним из вышеперечисленных антител. В другом варианте изобретения предлагается способ определения функции и/или активности полиубиквитина, содержащего связь С-конца с N-концом, в клетке или образце, который включает приведение клетки или образца в контакт с по меньшей мере одним из вышеперечисленных антител и оценку влияния указанной стадии контакта на клетку или образец.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1 иллюстрирует результаты пятна фага ТИФА, демонстрирующие относительные сигналы связывания на длине волны 450 нм для клонов 1D8, 1Е3, 1F4 и 1А10 с панелью убиквитиновых белков, как описано в Примере 1В. Каждый из клонов библиотеки Fab содержал метку gD, и показ Fab на фаге оценивали путем связывания с анти-gD антителом. Непокрытую ячейку использовали в качестве отрицательного контроля.

Фиг.2А и 2В иллюстрируют последовательности аминокислот легкой и тяжелой цепи Fab, полученных в Примере 1. Фиг.2А иллюстрирует последовательность легкой цепи клонов 1Е3, 1D8, 1F4 и 1А10 (SEQ ID NO:25-28, соответственно). Фиг.2В иллюстрирует выравнивание последовательности тяжелой цепи клонов 1Е3, 1D8, 1F4 и 1А10 (SEQ ID NO:29-32, соответственно). На Фиг.2А и 2В последовательности HVR для каждого клона показаны обведенными прямоугольником участками, причем первый прямоугольник показывает HVR-L1 (Фиг.2А) или HVR-H1 (Фиг.2В), второй прямоугольник показывает HVR-L2 (Фиг.2А) или HVR-H2 (Фиг.2В), и третий прямоугольник показывает HVR-L3 (Фиг.2) или HVR-H3 (Фиг.2В).

Фиг.3 иллюстрирует результаты 1С₅₀ конкуренции ТИФА для фага с целью измерения аффинности очищенных 1F4, 1D8 и 1Е3 Fab для линейного диубиквитина.

Фиг.4 иллюстрирует результаты анализа методом Вестерн-блота для определения способности Fab 1D8 и 1Е3 специфично распознавать панель диубиквитиновых белков в контексте иммобилизации.

Фиг.5А и 5В иллюстрируют последовательности аминокислот легкой и тяжелой цепи клонов созревшей аффинности, полученных в Примере 2 из кругов сортировки библиотеки созревания аффинности 1D8. Фиг.5А иллюстрирует последовательности легкой цепи клонов созревшей аффинности 1D8.3C2, 1D8.3F8 и 1D8.4F5 (SEQ ID NO:33-35, соответственно). Фиг.5А иллюстрирует последовательности 1D8 как SEQ ID NO:26. Фиг.5В иллюстрирует выравнивание последовательностей тяжелой цепи клонов созревшей аффинности 1D8.3C2, 1D8.3F8 и 1D8.4F5 (SEQ ID NO:36-38, соответственно). Фиг.5В иллюстрирует последовательности 1D8 как SEQ ID NO:30. Как на Фиг.5А, так и 5В, последовательности HVR для каждого клона показаны обведенными прямоугольниками участками, причем первый прямоугольник показывает HVR-L1 (Фиг.5А) или HVR-H1 (Фиг.5В), второй прямоугольник показывает HVR-L2 (Фиг.5А) или HVR-H2 (Фиг.5В), и третий прямоугольник показывает HVR-L3 (Фиг.5А) или HVR-H3 (Фиг.5В). Модификации аминокислот относительно материнской последовательности 1D8 обозначены серой заливкой.

Фиг.6 иллюстрирует результаты IC₅₀ конкуренции ТИФА для фага с целью измерения аффинности Fab 1D8, 1D8.3C2, 1D8.3F8 и 1D8.4F5 с линейным диубиквитином.

Фиг.7А и 7В иллюстрируют результаты исследований, в которых оценивали характеристики специфичности связывания мутантных вариантов созревшей аффинности в сравнении с материнским клоном 1Е3 и контрольными антителами. Связывание материнского клона 1Е3 и 11 одинарных мутантных вариантов созревшей аффинности, показанных на фаге, тестировали на предмет связывания с панелью убиквитиновых белков в анализе ТИФА. Связывание с анти-gD антителом использовали для оценки показа Fab на фаге, и не покрытые лунки использовали в качестве отрицательного контроля.

Фиг.8А и 8В иллюстрируют результаты исследований, в которых оценивали характеристики специфичности связывания одинарных мутантных и двойных мутантных вариантов в сравнении с материнским клоном 1Е3 и контрольными антителами, как описано в Примере 3. Связывание материнского клона 1Е3, 4 одинарных мутантных вариантов созревшей аффинности и 3 двойных мутантных вариантов созревшей аффинности, показанных на фаге, тестировали на предмет связывания с панелью убиквитиновых белков в анализе ТИФА. Связывание с анти-gD антителом использовали для оценки показа Fab на фаге, и не покрытые лунки использовали в качестве отрицательного контроля.

Фиг.9А и 9В иллюстрируют последовательности аминокислот легкой и тяжелой цепи Fab 1Е3, клоны созревшей аффинности, полученные в Примере 3 из кругов сортировки второй библиотеки созревания аффинности 1Е3 (1F11 и 3F5), мутация Y102L наблюдалась в клоне 4Е4 и тройном мутантном Fab, содержащем модификации аминокислот из клонов 1F11 и 3F5 и мутацию Y102L как описано в Примере 3Р. Фиг.9А иллюстрирует последовательности легкой цепи клонов созревшей аффинности для 1Е3, 1F11, 3F5, Y102L и 1F11/3F5/Y102L (SEQ ID NO:25, 193, 194, 195 и 94, соответственно). Фиг.9В иллюстрирует выравнивание последовательностей тяжелой цепи клонов созревшей аффинности для 1Е3, 1F11, 3F5, Y102L и 1F11/3F5/Y102L (SEQ ID NO:29, 196, 197, 198 и 95, соответственно). На Фиг.9А и 9В положения Kabat, служащие мишенью для вариации аминокислот во вторых библиотеках созревания аффинности для 1Е3 показаны очерченными прямоугольником участками. Модификации аминокислот относительно материнской последовательности 1Е3 выделены заливкой серым цветом.

На Фиг.10 проиллюстрированы анализы методом Вестерн-блоттинга связывания материнского 1Е3, одинарных и двойных мутантных IgG с линейным диубиквитином (серийные разведения 1000, 333, 111, 37 и 12 нг на полосу) и K63-связанным диубиквитином (1000 нг на полосу).

Фиг.11 иллюстрирует анализ методом Вестерн-блоттинга связывания материнского 1Е3, двойных и тройных мутантных IgG с линейным диубиквитином (серийные разведения 1000, 333, 111, 37 и 12 нг на полосу) и K63-связанным диубиквитином (1000 нг на полосу).

Фиг.12 иллюстрирует анализ методом Вестерн-блоттинга связывания Y1012L, мутантного Y102L T110A, а также IgG Y102L, T110A, 3F5 и 1F11, содержащих различные комбинации мутаций, с линейным диубиквитином (серийные разведения 1000, 333, 111, 37 и 12 нг на полосу) и K63-связанным диубиквитином (1000 нг на полосу).

Фиг.13 иллюстрирует анализ методом Вестерн-блоттинга связывания материнского 1Е3, одинарных, двойных и тройных мутантных IgG, как описано в Примере 3М, с линейным диубиквитином (серийные разведения 1000, 333, 111, 37 и 12 нг на полосу) и K63-связанным диубиквитином (1000 нг на полосу).

Фиг.14 иллюстрирует анализ методом Вестерн-блоттинга связывания 1Е3 и 1F11/3F5/Y102L IgG с двукратными серийными разведениями линейного диубиквитина (1000, 500, 250, 125, 63, 31 и 16 нг/полому, где указан градиент) или моноубиквитина, K11-связанного диубиквитина, K48-связанного диубиквитина и K63-связанного диубиквитина (1 мкг/полосу). В качестве контроля анализировали связывания анти-K63 gG, Apu3.A8, с двукратными серийными разведениями K63-связанного диубиквитина (1000, 500, 250, 125, 63, 31 и 16 нг/полосу, где указан градиент) или моноубиквитина, линейного диубиквитина, K11-связанного диубиквитина и K48-связанного диубиквитина (1 мкг/полосу). Окрашенный Coomassie гель (панель вверху слева) приведен для иллюстрации того, каким образом каждый из изученных убиквитинов мигрирует в гелях.

Фиг.15 иллюстрирует результаты экспериментов, в которых линейный моноубиквитин, полиубиквитин 2-7 (длиной от 2 до 7 субъединиц убиквитина), K48-связанный полиубиквитин 2-7 (длиной от 2 до 7 субъединиц убиквитина), K63-связанный полиубиквитин 2-7 (длиной от 2 до 7 субъединиц убиквитина) и K11-связанный полиубиквитин (1 мкг каждою на полису) подвергали иммуноблоттингу с пан-убиквитиновым антителом P4D1 (средняя панель) или 1F11/3F5/Y102L IgG (правая панель). Окрашивание Coomassie выявило состав образцов (левая панель). Показано короткое и длительное время контакта для Вестерн-блотов.

Фиг.16А и 16В иллюстрируют результаты экспериментов, в которых лизаты клеток HeLa S3, обработанных различными концентрациями TNFα и на протяжении различных периодов времени 5,8 мкМ MG132, подвергали иммуноблоттингу с гибридным антителом 1F11/3F5/Y102L для цепей линейного убиквитина или с антителом Apu3.A8 для цепей K63-связанного убиквитина. В качестве контроля по 250 нг очищенного линейного полиубиквитин 2-7 и K63-связанного полиубиквитина 2-7 анализировали на каждом геле (Фиг.16А). Для оценки уровня активации пути NFκB лизаты подвергали блоттингу на предмет уровней IκВα (Фиг.16 В). В качестве нагрузочного контроля проводили блоттинг лизатов на предмет β-тубулина.

Фиг.17 иллюстрирует результаты экспериментов иммунопреципитации с гибридным антителом против линейного полиубиквитина 1F11/3F5/Y102L, контрольным изотипом или анти-K52 антителом Apu3.A8. Эксперименты ИЛ выполняли в буфере ИП 4 М мочевины с тремя наборами условий (смесь всех цепей убиквитин, отсутствие линейных цепей убиквитина или только линейные цепи убиквитина). В качестве контроля по 1 мкг очищенного линейного полиубиквитина 2-7 и K63-связанного полиубиквитина 2-7 анализировали на каждом геле.

Фиг.18А и 18В иллюстрируют результаты экспериментов иммунопреципитации с использованием смесей 1:1 линейного полиубиквитина 2-7 и K63-связанного полиубиквитина 2-7 с антителом против линейного полиубиквитина 1F11/3F5/Y102L или анти-КбЗ антителом Apu3.A8 при различных концентрациях мочевины или в ФБРТ, которые подвергали иммуноблоттингу с 1F11/3F5/Y102L (против линейного) или Apu3.A8 (анти-K63). В качестве контроля по 1 мкг очищенного линейного полиубиквитина 2-7 и K63-связанного полиубиквитина 2-7 анализировали на каждом геле. Фиг.18А иллюстрирует результаты экспериментов ИП при 0М, 2М, 4М и 6М мочевины. Фиг.18В иллюстрирует результаты экспериментов ИП при 6М, 7 М и 8 М мочевины.

Фиг.19 иллюстрирует результаты экспериментов иммунопреципитации и иммуноблоттинга с использованием смеси 1:1:1:1 линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина 2-7 с антителом против линейного полиубиквитина 1F11/3F5/Y102L, контрольным изотипом или анти-K63-полиубиквитиновым антителом Apu3.A8, поперечно сшитым с гранулами Белка А при различных концентрациях мочевины. Антитела, используемые для иммуноблоттинга, представляли собой 1F11/3 F5/Y102L (против линейного), 2А3/2Е6 (анти-КП), Арu2.07 (анти-K48) или Apu3.A8 (анти-K63) IgG. В качестве контроля по 1 мкг очищенного линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина 2-7 анализировали на каждом геле.

Фиг.20 иллюстрирует результаты экспериментов иммунопреципитации и иммуноблоттинга с использованием смеси 1:1:1:1 линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина 2-7 с гибридным антителом против линейного полиубиквитина 1F11/3 F5/Y 102L, контрольным изотипом или анти-K63-полиубиквитиновым IgG антителом Apu3.A8, поперечно сшитым с гранулами Белка G при различных концентрациях мочевины. Антитела, используемые для иммуноблоттинга, представляли собой 1F11/3F5/Y102L (против линейного), 2А3/2Е6 (анти-КП), Apu2.07 (анти-K48) или Apu3.A8 (анти-K63) IgG. В качестве контроля по 1 мкг очищенного линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина 2-7 анализировали на каждом геле.

Фиг.21А иллюстрирует результаты экспериментов иммунопреципитации и иммуноблоттинга из смеси 1:1:1:1 линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина 2-7 с антителом против линейного полиубиквитина 1F11/3F5/Y102L, контрольным изотипом или анти-K63-полиубиквитиновым антителом Apu3.A8 при различных концентрациях мочевины. Антитела, используемые для иммуноблоттинга, представляли собой 1F11/3F5/Y102L (против линейного), 2А3/2Е6 (анти-K11), Apu2.07 (анти-K48) или Apu3.A8 (анти-K63) IgG. В качестве контроля по 500 нг очищенного линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина 2-7 анализировали на каждом геле.

Фиг.21В иллюстрирует результаты экспериментов иммунопреципитации из смеси 1:1:1:1 линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина 2-7 с гибридным антителом против линейного полиубиквитина 1F11/3F5/Y102L, контрольным изотипом или анти-K63-полиубиквитиновым антителом Apu3.A8 при различных концентрациях мочевины с разделением на геле SDS-PAGE и окрашиванием Coomassie. Показаны участки, вырезанные для масс-спектрометрии AQUA.

Фиг.21C представляет собой график, на котором указано количество в пикомолях связей полиубиквитина, идентифицированных масс-спектрометрией AQUA из иммунопреципитатов 1F11/3F5/Y102L, как показано на Фиг.24В (участок В и участок С) и описано в Примере 4D.

Фиг.21D представляет собой график, на котором указан состав связей полиубиквитиновых цепей, идентифицированных масс-спектрометрией AQUA из иммунопреципитатов 1F11/3F5/Y102L, как показано на Фиг.24В (участок В и участок С).

Фиг.21Е представляет собой график, на котором указан процент линейных цепей, извлеченных из иммунопреципитатов 1F11/3F5/Y102L, по данным масс-спектрометрии AQUA.

Фиг.22А иллюстрирует иммуноблоты с лизатами из клеток 293Т, трансфицированных плазмидой, чрезмерно экспрессирующей Hoil-1L и Hoip, или пустым вектором. Пятна зондировались на линейный полиубиквитин, Hoil-1L, Hoip и β-тубулин, как описано в Примере 4Е.

Фиг.22В иллюстрирует результаты экспериментов иммунопреципитации из лизатов клеток 293Т, трансфицированных плазмидой, чрезмерно экспрессирующей Hoil-1L и Hoip, или пустым вектором. Иммуноблоты зондировали на наличие линейного полиубиквитин или окрашивали Coomassie. Показанные участки окрашенного Coomassie геля вырезали для масс-спектрометрии AQUA.

Фиг.22С иллюстрирует график, на котором показан состав связей полиубиквитина, идентифицированный масс-спектрометрией AQUA, в иммунопреципитатах 1F11/3F5/Y102L из клеток, чрезмерно экспрессирующих Hoil-1L/Hoip, как проиллюстрировано на Фиг.22В.

Фиг.22D иллюстрирует иммунофлуоресценцию клеток HeLa S3, трансфицированных плазмидой, чрезмерно экспрессирующей Hoil-1L и Hoip, или пустым вектором, и окрашенных с использованием антитела против линейного полиубиквитина 1F11/3F5/Y102L. Добавление рекомбинантного линейного полиубиквитина длиной пять или семь субъединиц (*) создает конкуренцию за связывание с антитела против линейного полиубиквитина.

Фиг.23 иллюстрирует различные представления со-кристаллической структуры комплекса, образованного между фрагментом Fab 1F11/3F5/Y102L и линейным диубиквитином. А) 1F11/3F5/Y102L показан в виде эскиза внизу фигуры, и линейный диубиквитин показан как эскиз внутри модели заполненного пространства вверху. Показаны проксимальные и дистальные субъединицы убиквитина, а также линейная связь.

B) Эпитоп на линейном диубиквитине показан темно-серым цветом на поверхности диубиквитина, которая взаимодействует с 1F11/3F5/Y102L. Остатки, для которых по меньшей мере 25% доступной для растворителя площади поверхности спрятано в зоне контакта линейного диубиквитина и 1F11/3F5/Y102L и/или которые находятся в пределах 4,5 Å Fab, обозначены однобуквенным кодом аминокислоты и номером остатка. На Фиг.23В раскрыты остатки 31-37, 70-76 и 60-63 как SEQ ID NO:379-381, соответственно.

C) Паратоп на Fab 1F11/3F5/Y102L показан темно-серым цветом на поверхности Fab, которая взаимодействует с диубиквитином. Остатки, для которых по меньшей мере 25% доступной для растворителя площади поверхности спрятано в зоне контакта 1F11/3F5/Y102L и диубиквитина и/или которые находятся в пределах 4,5 Å диубиквитина, обозначены однобуквенным кодом аминокислоты и номером остатка. На Фиг.23С раскрыты остатки 95-99 и 52-56 как SEQ ID NO:378 и 377, соответственно.

Фиг.24 иллюстрирует дополнительные представления в увеличенном масштабе со-кристаллической структуры комплекса, образованного между фрагментом Fab 1F11/3F5/Y102L и линейным диубиквитином. А) Увеличенный масштаб иллюстрирует водородные связи, образованные между боковой цепью Gln56 тяжелой цепи и карбонильными группами основной цепи Gly75 и Gly76. Диубиквитин показан светлосерым, и Fab - темно-серым. В) Потенциальное электростатическое взаимодействие между Lys52 легкой цепи и Asp32 и диполем карбокси-концевого конца альфа-спирали диубиквитина. Диубиквитин показан светло-серым, и Fab - темно-серым. С) Гидрофобные взаимодействия между Leu 102 тяжелой цепи и Val2 и Leu4 каркаса 1 тяжелой цепи. Leu 102 находится на карбокси-конце CDR Н3. Диубиквитин показан светло-серым, и Fab - темно-серым.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

"Человеческий каркас-акцептор" для целей данного описания представляет собой каркас, содержащий последовательность аминокислот каркаса вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркаса вариабельного домена тяжелой цепи (VH), происходящие от каркаса человеческого иммуноглобулина или человеческого консенсусного каркаса, как определяется ниже. Человеческий каркас-акцептор, "происходящий от" каркаса человеческого иммуноглобулина или человеческого консенсусного каркаса, может содержать такую же последовательность аминокислот или он может содержать модификации последовательности аминокислот. В некоторых вариантах количество модификаций аминокислот составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. В некоторых вариантах последовательность человеческого каркаса-акцептора VL идентична последовательности каркаса человеческого иммуноглобулина VL или последовательности человеческого консенсусного каркаса.

"Аффинность" обозначает прочность общей суммы нековалентных взаимодействий между одинарным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, в данном описании "аффинность связывания" обозначает внутреннюю аффинность связывания, которая отображает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антитело и антиген). Аффинность молекулы Х к ее партнеру Y, в общем, может быть представлено константой диссоциации (Kd). Аффинность может быть измерена общими способами, известными в данной области, в том числе, описанными в данном описании. Конкретные иллюстративные и примерные варианты для измерения аффинности связывания описаны ниже.

Антитело "созревшей аффинности" обозначает антитело с одной или более модификаций в одном или более гипервариабельных участков (HVR), по сравнению с родительским антителом, которое не содержит таких модификаций, причем такие модификации приводят к улучшению аффинности антитела к антигену.

"Антитело-агонист" в данном описании представляет собой антитело, которое имитирует по меньшей мере один из видов функциональной активности целевого полипептида.

"Антитело-антагонист" или "блокирующее антитело" представляет собой антитело, которое подавляет или уменьшает биологическую активность антигена, с которым оно специфично связывается. Некоторые блокирующие антитела или антитела-антагонисты в существенной мере или полностью подавляют биологическую активность антигена.

Термин "антитело" в данном описании используется в самом широком смысле и включает различные структуры антител, в том числе, но, не ограничиваясь ими, моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифичные антитела (например, антитела с двойной специфичностью), и фрагменты антител, до тех пор, пока они демонстрируют желательную активность связывания с антигеном.

"Фрагмент антитела" обозначает молекулу, кроме интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, не ограничиваясь ими, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител (например, scFv); и полиспецифичные антитела, образованные фрагментами антител.

"Антитело, которое связывается с тем же эпитопом", что и референтное антитело, обозначает антитело, которое блокирует связывание референтного антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или более, и наоборот, референтное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или более. Пример конкурентного анализа предложен в данном описании.

Термины "антитело против полиубиквитина с линейной связью" и "антитело, которое связывается с полиубиквитином, содержащим линейную связь", обозначает антитело, которое способно к связыванию с полиубиквитином, содержащим линейную связь, с достаточной аффинностью, таким образом, что антитело пригодно в качестве диагностического и/или терапевтического агента для нацеливания на полиубиквитин, содержащий линейную связь. В одном из вариантов степень связывания антитела против полиубиквитина с линейной связью с не родственным, полиубиквитиновым белком, не содержащим линейной связи, составляет менее чем приблизительно 10% связывания антитела с полиубиквитином, содержащим линейную связь, по данным, например, радиоиммуноанализа (РИА). В некоторых вариантах константа диссоциации (Kd) антитела, которое связывается с полиубиквитином, содержащим линейную связь, составляет ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-8 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 M). В некоторых вариантах антитело против полиубиквитина с линейной связью связывается с эпитопом на полиубиквитине с линейной связью, который является консервативным для полиубиквитина с линейной связью от различных видов.

В данном описании термина "антитело против полиубиквитина (анти-полиубиквитиновое антитело)" обозначает антитело, которое способно специфично связываться с молекулой полиубиквитина.

В данном описании термины "антитело против убиквитина (анти-убиквитиновое антитело)" и "антитело против моноубиквитина (анти-моноубиквитиновое антитело)" используются равнозначно и обозначают антитело, которое способно специфично связываться с молекулой убиквитина.

Термин "химерное" антитело обозначает антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из конкретного источника или вида, в то время как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или вида.

"Класс" антитела обозначает тип константного домена или константного участка, определяемый его тяжелой цепью. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут дополнительно подразделяться на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, носят название α, δ, ε, γ и μ, соответственно,

Термин "цитотоксический агент" в данном описании обозначает субстанцию, которая подавляет или предупреждает функционирование клетки и/или вызывает гибель или уничтожение клетки. Цитотоксические агенты включают, но, не ограничиваясь ими, радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты или лекарственные средства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркаляторы); подавляющие рост агенты; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, например, низкомолекулярные токсины или обладающие ферментной активностью токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, в том числе, их фрагменты и/или варианты; и различные противоопухолевые или противораковые агенты, раскрытые ниже.

"Расстройство" представляет собой любое состояние, при котором можно получить благоприятный эффект от лечения антителом по изобретению. Это включает хронические и острые расстройства или заболевания, в том числе такие патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к возникновению расстройства, являющегося предметом интереса. Неограничивающие примеры расстройств, которые лечатся в данном изобретении, включают рак и гипотрофические расстройства, в том числе, но, не ограничиваясь ими, мышечные дегенеративные расстройства и нейродегенеративные расстройства.

"Эффекторные функции" обозначают такую биологическую активность, относящуюся к участку Fc антитела, которая варьирует с изотипом антитела. Примеры эффекторных функций антитела содержат: связывание Clq и комлементзависимую цитотоксичность (КЗЦ); связывание с рецептором Fc; антителозависимую, клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ); фагоцитоз; регуляцию вниз рецепторов на поверхности клетки (например, рецептор В-клеток); и активация В-клеток.

"Эффективное количество" средства, например, фармацевтического состава, обозначает эффективное количество, в таких дозах и в течение таких периодов времени, которые необходимы для достижения желательного терапевтического или профилактического результата.

Термин "участок Fc" в данном описании используется для определения С-концевого участка тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит по меньшей мере часть константного участка. Термин включает участки Fc с природной последовательностью и варианты участков Fc. В одном из вариантов участок Fc тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) участка Fc может присутствовать или отсутствовать. Если иное не определено в данном описании, нумерация остатков аминокислот на участке Fc или константном участке производится согласно системе нумерации ЕС, которая также носит название «индекс ЕС», как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Каркас" или "FR" обозначает остатки вариабельного домена, кроме остатков гипервариабельного участка (HVR). FR вариабельного домена, в общем, состоит из четырех доменов FR: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR, в общем, появляются в следующей последовательности в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Термины "полноразмерное антитело", "интактное антитело" и "цельное антитело" используются в данном описании равнозначно для обозначения антитела со структурой, в существенной мере сходной со структурой природного антитела или содержащее тяжелые цепи, которые содержат участок Fc, как определяется в данном описании.

Термины "клетка-хозяин", "линия клеток-хозяев" и "культура клеток-хозяев" используются равнозначно и обозначают клетки, в которые введена экзогенная нуклеиновая кислота, в том числе потомка таких клеток. Клетки-хозяева включают "трансформантов" и "трансформированные клетки", которые включают первично трансформированную клетку и потомка, полученного от нее, независимо от количества пассажей. Потомок может не быть полностью идентичным родительской клетке по содержанию нуклеиновой кислоты, но может содержать мутации. Мутантный потомок, который обладает такой же функцией или биологической активностью, какую показывает скрининг или по которой произведена селекция первично трансформированной клетки, включен в данное описание.

"Человеческое антитело" представляет собой такое, у которого последовательность аминокислот соответствует последовательности антитела, продуцированного человеком или клеткой человека или происходящего из другого источника, в котором применяются репертуары человеческих антитела или другие последовательности, кодирующие человеческое антитело. Данное определение человеческого антитела специфично исключает гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки.

"Человеческий консенсусный каркас" представляет собой каркас, в котором представлены остатки аминокислот, чаще всего появляющиеся при селекции последовательностей каркаса VL или VH человеческого иммуноглобулина. В общем, селекцию последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина производят из подгруппы последовательностей вариабельного домена. В целом, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу, как определено в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols.1-3. В одном из вариантов для VL, подгруппа представляет собой подгруппу каина I, как в Kabat с соавт., выше. В одном из вариантов для VH, подгруппа представляет собой подгруппу III, как в Kabat с соавт., выше.

"Гуманизированное" антитело обозначает химерное антитело, содержащее остатки аминокислот из нечеловеческих HVR и остатки аминокислот из человеческих FR. В некоторых вариантах гуманизированное антитело содержит в существенной мере все из по меньшей мере одного, и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или в существенной мере все HVR (например, CDR) соответствуют участкам нечеловеческого антитела, и все или в существенной мере все FR соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константного участка антитела, происходящего от человеческого антитела. "Гуманизированная форма" антитела, например, нечеловеческого антитела, обозначает антитело, которое подвергалось гуманизации.

Термин "гипервариабельный участок" или "HVR" в данном описании обозначает каждый из участков вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными с точки зрения последовательности и/или формы структурно определенных петель ("гипервариабельные петли"). В общем, природные четырехцепочечные антитела содержат шесть HVR; три в VH (H1, Н2, Н3), и три в VL (L1, L2, L3). HVR, в общем, содержат остатки аминокислот из гипервариабельных петель и/или из "определяющих комплементарность участков (CDR)", причем последним свойственна наиболее высокая изменчивость последовательности и/или участие в распознавании антигена. Примеры гипервариабельных петель, возникают из остатков аминокислот 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (HI), 53-55 (Н2), и 96-101 (Н3). (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Примеры CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3), возникающих из остатков аминокислот 24-34 LI, 50-56 L2, 89-97 L3, 31-35B HI, 50-65 Н2, и 95-102 Н3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) За исключением CDR1 в VH, в общем CDR содержат остатки аминокислот, которые образуют гипервариабельные петли. CDR также содержат "остатки, определяющие специфичность" или "ООС", которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. ООС содержатся в пределах участков CDR под названием «сокращенные-CDR» или «a-CDR». Примеры a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-Н3) возникают из остатков аминокислот 31-34 L1, 50-55 L2, 89-96 L3, 31-35B H1, 50-58 Н2 и 95-102 113. (См. Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008).) Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) нумеруются в данном описании согласно Kabat с соавт., выше.

"Иммуноконъюгат" представляет собой антитело, конъюгированное с одной или более гетерологичных молекул, в том числе, но, не ограничиваясь ими, цитотоксическим агентом.

"Индивидуум" или "субъект" представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают, не ограничиваясь ими, домашних животных (например, коровы, овцы, коты, собаки и лошади), приматов (например, человека и других приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых вариантах индивидуум или субъект является человеком.

"Выделенное" антитело представляет собой такое, которое отделено от компонента его природного окружения. В некоторых вариантах антитело очищено до чистоты более 95% или 99%, по данным, например, электрофореза (например, SDS-PAGE, изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), капиллярный электрофорез) или хроматографии (например, ионообменной или обращенно-фазовой ВЭЖХ). Обзора методов оценки чистоты антитела, см., например, в Flatman et al., J. Chromatogr. В 848:79-87 (2007).

"Выделенная" нуклеиновая кислота обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая отделена от компонента ее природного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты расположена вне хромосомы или в положении хромосомы, которое отличается от ее природного положения в хромосоме.

"Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело против полиубиквитина с линейной связью" обозначает одну или более молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих тяжелые и легкие цепи (или их фрагменты) антитела, в том числе такую молекулу(ы) нуклеиновой кислоты в одном векторе или отдельных векторах, причем такая молекула(ы) нуклеиновой кислоты присутствуют в одном или более положениях в клетке-хозяине.

В данном описании термины "полиубиквитин, содержащий линейную связь" и "полиубиквитин, содержащий связь С-конца с N-концом" взаимозаменяемы и обозначают молекулу полиубиквитина, содержащую по меньшей мере одну изопептидную связь между С-концом {например, С-концевой глицин) одного фрагмента убиквитина и N-концевой α-аминогруппой (например, N-концевой метионин) другого фрагмента убиквитина.

В данном описании "лизиновая связь" указывает на связь между одним фрагментом убиквитина и другим фрагментом убиквитина, в которой принимает участие остаток лизина {например, K6, K11, K27, K29, K33, K48 и/или K63).

Термин "моноклональное антитело" в данном описании обозначает антитело, полученное из популяции в существенной мере однородных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих природные мутации или появляющихся в ходе приготовления композиции моноклональных антител, причем такие варианты, в общем, присутствуют в незначительных количествах. В противоположность композициям поликлональных антител, которые обычно содержат различные антитела, направленные против различных детерминантов (эпитопы), каждое моноклональное антитело композиции моноклональных антител направлено против одного и того же детерминанта на антигене. Таким образом, прилагательное "моноклональный" указывает на характер антитела как полученного из в существенной мере однородной популяции антител, и не должно интерпретироваться как требование продуцирования антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые применяются в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены разнообразными методами, в том числе, но, не ограничиваясь ими, методом гибридомы, методами рекомбинации ДНК, методами показа фага и методами, в которых используются трансгенные животные, содержащие все или часть человеческих локусов иммуноглобулина, причем такие методы и другие примеры способов создания моноклональных антител описаны в данном описании.

"Оголенное антитело" обозначает антитело, которое не конъюгировано с гетерологичным фрагментом (например, цитотоксический фрагмент) или радиоактивной меткой. Оголенное антитело может присутствовать в фармацевтическом составе.

"Природные антитела" ссылаются на природные молекулы иммуноглобулина различной структуры. Например, природные IgG антитела представляет собой гетеротетрамерные гликопротеины размером приблизительно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, соединенных дисульфидными связями. От N-конца к С-концу, каждая тяжелая цепь содержит вариабельный участок (VII), также называемый тяжелым вариабельным доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, и далее три константных домена (СН1, СН2 и СН3). Подобным образом, от N-конца к С-концу, каждая легкая цепь содержит вариабельный участок (VL), также называемый легким вариабельным доменом или вариабельным доменом легкой цепи, и далее легкий константный домен (CL). Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности ее константного домена.

Термин "Листок-вкладыш" используется для обозначения инструкции, которая обычно вкладывается в коммерческие упаковки терапевтических продуктов и содержит информацию о показаниях, способе применения, дозах, способе введения, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или специальных предупреждениях, касающиеся применения такого терапевтического продукта.

"Процент (%) идентичности" последовательности аминокислот относительно референтной последовательности полипептида определяется как процент остатков аминокислот в последовательности-кандидате, которые идентичны остаткам аминокислот в референтной последовательности полипептида, после выравнивания последовательностей и введения промежутков, при необходимости, чтобы обеспечить максимальный процент идентичности последовательностей, но без рассмотрения любых консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения процента идентичности последовательностей аминокислот может быть проведено различными способами, которые находятся в пределах компетенции специалиста в данной области, например, с использованием публично доступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для обеспечения максимального выравнивания по полной длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей данного описания значения % идентичности последовательностей аминокислот генерируются с использованием компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа сравнения последовательностей ALIGN-2 была создана Genentech, Inc., и исходный код представлен с пользовательской документацией в Офисе Авторских Прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где он зарегистрирован в соответствии с регистрацией авторских прав США, № TXU510087. Программа ALIGN-2 публично доступна от Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния, или может быть скомпилирована из исходного кода. Программу ALIGN-2 необходимо компилировать для использования с операционной системой UNIX, в том числе цифровой UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей установлены программой ALIGN-2 и не изменяются.

В ситуациях, где ALIGN-2 используется для сравнения последовательностей аминокислот, % идентичности последовательностей аминокислот для данной последовательности аминокислот А, относительно или против данной последовательности аминокислот В (которая может альтернативно называться данной последовательностью аминокислот А, обладающей определенным % идентичности последовательности аминокислот, относительно или против данной последовательности аминокислот В) вычисляют, как указано ниже:

часть Х*100/Y,

где Х представляет собой количество остатков аминокислот, оцененных как идентичные совпадения программой выравнивания последовательностей ALIGN-2 в выравнивании А и В, полученном с помощью указанной программы, и где Y представляет собой общее количество остатков аминокислот в В. Следует понимать, что если длина последовательности аминокислот А не равна длине последовательности аминокислот В, % идентичности последовательностей аминокислот А к В не будет равен % идентичности последовательностей аминокислот В к А. Если конкретно не указано иное, все значения % идентичности последовательности аминокислот, используемые в данном описании, получены, как описано в предыдущем абзаце, с использованием компьютерной программы ALIGN-2.

Термин "фармацевтический состав" обозначает композицию, которая находится в форме, позволяющей эффективное проявление биологической активности активного ингредиента, содержащегося в данной композиции, и не содержащей дополнительных компонентов, которые были бы неприемлемо токсичными для субъекта, которому вводят композицию.

"Фармацевтически приемлемый носитель" обозначает ингредиент фармацевтического состава, кроме активного ингредиента, нетоксичный для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но, не ограничиваясь ими, буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант.

В данном описании термин "полиубиквитин" определен как все разновидности природных человеческих и синтетических полимерных цепей убиквитина, которые находятся в пределах человеческих и синтетических классов различных полимерных связей убиквитина, в том числе, но, не ограничиваясь ими, линейный полиубиквитин, K6-связанный полиубиквитин, K11-связанный полиубиквитин, K27-связанный полиубиквитин, K29-связанный полиубиквитин, K33-связанный полиубиквитин, K48-связанный полиубиквитин и K63-связанный полиубиквитин. Длина полиубиквитина может быть любой, и молекула содержит по меньшей мере два фрагмента убиквитина.

В данном описании "лечение" (и его грамматические вариации, такие как "лечить" или "терапия") обозначает клиническое вмешательство с целью изменения природного протекания у индивидуума, подлежащего лечению, и может проводиться для профилактики или в ходе протекания клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают, не ограничиваясь ими, предупреждение возникновения или рецидива заболевания, облегчения симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предупреждение метастаза, уменьшение скорости прогрессирования заболевания, облегчение или временное облегчение патологического состояния, и ремиссию или улучшение прогноза. В некоторых вариантах антитела по изобретению применяются для отодвигания развития заболевания или замедления прогрессирования заболевания.

В данном описании термины "убиквитин" и "моноубиквитин" используются равнозначно и обозначают любой природный убиквитин из любого источника-организма позвоночного, в том числе, млекопитающих, таких как приматы (например, человек) и грызуны (например, мыши и крысы), если только не указано иное. Термин включает "полноразмерный", необработанный убиквитин, а также любую укороченную или посттрансляционно модифицированную форму убиквитина, которая является результатом обработки в клетке, исключая молекулы, состоящие из множества фрагментов убиквитина. Термин также включает природные варианты убиквитина, например, укороченные варианты или аллельные варианты. Последовательность аминокислот для примера человеческого убиквитина показана в SEQ ID NO:97: MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG (SEQ ID NO:97). Убиквитин содержит по меньшей мере один остаток лизина в положении аминокислоты 6, аминокислоты 11, аминокислоты 27, аминокислоты 29, аминокислоты 33, аминокислоты 48 и/или аминокислоты 63 (отмечены полужирным начертанием шрифта в SEQ ID NO:97, выше).

В данном описании термин "убиквитиновый путь" обозначает биохимический путь в клетке или воссозданный in vitro, который включает убиквитин и/или полиубиквитин.

Термины "вариабельный участок" или "вариабельный домен" обозначает домен тяжелой или легкой цепи антитела, который принимает участие в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) природного антитела, в общем, обладают сходной структурой, причем каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR). (См., например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6^th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) Одинарный домен VH или VL может быть достаточным для обеспечения специфичности связывания с антигеном. Дополнительно, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, могут быть выделены с использованием домена VH или VL из антитела, который связывается с антигеном, с целью скрининга библиотеки комплементарных доменов VL или VH, соответственно. См., например, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al. Nature 352:624-628 (1991).

Термин "вектор" в данном описании обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную к распространению другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Термин включает вектор как самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, инкорпорированный в геном клетки-хозяина, в которую он введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы здесь и далее называются " векторами экспрессии".

II. КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ

В одном из аспектов изобретение частично основывается на создании антител, которые способны к специфичному распознаванию первой молекулы полиубиквитина, содержащей первую полиубиквитиновую связь, но не связываются специфично со второй молекуле полиубиквитина, содержащей вторую полиубиквитиновую связь. В некоторых вариантах предложены антитела, которые специфично связываются с линейным пилиубиквитином или полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом. Антитела по изобретению пригодны для исследований и, например, для диагностики или лечения, например, заболеваний и расстройств, связанных с аберрантным прогрессированием клеточного цикла.

Уникальные свойства антител против линейного полиубиквитина по изобретению делают их особенно пригодными для различения между формами полиубиквитин с разными видами связей в клеточной системе, не прибегая к неуклюжему и дорогому генетическому манипулированию или биофизическим методам, таким как масс-спектрометрия. Антитела против содержащего линейную связь полиубиквитина по изобретению могут использоваться для характеристики функции(й) и специфичной активности линейных полиубиквитинов, in vitro и in vivo. Антитела против содержащего линейную связь полиубиквитина по изобретению могут также использоваться для определения специфической роли линейных полиубиквитинов в развитии и патогенезе заболевания. Антитела против содержащего линейную связь полиубиквитина по изобретению дополнительно могут использоваться для лечения заболеваний, при которых один или более специфичных линейных полиубиквитинов аберрантно регулируются или аберрантно функционируют, не мешая нормальной активности полиубиквитинов, в отношении которых анти-полиубиквитиновые антитела не являются специфичными.

Описано вовлечение убиквитиновой системы в путь NFκ-B. Karin et al., Nature Rev. Immunol. 5:749-759 (2005) и Chen, Z.J., Nature Cel Biol. 7:758-765 (2005). Показано, что стимуляция клеток прововоспалительными цитокинами приводит к K63-связанному полиубиквитинированию белков RIP 1 и НЭМО, результатом чего становится активация 1кВ киназы (IKK). Tokunaga et al., Nature Cell Biol. 11: 123-132 (2009). Далее IKK полиубиквитинируется K48-связанным полиубиквитином, и затем разлагается, что приводит к активации NFκ-B. Id. Недавно также было показано, что КСЛЦУ активизирует путь NFκ-B, но не путь JNK, посредством линейного полиубиквитинирования NFκ-B. Id. NF-κВ также играет роль в пролиферации клеток и клеточном цикле. Многие виды рака демонстрируют аберрантную активацию NF-κВ, и угнетение NF-κВ подавляет пролиферацию раковых клеток. Garg and Aggarwal, Leukemia 16: 1053-68 (2002). Присутствие линейно-связанного полиубиквитина на белках, таких как NF-κВ, играет важную роль в модуляции активности NF-κВ и прогрессировании клеточного цикла. Таким образом, антитела и Fab по изобретению предлагают пригодные терапевтические средства для модуляции расстройств и патологических состояний, при которых регуляция клеточного цикла является аберрантной. В одном из вариантов антитела против линейного полиубиквитина по изобретению применяются для лечения заболеваний и расстройств, при которых прогрессирование клеточного цикла аберрантно регулируется вверх, что приводит к избыточному делению клеток, такому как рак. В другом варианте, антитела против полиубиквитина с линейной связью по изобретению применяются для лечения заболеваний и расстройств, при которых прогрессирование клеточного цикла аберрантно регулируется вниз, что приводит к недостаточному делению клеток и сопутствующему истощению или разрушению ткани. Примеры таких заболеваний включают, не ограничиваясь ими, мышечные дегенеративные расстройства и нейродегенеративные расстройства (в том числе, не ограничиваясь ими, синдром Шарко-Мари-Туз, полиомиелит, амиотрофный латеральный склероз и синдром Гийена-Барре).

В данном описании термины "расстройство пролиферации клетки" и "пролиферативное расстройство" обозначают расстройства, которые связаны с некоторой степенью аномальной пролиферации клеток. В одном из вариантов расстройство пролиферации клетки является раком.

Термины "рак" и "раковый" обозначают или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется неупорядоченным ростом/пролиферацией клеток. Примеры рака включают, не ограничиваясь ими, карциному, лимфому (например, ходжкинскую и неходжкинскую лимфому), бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких видов рака включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, печеночно-клеточный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак аппендикса, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак ободочной и прямой кишки, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, лейкоз и другие лимфопролиферативные расстройства, а также различные виды рака головы и шеи.

Термин "опухоль" в данном описании обозначает весь неопластический рост клетки и пролиферацию, злокачественные или доброкачественные, а также все предраковые и раковые клетки и ткани. Термины "рак", "раковый", "расстройство пролиферации клетки", "пролиферативное расстройство" и "опухоль" в данном описании не являются взаимоисключающими.

Термин "мышечное дегенеративное расстройство" обозначает или описывает физиологическое состояние у животных, в организме которых присутствуют мышцы, которое обычно характеризуется ухудшением или ослабеванием скелетной и/или гладкой мышцы, таким образом, что нормальная функция мышцы снижается. Примеры мышечных дегенеративных расстройств включают, не ограничиваясь ими, мышечную дистрофию, миотоническую дистрофию, врожденную миотонию, кахексию, саркопению, рассеянный склероз, амиотрофный латеральный склероз, синдром Айзека, синдром мышечной скованности, семейные периодические параличи, миопатию, миотонию, рабдомиолиз, мышечную атрофию, и различные виды мышечной слабости и ригидности мышц.

Термин "нейродегенеративное расстройство" обозначает или описывает физиологическое состояние у животных, организм которых содержит нервные клетки, которое обычно характеризуется поражением нервной ткани или ухудшением коммуникации между клетками нервной ткани. Примеры нейродегенеративных расстройств включают, не ограничиваясь ими, нейродегенеративные заболевания (в том числе, не ограничиваясь ими, заболевание с тельцами Леви, постполиомиелитный синдром, синдром Шая-Дрейджера, оливомостомозжечковую атрофию, болезнь Паркинсона, множественную системную атрофию, амиотрофный латеральный склероз, синдром Гийена-Барре, синдром Шарко-Мари-Туз, стрионигральную дегенерацию и разрушение нервной клетки/ткани, вызванное или связанное с таупатиями, прионные заболевания, бульбарный паралич, заболевание моторных нейроном, деменцию и гетеродегенеративные расстройства нервной системы (в том числе, не ограничиваясь ими, болезнь Канавана, болезнь Хантингтона, кероидлипофусциноз нейронала, болезнь Александера, синдром Туретта, синдром Менкеса, синдром Коккейна, синдром Галлервордена=Шпатца, болезнь Лафора, синдром Ретта, гепатолентикулярную дегенерацию, синдром Леш-Нейхана и синдром Унферрихта-Лундборга).

В другом аспекте антитела против содержащего линейную связь полиубиквитина по изобретению находят применение в качестве реактивов для обнаружения и выделения полиубиквитина, содержащего линейную связь, например, обнаружения полиубиквитина в различных типах клеток и тканей, в том числе, определение плотности полиубиквитин и распределения в популяциях клеток и в пределах конкретной клетки, а также сортировки клеток на основании присутствия или количества полиубиквитина. Еще в одном аспекте настоящие антитела против содержащего линейную связь полиубиквитина пригодны для создания антагонистов полиубиквитина с блокирующим характером активности, сходных с активностью антител-объектов изобретения. В качестве дополнительного примера, антитела против содержащего линейную связь полиубиквитина по изобретению могут применяться для идентификации других анти-полиубиквитиновых антител, которые связываются в существенной мере с тем же антигенным детерминантом(ами) полиубиквитина, что и антитела, приведенные в качестве примера в данном описании, включая линейные и конформационные эпитопы.

Антитела против содержащего линейную связь полиубиквитина по изобретению могут применяться в анализах, основанных на физиологических путях, в которых участвует полиубиквитин, для скрининга на низкомолекулярные антагонисты функции полиубиквитина с линейной связью. Например, поскольку известно, что линейно связанные цепи полиубиквитина необходимы для активации NFκB (Tokunaga et al. Nature Cell Biol. 11: 123-132 (2009)), активность антител против линейно связанного полиубиквитина для модулирования (регуляция вверх или вниз) активации NFκB в леченных клетках или тканях может сравниваться с активностью одного или более потенциальных низкомолекулярных антагонистов молекулы линейно связанного полиубиквитин в модулировании активации NFκxB.

А. ПРИМЕРЫ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ЛИНЕЙНО СВЯЗАННОГО ПОЛИУБИКВИТИНА

В одном из аспектов изобретения предлагаются выделенные антитела, которые связываются с линейным полиубиквитином или полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом. В некоторых вариантах антитело против линейно связанного полиубиквитина специфично связывается с полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом, но не связывается специфично с моноубиквитином. В некоторых вариантах антитело против линейно связанного полиубиквитина специфично связывается с полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом, но не связывается специфично с полиубиквитином, содержащим лизиновую связь (т.е. K6-, K11-, K27-, K29-, K33-, K48- и/или K63-связи).

В одним из аспектов изобретения предлагается антитело против линейно связанного полиубиквитина, содержащее участок HVR-H1, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:7, 10, 13, 16, 22 и 73-81. В одном из аспектов изобретения предлагается антитело, содержащее участок HVR-H2, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:8, 11, 14, 17, 23, 24 и 82-86. В одном из аспектов изобретения предлагается антитело, содержащее участок HVR-H3, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:9, 12, 15, 18 и 87-93.

В одном из аспектов изобретения предлагается антитело, содержащее участок HVR-H1, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:7, 10, 13, 16, 22 и 73-81, и участок HVR-H2, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:8, 11, 14, 17, 23, 24 и 82-86. В одном из аспектов изобретения предлагается антитело, содержащее участок HVR-H1, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:7, 10, 13, 16, 22 и 73-81, и участок HVR-H3, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:9, 12, 15, 18 и 87-93. В одном из аспектов изобретения предлагается антитело, содержащее участок HVR-H2, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:8, 11, 14, 17, 23, 24 и 81-85, и участок HVR-H3, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:9, 12, 15, 18 и 86-92.

В одном из аспектов изобретения предлагается антитело, содержащее участок HVR-L1, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:1, 4, 19 и 50-57. В одном из аспектов изобретения предлагается антитело, содержащее участок HVR-L2, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:2 и 58-62. В одном из аспектов изобретения предлагается антитело, содержащее участок HVR-L3, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:3, 5, 6, 20, 21 и 64-72.

В одном из аспектов изобретения предлагается антитело, содержащее участок HVR-L1, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:1, 4, 19 и 50-57, и участок HVR-L2, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:2 и 58-63. В одном из аспектов изобретения предлагается антитело, содержащее участок HVR-L1, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:1, 4, 19 и 50-57, и участок HVR-L3, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SLQ ID NO:3, 5, 6, 20, 21 и 64-72. В одним из аспектов изобретения предлагается антитело, содержащее участок HVR-L2, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:2 и 58-63, и участок HVR-L3, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:3, 5, 6, 20, 21 и 64-72.

В одном из аспектов изобретения предлагается антитело, содержащее по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или все шесть из следующего:

(i) последовательность HVR-H1, содержащая по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:7, 10, 13, 16, 22 и 73-81;

(ii) последовательность HVR-H2, содержащая по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:8, 11, 14, 17, 23, 24 и 82-86;

(iii) последовательность HVR-H3, содержащая по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:9, 12, 15, 18 и 87-93;

(iv) последовательность HVR-L1, содержащая по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:1,4, 19 и 50-57;

(v) последовательность HVR-L2, содержащая по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:2 и 58- 63; и

(vi) последовательность HVR-L3, содержащая по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:3, 5, 6, 20, 21 и 64-72.

В одном из аспектов изобретения предлагается антитело, которое специфично связывается с полиубиквитином, содержащим линейную связь, с высокой аффинностью, но при этом связывается с полиубиквитином, содержащим какую-либо другую лизиновую связь, со значительно меньшей аффинностью, которое содержит по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или все шесть из следующего:

(i) последовательность HVR-H1, содержащая по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:7, 10, 13, 16, 22 и 73-81;

(ii) последовательность HVR-H2, содержащая по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:8, 11, 14, 17, 23, 24 и 82-86;

(iii) последовательность HVR-H3, содержащая по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:9, 12, 15, 18 и 87-93;

(iv) последовательность HVK-L1, содержащая ни меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:1, 4, 19 и 50-57;

(v) последовательность HVR-L2, содержащая по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:2 и 58- 63; и

(vi) последовательность HVR-L3, содержащая по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:3, 5, 6, 20, 21 и 64-72.

В одном из аспектов изобретения предлагаются антитела, содержащие последовательности HVR тяжелой цепи, как проиллюстрировано на Фиг.2В, 5В или 9В. В одном из вариантов антитела содержат последовательности HVR легкой цепи, как проиллюстрировано на Фиг.2А, 5А или 9А. В одном из вариантов антитела содержат последовательности HVR тяжелой цепи, как проиллюстрировано на Фиг.2В, 5В или 9В, и последовательности HVR легкой цепи, как проиллюстрировано на Фиг.2А, 5А или 9А. В одном из вариантов антитела содержат последовательности HVR легкой цепи, как проиллюстрировано в Табл. 5 и 7. В одном из вариантов изобретения предлагаются антитела, содержащие последовательности HVR тяжелой цепи, как проиллюстрировано в Табл. 5 и 7. В одном из вариантов антитела содержат последовательности HVR тяжелой цепи, как проиллюстрировано в Табл. 5 и 7, и последовательности HVR легкой цепи, как проиллюстрировано в Табл. 5 и 7.

Некоторые варианты антител по изобретению содержат вариабельный домен легкой цепи гуманизированного 4D5 антитела (huMAb4D5-8) (ГЕРЦЕПТИН®, Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, СА, США) (также ссылка в патенте США 6,407,213 и Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93), как проиллюстрировано в SEQ ID NO:98 ниже.

(Остатки HVR подчеркнуты)

В одном из вариантов последовательность вариабельного домена легкой цепи huMAb4D5-8 модифицирована в одном или более положений 28, 30, 31, 53, 66 и 91 (Asp, Asn, Thr, Phe, Arg и His, как показано выше полужирным начертанием шрифта/курсивом, соответственно). В одном из вариантов модифицированная последовательность huMAb4D5-8 содержит Ser в положении 28, Ser в положении 30, Ser в положении 31, Ser в положении 53, Gly в положении 66 и/или Ser в положении 91.

Соответственно, в одном из вариантов антитело по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность, проиллюстрированную в SEQ ID NO:99 ниже:

(Остатки HVR подчеркнуты)

Замененные остатки относительно huMAb4D5-8 показаны выше полужирным начертанием шрифта/курсивом.

Антитела по изобретению могут содержать любую пригодную последовательность вариабельного домена каркаса, при условии, что активность связывания с линейно связанным полиубиквитином в существенной мере сохраняется. Например, в некоторых вариантах, антитела по изобретению содержат консенсусную последовательность каркаса тяжелой цепи человека подгруппы III. В одном из вариантов таких антител, консенсусная последовательность каркаса содержит замену в положении 71, 73, 78 и/или 102. В некоторых вариантах таких антител, положение 71 представляет собой А, 73 представляет собой Т, 78 представляет собой А и/или 102 представляет собой L. В одном из вариантов такие антитела содержат последовательности каркаса вариабельного домена тяжелой цепи huMAb4D5-8 (ГЕРЦЕПТИН®, Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния, США) (также ссылка в патентах США 6,407,213 и 5,821,337, и Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93). В одном из вариантов такие антитела дополнительно содержат консенсусную последовательность каркаса легкой цепи человека κ1. В одном из вариантов такие антитела содержат, по меньшей мере одну, две или все из последовательностей HVR легкой цепи SEQ ID NO:1-6, 19-21 and 50-72. В одном из вариантов такие антитела содержат последовательности HVR легкой цепи huMAb4D5-8e как описано в патентах США 6,407,213 и 5,821,337. В одном из вариантов такие антитела содержат последовательности вариабельного домена легкой цепи huMAb4D5-8 (SEQ ID NO:98 и 99) (ГЕРЦЕПТИН®, Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния, США) (также ссылка в патентах США 6,407,213 и 5,821,337, и Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93).

В одном из вариантов происходит созревание аффинности антитела по изобретению, чтобы получить желательную аффинность связывания с мишенью. В одном из примеров антитело созревшей аффинности по изобретению, которое специфично связывается с линейно связанным полиубиквитином с высокой аффинностью, но связывается с полиубиквитином, содержащим лизиновую связь, со значительно меньшей аффинностью, содержит в HVR-H1 замену аминокислоты в положении 32. В другом примере, антитело созревшей аффинности по изобретению, которое специфично связывается с линейно связанным полиубиквитином, содержащим лизиновую связь, со значительно меньшей аффинностью, содержит замену в HVR-H2 в положениях аминокислот 50, 54 и/или 56. В другом примере антитело созревшей аффинности по изобретению, которое специфично связывается с линейно связанным полиубиквитином, содержащим лизиновую связь, со значительно меньшей аффинностью, содержит замену в HVR-H3 в положении аминокислоты 103. В другом примере антитело созревшей аффинности по изобретению, которое специфично связывается с линейно связанным полиубиквитином с высокой аффинностью, но связывается с полиубиквитином, содержащим другие лизиновые связи, со значительно меньшей аффинностью, содержит замену в HVR-L1 в положениях аминокислот 28, 30, 31 и/или 32. В другом примере, антитело созревшей аффинности по изобретению, которое специфично связывается с линейно связанным полиубиквитином с высокой аффинностью, но связывается с полиубиквитином, содержащим другие лизинивые связи, со значительно меньшей аффинностью, содержит замену в HVR-L3 в положениях аминокислот 92, 93 и/или 94. В другом примере, антитело созревшей аффинности по изобретению, которое специфично связывается с линейно связанным полиубиквитином с высокой аффинностью, но связывается с полиубиквитином, содержащим другие лизиновые связи, со значительно меньшей аффинностью, содержит замену в HVR-L2 в положении аминокислоты 52.

В одном из вариантов антитело по изобретению содержит по меньшей мере одну последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:29-32, 36-38, 95 и 196-198. В одном из вариантов антитело по изобретению содержит по меньшей мере один вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO:25-28, 33-35, 94 и 193-195. В одном из вариантов антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:29-32, 36-38, 95 и 196-198, а также содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей SEQ ID NO:25-28, 33-35, 94 и 193-195. В других вариантах антитело по изобретению, соответствующее конкретному номеру клона, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, как проиллюстрировано на Фиг.2В, 5В или 9В для указанного номера клона. В других вариантах антитело по изобретению, соответствующее конкретному номеру клона, содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность FJVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, как проиллюстрировано на Фиг.2А, 5А и 9А для указанного номера клона. В других вариантах антитело по изобретению, соответствующее конкретному номеру клона, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, как проиллюстрировано на Фиг.2В, 5В или 9В для указанного номера клона, а также содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, как проиллюстрировано на Фиг.2А, 5А и 9А, для указанного номера клона.

В одном из аспектов изобретения предлагается антитело, которое конкурирует с любым из вышеперечисленных антител за связывание с линейно связанным полиубиквитином. В одном из аспектов изобретения предлагается антитело, которое связывается с таким же антигенным детерминантом на линейно связанном полиубиквитине, как любое из вышеперечисленных антител.

Как показами в данном описании, антитела но изобретению специфично связываются с выделенным полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом. Как показано в данном описании, антитела по изобретению также специфично связываются с полиубиквитином, содержащим линейную связь С-конца с N-концом, если такой полиубиквитин присоединен к гетерологичному белку.

В любом из упомянутых выше вариантов антитело против линейно связанного полиубиквитина гуманизировано. В одном из вариантов антитело против линейно связанного полиубиквитина содержит HVR, как в любом из упомянутых выше вариантов, и дополнительно содержит человеческий каркас-акцептор, например, человеческий каркас иммуноглобулина или консенсусный человеческий каркас. В другом варианте антитело против линейно связанного полиубиквитина содержит HVR, как в любом из упомянутых выше вариантов, и дополнительно содержит VH, содержащий последовательность FR1, FR2, FR3 или FR4 любой из SEQ ID NO:29-32, 36-38 и 95. В другом варианте антитело против линейно связанного полиубиквитина содержит HVR, как в любом из упомянутых выше вариантов, и дополнительно содержит VL, содержащий последовательность FR1, FR2, FR3 или FR4 любой из SEQ ID NO:25-28, 33-35, 94 и 193-195.

В другом аспекте антитело против линейно связанного полиубиквитина содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH) по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%о, 99% или 100% идентичную последовательности аминокислот любой из SEQ ID NO:29-32, 26-38, 95 и 196-198. В некоторых вариантах последовательности VH, идентичные по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержат замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно референтной последовательности, но антитело против линейно связанного полиубиквитина, содержащее такую последовательность, сохраняет способность связываться с линейно связанным полиубиквитином. В некоторых вариантах общее количество от 1 до 10 аминокислот заменены, вставлены и/или удалены в любой из SEQ ID NO:29-32, 36-38, 95 и 196-198. В некоторых вариантах замены, вставки или делеции осуществляются в участках за пределами HVR (т.е. в FR). Необязательно, антитело против линейно связанного полиубиквитина содержит последовательность VH любой из SEQ ID NO:29-32, 36-38, 95 и 196-198, в том числе, посттрансляционные модификации такой последовательности.

В другим аспекте предлагается антитело против линейно связанного полиубиквитина, причем указанное антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), последовательность которого по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности аминокислот любой из SEQ ID NO:25-28, 33-35, 94 и 193-195. В некоторых вариантах последовательность VL, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно референтной последовательности, но антитело против линейно связанного полиубиквитина, содержащее такую последовательность, сохраняет способность связываться с линейно связанным полиубиквитином. В некоторых вариантах общее количество от 1 до 10 аминокислот заменено, вставлено и/или удалено в любой из SEQ ID NO:25-28, 33-35, 94 и 193-195. В некоторых вариантах замены, вставки или делеции происходят в участках за пределами HVR (т.е. в FR). Необязательно, антитело против линейно связанного полиубиквитина содержит последовательность VL в любой из SEQ ID NO:25-28, 33-35, 94 и 193-195, в том числе, посттранеляционные модификации такой последовательности.

В другом аспекте предлагается антитело против линейно связанного полиубиквитина, причем указанное антитело содержит VH, как в любом из вариантов, предложенных выше, и VL, как в любом из вариантов, предложенных выше. В одном из вариантов антитело содержит последовательности VH и VL любой из SEQ ID NO:29-32, 36-38, 95 и 196-198 и SEQ ID NO:25-28, 33-35, 94 и 193-195, соответственно, в том числе посттрансляционные модификации таких последовательностей.

В дальнейшем аспекте изобретения антитело против линейно связанного полиубиквитина согласно любому из упомянутых выше вариантов представляет собой моноклональное антитело, в том числе химерное, гуманизированное или человеческое антитело. В одном из вариантов антитело против линейно связанного полиубиквитина представляет собой фрагмент антитела, например, Fv, Fab, Fab', scFv, диатело или фрагмент F(ab')₂. В другом варианте антитело представляет собой полноразмерное антитело, например, интактное антитело IgG1 или антитело другого класса или изотипа, как определяется в данном описании.

Предлагаются композиции, содержащие по меньшей мере одно антитело против линейно связанного полиубиквитина или по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий последовательности, кодирующие антитело против линейно связанного полиубиквитина. В некоторых вариантах композиция может быть фармацевтическим составом. В данном описании композиции содержат одно или более антител, которые связываются с одним или более полиубиквитином, и/или один или более полинуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие одно или более антител, которые связываются с одним или более полиубиквитинов. Такие композиции, могут дополнительно содержать пригодные носители, такие как фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, включая буферы, хорошо известные в данной области.

В дальнейшем аспекте антитело против линейно связанного полиубиквитина согласно любому из упомянутых выше вариантов, может обладать любым из признаков, отдельно или в комбинации, как описано в Разделах 1 -7 ниже:

1. Аффинность антител

В некоторых вариантах константа диссоциации (Kd) антитела, предложенного в данном описании, составляет ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-13 до^-13 М).

В одном из вариантов Kd измеряют в анализе связывания радиомеченого антигена (РИА), выполняемом с версией Fab целевого антитела и его антигеном, как описано в следующем анализе. Аффинность связывания Fab с антигеном в растворе измеряют путем уравновешивания Fab с минимальной концентрацией меченого (¹²⁵I) антигена в присутствии серий титрования немеченного антигена, с последующим захватом связанного антигена с помощью планшета, покрытого анти-Fab антителом (см., например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Для определения условий анализа мультилуночные планшеты для микротитрования (Thermo Scientific) покрывают на протяжении ночи 5 мкг/мл захватывающего анти-Fab антитела (Cappel Labs) в 50 мМ натрия карбоната (рН 9,6), и далее блокируют 2% (масс/об) альбумина телячьей сыворотки в ФБР в течение 2-5 час при комнатной температуре (приблизительно 23°С). На не адсорбирующем планшете (Nunc #269620), 100 пМ или 26 пМ [¹²⁵I]-антигена смешивают с серийными разведениями целевого Fab (например, согласующегося с оценкой Fab-12 анти-ФРЭС антитела, в Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Целевой Fab далее инкубируют на протяжении ночи; однако, инкубация может продолжаться в течение более длительного периода (например, приблизительно 65 час), чтобы гарантировать, что равновесие достигнуто. Затем, смеси переносят на планшет захвата для инкубации при комнатной температуре (например, в течение 1 час). Далее раствор удаляют, и планшет промывают 8 раз 0,1% раствором полисорбата 20 (ТВИН-20®) в ФБР. После высушивания планшетов добавляют 150 мкл/лунку сцинтилляционного реактива (МИКРОСЦИНТ-20™; Packard), и планшеты считывают на гамма-счетчике ТОПКАУНТ™ (Packard) в течение 10 мин. Концентрации каждого Fab, которые меньше или равны 20% максимального связывания, выбирают для применения в конкурентных анализах связывания.

Согласно другому варианту, Kd измеряют с использованием анализа резонанса поверхностного плазмона, используя BIACORE^®-2000 или BIACORE^®-3000 (BIAcore, Inc., Пискатауэй, Нью-Джерси) при 25°С, например, с помощью чипсов с иммобилизированным антигеном СМ5 при ~10 резонансных единицах (РЕ). Если коротко, чипы биодатчика с карбоксиметилированным декстраном (СМ5, BIACORE, Inc.) активируют N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида гидрохлоридом (ЭДК) и N-гидроксисукцинимидом (НГС) согласно инструкциям поставщика. Антиген разбавляют 10 мМ раствором натрия ацетата, рН 4,8, до концентрации 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инъекцией со скоростью потока 5 мкл/мин до достижения приблизительно 10 резонансных единиц (РЕ) сочетанного белка. После инъекции антигена, 1 М этаноламина вводят для блокирования не прореагировавших групп. Для измерений кинетики, двукратные серийные разведения Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) вводят в ФБР, содержащем 0,05% поверхностно-активного вещества полисорбата 20 (ТВИН-20™) (ФБРТ) при 25°С со скоростью потока приблизительно 25 мкл/мин. Значения скорости (k_on) ассоциации и скорости диссоциации (k_off) вычисляют с использованием простой модели связывания 1:1 по Ленгмюру (BIACORE^® Evaluation Software версия 3.2), путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) вычисляют как соотношение k_off/k_on. См., например, Chen et al., J. Моl. Biol. 293:865-881 (1999). Если скорость ассоциации превышает 10⁶ М^-1с^-1 по данным анализа резонанса поверхностного плазмона, описанного выше, то скорость ассоциации может быть определена с применением техники гашения флуоресценции, которая измеряет возрастание или снижение интенсивности эмиссии флуоресценции (возбуждение = 295 нм; эмиссия = 340 нм, попоено-пропускающий, 16 нм) при 25°С 20 нМ антитела против антитела (фирма Fab) в ФБР, рН 7,2, в присутствии повышенных концентраций антигена, что измеряется с помощью спектрометра, такого как оборудованный остановкой потока спектрофотометр (Aviv Instruments) или спектрофотометра SLM-AMINCO™ серии 8000 (ThennoSpectronic) с перемешиваемой кюветой. Другие химические реакции сцепления антигена-мишени с поверхностью чипа (например, стрептавидин/биотин, гидрофобное взаимодействие или химия дисульфида) также легко доступны вместо методологии аминного сочетания (чип СМ5), описанной выше, как будет понятно среднему специалисту в данной области.

2. Фрагменты антител

В некоторых вариантах антитело, предложенное в данном описании, представляет собой фрагмент антитела.

Фрагменты антитела включают, не ограничиваясь ими, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv и фрагменты scFv, а также другие фрагменты, описанные ниже. Обзор некоторых фрагментов антител см. в Hudson et al. Nat. Med. 9: 129-134 (2003). Обзор фрагментов scFv см., например, в Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269-315 (1994); см. также WO 93/16185; и патенты США 5,571,894 и 5,587,458. Обсуждение фрагментов Fab и F(ab')₂, содержащих остатки эпитопа связывания с рецептором реутилизации и обладающих увеличенным периодом полувыведения in vivo, см. в патенте США 5,869,046.

Диатела представляют собой фрагменты антител с двумя сайтами связывания с антигеном, которые могут быть двухвалентными или биспецифичными. См., например, ЕР 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); и Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Триатела и тетратела также описаны в Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003).

Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие полноразмерный вариабельный домен тяжелой цепи антитела или его часть или полноразмерный вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. В некоторых вариантах однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (Domantis, Inc., Waltham, МА; см., например, патент США 6,248,516 В1).

Фрагменты антитела могут быть получены различными способами, в том числе, не ограничиваясь ими, протеолитическим расщеплением интактного антитела, а также путем выработки рекомбинантными клетками-хозяевами (например, Е. coli или фаг), как описано в данном описании.

3. Химерные и гуманизированные антитела

В некоторых вариантах антитело, предложенное в данном описании, представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в патенте США 4,816,567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984). В одном из примеров, химерное антитело содержит нечеловеческий вариабельный участок (например, вариабельный участок, происходящий из организма мыши, крысы, хомяка, кролика или негуманоидного примата, такого как обезьяна) и человеческий константный участок. В дальнейшем примере химерное антитело представляет собой антитело "с переключением синтеза классов", для которого класс или подкласс был изменен по сравнению с родительским антителом. Химерные антитела содержат их антигенсвязывающие фрагменты.

В некоторых вариантах химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Обычно, нечеловеческое антитело гуманизируют для снижения иммуногенности для человека, при сохранении специфичности и аффинности родительского нечеловеческого антитела. В общем, гуманизированное антитело содержит один или более вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR (или их части) происходят из нечеловеческого антитела, и FR (или их части) происходят из последовательностей человеческих антител. Гуманизированное антитело необязательно также содержит по меньшей мере часть человеческого константного участка. В некоторых вариантах некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками нечеловеческого антитела (например, антитела из которого получены остатки HVR), например, с целью восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.

Гуманизированные антитела и способы их создания рассмотрены, например, в Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008), и дополнительно описаны, например, в Riechmann et al. Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); патенты США 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, и 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (описание пересадки SUR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (описание "изменения поверхности"); DaU'Acqua et al. Methods 36:43-60 (2005) (описание "перетасовки FR"); и Osboum et al. Methods 36:61-68 (2005) и Klimka et al, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (описание подхода "управляемой селекции" к перетасовке FR).

Человеческие каркасные участки, которые могут применяться для гуманизации, включают, не ограничиваясь ими: каркасные домена, выбранные с помощью метода "наилучшего соответствия" (см., например, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); каркасные домены, происходящие из консенсусной последовательности человеческих антител конкретной подгруппы вариабельных участков легкой или тяжелой цепи (см., например, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); и Presta et al. J. Immunol, 151:2623 (1993)); зрелые человеческие (содержащие соматические мутации) каркасные участки или каркасные участки зародышевой линии человека (см., например, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)); и каркасные участки, полученные в результате скрининга библиотек FR (см., например, Васа et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997) и Rosok et al., J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996)).

4. Человеческие антитела

В некоторых вариантах антитело, предложенное в данном описании, представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела могут быть получены с применением различных способов, известных в данной области. В общем, человеческие антитела описаны в van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Phannacol. 5:368-74 (2001) и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

Человеческие антитела могут быть получены путем введения иммуногенного агента трансгенному животному, организм которого модифицирован таким образом, чтобы вырабатывать интактные человеческие антитела или интактные антитела с человеческими вариабельными участками в ответ на антигенную нагрузку. Организм таких животных обычно содержит все или часть человеческих локусов иммуноглобулина, которые заменяют эндогенные локусы иммуноглобулина, или которые присутствуют внехромосомно, или интегрированы случайным образом в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей, эндогенные локусы иммуноглобулина, в общем, инактивированы. Обзор методов получения человеческих антител от трансгенных животных см. в Lonberg, Nat. Biotech. 23; 1117-1125 (200;)). Дополнительно см., например, патенты США 6,075,181 и 6,150,584, описывающие технологию XENOMOUSE™; патент США 5,770,429, описывающий технологию HUMAB®; патент США 7,041,870, описывающий технологию K-М MOUSE®, и публикацию Патентной заявки США №2007/0061900, описывающую технологию VELOCIMOUSE®). Человеческие вариабельные участки из интактных антител, генерируемых такими животными, могут быть дополнительно модифицированы, например, путем комбинации с другим человеческим константным участком.

Человеческие антитела также могут быть получены способами на основе гибридом. Описаны линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека для выработки человеческих моноклональных антител. (См., например, Kozbor J. Immunol, 133: 3001 (1984); Brodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boemer et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Человеческие антитела, генерируемые посредством технологии гибридомы В-клеток человека, также описаны в Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Дополнительные способы включают описанные, например, в патенте США 7,189,826 (описание выработки моноклональных человеческих антител IgM линиями клетки гибридомы) и Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (описание человеческо-человеческих гибридом). Технология человеческой гибридомы (технология Trioma) также описана в Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) и Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

Дополнительно человеческие антитела могут быть получены путем выделения последовательностей вариабельного домена клона Fv, выбранных из полученных от человека библиотек показа фага. Такие последовательности вариабельного домена далее могут быть комбинированы с желательным человеческим константным доменом. Ниже описаны техники селекции человеческих антител из библиотек антител.

5. Получение библиотек антител

Антитела по изобретению могут быть выделены путем екрининга комбинаторных библиотек на антитела с желательной активностью или видами активности. Например, разнообразные методы известны в данной области для генерации библиотек показа фага и екрининга таких библиотек на антитела, обладающие желательными характеристиками связывания. Такие способы рассмо1рены, например, в Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed.. Human Press, Totowa, NJ, 2001) и дополнительно описаны, например, в McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34); 12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004).

В некоторых методах показа фага, репертуары генов VH и VL отдельно клонируются методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и случайно рекомбинируются в библиотеках фага, скрининг которых может быть проведен в дальнейшем на предмет антигенсвязывающего фага, как описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Фаг обычно показывает фрагменты антител, как одноцепочечные Fv (scFv) фрагменты или фрагменты Fab. Библиотеки из иммунизированных источников предлагают антитела с высокой аффинностью к иммуногенному агенту без необходимости в конструировании гибридом. Альтернативно, наивный репертуар может быть клонирован (например, от человека), чтобы предложить единый источник антител к широкому спектру неауто-, а также аутоантигенов, без какой-либо иммунизации, как описано Griffiths et al., ЕМВО J, 12: 725-734 (1993). И, наконец, наивные библиотеки также могут быть получены синтетически, путем клонирования не реаранжированных сегментов V-гена из стволовых клеток и применения праймеров ПЦР, содержащих случайную последовательность, для кодирования гипервариабельных участков CDR3 и для осуществления реаранжировки in vitro, как описано Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992). Патентные публикации, описывающие фаговые библиотеки человеческих антител, включают, например: патент США 5,750,373 и Патентные публикации США 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.

Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, в данном описании считаются человеческими антителами или фрагментами человеческих антител.

6. Полиспецифичные антитела

В некоторых вариантах антитело, предложенное в данном описании, представляет собой полиспецифичное антитело, например, антитело с двойной специфичностью. Полиспецифичные антитела представляют собой моноклональные антитела, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере с двумя различными сайтами. В некоторых вариантах один из видов специфичности связывания касается линейно связанного полиубиквитина, и другой касается любого другого антигена. В некоторых вариантах антитела с двойной специфичностью могут связываться с двумя различными эпитопами на полиубиквитине, содержащем линейную связь,. Дополнительно антитела с двойной специфичностью могут применяться для локализации цитотоксических агентов на клетках, которые экспрессируют полиубиквитин, содержащий линейную связь. Антитела с двойной специфичностью могут быть получены как полноразмерные антитела или фрагменты антител.

Способы создания полиспецифичных антител включают, не ограничиваясь ими, рекомбинантную со-экспрессию двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина с различной специфичностью (см. Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 и Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), и конструирование "выступ-во-впадину" (см., например, патент США 5,731,168). Дополнительно, полиспецифичные антитела могут быть получены путем конструирования электростатических механизмов управления для создания Fc антитела-гетеродимерных молекул (WO 2009/089004A1); поперечное сшивание двух или более антител или фрагментов (см., например, патент США 4,676,980 и Brennan et al. Science, 229: 81 (1985)); применение лейциновых зипперов для выработки биспецифичных антител (см., например, Kostelny et al., J. Immunol, 148(5): 1547-1553 (1992)); применение технологии "диатела" для создания фрагментов антител с двойной специфичностью (см., например, Hollinger et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); и применение димеров одноцепочечных Fv (sFv) (см., например, Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994)); а также получение триспецифичных антител, как описано, например, в Tutt et al. J. Immunol 147: 60(1991).

Сконструированные антитела с тремя или более функциональными антигенсвязывающими сайтами, в том числе, "антитела-осьминоги", также включены в данное описание (см., например, US 2006/0025576 A1).

Антитело или фрагмент в данном описании также включает "FAb двойного действия" или "ДДФ", содержащий антигенсвязывающий сайт, который связывается с линейно связанным полиубиквитином, а также с другим, отличным антигеном (см., например, US 2008/0069820).

7. Варианты антител

В некоторых вариантах предусмотрены варианты последовательности аминокислот антител, предложенных в данном описании. Например, может быть желательным улучшить аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела. Варианты последовательности аминокислот антитела могут быть получены путем введения подходящих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в пределах последовательностей аминокислот антитела. Любая комбинация делеции, вставки и замены может быть осуществлена для получения конечного конструкта, при условии, что конечный конструкт обладает желательными характеристиками, например, связывания с антигеном.

а) Варианты замены, вставки и делеции

В некоторых вариантах предложены варианты антитела, содержащие одну или более замен аминокислот. Целевые сайты для мутагенеза путем замены включают HVR и FR. Консервативные замены показаны в Табл. 1 под заголовком "консервативные замены". Более существенные модификации предложены в Табл. 1 под заголовком "примеры замен", и как описано дополнительно ниже со ссылкой на классы боковых цепей аминокислот. Замены аминокислот могут быть введены в целевое антитело, и проведен скрининг продуктов на желательную активность, например, сохранение/улучшение связывания с антигеном, снижение иммуногенности или улучшение АЗКЦ или КЗЦ.

ТАБЛИЦА 1 Первоначальный остаток Примеры замен Предпочтительные замены Ala (А) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp; Lys; Arg Gin Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (С) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn

Glu (L) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин Leu Leu (L) Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин Leu

Аминокислоты могут быть сгруппированы с соответствии с общими свойствами боковой цепи:

(1) гидрофобные: норлейцин. Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены повлекут за собой обмен члена этих классов на другой класс.

Один из видов содержащего замену варианта включает замену одного или более остатков гипервариабельного участка родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). В общем, полученный вариант(ы), выбранный для дальнейшего изучения, будет содержать модификации (например, улучшение) определенных биологических свойств (например, повышенная аффинность, сниженная иммуногенность) относительно родительского антитела и/или в существенной мере сохранит определенные биологические свойства родительского антитела. Примером содержащего замену варианта является антитело созревшей аффинности, которое обычно может быть получено, например, с применением основанных на показе фага техник созревания аффинности, например, таких как описаны в данном описании. Если коротко, один или более остатков HVR мутировали, и варианты антител показаны на фаге, и проведен скрининг на конкретный вид биологической активности (например, аффинность связывания).

Модификации (например, замены) могут быть введены в HVR, например, для улучшения аффинности антитела. Такие модификации могут быть введены в участки HVR, т.е., остатки, кодируемые кодонами, которые подвергаются мутации с высокой частотой в ходе процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)), и/или ООС (a-CDR), с тестированием различных полученных VH или VL на аффинность связывания. Созревание аффинности путем конструирования и повторной селекции из вторичных библиотек описано, например, в Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) В некоторых вариантах созревания аффинности, вносят разнообразие в вариабельные гены, выбранные для созревания, любым из множества способов (например, ПЦР сниженной точности, перетасовка цепей или направленный олигонуклеотидом мутагенез). Затем создают вторичную библиотеку. Далее проводят скрининг библиотеки, чтобы идентифицировать любые варианты антитела с желательной аффинностью. Другой способ внесения разнообразия включает HVR-направленные подходы, в которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков за один раз). Остатки HVR, принимающие участие в связывании с антигеном, могут быть специфично идентифицированы, например, с применением аланин-сканирующего мутагенеза или моделирования. В частности, мишенью часто служат CDR-H3 и CDR-L3.

В некоторых вариантах замены, вставки или делеции могут происходить в пределах одного или более HVR, до тех пор, пока такие модификации не снижают значительно способность антитела связываться с антигеном. Например, консервативные модификации (например, консервативные замены, как предусмотрено в данном описании), которые не снижают значительно аффинности связывания, могут быть введены в HVR. Такие модификации могут находиться за пределами участков HVR или ООС. В некоторых вариантах различных последовательностей VH и VL, предложенных выше, каждый HVR не модифицирован или содержит не более одной, двух или трех замен аминокислот.

Подходящий метод идентификации остатков или участков антитела, которые могут служить целью мутагенеза, носит название "аланин-сканирующего мутагенеза", как описано Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. В данном методе, остаток или группа остатков (например, заряженные остатки-мишени, такие как arg, asp, his, lys и glu) идентифицируют и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином), чтобы определить, затронуто ли взаимодействие антитела с антигеном. Дальнейшие замены могут быть введены в положениях аминокислот, демонстрирующих функциональную чувствительность к первоначальным заменам. Альтернативно или дополнительно, кристаллическая структура комплекса антитела с антигеном используется для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактирующие остатки и соседние остатки могу служить мишенью или быть исключены как кандидаты для замены. Можно провести скрининг вариантов для определения наличия у них желательных свойств.

Вставки последовательности аминокислот включают амино- и/или карбокси-концевые слияния, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащим сотню или более остатков, а также вставки одного или нескольких остатков аминокислот внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым метионилом. Другие варианты молекулы антитела со вставкой содержат слияние N- или С-конца антитела с ферментом (например, для антитело-опосредованной терапии с использованием ферментов и пролекарств) или полипептидом, который увеличивает период полувыведения антитела из сыворотки.

б) Варианты гликозилировапия

В некоторых вариантах антитело, предложенное в данном описании, модифицировано для повышения или снижения степени гликозилирования антитела. Добавление или делеция сайтов гликозилирования для антитела могут быть подходящим образом осуществлены путем изменения последовательности аминокислот таким образом, что один или более сайтов гликозилирования создаются или удаляются.

Если антитело содержит участок Fc, присоединенный к нему углевод может быть модифицирован. Природные антитела, продуцированные клетками млекопитающих, обычно содержат разветвленный, биантеннарный олигосахарид, который, в общем, присоединен с помощью N-связи к Asn297 домена СН2 участка Fc. См., например, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). илигосахарид может содержать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в "стволе" биантеннарной структуры олигосахарида. В некоторых вариантах модификации олигосахарида в антителе по изобретению могут быть осуществлены с целью создания вариантов антитела с определенными улучшенными свойствами.

В одном из вариантов предложены варианты антитела, содержащие углеводную структуру, в которой отсутствует фукоза, а которая присоединена (прямо или косвенно) к участку Fc. Например, количество фукозы в таком антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Количество фукозы определяют, вычисляя среднее количество фукозы в пределах сахарной цепи при Asn297, относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn 297 (например, сложные, гибридные структуры и структуры с высоким содержанием маннозы) по данным масс-спектрометрии время-пролетной ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы, как описано, например, в WO 2008/077546. Asn297 обозначает остаток аспарагина, находящийся в положении 297 в участке Fc (нумерация ЕС остатков участка Fc); однако, Asn297 также может находиться в положении±3 аминокислоты относительно положения 297 в направлении по ходу или против хода транскрипции, т.е. между положениями 294 и 300, за счет незначительных вариаций последовательности в антителах. Такие варианты фукозилирования могут улучшать функцию АЗКЦ. См., например, Патентные публикации US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Примеры публикаций, связанных с "дефукозилированными" или "фукозодефицитными" вариантами антитела, включают: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Примеры линий клеток, способных к выработке дефукозилированных антител, включают клетки Lee 13 КХЯ с дефицитом фукозилирования белка (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); патентная заявка US 2003/0157108 A1, Presta, L; и WO 2004/056312 A1, Adams с соавт., особенно в Примере 11), и линии клеток с инактивированными генами, например, геном альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8, клетки КХЯ с инактивированными генами (см., например, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (.2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); и WO 2003/085107).

Дополнительно предлагаются варианты антител с расщепленными олигосахаридами, например, в которых биантеннарный олигосахарид, присоединенный к участку Fc антитела, разрезан пополам GlcNAc. Такие варианты антитела могут уменьшать фукозилирование и/или улучшать функцию АЗКЦ. Примеры таких вариантов антител описаны, например, в WO 2003/011878 (Jean-Mairet с соавт.); патенте США 6,602,684 (Umana с соавт.); и US 2005/0123546 (Umana с соавт.). Дополнительно предложены варианты антител по меньшей мере с одним остатком галактозы в олисахариде, присоединенном к участку Fc. Такие варианты антител могут улучшать функцию КЗЦ. Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087 (Patel с соавт.); WO 1998/58964 (Raju, S.); и WO 1999/22764 (Raju, S.).

в) Варианты участка Fc

В некоторых вариантах одна или более модификаций аминокислот могут быть введены в участок Fc антитела, предложенного в данном описании, с генерацией, таким образом, варианта участка Fc. Вариант участка Fc, может содержать человеческую последовательность участка Fc (например, человеческий участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), содержащую модификацию аминокислот {например, замену) в одном или более положениях аминокислот.

В некоторых вариантах изобретения предусмотрен вариант антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает это желательным кандидатом для применения в областях, где важен период полувыведения антитела in vivo, тогда как некоторые эффектора функции (например, комплемент и АЗКЦ) не нужны или вредны. Анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo могут проводиться, чтобы подтвердить уменьшение/истощение функции КЗЦ и/или АЗКЦ. Например, анализы связывания с рецептором Fc (FcR) могут проводиться, чтобы гарантировать, что антитело не связывается с FcγR (и, таким образом, вероятно отсутствие активности АЗКЦ), но сохраняет способность связываться с FcRn. Основные клетки, опосредующие АЗКЦ, клетки ПК, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на кроветворных клетках кратко охарактеризована в Табл. 3 на стр.464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Неограничивающие примеры анализов т vitro для оценки активности АЗКЦ целевой молекулы описаны в патенте США 5,500,362 (см., например, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) и Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985); 5,821,337 (см. Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987)). Альтернативно, могут применяться методы нерадиоактивных анализов (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности ACTI™ для проточной цитометрии (CellTechnology, Inc., Mountain View, Калифорния; и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96^® (Promega, Мэдисон, Висконсин). Пригодные эффекторные клетки для таких анализов включают моноядерные клетки периферической крови (МКГТЛ) и природные клетки-киллеры (ПК). Альтернативно или дополнительно, активность АЗКЦ целевой молекулы может быть оценена in vivo, например, на животной модели, такой как раскрытая в Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Дополнительно могут быть проведены анализы связывания Clq, чтобы подтвердить, что антитело не в состоянии связывать Clq и, таким образом, активность КЗЦ отсутствует. См., например, анализы методом ТИФА связывания Clq и С3с в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Чтобы оценить активацию комплемента, может быть проведен анализ КЗЦ (см., например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); и Cragg, M.S. and M.J. Glennie. Blood 103:2738-2743 (2004)). Дополнительно, связывание с FcRn и клиренс/период полувыведения in vivo можно определить с применением способов, известных в данной области (см., например, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).

Антитела со сниженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или более остатков 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 участка Fc (патент США 6,737,056). Такие мутанты Fc включают мутантов Fc с заменами в двух или более положениях аминокислот 265, 269, 270, 297 и 327, в том числе, так называемый мутант Fc "DANA" с заменой остатков 265 и 297 на аланин (патент США 7,332,581).

Описаны некоторые варианты антител с улучшенным или сниженным связыванием с FcR. (См., например, патент США 6,737,056; WO 2004/056312, и Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)

В некоторых вариантах, вариант антитела содержит участок Fc с одной или более заменами аминокислот, которые улучшают АЗКЦ, например, замены в положениях 298, 333 и/или 334 участка Fc (нумерация остатков ЕС).

В некоторых вариатах в учаток Fc введены модификации, которые приводят к изменению (т.е., или улучшению или уменьшению) связывания с C1q и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (КЗЦ), например, как описано в патенте США 6,194,551, WO 99/51642, и Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Антитела с увеличенным периодом полувыведения и улучшенным связыванием с рецептором новорожденных Fc (FcRn), который ответственен за передачу материнских IgG утробному плоду (Guyer et al., J. Immunol. I 17:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), описаны в US 2005/0014934А1 (Hinton с соавт.). Такие антитела содержат участок Fc с одной или более замен, которые улучшают связывание участка Fc с FcRn. Такие варианты Fc включают варианты с заменами одного или более остатков участка Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, заменой остатка участка Fc 434 (патент США 7,371,826).

См. также Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); патент США 5,648,260; патент США 5,624,821; и WO 94/29351 касательно других примеров вариантов участка Fc.

г) Цистеин-сконструированные варианты антител

В некоторых вариантах может быть желательным создать цистеин-сконструированные антитела, например, "тиоМАb," в которых один или более остатков антитела заменены остатками цистеина. В конкретных вариантах замененные остатки находятся на доступных сайтах антитела. Путем замены таких остатков цистеином, реакционно-способные тиольные группы, таким образом, размещаются на доступных сайтах антитела и могут быть использованы для конъюгации антитела с другими фрагментами, такими как фрагменты лекарственных средств или фрагменты линкер-лекарственное средство, с целью получения иммуноконъюгата, как описано дополнительно в данном описании. В некоторых вариантах любой один или более из следующих остатков может быть заменен цистеином: V205 (нумерация Kabat) легкой цепи; А 118 (нумерация ЕС) тяжелой цепи; и S400 (нумерация ЕС) тяжелой цепи участка Fc.

Цистеин-сконструированные антитела могут быть сгенерированы, как описано, например, в патенте США 7,521,541.

д) Производные антител

В некоторых вариантах антитело, предложенное в данном описании, может быть дополнительно модифицировано таким образом, чтобы содержать дополнительные небелковые фрагменты, которые известны в данной области, и являются легко доступными. Фрагменты, пригодные для дериватизации антитела, включают, не ограничиваясь ими, водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, полиэтиленгликоль (ГТЭГ), сополимеры этиленгликоль/полипропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или случайные сополимеры), а также декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры пропропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликоль пропиональдегид может давать преимущества с точки зрения производства за счет его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать, и, если присоединен более чем один полимер, их молекулы могут быть одинаковыми или различными. В общем, количество и/или вид полимеров, используемых для дериватизации, может быть определен на основании таких соображений, как, не ограничиваясь ими, конкретные свойства или функции антитела, которое подлежит улучшению, будет ли производное антитела применяться в терапии при определенных состояниях, и т.п.

В другом варианте предложен конъюгат антитела и небелкового фрагмента, который может быть избирательно нагрет путем контакта с излучением. В одном из вариантов небелковый фрагмент представляет собой углеродную нанотрубку (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Излучение может иметь любую длину волны, и включает, не ограничиваясь ими, длины волн, которые не вредят обычным клеткам, но которые нагревают небелковый фрагмент до температуры, при которой гибнут клетки, находящиеся вблизи антитела-небелкового фрагмента.

Б. Рекомбинантные способы и композиции

Антитела могут быть получены с применением рекомбинантных способов и композиций, например, как описано в патенте США 4,816,567. В одном из вариантов предложена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело против линейно связанного полиубиквитина, описанное в данном описании. Такая нуклеиновая кислота может кодировать последовательность аминокислот, содержащую VL, и/или последовательность аминокислот, содержащую VH, антитела (например, легкие и/или тяжелые цепи антитела). В дополнительном варианте предложены один или более векторов (например, векторы экспрессии), содержащих такую нуклеиновую кислоту. В дополнительном варианте предложена клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. В одном из таких вариантов, клетка-хозяин содержит (например, трансформирована с помощью): (1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует последовательность аминокислот, содержащую VL антитела, и последовательность аминокислот, содержащую VH антитела, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует последовательность аминокислот, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует последовательность аминокислот, содержащую VH антитела. В одном из вариантов клетка-хозяин является эукариотной, например клетка яичника китайского хомяка (КХЯ) или лимфоидная клетка (например, клетка Y0, NS0, Sp20). В одном из вариантов предложен способ создания антитела против линейного связанного полиубиквитина, причем способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело, как предусмотрено выше, в условиях, пригодных для экспрессии антитела, и, необязательно, выделение антитела из клетки-хозяина (или среды культивирования клетки-хозяина).

Для выработки рекомбинантного антитела против линейно связанного полиубиквитина, нуклеиновую кислота, кодирующую антитело, например, как изложено выше, выделяют и вставляют в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такая нуклеиновая кислота может быть легко выделена и секвенирована с применением обычных методик (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны к специфичному связыванию с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела).

Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии кодирующих антитело векторов включают прокариотные или эукариотные клетки, описанные в данном описании. Например, антитела могут вырабатываться бактериями, в частности, если гликозилирование и эффекторная функция Fc не нужны. Для экспрессии фрагментов антитела и полипептидов в бактериях, см., например, патенты США 5,648,237, 5,789,199 и 5,840,523. (См. также Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254, где описана экспрессия фрагментов антител в Е. coli.) После экспрессии антитело может быть выделено из пасты бактериальных клеток в растворимой фракции, и может быть дополнительно очищено.

В дополнение к прокариотам, эукариотные микроорганизмы, такие как, например, волокнистые грибы или дрожжи, пригодны для клонирования или в качестве хозяев экспрессии для кодирующих антитело векторов, в том числе, штаммы грибов и дрожжей, чьи пути гликозилирования были "гуманизированы", что ведет к выработке антитела с частично или полностью человеческим характером гликозилирования. См. Gemgross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004), и Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированных антител также получены из многоклеточных организмов (беспозвоночные и позвоночные животные). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Идентифицированы многочисленные штаммы бакуловируса, которые могу использоваться в сочетании с клетками насекомых, особенно для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

Культуры растительных клеток также могут использоваться в качестве хозяев. См., например, патенты США 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 и 6,417,429 (описание технологии выработки антител в трансгенных растениях PLANTIBODIES™).

Клетки позвоночных также могут использоваться в качестве хозяев. Например, могут быть пригодными линии клеток млекопитающих, адаптированные для роста в суспензии. Другими примерами пригодных линий клеток-хозяев млекопитающих является линия почки обезьяны CV1, трансформированная SV40 (COS-7); линия почки человеческого эмбриона (293 или клетки 293, как описано, например, в Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почки детеныша хомяка (ВНК); клетки Сертоли мыши (клетки ТМ4, как описано, например, в Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой обезьяны (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени серой крысы (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Нер G2); опухоль молочной железы мыши (MM I Ub0562); клетки 1 RJ, как описано, например, в Mather et al. Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); клетки MRC 5; и клетки FS4. Другие пригодные линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (КХЯ), в том числе, клетки ДГФР КХЯ (Uriaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); и линии клеток миеломы, такие как YO, NSO и Sp2/0. Обзор некоторых линий клеток-хозяев млекопитающих, пригодных для выработки антител, см., например, в Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp.255-268 (2003).

В. Анализы

Антитела против содержащего линейную связь полиубиквитина, предложенные в данном описании, могут быть идентифицированы, подвергнуты скринингу или охарактеризованы на предмет их физических/химических свойств и/или биологической активности в различных анализах, известных в данной области.

1. Анализы связывания и другие анализы

В одном из аспектов антитело по изобретению тестируют на активность связывания с антигеном, например, известными способами, такими как ТИФА, Вестерн-блот, и т.п.

В другом аспекте конкурентные анализу могут применяться для идентификации антитела, которое конкурирует, например, с любым из Fab или антител, описанных в данном описании, таких как 1Е3, 1D8, 1F4, 1А10, 1D8.3C2, 1D8.3F8. 1D8.4F5, 1F11, 2А2, 2С11, 2Н5, ЗЕ4, 4С9, 4Е4, 4G7, 3F5, 3А7 и 4С10, или гибридными антителами, как описано в данном описании, например, 4Е4/Т110А, 4С9/Т110А, 4G7/Y102G, 1F11/3F5, 1F11/3E4, 1F11/4G7, 2С11/ЗЕ4, 2С11/3F5, 2С11/4G7, 2Н5/ЗЕ4, 2H5/3F5, 2H5/4G7, 1F11/3F5/Y102L, за связывание с линейно связанным полиубиквитином. В некоторых вариантах такое конкурирующее антитело связывается с тем же эпитопом (например, линейный или конформационный эпитоп), с которым связывается любой из Fab или антител, описанных в данном описании, например, 1Е3, 1D8, 1F4, 1А10, 1D8.3C2, 1D8.3F8. 1D8.4F5, 1F11, 2А2, 2С11, 2Н5, 3Е4, 4С9, 4Е4, 4G7, 3F5, 3А7 и 4С10, или гибридных антител, как описано в данном описании, например, 4Е4/Т110А, 4С9/Т110А, 4G7/Y102G, 1F11/3F5, 1F11/3E4, 1F11/4G7, 2С11/3Е4, 2С11/3F5, 2С11/4G7, 2Н5/3Е4, 2H5/3F5, 2H5/4G7, 1F11/3F5/Y102L для связывания с линейно связанным полиубиквитином. Подробно описанные примерные способы картирования эпитопа, с которым связывается антитело, предложены в Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," в Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).

В примерном конкурентном анализе, иммобилизированный полиубиквитин, содержащий линейную связь, инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с линейно связанным полиубиквитином (например, антитела 1Е3, 1D8, 1F4, 1А10, 1D8.3C2, 1D8.3F8. 1D8.4F5, 1F11, 2А2, 2С11, 2Н5, 3Е4, 4С9, 4Е4, 4G7, 3F5, 3А7 и 4С10 или гибридные антитела 4Е4/Т110А, 4С9/Т1 10А, 4G7/Y102G, 1F11/3F5, 1F11/3E4, 1F11/4G7, 2С11/3Е4, 2C11/3F5, 2C11/4G7, 2Н5/3Е4, 2H5/3F5, 2H5/4G7, 1F11/3F5/Y102L для связывания с линейно связанным полиубиквитином, и второе немеченое антитело, которое тестируют на предмет его способности конкурировать с первым антителом за связывание с линейно связанным полиубиквитином. Второе антитело может присутствовать в гибридоме супернатанта. В качестве контроля, иммобилизированный полиубиквитин, содержащий линейную связь, инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не второе немеченное антитело. После инкубации в условиях, позволяющих связывание первого антитела с линейно связанным полиубиквитином, избыток несвязанного антитела удаляют, и измеряют количество метки, связанной с иммобилизированным линейно связанным полиубиквитином. Если количество метки, связанной с иммобилизированным линейно связанным полиубиквитином, в существенной мере снижено в исследуемом образце относительно контрольной выборки, это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с линейно связанным полиубиквитином. См. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

2. Анализы активности

В одном из аспектов предложены анализы для идентификации антител против линейно связанного полиубиквитина, обладающих биологической активностью. Биологическая активность может включать, например, модулирование скорости разложения линейно связанных полиубиквитинированных белков в клетке или ткани и модулирование скорости прогрессирования клеточного цикла в клетке. Также предложены антитела, обладающие такой биологической активностью in vivo и/или in vitro.

В некоторых вариантах антитело по изобретению тестируют на предмет такой биологической активности.

Г. Иммуноконъюгаты

В изобретении также предлагаются иммуноконъюгаты, содержащие антитело против линейно связанного полиубиквитина, конъюгированное с одним или более цитотоксическими агентами, такими как химиотерапевтические агенты или лекарственные средства, агенты для ингибирования роста, токсины (например, белковые токсины, токсины с ферментной активностью бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.

В одном из вариантов иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство (КАЛС), в котором антитело конъюгировано с одним или более лекарственных средств, включая, но, не ограничиваясь ими, майтанзиноид (см. патенты США 5,208,020, 5,416,064 и Европейский патент ЕР 0425235 В1); ауристатин, например, лекарственные монометилауристатиновые фрагменты DE и DF (ММАЕ и MMAF) (см. патенты США 5,635,483, 5,780,588 и 7,498,298); доластатин; калихеамицин или его производное (см. патенты США 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 и 5,877,296; Hinman et al. Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); и Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); антрациклин, такой как дауномицин или доксорубицин (см. Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); и патент США 6,630,579); метотрексат; виндезин; таксан, например, доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тезетаксел и ортатаксел; трихотецен; и СС1065.

В другом варианте иммуноконъюгат содержит антитело, как описано в данном описании, конъюгированное с обладающим ферментной активностью токсином или его фрагментов, включая, но, не ограничиваясь ими, цепь А дифтерии, несвязывающие активные фрагменты токсина дифтерии, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII, и PAP-S), ингибитор momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены.

В другом варианте иммуноконъюгат содержит антитело, как описано в данном описании, конъюгированное с радиоактивным атомом для образования радиоконъюгата. Множество радиоактивных изотопов доступны для образования радиоконъюгатов. Примеры включают At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu. Если радиоконъюгат применяют для обнаружения, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфического исследования, например, tc99m или 1123, или спин-метку для визуализации методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известной как магнитная резонансная томография, МРТ), снова такую как йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.

Конъюгаты антитела и цитотоксического агента могут быть получены с применением множества бифункциональных агентов сочетания белка, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдио)пропионат (СПДП), сукцинимидил-4-(N-мелаинимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (СМЦК), иминотиолан (ИТ), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидо соединения (такие как бис(n-азидобензоил)гександиамин), производные бие-диазония (такие как бис-(n-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол 2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицина может быть получен, как описано в Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Углерод-14-меченый 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилен триаминпентауксусная кислота (МХ-ДТПК) является примером хелатного агента для конъюгации радионуклида с антителом. См. WO 94/11026. Линкер может быть "расщепляемым линкером", который облегчает высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, может применяться кислотно-лабильный линкер, чувствительный к пептидазе линкер, фотолабильный линкер, диметиловый этана или дисульфид-содержащий линкер (Chari et al. Cancer Res. 52: 127-131 (1992); патент США 5,208,020).

Иммуноконъюгаты или КАЛС четко включены в данное изобретение, но не ограничиваются такими конъюгатами, полученными с использованием поперечно-сшивающих линкерных реагентов, включая, но, не ограничиваясь ими, БМПС, EMCS, GMBS, ГБВС, LC-SMCC, MBS, МФБГ, SBAP, СИА, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC, сульфо-SMPB и СВСБ (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые коммерчески доступны (например, от Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, Иллинойс, США).

Д. Способы и композиции для диагностики и обнаружения

В некоторых вариантах любое из антител против линейно связанного полиубиквитина, предложенных в данном описании, пригодно для обнаружения присутствия полиубиквитина, содержащего линейную связь, в биологическом образце. Термин "обнаружение" в данном описании включает количественное или качественное обнаружение. В некоторых вариантах биологический образец включает клетку или ткань, например, но, не ограничиваясь ими, опухолевую клетку, мышечную клетку или нервную клетку.

В одном из вариантов предложено антитело против линейно связанного полиубиквитина для применения в способе диагностики или обнаружения. В дальнейшем аспекте предложен способ обнаружения присутствия полиубиквитина, содержащего линейную связь, в биологическом образце. В некоторых вариантах способ включает приведение биологического образца в контакт с антителом против линейно связанного полиубиквитина, как описано в данном описании, в условиях, позволяющих связывание антитела против линейного связанного полиубиквитина с полиубиквитином или полиубиквитииированным белком, и обнаружение факта образования комплекса между антителом против линейно связанного полиубиквитина и полиубиквитином или полиубиквитинированным белком. Такой способ может представлять собой способ in vitro или in vivo. В одном из вариантов антитело против линейно связанного полиубиквитина используется для отбора субъектов, пригодных для терапии антителом против линейно связанного полиубиквитина, например, если полиубиквитин, содержащий линейную связь, представляет собой биомаркер для отбора больных.

Примеры расстройств, которые можно диагностировать с применением антитела по изобретению, включают связанные с клеточным циклом заболевания или расстройства, которые могут представлять собой заболевание или расстройство, связанное с аберрантно ускоренным прогрессированием клеточного цикла, или заболевание или расстройство, связанное с аберрацию замедленным прогрессированием клеточного цикла. В одном из аспектов заболевание или расстройство, связанное с аберрантно ускоренным прогрессированием клеточного цикла, представляет собой рак. В другом аспекте заболевание или расстройство, связанное с аберрантно замедленным прогрессированием клеточного цикла, представляет собой, например, мышечное дегенеративное расстройство или нейродегенеративное расстройство.

В некоторых вариантах предложены меченые антитела против содержащего линейную связь полиубиквитина. Метки включают, не ограничиваясь ими, метки или фрагменты, которые обнаруживаются непосредственно (такие как флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также фрагменты, такие как ферменты или лиганды, которые обнаруживаются косвенно, например, посредством ферментной реакции или молекулярного взаимодействия. Примеры меток включают, не ограничиваясь ими, радиоизотопы ³²P, ¹⁴С, ¹²⁵I, ³H и ¹³¹I, флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, данзил, умбеллиферон, люциферазы, например, люцифераза светлячка и бактериальная люцифераза (патент США 4,737,456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (ПХ), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазы, например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантиноксидаза, связанная с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления прекурсора красителя, таким как ПХ, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спин-метки, метки бактериофага, стабильные свободные радикалы, и т.п.

Е. Фармацевтические составы

Фармацевтические составы, содержащие антитело против линейно связанного полиубиквитина, как описано в данном описании, получают, смешивая такое антитело, обладающее желательной степенью чистоты, с одним или более необязательных фармацевтически приемлемых носителей (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители, в общем, нетоксичны для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях, и включают, не ограничиваясь ими: буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензэтония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как альбумин сыворотки, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другая углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатные агенты, такие как ЭДТА; сахара, например, сахароза, маннит, трегалоза или сорбитол; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ГТЭГ). Примеры фармацевтически приемлемых носителей в данном описании дополнительно включают агенты для дисперсии интерстициальньгх лекарственных средств, такие как растворимые нейтрально-активные гликопротеины гиалуронидазы (рНАГРГ), например, человеческие растворимые РН-20 гликопротеины гиалуронидазы, такие как rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Некоторые примеры рНАГРГ и способов применения, в том числе, rHuPH20, описаны в Патентных публикациях США 2005/0260186 и 2006/0104968. В одном из аспектов рНАГРГ объединены с одной или более дополнительных гликозаминогликаназ, таких как хондроитиназы.

Примеры лиофилизированных композиций антител описаны в патенте США 6,267,958. Водные композиции антител включают описанные в патенте США 6,171,586 и WO 2006/044908, последние композиции содержат гистидин-ацетатный буфер.

Композиция в данном описании дополнительно может содержать более одного активного ингредиента, по мере необходимости для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно обладающие дополняющими видами активности, которая не воздействуют отрицательно друг на друга. Например, может быть желательным дополнительно предложить один или более химиотерапевтических агентов. Такие активные ингредиенты подходящим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для предусмотренной цели.

Активные ингредиенты могут быть помещены в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или межфазной полимеризации, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы из поли-(метилметакрилата), соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в микроэмульсиях. Такие методы раскрыты в 16-м издании Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Могут быть получены композиции с замедленным высвобождением. Подходящие примеры композиций с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, где матрицы находятся в виде изделий определенной формы, например, пленок или микрокапсул.

Композиции для введения in vivo, в общем, являются стерильными. Стерильность может быть легко обеспечена, например, фильтрацией сквозь мембраны для стерилизующей фильтрации.

Ж. Способы лечения и композиции

Любое из антител против линейно связанного полиубиквитина, предложенных в данном описании, может применяться в способах лечения.

В одном из аспектов предложено антитело против линейно связанного полиубиквитина для применения в качестве лекарственного средства. В дальнейших аспектах предложено антитело против линейно связанного полиубиквитина для применения при лечении расстройств, связанных с аномальным регулированием клеточного цикла (в том числе, но, не ограничиваясь ими, расстройства пролиферации, такие как рак и гипотрофические расстройства, включая, но, не ограничиваясь ими, мышечные дегенеративные расстройства и нейродегенеративные расстройства). В некоторых вариантах предложено антитело против линейно связанного полиубиквитина для применения в способе лечения. В некоторых вариантах изобретения предлагается антитело против линейно связанного полиубиквитина для применения в способе лечения индивидуума, страдающего расстройством, связанным с аномальным регулированием клеточного цикла, причем способ включает введение указанному индивидууму эффективного количества антитела против линейно связанного полиубиквитина. В одном из таких вариантов способ дополнительно включает введение указанному индивидууму эффективною количества ни меньшей мере одною дополнительного терапевтического агента, например, как описано ниже. В дальнейших вариантах изобретения предлагается антитело против линейно связанного полиубиквитина для применения с целью модуляции регулирования клеточного цикла таким образом, что происходит коррекция скорости прогрессирования клеточного цикла. В некоторых вариантах изобретения предлагается антитело против линейно связанного полиубиквитина для применения в способе модулирования скорости прогреесирования клеточного цикла у индивидуума, который включает введении указанному индивидууму эффективного количества антитела против линейно связанного полиубиквитина с целью модуляции прогрессирования клеточного цикла и, таким образом, коррекции скорости деления клеток. "Индивидуум" согласно любому из упомянутых выше вариантов предпочтительно является человеком.

В дальнейшем аспекте изобретения предусматривается применение антитела против линейно связанного полиубиквитина для производства или приготовления лекарственного средства. В одном из вариантов лекарственное средство предназначено для лечения расстройств, связанных с аномальным регулированием клеточного цикла (в том числе, но, не ограничиваясь ими, расстройств пролиферации, таких как рак, и гипотрофических расстройств, включая, но, не ограничиваясь ими, мышечные дегенеративные расстройства и нейродегенеративные расстройства). В дополнительном варианте лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения расстройства, связанного с аномальным регулированием клеточного цикла, причем способ включает введение индивидууму, страдающему таким расстройством, эффективного количества лекарственного средства. В одном из таких вариантов способ дополнительно включает введение указанному индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, как описано ниже. В дополнительном варианте лекарственное средство предназначено для модулирования скорости прогрессирования клеточного цикла. В дополнительном варианте лекарственное средство предназначено для применения в способе модулирования скорости прогрессирования клеточного цикла у индивидуума, причем способ включает введение указанному индивидууму эффективного количества лекарственного средства для коррекции скорости деления клеток. "Индивидуум" согласно любому из упомянутых выше вариантов может быть человеком.

В дальнейшем аспекте изобретения предлагается способ лечения расстройства, связанного с аномальным регулированием клеточного цикла. В одном из вариантов способ включает введение индивидууму, страдающему таким расстройством, связанным с аномальным регулированием клеточного цикла, эффективного количества антитела против линейно связанного полиубиквитина. В одном из таких вариантов способ дополнительно включает введение указанному индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, как описано ниже. "Индивидуум" согласно любому из упомянутых выше вариантов может быть человеком.

В дальнейшем аспекте изобретения предлагаются фармацевтические составы, содержащие любое из антител против линейно связанного полиубиквитина, предложенных в данном описании, например, для применения в любом из упомянутых выше способов лечения. В одном из вариантов фармацевтический состав содержит любое из антител против линейно связанного полиубиквитина, предложенных в данном описании, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте фармацевтический состав содержит любое из антител против линейно связанного полиубиквитина, предложенных в данном описании, и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, например, как описано ниже.

Антитела по изобретению могут применяться в терапии отдельно или в комбинации с другими агентами. Например, антитело по изобретению может вводиться совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом. В некоторых вариантах дополнительный терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент.

"Химиотерапевтический агент" представляет собой химическое соединение, пригодное для лечения рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид ЦИТОКСАН®; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, МАРИНОЛ®); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновая кислота; камптотецин (в том числе: синтетический аналог топотекан (ГИКАМТИН®), СРТ-11 (иринотекан, КАМПТОЗАР®), ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (в том числе, его синтетические аналоги адоселезин, карселезин и биселезин); подофиллотоксин; подофиллиновая кислота; тенипозид; криптофицины (особенно криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (в том числе, синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; производные ипритного азота, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамин оксид гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенэстерин, преднимустин, трофосфамид, ипритный урацил; производные нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl, 33: 183-186 (1994)); динемицин, в том числе, динемицин; эсперамицин; а также неокарциностатиновый хромофор и родственные антибиотические хромофоры энедиинового хромобелка), аклациномизины, актиномицин, антрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин АДРИАМИНЦИН® (в том числе, морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, хеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин; анти-метаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-ФУ); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, агенты против опухолей надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; агенты для восполнения фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазохон; элфомитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглюцид; галлия нитрат; гидроксимочевина; лентинан; лонидайнин; мейтанзиноиды, такие как мейтанзин и анзамитоцины, миплуазон, митоксажрин, миииданмол, нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс ПСК® (JHS Natural Products, Юджин, Орегон); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазихон; 2,2',2ʺ-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангидин); уретан; виндезин (ЭЛДИЗИН®, ФИЛДЕЗИН®); дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ага-С"); тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел ТАКСОЛ® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, Нью-Джерси), не содержащий кремофора АБРАКСАН™, образованный с помощью альбумина препарат паклитаксела в форме наночастиц (American Pharmaceutical Partners, Шомберг, Иллинойс) и доцетаксел ТАКСОТЕР® (Rhone-Poulenc Rorer, Энтони, Франция); хлорамбуцил; гемцитабин (ГЕМЗАР®); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин (ВЕЛБАН®); платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин (ОНКОВИН®); оксалиплатин; лейковорин; винорельбин (НАВЕЛЬБИН®); новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибадронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (ДФМО); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин (КСЕЛОДА®); фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из упомянутого выше; а также комбинации двух или более из упомянутого выше, такие как CHOP, сокращение для комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, сокращенное обозначение схемы лечения оксалиплатином (ЭЛОКСАТИН™) в комбинации с 5-ФУ и лейковорином.

Также в данное определение входят анти-гормональные агенты, механизм действия которых состоит в регуляции, снижении, блокировании или подавлении влияния гормонов, которое может способствовать росту рака, и часто принимают форму для системного лечения или лечения всего организма. Они могут представлять собой непосредственно гормоны. Примеры включают анти-эстрогены и селективные модуляторы рецептора эстрогена (СМРЭ), в том числе, например, тамоксифен (включая тамоксифен НОЛВАДЕКС®), ралоксифан ЭВИСТА®, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY 117018, онапристон и торемифен ФАРЕСТОН®; анти-прогестерон; регуляторы вниз рецептора эстрогена (ВРЭ); агенты, функция которых состоит в подавлении или прекращении работы яичников, например, агонисты лютеотропного гирмина (ЛИ), такие как лейприлида ацетат ЛЮПРОН® и ЭЛИГАРД®, гозерелина ацетат, бузерелина ацетат и триптерелин; другие анти-андрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; и ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, регулирующий выработку эстрогена в надпочечниках, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, мегестрола ацетат МЕГАЗЕ®, экземестан АРОМАЗИН®, формастани, фадрозол, ворозол РИВИЗОР®, летрозол ФЕМАРА® и анастрозол АРИМИДЕКС®. Кроме того, такое определение химиотерапевтических агентов включает бифосфонаты, такие как клодронат (например, БОНЕФОС® или ОСТАК®), этидронат ДИДРОКАЛ®, NE-58095, золедроновую кислоту/золедронат ЗОМЕТА®, алендронат ФОЗАМАКС®, памидронат АРЕДИА®, тилудронат СКЕЛИД® или ризедронат АКТОНЕЛ®; а также троксацитабин (1,3-диоксолановый аналог нуклеозида цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, особенно такие, которое препятствуют экспрессии генов в сигнальных путях, принимающих участие в аберрантной пролиферации клеток, например, РКС-альфа, Raf, H-Ras, и рецептор эпидермального фактора роста (ЭФР-Р); вакцины, такие как вакцина ТЕРАТОП® и вакцины для генной терапии, например, вакцина АЛЛОВЕКТИН®, вакцина ЛЕЙВЕКТИН® и вакцина ВАКСИД®; ингибитор топоизомеразы 1 ЛУРТОТЕКАН®; АБАРЕЛИКС® nnRH; лапатиниб дитозилат (двойной ингибитор низкомолекулярной тирозинкиназы ErbB-2 и ЭФРР, также известный как GW572016); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из упомянутого выше.

Такие схемы комбинированной терапии, отмеченные выше, включают сочетанное введение (при котором два или более терапевтических агентов введены в одну и ту же или отдельные композции), и введение по отдельности, при котором введение антитела по изобретению может происходить до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента и/или адъюванта. Дополнительно, антитела по изобретению могут применяться в комбинации с радиационной терапией.

Антитело по изобретению (и любой дополнительный терапевтический агент) можно вводить любыми пригодными способами, в том числе, парентерально, внутрилегочно и интраназально, и, при желании, применять местно, в очаг поражения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Введение доз может быть проведено любым подходящим способом, например, инъекционно, в том числе, внутривенными или подкожными инъекциями, чти зависит, отчасти от типа введения - кратковременное или хроническое. Различные схемы лечения, включая, но не ограничиваясь ими, однократное или многократное введение в различных точках времени, введение болюса и импульсная инфузия предусматриваются в данном изобретении.

Антитела по изобретению могут быть введены в композиции, разделены на дозы и введены способом, который согласуется с надлежащей медицинской практикой. Факторы для рассмотрения в данном контексте включают конкретное расстройство, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального больного, причину расстройства, локализацию доставки агента, способ введения, расписание введения и другие факторы, известные практикующим медицинским специалистам. Антитело не нуждается в том, чтобы, но необязательно может быть введено в композицию с одним или более агентов, в настоящее время применяемых для предупреждения или лечения целевого расстройства. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в композиции, вида расстройства или лечения и других факторов, обсуждаемых выше. В общем, они применяются с такими же дозировками и способами введения, как описано в данном описании, или приблизительно от 1 до 99% доз, приведенных в данном описании, или с любой дозой и способом введения, который является эмпирически/клинически определенным как пригодный.

Локализация мишени связывания антитела по изобретению может быть принята во внимание при получении и введении антитела. Если мишень связывания представляет собой молекулу внутри клетки, некоторые варианты изобретения предусматривают введение антитела или его фрагмента связывания с антигеном в клетку, где находится мишень связывания. В одном из вариантов антитело по изобретению может экспрессироваться внутриклеточно как интратело. Термин "интратело" в данном описании обозначает антитело или его часть связывания с антигеном, которые экспрессируется внутриклеточно, и которые способны селективно связываться с молекулой-мишенью, как описано в Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997); Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004); патентах США 6,004,940 и 6,329,173; Публикации патентной заявки США №2003/0104402 и Публикации РСТ WO 2003/077945. Внутриклеточная экспрессия интратела осуществляется путем введения нуклеиновой кислоты, кодирующей желательное антитело или его часть связывания с антигеном (без лидерной последовательности дикого типа и секреторных сигналов, в норме связанных с геном, кодирующим такое антитело или фрагмент связывания с антигеном) в клетку-мишень. Может применяться любой стандартный способ введения нуклеиновых кислот в клетку, в том числе, не ограничиваясь ими, микроинъекция, баллистическая инъекция, электропорация, осаждение кальция фосфатом, липосомы и трансфекция ретровирусными, аденовирусными, адено-связанными вирусными векторами и векторами коровьей оспы, несущими целевую нуклеиновую кислоту. Одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих полноразмерное антитело против полиубиквитина по изобретению или его часть, может быть введена в клетку-мишень, таким образом, что экспрессируется одно или более интрател, которые способны к внутриклеточному связыванию с полиубиквитином и модуляции одного или более опосредованных полиубиквитином клеточных путей.

В другом варианте предложены интернализирующиеся антитела. Антитела могут обладать определенными характеристиками, которые повышают доставку антител в клетки, или могут быть модифицированы таким образом, чтобы обладать указанными характеристиками. Способы осуществления этого известны в данной области. Например, известно, что катионизация антитела облегчает его захват клетками (см., например, патент США 6,703,019). Липофекции или липосомы также могут применяться для доставки антитела в клетки. Если используются фрагменты антитела, наименьший ингибирующий фрагмент, который специфично связывается с домен связывания белка-мишени, в общем, является предпочтительным. Например, на основании последовательностей вариабельного участка антитела, могут быть созданы пептидные молекулы, которые сохраняют способность связываться с последовательностью белка-мишени. Такие пептиды могут быть синтезированы химически и/или продуцированы технологией рекомбинантной ДНК. См., например, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893 (1993).

Вхождение модуляторных полипептидов в клетки-мишени может быть увеличено способами, известными в данной области. Например, некоторые последовательности, такие как происходящие от Tat ВИЧ или белка Antennapedia homeodomain, способны направлять эффективный захват гетерологичных белков через мембраны клеток. Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4325-4329 (1999).

Если мишень связывания расположена в мозге, некоторые варианты изобретения предусматривают антитело или его фрагмент связывания с антигеном, которые проникают через гематоэнцефалический барьер. Некоторые нейродегенеративные заболевания связаны с увеличением проницаемости гематоэнцефалического барьера, таким образом, что антитело или фрагмент связывания с антигеном может быть легко введен в мозг. Если гематоэнцефалический барьер сохраняется интактным, существует несколько известных из уровня техники подходов для переноса молекул сквозь него, в том числе, не ограничиваясь ими, физические методы, основанные на липидах методы и основанные на рецепторах и каналах методы.

Физические методы переноса антитела или фрагмента связывания с антигеном через гематоэнцефалический барьер включают, не ограничиваясь ими, обход гематоэнцефалического барьера, полностью или создавая проходы в гематоэнцефалическом барьере. Способы обхода включают, не ограничиваясь ими, прямую инъекцию в мозг (см., например, Papanastassiou et al. Gene Therapy 9: 398-406 (2002); интерстициальную инфузию/конвекционную доставку (см., например, Воbо et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)), и имплантацию устройства доставки в мозг (см., например. Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); и Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical). Методы создания проходов в барьере включают, не ограничиваясь ими, ультразвук (см., например, Патентную публикацию США №2002/0038086), осмотическое давление (например, введение гипертонического раствора маннита (Neuwelt, E.A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, vols. 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), пермеабилизацию, например, брадикинин или пермеабилизатор А-7 (см., например, патенты США 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206 и 5,686,416) и трансфекцию нейронов, которые расположены по обе стороны гематоэнцефалического барьера, векторами, содержащими гены, которые кодируют антитело или его фрагмент связывания с антигеном (см., например, Патентную публикацию США №2003/0083299).

Основанные на липидах способы переноса антитела или фрагмента связывания с антигеном через гематоэнцефалический барьер включают, не ограничиваясь ими, инкапсуляцию антитела или фрагмента связывания с антигенов в липосомы, соединенные с антителосвязывающими фрагментами, которые связываются с рецепторами на сосудистом эндотелии гематоэнцефалического барьера (см., например. Публикацию патентной заявки США №20020025313), и покрытие антитела или фрагмента связывания с антигеном частицами липопротеинов низкой плотности (см., например. Публикацию патентной заявки США №20040204354) или аполипопротеина Е (см., например, Публикацию патентной заявки США №20040131692).

Основанные на рецепторах и каналах методы переноса антитела или фрагмента связывания с антигеном через гематоэнцефалический барьер включают, не ограничиваясь ими, применение глюкокортикоидных блокаторов для увеличения проницаемости гематоэнцефалического барьера (см., например, Публикации патентных заявок США №2002/0065259, 2003/0162695 и 2005/0124533); активацию калиевых каналов (см., например, Публикацию патентной заявки США №2005/0089473); ингибирующие АВС переносчики лекарственных средств (см., например, Публикацию патентной заявки США №2003/0073713); покрытие антител трансферрином и модулирование активности одного или более рецепторов трансферрина (см., например, Публикацию патентной заявки США №2003/0129186), а также катионизацию антитела (см., например, патент США 5,004,697).

Для предотвращения или лечения заболевания, подходящие дозы антитела по изобретению (применяемого отдельно или в комбинации с одним или более других дополнительных терапевтических агентов) будет зависеть от вида заболевания, которое подлежит лечению, вида антитела, тяжести и протекания заболевания, введения антитела для профилактических или лечебных целей, предыдущей терапии, клинического анамнеза больного и реакции на антитело, а также решения наблюдающего врача. Антитело пригодным способом вводят больному однократно или в виде серии введений. В зависимости от вида и тяжести заболевания, начальная доза-кандидат для введения пациенту, например, путем введения одной или более отдельных доз или путем непрерывной инфузии, может составлять приблизительно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1-10 мг/кг) антитела. Типичная суточная доза может варьировать от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от перечисленных выше факторов. Для повторного введения на протяжении нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение, в общем, будет продолжаться до желательного подавления симптомов заболевания. Один из примеров дозы антитела находится в интервале от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Таким образом, одна или более доз приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любая их комбинация) может быть ведена больному. Такие дозы могут быть введены дискретно, например, каждую неделю или каждые 3 недели (например, таким образом, что больной получает от приблизительно 2 до приблизительно 20, или, например, приблизительно 6 доз антитела). Вначале может быть введена более высокая нагрузочная доза, с последующим введением одной или более меньших доза. Однако другие схемы лечения могут быть пригодными. Прогресс данной терапии легко контролируется обычными методами и анализами.

Следует понимать, что любая из упомянутых выше композиций или способов лечения может быть осуществлен с применением иммуноконъюгата по изобретению вместо или в дополнение к антителу против линейно связанного полиубиквитина.

З. Промышленные изделия

В другом аспекте изобретения предложено промышленное изделие, содержащее материалы, пригодные для лечения, предупреждения и/или диагностики описанных выше расстройств. Промышленное изделие содержит контейнер и этикетку или листок-вкладыш на контейнере или прикрепленные к нему. Пригодные контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы, пакеты для в/в растворов, и т.п. Контейнеры могут быть сделаны из различных материалов, таких как стекло или пластический материал. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в соединении с другой композицией, эффективна для лечения, предупреждения и/или диагностики состояния, и может быть оборудован стерильным портом доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон, оборудованный пробкой, которая прокалывается иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере, один активный агент в композиции представляет собой антитело по изобретению. На этикетке или листке-вкладыше в упаковку указано, что композиция применяется для лечения состояния выбора. Кроме того, промышленное изделие может содержать (а) первый контейнер с композицией, содержащейся в нем, причем композиция содержит антитело по изобретению; и (б) второй контейнер с композицией, содержащейся в нем, причем композиция содержит дополнительный цитотоксический или другой терапевтический агент. Промышленное изделие в данном варианте изобретения может дополнительно содержать листок-вкладыш, в котором указано, что композиции могут применяться для лечения конкретного состояния. Альтернативно или дополнительно, промышленное изделие может содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (БВДИ), буферизованный фосфатов раствор соли, раствор Рингера и раствор глюкозы. Он может дополнительно содержать другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точки зрения, в том числе, другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Следует понимать, что любое из упомянутых выше промышленных изделий может содержать иммуноконъюгат по изобретению, вместо или в дополнение к антителу против линейно связанного полиубиквитина.

III. ПРИМЕРЫ

Ниже приведены примеры способов и композиций по изобретению. Следует понимать, что различные другие варианты могут быть реализованы с учетом приведенного выше общего описания.

ПРИМЕР 1: Выделение и характеристика антител против линейного полиубиквитина

А) Генерация антигена

Антиген, применяемый для сортировки библиотек показа фага, представлял собой линейный диубиквитин (Boston Biochem). Линейный диубиквитин представляет собой слияние голова-к-хвосту двух молекул убиквитина посредством пептидной связи между карбокси-концом первой молекулы убиквитина и амино-концом второй молекулы убиквитина.

Б) Сортировка наивной библиотеки

Наивную библиотеку показа фага YSGX Fab подвергали четырем кругам сортировки против линейного диубиквитина. После четырех кругов сортировки обогащения не наблюдалось (см. Табл. 2). Библиотека показа фага YSGX Fab содержит рандомизированные аминокислоты во всех трех CDR тяжелой цепи и CDR L3 легкой цепи (см. Публикацию патентной заявки США №2005-0106667 и Fellouse F. et al. JMB 373:924-40 (2007)) и основана на гуманизированном антителе 4D5.

Наивную библиотеку показа фага общей легкой цепи YSGX Fab подвергали четырем кругам сортировки против линейного диубиквитина. Обогащение в 25 раз наблюдалось после четырех кругов сортировки (см. Табл. 2). Библиотека показа фага общей легкой цепи YSGX Fab содержит рандомизированные аминокислоты во всех трех CDR тяжелой цепи, как описано для библиотеки YSGX (см., Публикацию патентной заявки США №2005-0106667 и Fellouse F. et al. JMU 373; 924-40 (2007)), однако последовательность легкой цепи зафиксирована как модифицированная версия гуманизированного антитела 4D5.

Наивную библиотеку показа фага VH Fab подвергали четырем кругам сортировки против линейного диубиквитина. Обогащение в 8 раз наблюдалось после четырех кругов сортировки (см. Табл. 1). Библиотека показа фага VH Fab содержит рандомизированные аминокислоты во всех трех CDR тяжелой цепи (см., Публикацию патентной заявки США №2005/0119455 и Lee C.W. et al. JMB 340: 1073-93 (2004)) и основана на гуманизированном антителе 4D5.

Линейный диубиквитин (Boston Biochem) иммобилизировали на 96-луночном иммунопланшете Maxisorb (NUNC). Планшеты покрывали в течение ночи при 4°С 5 мкг/мл линейного диубиквитина в 50 мМ натрий-карбонатном буфере, рН 9,6. Покрытые планшеты блокировали с помощью 200 мкл/лунку 2,5% молока в фосфатном буферном растворе (ФБР), содержащем 0,05% Твина 20 (ФБРТ) в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Наивные библиотеки фага осаждали из запасных растворов в глицерине с помощью 1/5 объема 20% полиэтиленгликоля (ПЭГ)/2,5 М NaCl, ресуспендированного в 2,5% молока/ФБРТ, и инкубировали при 25°С в течение 1 час, пока происходило блокирование планшета. Через 1 час блокирующий буфер удаляют с планшета, добавляли 100 мкл/лунку фага в 2,5% молока/ФБРТ и инкубировали при 25°С в течение 4 час при встряхивании. После связывания планшет промывали 10 раз ФБРТ путем заполнения лунок вручную и удаления буфера между циклами промывания. Фаг элюировали с помощью 150 мкл/лунку 50 мМ НС 1/5 00 мМ KCl в течение 30 мин при 25°С и встряхивании. Элюат нейтрализовали с помощью 150 мкл/лунку 1 М Трис, рН 7,5, и затем разводили в XL1-Blue (Agilent) Escherichia coli (E.coli) с добавлением хелперного фага М13К07.

Амплифицированный фаг использовали для дополнительных кругов селекции против линейного диубиквитина, как было описано выше. В кругах 2-4 растворимый убиквитин в различных формах добавляли к фагу для противоселекции. Во втором круге использовали 10 мкг/мл растворимого моноубиквитина (Boston Biochem). В третьем и четвертом кругах использовали по 10 мкг/мл каждой из цепей растворимого моноубиквитина (Boston Biochem), K11-связанного диубиквитина (Genentech), K48-связанного полиубиквитина 2-7 (Boston Biochem) и K63-связанного полиубиквитина 2-7 (Boston Bioehem). Обогащение вычисляли для кругов 2-4 путем сравнения номера извлеченного фага с линейным диубиквитином в сравнении с непокрытой ячейкой. Обогащение наблюдалось в кругах 2-4 для библиотеки общей легкой цепи и библиотеки VH, но не для библиотеки YSGX (см. Табл. 2).

ТАБЛИЦА 2 Библиотека Круг 2 Круг 3 Круг 4 Общая легкая цепь YSGX 2Х 2Х 25Х YSGX 0Х 0Х 0Х VH 3Х 120Х 800Х

Был проведен скрининг 96 индивидуальных клонов из второго круга сортировки библиотеки VH, 192 клонов из третьего круга сортировки библиотеки VH, 96 клонов из четвертого круга сортировки библиотеки VH и 192 клонов из четвертого круга сортировки библиотеки общей легкой цепи. Поскольку не наблюдалось обогащения для библиотеки YSGX, скрининг клонов из данной библиотеки не проводился. Индивидуальные клоны выращивали в 96-луночном формате в 1 мл бульона 2YT, содержащего 50 мкг/мл карбенициллина и 1×10¹⁰ фага/мл хелперного фага M13K07 при 37°С на протяжении ночи при встряхивании. Клетки гранулировали путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Супернатанты указанных культур использовали для высокопроизводительного анализа пятна фага методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) на предмет связывания с линейным диубиквитином (Boston Biochem), моноубиквитином (Boston Biochem), K11-связанным диубиквитином (Genentech), K48-связанным полиубиквитином 2-7 (Boston Biochem), K63-связанным полиубиквитином 2-7 (Boston Biochem), анти-gD антителом (Genentech) или не покрытой лункой. Все библиотеки Fab содержат карбокси-концевую метку gD на легкой цепи, которая позволяет оценку уровня показа путем связывания с анти-gD антителом. Панель убиквитиновых белков была иммобилизирована на 384-луночных иммунопланшетах Maxisorb (NLTNC). Планшеты покрывали при 4°С в течение ночи 2 мкг/мл каждого белка в 50 мМ натрий-карбонатном буфере, рН 9,6. Покрытые планшеты блокировали с помощью 60 мкл/лунку 2,5% молока в ФБРТ на протяжении 1 час при 25°С и встряхивании. Через 1 час блокирующий буфер удаляли с планшета, добавляли 20 мкл/лунку ФБРТ и 10 мкл/лунку супернатанта фага. Планшеты инкубировали при 25°С в течение 1 час при встряхивании. Затем планшет промывали 6 раз ФБРТ путем заполнения лунок вручную и удаления буфера между циклами промывания. Разведение 1:5000 конъюгированного с пероксидазой хрена (ПХ) вторичного анти-М13 антитела (GE Healthcare) в ФБРТ использовали для обнаружения связывания фага. Добавляли 30 мкл/лунку вторичного разведения, и планшет инкубировали при 25°С в течение 30 мин при встряхивании. Затем планшет вручную промывали 6 раз ФБРТ и дважды ФБР. Связанное вторичное антитело обнаруживали с использованием субстрата ТМБ (KPL), с последующим гашением равным объемом 1 М фосфорной кислоты. Оптическую плотность считывали на длине волны 450 нм.

Из библиотеки общей легкой цепи было идентифицировано несколько объектов со слабым специфичным связыванием с линейным диубиквитином (см. Фиг.1). Были секвенированы вариабельные домены легкой и тяжелой цепи этих клонов. Были идентифицированы две уникальные последовательности (1F4 (SEQ ID NO:27 и 31) и 1А10 (SEQ ID NO:28 и 31)), однако, на основании последовательности легкой цепи было определено, что один из этих клонов (1F4) фактически происходит из библиотеки YSGX, которая не содержит фиксированной легкой цепи (см. Фиг.2А). Из библиотеки VH было идентифицировано несколько клонов, демонстрирующих прочное связывание с линейным диубиквитином и более слабое связывание с K63-связанным полиубиквитином (см. Фиг.1). Вариабельные домены тяжелой цепи этих клонов библиотеки VH были секвенированы. Ожидалось, что последовательности CDR H1, CDR H2 и CDR Н3 будут специфичными для клона, принимая во внимание, что каркасные последовательности тяжелой цепи должны быть идентичными, на основании дизайна библиотеки VH. Ожидалось, что полноразмерная последовательность легкой цепи (как каркаса, так и CDR) будет инвариантной за счет дизайна библиотеки. Последовательность CDR L1 представляет собой RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:1), последовательность CDR L2 представляет собой SASFLYS (SEQ ID NO:2) и последовательность CDR L3 представляет собой QQSYTTPPT (SEQ ID NO:3). Были идентифицированы две уникальных последовательности тяжелой цепи (1D8 (SEQ ID NO:30) и 1Е3 (SEQ ID NO:29)) (см. Фиг.2В).

В) Превращение фагемид в показ одновалентного Fab

Клоны фагемид 1D8 и 1Е3 из библиотеки VH были превращены из двухвалентного формата Fab-zip в одновалентный показ Fab для целей созревания аффинности. Лейциновый зиппер между концом константного домена CH1 и стартом гена III (gpIII) был удален с применением мутагенеза по Кункелю (см. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)). Мутагенный олигонуклеотид F220-delzip (TCTTGTGACAAAACTCACAGTGGCGGTGGCTCTGGT) (SEQ ID NO:100) был объединен с 1 мкг ДНК фагемиды 1D8 или 1Е3 по Кункелю.

Клоны 1А10 и 1F4 из библиотеки общей легкой цепи и библиотеки YSGX, соответственно, были превращены из двухвалентного формата Fab-C в одновалентный показ Fab для целей созревания аффинности. Цистеин между концом константного домена СН1 и gpIII был удален с применением мутагенеза по Кункелю. Мутагенный нуклеотид F1120-delCGRP

(TGTGACAAAACTCACCTCAGTGGCGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAA AAG) (SEQ IQ NO:101) объединяли с 1 мкг ДНК фагемиды 1А10 или 1F4 по Кункелю. Полученные одновалентные фагемиды Fab использовали, чтобы продуцировать фаг для IC₅₀ ТИФА.

Г) Фаг IC₅₀ ТИФА

Фаг, показывающий одновалентные Fab для 1D8, 1Е3, 1А10 и 1F4, был протестирован в IC₅₀ ТИФА, чтобы получить оценку относительного аффинности с линейным диубиквитином. Начальный титр ТИФА был получен для определения количества фага, при котором достигается сигнал OD₄₅₀=0,5. Линейный диубиквитин (Boston Biochem) иммобилизировали на 96-луночном иммунопланшете Maxisorb (NUNC). Планшеты покрывали в течение ночи при 4°С 1 мкг/мл линейного диубиквитина в 50 мМ натрий-карбонатном буфере, рН 9,6. Покрытые планшеты блокировали с помощью 200 мкл/лунку 2,5% молока в ФБРТ в течение 1 час при 25°С и встряхивании. 12 двукратных серийных разведений фага готовили в 2,5% молока в ФБРТ от OD₂₆₈=4,0 до OD₂₆₈=0,002. Через 1 час блокирующий буфер удаляли с планшета, добавляли 100 мкл/лунку каждого разведения фага в 2,5% молока/ФБРТ и инкубировали при 25°С в течение 15 мин при встряхивании. Далее планшет промывали 6 раз ФБРТ с помощью устройства для промывания планшетов. Разведение 1:5000 конъюгированного с пероксидазой хрена (ПХ) вторичного антитела против фага М13 (GE Healthcare) в ФБРТ использовали для обнаружения связывания фага. Добавляли 100 мкл/лунку вторичного разведения, и планшет инкубировали при 25°С в течение 30 мин при встряхивании. Затем планшет промывали 12 раз ФБРТ с использованием устройства для промывания планшетов, и дважды ФБР вручную. Связанное вторичное антитело обнаруживали с использованием субстрата ТМБ (KPL), с последующим гашением равным объемом 1 М фосфорной кислоты. Оптическую плотность считывали на длине волны 450 нм. Концентрация фага, при которой OD₄₅₀=0,5, составляла OD₂₆₈=1,0 фага для клона 1F4, OD₂₆₈=0,125 для клона 1D8, и OD₂₆₈=0,5 для клона 1Е3. Для клона 1А10, даже при OD₂₆₈ фага=4,0, OD₄₅₀ составила только 0,376. Такое связывание является очень слабым и, таким образом, клон 1А10 далее не рассматривали. Двукратные серийные разведения растворимого линейного убиквитина от 10 мкМ до 5 нМ для клона 1F4, и трехкратные серийные разведения растворимого линейного убиквитина от 10 мкМ до 56 пМ для клонов 1D8 и 1Е3 плюс концентрации выбранного фага в 2,5% молока в ФБРТ инкубировали при 25°С в течение 1 час при встряхивании. Затем количество свободного фага для каждой линейной концентрации диубиквитина измеряли, инкубируя смеси на 96-луночном иммунопланшете Maxisorb, покрытым 1 мкг/мл линейного диубиквитина и блокированным 2,5% молока в ФБРТ. Смесь фаг/линейный диубиквитин инкубировали на планшете в течение 15 мин при 25°С и встряхивании. Далее планшет промывали 6 раз ФБРТ с помощью устройства для промывания планшетов. Разведение 1:5000 конъюгированного с пероксидазой хрена (ПХ) вторичного антитела против фага М13 (GE Healthcare) в ФБРТ использовали для обнаружения связывания фага. Добавляли 100 мкл/лунку вторичного разведения, и планшет инкубировали при 25°С в течение 30 мин при встряхивании. Затем планшет промывали 12 раз ФБРТ с использованием устройства для промывания планшетов, и дважды ФБР вручную. Связанное вторичное антитело обнаруживали с использованием субстрата ТМБ (KPL), с последующим гашением равным объемом 1 М фосфорной кислоты. Оптическую плотность считывали на длине волны 450 нм. Оптическую плотность наносили на график против концентрации растворимого линейного диубиквитина, который показывает, что для 1F4 IC₅₀ превышает 10 мкМ (см. Фиг.3), для 1D8 IC₅₀ составляет приблизительно 5 мкМ (см. Фиг.3), и для 1Е3 IC₅₀ составляет 80 нМ (см. Фиг.3).

Д) Получение Fab

Клоны, происходящие из библиотек Fab показа фага, экспрессируют под контролем промотора щелочной фосфатазы (PhoA) E.coli. Как легкая цепь, так и тяжелая цепь содержит амино-концевую бактериальную сигнальную последовательность stil, чтобы позволить секрецию в Е. coli, и экспрессируются из единого фагемидного вектора. Карбокси-конец тяжелой цепи слит внутри рамки считывания с С-концом генным продуктом III (gpIII) бактериофага М13, что позволяет показ одновалентного фрагмента Fab на фаге. Для того чтобы экспрессировать растворимый Fab, вводят стоп-кодон в одновалентные фагемиды 1D8 и 1Е3 между концом константного домена СН1 Fab и началом gpIII. Мутагенные олигонуклеотиды:

5'-FabdelzipTAA (CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAAAGTGGCGGTGG CTCTGGTTCCGGTG) (SEQ ID NO:102) и

3'-FabdelzipTAA

(CACCGGAACCAGAGCCACCGCCACTTTATGTGTGAGTTTTGTCACAAGATTTGGG) (SEQ ID NO:103) использовали для вставки стоп-кодона с применением набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange® Lightning (Agilent). Полученные плазмиды экспрессии растворимого Fab были трансформированы в штамм Е. coli 62A7 (Genentech) и нанесены на твердый агар, содержащий карбенициллин. Одинарные колонии использовали для инокуляции 25 мл бульона 2YT, содержащего 50 мкг/мл карбенициллина. Культуру выращивали на протяжении ночи при 37°С, и 5 мл использовали для инокуляции 500 мл полной среды C.R.A.P. (3,57 г (NH₄)₂SO₄, 0,71 г натрия цитрата*2H₂O, 1,07 г KCl, 5,36 г экстракта дрожжей (сертифицированный), 5,36 г Hycase SF (Sheffield), pH доводили до 7,3 путем добавления KОН, и объем доводили до 872 мл с помощью ультраочищенной воды, обработанной в автоклаве и охлажденной до 55°С, в которую добавляли (на 1 л) 110 мл 1 М 3-N-морфолин-пропансульфониевой кислоты, pH 7,3, 11 мл 50% глюкозы и 7 мл 1 М MgSO₄, содержащего 50 мкг/мл карбенициллина. Культуры выращивали при 30°С в течение 24 час при встряхивании. Клетки отделяли центрифугированием, и гранулы хранили при -20°С. Fab очищали путем ресуспендирования гранулы клеток в 35 мл холодного промывочного буфера (фосфатный буферный раствор [ФБР]+150 мМ NaCl), содержащего 10 мкг/мл ДНКазы 1 (Invitrogen), 0,2 мг/мл лизоцима (USB) и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) (Calbiochem). Гранулу ресуспендировали путем быстрого вихревого перемешивания. Чтобы позволить полный лизис, клетки инкубировали в течение 15 мин при 25°С. Осколки клеток гранулировали центрифугированием, и лизат помещали на колонку белок А-сефарозы объемом 1 мл (GE Healthcare), предварительно уравновешенную холодным промывочным буфером. Колонку промывали 50 мл холодною промывочною буфера, элюировали 3 мл 0,1 М уксусной кислоты и нейтрализовали 150 мкл 1 М Трис, рН 11,0. Fab концентрировали с использованием фильтровальных модулей для центрифуги Amicon Ultra-15 (порог 10 кДа, Millipore). Полученную концентрацию Fsb определяли спектрофотометрически (1 OD₂₈₀=1,5 мг/мл).

Е) Вестерн-блот Fab

Fab 1D8 и 1Е3 (из Примера 1Е) тестировали на предмет связывания с линейным диубиквитином (Boston Biochem), моноубиквитином (Boston Biochem), K11-связанным диубиквитином (Genentech), K48-связанным диубиквитином (Boston Biochem) и K63-связанным диубиквитином (Boston Biochem) в Вестерн-блоте. 1 мкг каждого белка в 1X буфере LDS (Invitrogen) с восстановителем нагревали до 70°С, выдерживая при этой температуре в течение 10 мин, и проводили анализ на гелях 4-12% NuPAGE Бис Трис 1,0 мм в буфере МЭС (Invitrogen) в двух экземплярах. Гели переносили для пропускания постоянного тока 30 В в течение 1,5 час путем влажного переноса в 10% метанола и 1X буфере переноса NuPAGE (Invitrogen) на нитроцеллюлозу толщиной 0,2 мкм (Invitrogen). Сайты неспецифического связывания на мембранах блокировали путем инкубации в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1,5 час при 25°С и встряхивании. Далее мембраны инкубировали в 5 мкг/мл Fab 1D8 или 1Е3 в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Мембрану промывали трижды в ФБРТ при встряхивании. Fab обнаруживали путем инкубирования мембраны в разведении 1:10000 козьего антитела, специфичного в отношении человеческого фрагмента Fab, конъюгированного с ПХ (Sigma Aldrieh) в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С при встряхивании. Далее мембраны трижды промывали ФБРТ и 1 раз ФБР. Вторичное антитело обнаруживали с использованием хемилюминесцентного субстрата Super Signal West Pico (Thermo Scientific), с последующим приведением блотов в контакт с пленкой. 1Е3 Fab обнаруживает только линейный диубиквитин, но не моноубиквитин, K11-связанный диубиквитин, K48-связанный диубиквитин или K63-связанный диубиквитин (см. Фиг.4). 1D8 Fab не обнаруживал никаких форм убиквитина в анализе методом Вестерн-блота (см. Фиг.4).

Ж) Анализ аффинности выделенных Fab IDS и 1F.3

Аффинность Fab 1D8 и 1Е3 (из Примера 1Е) была проанализирована методом резонанса поверхностного плазмона (РГТП) с использованием BIACORE™ 3000 (GE Healthcare). Приблизительно 120 единиц резонанса (ЕР) линейного диубиквитина (Boston Biochem), K48-связанного диубиквитина (Boston Biochem) и K63-связанного диубиквитина (Boston Biochem) были иммобилизированы на проточной кювете 2, проточной кювете 3 и проточной кювете 4, соответственно, чипа СМ5 с использованием протокола аминного сочетания, предоставленного производителем. Проточную кювету 1 активировали и блокировали этаноламином, без иммобилизированного белка, чтобы использовать для референтного вычитания. Двукратные серийные разведения (0,5-500 нМ) Fab 1E3 в 10 мМ Hepes, pH 7,2, 150 мкМ NaCl и 0,01% Твина 20 (БГРШ) вводили инъекционно (всего 60 мкл при скорости потока 30 мкл/мин) над каждой проточной кюветой, используя БГРШ в качестве буфера анализа. Сигнал для каждой проточной кюветы регистрировали, и референтный сигнал вычитали. Исследовали различные условия регенерации. Даже при применении 10 мМ HCl поверхность чипа не могла быть полностью регенерирована до исходного состояния. Если тестировали 10 мМ глицина, pH 1,7, это изменяло поверхность чипа и снижало емкость связывания.

Альтернативный подход тестировали с использованием способа захвата Fab на BIACORE™ 3000 (GE Healthcare). Приблизительно 11000 единиц резонанса (ЕР) антитела захвата против человеческого Fab (GE Healthcare) иммобилизировали на проточных кюветах 1 и 2 чипа СМ5 с использованием протокола аминного сочетания, предоставленного производителем. 10 мкл 10 мкг/мл Fab в 10 мМ Hepes, pH 7,2, 150 мМ NaCl и 0,01% Твина 20 (БГРШ) вводили инъекционно со скоростью потока 10 мкл/мин над проточной кюветой 2, что приводило к захвату приблизительно 430 РЕ Fab. Проточная кювета 1 содержала только антитело захвата и служила для референтного вычитания. Двукратные серийные разведения (1-1000 нМ) линейного диубиквитина (Boston Biochem) или K63-связанного диубиквитина (Boston Biochem) в БГРШ вводили инъекционно (всего 60 мкл со скоростью потока 30 мкл/мин) над проточными кюветами 1 и 2. Сигнал для каждой проточной кюветы регистрировали, и референтный сигнал вычитали. После периода диссоциации 4 мин поверхность чипа регенерировали двумя инъекциями по 30 мкл 10 мМ глицина, pH 2,1, при скорости потока 30 мкл/мин. Данные было сложно аппроксимировать к любой модели связывания, поскольку диубиквитин не полностью диссоциировал с чипа. Кроме того, скорость ассоциации была очень большой, и связывание не достигало фазы плато даже при самой высокой из использованных концентраций диубиквитина. Таким образом, сложно оценить K_D для указанных Fab.

ПРИМЕР 2 - Созревание аффинности 1F4,1D8 и 1Е3

А) Генерация стоп-шаблона

Стоп-кодон ТАА вставляли по отдельности в любой из CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR НЗ или CDR L3 и НЗ (что давало стоп-шаблоны L1, L2, L3, Н3 и L3/H3, соответственно) для синтеза библиотеки с применением мутагенеза по Кункелю. Стоп-кодоны вынуждали разнообразие в пределах конкретной петли CDR, требуя остановки восстановления с целью достижения экспрессии полноразмерного Fab и показа на фаге. Мутагенный олигонуклеотиды стоп-кодона, перечисленные ниже, сочетали с 1 мкг ДНК соответствующей одновалентной фагемиды по Кункелю. Полученные стоп-шаблоны одновалентной фагемиды Fab использовали для генерации библиотеки созревания аффинности.

Для клонов 1D8 и 1Е3, мутагенный олигонуклеотид CDR L1 стоп, который использовали для вставки стоп-кодона ТАА в положении 24 (нумерация Kabat) в пределах CDR L1 легкой цепи, представлял собой 4D5LC1.stop (GTCACCATCACCTGCTAAGCCAGTCAGGATGTG) (SEQ ID NO:104). Для клонов 1D8 и 1Е3, мутагенный олигонуклеотид CDR L2 стоп, который использовали для вставки стоп-кодона ТАА в положении 50 (нумерация Kabat) в пределах CDR L2 легкой цепи, представлял собой 4D5LC2.stop (GAAGCTTCTGATTTACTAAGCATCCTTCCTCTAC) (SEQ ID NO:105). Для клонов 1D8 и 1Е3, мутагенный олигонуклеотид CDR L3 стоп, который использовали для вставки стоп-кодона ТАА в положении 89 (нумерация Kabat) в пределах CDR L3 легкой цепи, представлял собой 4D5LC3.stop (GCAACTTATTACTGTTAACAATCTTATACTACTC) (SEQ ID NO:106). Мутагенный олигонуклеотид CDR НЗ стоп, который использовали для вставки стоп-кодона ТАА в положении 95 (нумерация Kabat) в пределах CDR НЗ тяжелой цепи клона 1D8, представлял собой VH3.1D8.H3stop (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTTAAGCCGGGTCCCGCTTGTTGTCG) (SEQ ID NO:107). Мутагенный олигонуклеотид CDR НЗ стоп, который использовали для вставки стоп-кодона ТАА в положении 98 (нумерация Kabat) в пределах CDR Н3 тяжелой цепи клона 1Е3, представлял собой 413Vh5SRo6 (GAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGTGAGGCCTCGTAACTGCCCCCCTACGT TATGGACTACTGGGGTCAAGGAACACTAGTC) (SEQ ID NO:108).

Для клона 1F4 мутагенный олигонуклеотид CDR L1 стоп, который использовали для вставки стоп-кодона ТАА в положении 27 (нумерация Kabat) в пределах CDR L1 легкой цепи, представлял собой CLC.L1stop (CATCACCTGCCGTGCCAGTTAATCCGTGTCCAGCGCTGTAG) (SEQ ID NO:109). Для клона 1F4 мутагенный олигонуклеотид CDR L2 стоп, который использовали для вставки стоп-кодона ТАА в положении 52 (нумерация Kabat) в пределах CDR L2 легкой цепи, представлял собой CLC.L2st.op (CTTCTGATTTACTCGGCATAAAGCCTCTACTCTGGAGTC) (SEQ ID NO:110). Для клона 1F4 мутагенный олигонуклеотид CDR L3 стоп, который использовали для вставки стоп-кодона ТАА в положении 90 (нумерация Kabat) в пределах CDR L3 легкой цепи, представлял собой CLC4.1F4.L3stop (GCAACTTATTACTGTCAGTAATATTATTATTATTCTCCG) (SEQ ID NO:111). Мутагенный олигонуклеотид CDR Н3 стоп, который использовали для вставки стоп-кодона ТАА в положении 94 (нумерация Kabat) в пределах CDR НЗ тяжелой цепи клона 1F4, представлял собой CLC4.1F4.H3stop (GCCGTCTATTATTGTGCTTAAGGTTACGTTTGGAAAGGTG) (SEQ ID NO:112).

Б) Генерация библиотеки созревания аффинности

Всего 10 библиотек созревания аффинности генерировали для каждого клона (1F4, 1D8 и 1Е3). Все библиотеки генерировались посредством мутагенеза по Кункелю (см. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. США 82:488 (1985)). В случае мягкой рандомизации, вырожденные олигонуклеотиды были синтезированы таким образом, что остаток дикого типа сохранялся бы в 50% случаев, и в 50% случаев кодировалась бы одна из оставшихся 19 аминокислот. Чтобы достичь мягкой рандомизации, олигонуклеотиды были сконструированы таким образом, что некоторые положения нуклеотидов были заняты в 70% случаев указанным основанием, и в 10% случаев были заняты одним из трех других оснований (Gallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233 (1994)). Для тех олигонуклеотидов, которые отслеживали, если такая мягкая рандомизация была введена в конкретном основании, на присутствие мягкой рандомизации указывало наличие номера в положении такого основания. Номер "5" указывает, что основание аденин присутствует в 70% случаев в указанном том положении, в то время как каждое из оснований гуанин, цитозин и тимин присутствует в 10% случаев. Дополнительно, номер "6" обозначает гуанин, "7" - цитозин, и "8" - тимин, где в каждом случае любое из трех других оснований присутствует только в 10% случаев. В случае жесткой рандомизации вырожденные олигонуклеотиды были синтезированы таким образом, что разрешалось бы присутствие различных аминокислот, найденных в определенных положениях, в пределах природных человеческих антител. В данном случае использовались вырожденные кодоны, в которых буква "R" кодирует гуанин или аденин, "Y" кодирует тимин или цитозин, "М" кодирует аденин или цитозин, "K" кодирует гуанин или тимин, "S" кодирует гуанин или цитозин, "W" кодирует аденин или тимин, "Н" кодирует аденин, цитозин или тимин, "В" кодирует гуанин, тимин или цитозин, "V" кодирует гуанин, цитозин или аденин, "D" кодирует гуанин, аденин или тимин, и "N" кодирует гуанин, аденин, цитозин или тимин.

Десять библиотек были сгенерированы для за 1F4 и обозначены L1, L2, L3, L1/L2/L3, Н3, L3/H3, L1/H2, L2/H1, Н2/Н3 и L3/H1/H2. Библиотеки LI 1F4 содержали жестко рандомизированные положения 28-33 (нумерация Kabat) легкой цепи, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител. Мутагенные олигонуклеотиды L1 F111-L1 (ACCTGCCGTGCCAGTCAGRDTRKTRVWANWTHTGTAGCCTGGTATCAACAGAAAC) (SEQ ID NO:113) и F202-L1 (ACCTGCCGTGCCAGTCAGRDTRKTRVWANWTHTCTGGCCTGGTATCAACAGAAAC) (SEQ ID NO:114) смешивали в соотношении 1:2 с получением "смеси олиго L1" и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L1 1F4 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1F4 L2 содержала жестко рандомизированные положения 50, 53 и 55 (нумерация Kabat) легкой цепи, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител. Мутагенные олигонуклеотиды L2 F201-L2 (CCGAAGCTTCTGATTTA CKBGGCATCCAVCCTCTACTCTGGAGTCCCT) (SEQ ID NO:115) и F203-L2 (CCGAAGCTTCTGATTTACKBGGCATCCAVCCTCGMATCTGGAGTCCCTTCTCGC) (SEQ ID NO:116) смешивали в соотношении 1:1 с получением "смеси олиго L2" и объединяли с 20 мкг ДИК стоп-шаблона по Кункелю Т-2 1F4 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1F4 L3 содержала положения 91-96 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител, или мягко рандомизированные. Мутагенные олигонуклеотиды F133a (GCAACTTA TTACTGTCAGCAATMTDMCRVTNHTCCTYKGACGTTCGGACAGGGTACC) (SEQ ID NO:117), F133b (GCAACTTATTACTGTCAGCAATMTDMCRVTNHTCCTTWTACGTTCGGACAGGGTAC С) (SEQ ID NO:118), F133c (GCAACTTATTACTGTCAGCAASRTDMCRVTNHTCCTYKGACGTTCGGACAGGGTACC) (SEQ ID NO:119), F133d (GCAACTTATTACTGTCAGCAASRTDMCRVTNHTCCTTWTACGTTCGGACAGGGTACC) (SEQ ID NO:120) смешивали в соотношении 1:1:1:1 с получением "смеси жестких олиго L3". Мутагенные олигонуклеотиды F563-L3soft1 (ACTTATTACTGTCAGCAA878857577577CCT777ACGTTCGGACAGGGTACC) (SEQ ID NO:121), F564-L3soft2 (ACTTATTACTGTCAGCAA878857577577CCTTWTACGTTCGGACAGGGTACC)(SEQ ID NO:122) и F565-L3soft3 (ACTTATTACTGTCAGCAA 878857577577CCTYKGACGTTCGGACAGGGTACC) (SEQ ID NO:123) смешивали в соотношении 1:0,5:1 с получением "смеси мягких олиго L3".

"Смесь жестких олиго L3", "смесь мягких олиго L3" и мутагенный олигонуклеотид 1F4.L3soft (GCAACTTATTACTGTCAGCAA857857857857878CCG788ACGTTCGGACAGGGTACCA AG) (SEQ ID NO:124) смешивали в соотношении 1:1:1 с получением "смеси общего олиго L3" и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L3 1F4 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1F4 Н3 содержала мягко рандомизированные положения 95, 97, 99, 100 и 100а (нумерация Kabat) тяжелой цепи. Мутагенный олигонуклеотид CLC. 1F4.H3soft (GACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGC668TAC688TGG555668678ATGGACTACTGGG GTCAAGGAACC) (SEQ ID NO:125) объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю Н3 1F4 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1F4 L3/H3 содержала положения 91-96 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител, или мягко рандомизированные. Она также содержала мягко рандомизированные положения 95, 97, 99, 100 и 100а (нумерация Kabat) тяжелой цепи. "Смесь общих олиго L3" и мутагенный олигонуклеотид CLC.1F4.H3soft (SEQ ID NO:126), описанные выше, смешивали в соотношении 1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю 1 F4 L3/H3 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1F4 L1/H2 содержала положения 28-33 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител. Она также содержала мягко рандомизированные положения 50, 52, 53, 54 и 58 (нумерация Kabat) тяжелой цепи. «Смесь олиго L1», описанную выше, и мутагенный олигонуклеотид CLC4.1F4.H2soft (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCA878ATT857TCT857857AG CTATACT878TATGCCGATAGCGTCAAGGGCCG) (SEQ ID NO:126) смешивали в соотношении 1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L1 1F4 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1F4 L2/H1 содержала положения 50, 53, и 55 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител. Она также содержала мягко рандомизированные положения 30-33 (нумерация Kabat) тяжелой цепи. «Смесь олиго L2», описанную выше, и мутагенный олигонуклеотид CLC4.1F4.H1soft (GCAGCTTCTGGCTTCAACTTT857878857857ATGCACTGGGTGCGTCAGGCC) (SEQ ID NO:127) смешивали в соотношении 1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю 1 F4 L2 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю

Библиотека 1F4 Н2/Н3 содержала мягко рандомизированные положения 50, 52, 53, 54, 58, 95, 97, 99, 100, и 100а (нумерация Kabat) тяжелой цепи. Мутагенные олиujнуклtjтиды CLC4.1F4.H2boft (SCQ ID NO 126) и CT.C4.1F4.H3soft (SEQ ID NO:125), описанные выше, смешивали в соотношении 1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю Н3 1F4 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1F4 L1/L2/L3 содержала положения 28-33, 50, 53 и 55 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител. Она также содержала положения 91-96 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител, или мягко рандомизированные. "Смесь олиго L1", "смесь олиго L2" и "смесь общих олиго L3" смешивали в соотношении 1:1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L3 1F4 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю

Библиотека 1F4 L3/H1/H2 содержала положения 91-96 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител, или мягко рандомизированные. Она также содержала мягко рандомизированные положения 30-33, 50, 52, 53, 54 и 58 (нумерация Kabat) тяжелой цепи. "Смесь общих олиго L3", CLC4.1F4.Hlsoft (SEQ ID NO:127) и CLC4.1F4.H2soft (SEQ ID NO:126), описанных выше, смешивали в соотношении 1:1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L3 1F4 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю

Десять библиотек были сгенерированы для 1D8 и обозначены L1, L2, L3, L1/L2/L3, Н3, L3/H3, L1/H2, L2/H1, Н2/Н3 и L3/H1/H2. Библиотека 1D8 L1 содержала положения 28-33 (Kabat нумерация) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител. Мутагенные олигонуклеотиды L1 F1 11-L1 (SEQ ID NO:113) и F202-L1 (SEQ ID NO:114), описанные выше, смешивали в соотношении 1:2 с получением «смеси олиго L1» и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L1 1D8 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1D8 L2 содержала положения 50, 53 и 55 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител. Мутагенные олигонуклеотиды L2 F201-L2 (SEQ ID NO:115) и F203-L2 (SEQ ID NO:116), описанные выше, смешивали в соотношении 1:1 с получением «смеси олиго L2» и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L2 1D8 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1D8 L3 содержала положения 91-94 и 96 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител, или мягко рандомизированные. Мутагенные олигонуклеотиды F133a (SEQ ID NO:117), F133b (SEQ ID NO:118), F133c (SEQ ID NO:119) и F133d (SEQ ID NO:120), описанные выше, смешивали в соотношении 1:1:1:1 с получением "смеси жестких олиго L3". Мутагенные олигонуклеотиды F563-L3soft1 (SEQ ID NO:121), F564-L3soft2 (SEQ ID NO:122) и F565-L3soft3 (SEQ ID NO:123), описанные выше, смешивали в соотношении 1:0,5:1 с получением "смеси мягких олиго L3". Далее "смесь жестких олиго L3" и "смесь мягких олиго L3" смешивали в соотношении 1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L3 1D8 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1D8 Н3 содержала мягко рандомизированные положения 96-100 с (нумерация Kabat) тяжелой цепи. Мутагенный олигонуклеотид VH3.1D8.H3soft (GCCGTCTATTATTGTGCTCGTGAG678668878565788788878688ATGGACTACTGGGGTCAAGGAACC) (SEQ ID NO:128) объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю Н3 1D8 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1D8 L3/H3 содержала положения 91-94 и 96 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител, или мягко рандомизированные. Она также содержала мягко рандомизированные положения 96-100 с (нумерация Kabat) тяжелой цепи. "Смесь мягких олиго L3", "смесь жестких олиго L3" и мутагенный олигонуклеотид VH3.1D8.H3soft (SEQ ID NO:128), описанные выше, смешивали в соотношении 0,5:0,5:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L3/H3 1D8 (описанного в Примере 2A) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1D8 L1/H2 содержала положения 28-33 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител. Она также содержала положения 50, 52, 53, 54 и 58 (нумерация Kabat) тяжелой цепи мягко рандомизированные. «Смесь олиго L1», описанную выше, и мутагенный олигонуклеотид VH3.1D8.H2soft (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCT668ATT878CCT857668GGTTATACT657TATGCCGATAGCGTCAAGGGCCG) (SEQ ID NO:129) смешивали в соотношении 1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L1 1D8 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1D8 L2/H1 содержала положения 50, 53 и 55 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител. Она также содержала мягко рандомизированные положения 30-33 (нумерация Kabat) тяжелой цепи. «Смесь олиго L2», описанную выше, и мутагенный олигонуклеотид VH3.1D8.H1soft (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTC577657857657ATTCACTGGGTGCGTCAGGCC) (SEQ ID NO:130) смешивали в соотношении 1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L2 1D8 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1D8 Н2/Н3 содержала мягко рандомизированные положения 50, 52, 53, 54, 58 и 96-100 с (нумерация Kabat) тяжелой цепи. Мутагенные олигонуклеотиды VH3.1D8.H2soft (SEQ ID NO:129) и VH3.1D8.H3soft (SEQ ID NO:128), описанные выше, смешивали в соотношении 1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю Н3 1D8 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1D8 L1/L2/L3 содержала положения 28-33, 50, 53 и 55 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител. Она также содержала положения 91-94 и 96 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител, или мягко рандомизированные. "Смесь олиго L1", "смесь олиго L2", "смесь жестких олиго L3" и "смесь мягких олиго L3" смешивали в соотношении 1:1:0,5:0,5 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L3 ID 8 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1D8 L3/H1/H2 содержала положения 91-94 и 96 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител, или мягко рандомизированные. Она также содержала мягко рандомизированные положения 30-33, 50, 52, 53, 54 и 58 (нумерация Kabat) тяжелой цепи. "Смесь жестких олиго L3", "смесь мягких олиго L3", VH3.1D8.H1soft (SEQ ID NO:130) и VH3.1D8.H2soft (SEQ ID NO:129), описанные выше, смешивали в соотношении 0,5:0,5:1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L3 1D8 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Десять библиотек были сгенерированы для за 1Е3 и обозначены L1, L2, L3, L1/L2/L3, Н3, L3/H3, L1/H2, L2/H1, Н2/Н3 и L3/H1/H2. Библиотека 1Е3 L1 содержала положения 28-33 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител. Мутагенные олигонуклеотиды L1 F111-L1 (SEQ ID NO:113) и F202-L1 (SEQ ID NO:114), описанные выше, смешивали в соотношении 1:2 с получением «смеси олиго L1» и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L1 1Е3 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю

Библиотека 1Е3 L2 содержала положения 50, 53 и 55 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител. Мутагенные олигонуклеотиды L2 F201-L2 (SEQ ID NO:115) и F203-L2 (SEQ ID NO:116), описанные выше, смешивали в соотношении 1:1 с получением «смеси олиго L2» и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L2 1Е3 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1Е3 L3 содержала положения 91-94 и 96 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях и пределах природных человеческих антител, или мягко рандомизированные. Мутагенные олигонуклеотиды F133a (SEQ ID NO:117), F133b (SEQ ID NO:118), F133c (SEQ ID NO:119) и F133d (SEQ ID NO:120), описанные выше, смешивали в соотношении 1:1:1:1 с получением "смеси жестких олиго L3". Мутагенные олигонуклеотиды F563-L3soft1 (SEQ ID NO:121), F564-L3soft2 (SEQ ID NO:122) и F565-L3soft3 (SEQ ID NO:123), описанные выше, смешивали в соотношении 1:0,5:1 с получением "смеси мягких олиго L3". "Смесь жестких олиго L3" и "смесь мягких олиго L3" далее смешивали в соотношении 1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L3 1Е3 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1Е3 Н3 содержала мягко рандомизированные положения 95, 97, 98, 99 и 100а (нумерация Kabat) тяжелой цепи. Мутагенный олигонуклеотид VH4.1E3.H3soft (GACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGT577TGG788788565TGG688ATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTG) (SEQ ID NO:131) объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю Н3 1Е3 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1Е3 L3/H3 содержала положения 91-94 и 96 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител, или мягко рандомизированные. Она также содержала мягко рандомизированные положения 95, 97, 98, 99 и 100а (нумерация Kabat) тяжелой цепи. "Смесь мягких олиго L3", "Смесь жестких олиго L3" и мутагенный олигонуклеотид VH4.1E3.H3soft (SEQ ID NO:131), описанные выше, смешивали в соотношении 0,5:0,5:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L3/H3 1Е3 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1Е3 L1/H2 содержала положения 28-33 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител. Она также содержала мягко рандомизированные положения 50, 52, 53, 54 и 58 (нумерация Kabat) тяжелой цепи. «Смесь олиго L1», описанную выше, и мутагенный олигонуклеотид VH4.1E3.H2soft (GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCT878ATT577CCT878878GGTTCTACT657TATGCCGATAGCGTCAAGGGCCG) (SEQ ID NO:132) смешивали в соотношении 1:1 и объединяли с 20 мм ДНК стоп-шаблона по Кункелю L1 1Е3 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1Е3 L2/H1 содержала положения 50, 53 и 55 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител. Она также содержала мягко рандомизированные положения 30-33 (нумерация Kabat) тяжелой цепи. «Смесь олиго L2», описанную выше, и мутагенный олигонуклеотид VH4.1E3.H1soft (GCAGCTTCTGGCTTCACCTTC878558577857ATTAGCTGGGTGCGTCAGGCC) (SEQ ID NO:133) смешивали в соотношении 1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L2 1Е3 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1Е3 Н2/Н3 содержала мягко рандомизированные положения 50, 52, 53, 54, 58, 95, 97, 98, 99 и 100а (нумерация Kabat) тяжелой цепи. Мутагенные олигонуклеотиды VH4.1E3.H2soft (SEQ ID NO:132) и VH4.1E3.H3soft (SEQ ID NO:133), описанные выше, смешивали в соотношении 1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю Н3 1Е3 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1Е3 L1/L2/L3 содержала положения 28-33, 50, 53 и 55 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител. Она также содержала положения 91-94 и 96 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител, или мягко рандомизированные. "Смесь олиго L1", "смесь олиго L2", "смесь жестких олиго L3" и "смесь мягких олиго L3" смешивали в соотношении 1:1:0,5:0,5 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L3 1Е3 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека 1Е3 L3/H1/H2 содержала положения 91-94 и 96 (нумерация Kabat) легкой цепи, жестко рандомизированные, чтобы позволить присутствие различных аминокислот, найденных в указанных положениях в пределах природных человеческих антител, или мягко рандомизированные. Она также содержала положения 30-33, 50, 52, 53, 54 и 58 (нумерация Kabat) тяжелой цепи мягко рандомизированные. "Смесь жестких олиго L3", "смесь мягких олиго L3", VH4.1E3.H1soft (SFO ID NO:133) и VH4.1E3.H2soft (SEQ TD NO:132), описанные выше, смешивали в соотношении 0,5:0,5:1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L3 1Е3 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Реакции мутагенеза осуществляли путем электропорации в электрокомпетентные XL I-Blue (Agilent) E.coli и извлекали в 25 мл среды SOC в течение 45 мин при 37°С и встряхивании. Отбирали 20 мкл и серийные 10-кратные разведения наносили на планшеты с твердым агаром, содержащим карбенициллин, с последующим культивированием на протяжении ночи при 37°С, чтобы определить размер библиотеки. Остальную культуру переносили в 500 мл бульона 2YT, содержащего 50 мкг/мл карбенициллина и 1×10¹⁰ фага/мл хелперного фага М13К07. Клетки инфицировали при 37°С в течение 1 час при встряхивании. Добавляли 50 мкг/мл канамицина, и культуры культивировали еще в течение 7 час при 37°С и встряхивании. Затем температуру сдвигали до 30°С, и культуры выращивали еще в течение 22 час. Каждая из библиотек содержала по меньшей мере ~9,5×10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ). Фаг очищали из супернатанта культуры двумя кругами осаждения с 1/5 объема 20% полиэтиленгликоля (ПЭГ)/2,5 М NaCl.

В) Сортировка библиотеки созревания аффинности

Библиотеки созревания аффинности 1F4, 1D8 и 1Е3 подвергали четырем кругам сортировки. Каждую из десяти под-библиотек сортировали параллельно в первом кругу, а затем объединяли в пул для 2-4 кругов сортировки. Первый круг представлял собой планшетную сортировку с линейным диубиквитином, иммобилизированном на 96-луночном иммунопланшете Maxisorb (NUNC). Планшеты покрывали в течение ночи при 4°С 5 мкг/мл линейного диубиквитина (Boston Biochem) в 50 мМ натрий-карбонатном буфере, рН 9,6. Покрытые планшеты блокировали с помощью 200 мкл/лунку 2,5% молока в ФБР, содержащем 0,05% Твина 20 (ФБРТ) в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Библиотеки фага разбавляли до OD=2,0 ФБРТ, содержащим 2,5% молока, и 30 мкг/мл K63-связанного полиубиквитина 2-7 (Boston Biochem) добавляли для контрселекции. Через 1 час блокирующий буфер удаляли с планшета, добавляли 100 мкл/лунку фага и инкубировали при 25°С в течение 3 час при встряхивании. После связывания планшет промывали 20 раз ФБРТ путем заполнения лунок вручную и удаления буфера между циклами промывания. Фаг элюировали с помощью 150 мкл/лунку 50 мМ HCl/500 мМ KCl в течение 30 мин при 25°С и встряхивании. Элюат нейтрализовали с помощью 150 мкл/лунку 1М Трис, рН 7,5, и затем разводили в XL1-Blue (Agilent) E.coli с добавлением хелперного фага M13K07.

Амплифицированный фаг использовали для дополнительных кругов селекции против линейного диубиквитина с применением планшетной сортировки. Сортировка в растворе была невозможной, поскольку биотинилирование линейного диубиквитина препятствует связыванию Fab. Строгость более поздних циклов сортировки увеличивали тремя способами: добавлением 30 мкг/мл растворимого моноубиквитина, K 11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина 2-7 и K63-связанного полиубиквитина 2-7 к фагу для контрселекции; путем увеличения количества и длительности циклов промывания планшета, а также путем уменьшения количества используемого фага и продолжительности связывания с фагом. Второй круг сортировки проводили точно так же, как первый круг, за исключением того, что добавленные растворимые убиквитины был расширены таким образом, чтобы содержать вышеперечисленные цепи, количество используемого фага соответствовало OD₂₆₈=1,0, продолжительность связывания с фагом была уменьшена до 2 час, и количество циклов промывания планшета было увеличено до 30. Третий круг сортировки проводили точно так же, как второй круг, за исключением того, что продолжительность связывания с фагом была уменьшена до 1,5 час, и количество циклов промывания планшета было увеличено до 40, с четырьмя дополнительными циклами промывания, по 15 мин каждый, при 25°С и встряхивании, с пятью быстрыми циклами промывания между каждым из 15-минутных циклов. Четвертый круг сортировки проводили точно так же, как третий круг, за исключением того, что количество используемого фага было уменьшено до OD₂₆₈=0,5, продолжительность связывания фага была уменьшена до 1 час, и промывание включало 40 быстрых циклов промывания, с последующими четырьмя циклами промывания по 15 мин при 37°С и встряхивании. Обогащение вычисляли для кругов 2-4, путем сравнения количества фага, извлеченного с линейным диубиквитином, с непокрытой лункой. Обогащение наблюдалось в кругах 2-4 для всех трех библиотек (см. Табл. 3).

ТАБЛИЦА 3 Библиотека Круг 2 Круг 3 Круг 4 1F4AM 143Х 500Х 5000Х

1D8AM 850X 1400X 5500X 1Е3АМ 45X 167X 60X

После четырех кругов сортировки, 96 индивидуальных клонов были выбраны из третьего круга сортировки 1F4, второго круга сортировки 1D8, третьего круга сортировки 1D8, четвертого круга сортировки 1D8 и третьего круга сортировки 1Е3 и выращивались в 96-луночном формате в 1 мл бульона 2YT, содержащего 50 мкг/мл карбенициллина и 1×10¹⁰ фага/мл хелперного фага М13К07. Супернатанты указанных культур использовали для высокопроизводительного анализа пятна фага методом ТИФА на предмет связывания с линейным диубиквитином (Boston Biochem), моноубиквитином (Boston Biochem), K11-связанным диубиквитином (Genentech), K48-связанным диубиквитином (Boston Biochem), K63-связанным диубиквитином (Boston Biochem), анти-gD антителом (Genentech) или не покрытой лункой (как описано в Примере 1В). Из третьего круга сортировки 1F4 все клоны очень слабо связывались с линейным диубиквитином, демонстрируя OD450 менее 0,4, и, таким образом, далее не изучались. Из второго круга сортировки 1D8, 93 клона были специфичными в отношении линейного диубиквитина, но секвенирование выявило, что последовательность всех этих клонов была последовательностью материнского 1D8 дикого типа. Из третьего круга сортировки 1D8, 48 клонов были специфичными в отношении линейного диубиквитина, но секвенирование выявило, что последовательность всех из них, кроме 2-х, была последовательностью материнского 1D8 дикого типа. Два не материнских клона 1D8.3C2 (SEQ ID NO:33 и 36) и 1D8.3F8 (SEQ ID NO:34 и 37) (см. Фиг.5А и 5В) были протестированы для определения IC₅₀ для фага методом ТИФА как в примере ID, и продемонстрировано, что значения IC50 находятся в диапазоне низких мкМ для линейного диубиквитина, только ненамного лучше, чем 1D8 (см. Фиг.6). Из четвертого круга сортировки 1D8, 94 клона продемонстрировали прочное связывание как с линейным диубиквитином, так и с K63-связанным диубиквитином (OD₄₅₀ выше 1,0 для линейного, OD₄₅₀ выше 0,5 для K63) и, таким образом, их далее не исследовали. Только один клон, 1D8.4F5 (SEQ ID NO:35 и 38) (см. Фиг.5А и 5В), продемонстрировал прочное связывание с линейным диубиквитином и слабое связывание с K63-связанным диубиквитином (OD₄₅₀ ~1,3, OD₄₅₀ ~0,1 для K63). Значение IC₅₀ 1D8.4F5 для фага также было измерено методом ТИФА, как в Примере ID, и определено как ~2 мМ, что не намного лучше материнского клона 1D8 (см. Фиг.6). Из третьего круга сортировки 1L3, 33 клона были специфичными в отношении линейного диубиквитина, однако, все они продемонстрировали очень слабое связывание (OD₄₅₀ менее 0,5) и, таким образом, далее не изучались, Дополнительные 27 клонов продемонстрировали более прочное связывание с линейным диубиквитином (OD₄₅₀ более 0,5, но менее 1,0), однако, они также продемонстрировали увеличение связывания с K63-связанным диубиквитином (OD₄₅₀ более 0,1) и, таким образом, далее не изучались.

ПРИМЕР 3 - Второе созревание аффинности 1Е3

А) Генерация стоп-шаблона

Стоп-кодон ТАА вставляли по отдельности в любой из CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 и CDR Н3 (что давало стоп-шаблоны L1, L2, L3, H1, H2 и Н3, соответственно) для синтеза библиотеки с применением мутагенеза по Кункелю. Стоп-кодоны вынуждали разнообразие в пределах конкретной петли CDR, требуя остановки восстановления с целью достижения экспрессии полноразмерного Fab и показа на фаге. Мутагенный олигонуклеотиды стоп-кодона, перечисленные ниже, сочетали с 1 мкг ДНК соответствующей одновалентной фагемиды по Кункелю 1Е3. Полученные стоп-шаблоны одновалентной фагемиды Fab использовали для генерации библиотеки созревания аффинности.

Мутагенный олигонуклеотид, который использовали для вставки стоп-кодона ТАА в положении 31 (нумерация Kabat) в пределах CDR L1 легкой цепи 1Е3, представлял собой E3.Llstop (GCCAGTCAGGATGTG TCCTAAGCTGTAGCCTGGTATCAAC) (SEQ ID NO:134). Мутагенный олигонуклеотид, который использовали для вставки стоп-кодона ТАА в положении 53 (нумерация Kabat) в пределах CDR L2 легкой цепи 1Е3, представлял собой E3.L2stop (CTGATTTACTCGGCATCCTAACTCTACTCTGGAGTCCCTTC) (SEQ ID NO:135). Мутагенный олигонуклеотид, который использовали для вставки стоп-кодона ТАА в положении 93 (нумерация Kabat) в пределах CDR L3 легкой цепи 1Е3, представлял собой Е3.L3stop (CTTATTACTGTCAGCAATCTTATTAAACTCCTCCCACGTTCGGACAG) (SEQ ID NO:136). Мутагенный олигонуклеотид, который использовали для вставки стоп-кодона ТАА в положении 32 (нумерация Kabat) в пределах CDR H1 легкой цепи 1Е3, представлял собой Е3.H1stop (GGCTTCACCTTC AGTAATTAATATATTAGCTGGGTGCGTC) (SEQ ID NO:137). Мутагенный олигонуклеотид, который использовали для вставки стоп-кодона ТАА в положении 54 (нумерация Kabat) в пределах CDR H2 легкой цепи 1Е3, представлял собой E3.H2stop (GТТGСТТСТAТТACТCCTTAАGCGGТТСТАGТGАСТАТG) (SEQ ID NO:138). Мутагенный олигонуклеотид, который использовали для вставки стоп-кодона ТАА в положении 99 (нумерация Kabat) в пределах CDR Н3 легкой цепи 1Е3, представлял собой E3.H3stop (GCTCGTACCTGGTTGCTCTAATGGGTTATGGACTACTGG) (SEQ ID NO:139).

Б) Генерация библиотеки NNK одного положения

Поскольку первая попытка созревания аффинности 1F4 и 1D8 приводила только к небольшому улучшению аффинности, со значениями IC₅₀ все еще в диапазоне низких мкМ, усилия были сфокусированы на клоне 1Е3, который демонстрировал начальное значение IC₅₀ 80 нМ. Первая попытка созревания аффинности для 1Е3 дала множество клонов, которые продемонстрировали прочное связывание с линейным и с K63-связанным диубиквитином. Таким образом, был применен другой подход для минимизации связывания с K63-связанным диубиквитином, путем ограничения количества мутаций, введенных в одинарные клоны. Рандомизация NNK единственного положения применялась для введения одинарной замены аминокислоты в один CDR за один раз. Были сгенерированы 6 библиотек одинарных CDR, обозначенные L1, L2, L3, H1, H2 и Н3, в которых для одного положения в какой-либо одном клоне позволяли сохранение остатка дикого типа или замену на любую из других 19 аминокислот.

Библиотека L1 содержала положения 28-34 (нумерация Kabat) легкой цепи, индивидуально жестко рандомизированные с применением кодона NNK, чтобы позволить все 20 аминокислот. Мутагенные олигонуклеотиды L1

смешивали в соотношении 1:1:1:1:1:1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L1 1E3 (описанного в Примере 3А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека L2 содержала положения 50-56 (нумерация Kabat) легкой цепи, индивидуально жестко рандомизированные с применением кодона NNK, чтобы позволить все 20 аминокислот. Мутагенные олигонуклеотиды L2

смешивали в соотношении 1:1:1:1:1:1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L2 1Е3 (описанного в Примере 3А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека L3 содержала положения 91-96 (нумерация Kabat) легкой цепи, индивидуально жестко рандомизированные с применением кодона NNK, чтобы позволить все 20 аминокислот. Мутагенные олигонуклеотиды L3

смешивали в соотношении 1:1:1:1:1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю L3 1Е3 (описанного в Примере 3А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека H1 содержала положения 30-35 (нумерация Kabat) тяжелой цепи, индивидуально жестко рандомизированные с применением кодона NNK, чтобы позволить все 20 аминокислот. Мутагенные олигонуклеотиды Н1

смешивали в соотношении 1:1:1:1:1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю H1 1E3 (описанного в Примере 2А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека Н2 содержала положения 49-58 (нумерация Kabat) тяжелой цепи, индивидуально жестко рандомизированные с применением кодона NNK, чтобы позволить все 20 аминокислот. Мутагенные олигонуклеотиды Н2

смешивали в соотношении 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю Н2 1Е3 (описанного в Примере 3А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Библиотека Н3 содержала положения 95-102 (нумерация Kabat) тяжелой цепи, индивидуально жестко рандомизированные с применением кодона NNK, чтобы позволить все 20 аминокислот. Мутагенные олигонуклеотиды Н3

смешивали в соотношении 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1 и объединяли с 20 мкг ДНК стоп-шаблона по Кункелю Н3 1Е3 (описанного в Примере 3А) для генерации библиотеки посредством мутагенеза по Кункелю.

Реакции мутагенеза осуществляли путем электропорации в электрокомпетентные XLl-Blue (Agilent) E. coli и извлекали в 25 мл среды SOC в течение 45 мин при 37°С и встряхивании, Отбирали 20 мкл и серийные 10-кратные разведения наносили на планшеты с твердым агаром, содержащим карбенициллин, с последующим культивированием на протяжении ночи при 37°С, чтобы определить размер библиотеки. Остальную культуру переносили в 500 мл бульона 2YT, содержащего 50 мкг/мл карбенициллина и 1×10¹⁰ фага/мл хелперного фага M13K07. Клетки инфицировали при 37°С в течение 1 час при встряхивании. Добавляли 50 мкг/мл канамицина, и культуры культивировали еще в течение 7 час при 37°С и встряхивании. Затем температуру сдвигали до 30°С, и культуры выращивали еще в течение 22 час. Каждая из библиотек содержала по меньшей мере ~1,5 х 10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ). Фаг очищали из супернатанта культуры двумя кругами осаждения с 1/5 объема 20% полиэтиленгликоля (ПЭГ)/2,5 М NaCl.

Шестьдесят четыре индивидуальных клона от каждой из шести библиотек секвенировали, чтобы убедиться, что многообразие аминокислот в библиотеке точно отображало дизайн. Все библиотеки соответствовали дизайну.

В) Сортировка библиотеки созревания аффинности

Шесть библиотек созревания аффинности CDR NNK подвергали трем кругам сортировки параллельно против линейного диубиквитина или K63-связанного диубиквитина. Планшеты покрывали в течение ночи при 4°С 5 мкг/мл линейного диубиквитина (Boston Biochem) или K63-связанного диубиквитина (Boston Biochem) в 50 мМ натрий-карбонатном буфере, рН 9,6. Покрытые планшеты блокировали с помощью 200 мкл/лунку 2,5% молока в ФБР, содержащем 0,05% Твина 20 (ФБРТ) в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Библиотеки фага разбавляли до OD=1,0 ФБРТ, содержащим 2,5% молока. Через 1 час блокирующий буфер удаляли с планшета, добавляли 100 мкл/лунку фага и инкубировали при 25°С в течение 1,5 час при встряхивании. После связывания планшет промывали 10 раз ФБРТ путем заполнения лунок вручную и удаления буфера между циклами промывания. Фаг элюировали с помощью 100 мкл/лунку 50 мМ HCl/500 мМ KCl в течение 30 мин при 25°С и встряхивании. Элюат нейтрализовали с помощью 100 мкл/лунку 1 М Трис, рН 7,5, и затем разводили в XLl-Blue (Agilent) E. coli с добавлением хелперного фага M13K07.

Амплифицированный фаг использовали для дополнительных кругов селекции против линейного диубиквитина или K63-связанного диубиквитина с применением планшетной сортировки. Сортировка в растворе была невозможной, поскольку биотинилирование линейною диубиквитина препятствует связыванию 1E3 Fab. Строгость более поздних циклов сортировки увеличивали двумя способами: путем увеличения количества и длительности циклов промывания планшета; а также путем уменьшения количества используемого фага и продолжительности связывания с фагом. Второй круг сортировки проводили точно так же, как первый круг, за исключением того, что количество используемого фага соответствовало OD₂₆₈=0,5, и количество циклов промывания планшета было увеличено до 21, причем последний цикл проводили при инкубировании при 25°С и встряхивании в течение 5 мин. Третий круг сортировки проводили точно так же, как второй круг, за исключением того, что продолжительность связывания с фагом была уменьшена до 1 час, и количество циклов промывания планшета было увеличено до 30. Для линейного убиквитина данный круг сортировки был дополнен четырьмя циклами промывания, по 15 мин каждый, при 25°С и встряхивании, с пятью быстрыми циклами промывания между каждым из 15-минутных циклов. Далее проводили промывание длительностью 1 час при 25°С и встряхивании, и затем 5 быстрых циклов промывания. Обогащение вычисляли для кругов 2-3, путем сравнения количества фага, извлеченного с линейным диубиквитином или K63-связанным диубиквитином, с непокрытой лункой. Интенсивное обогащение наблюдалось в кругах 2-3 для всех 6 библиотек, сортированных против линейного диубиквитина, при этом только умеренное обогащение наблюдалось в случае K63-связанного диубиквитина (см. Табл. 4).

ТАБЛИЦА 4 Библиотека Линейный диубиквитин Линейный диубиквитин K63 диубиквитин K63 диубиквитин Круг 2 Круг 3 Круг 2 Круг 3 L1 10000Х 1000X 0X 3-5X L2 10000Х 1000X 0x 3-5X L3 10000Х 1000X 0x 3-5X H1 10000Х 1000X 0x 3-5X Н2 10000Х 1000X 0x 10Х Н3 10000Х 1000X 0x 10X

После трех кругов сортировки 64 отдельных клона были выбраны для каждой из 6 библиотек из второго круга сортировки против линейного диубиквитина, третьего круга сортировки против линейного диубиквитина и третьего круга сортировки против K63-связанною диубиквитина, и культивированы в 96-луночном формате в 1 мл бульона 2YT, содержащего 50 мкг/мл карбенициллина и 1×10¹⁰ фага/мл хелперного фага M13K07. Супернатанты указанных культур использовали для высокопроизводительного анализа пятна фага методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) на предмет связывания с лункой, покрытой 1 мкг/мл линейного диубиквитина (Boston Biochem), K63-связанного диубиквитина (Boston Biochem), анти-gD антитела (Genentech) или не покрытой лункой, как было описано выше (Пример 1В). Вариабельные домены указанных клонов также были секвенированы (см. Табл. 5 относительно линейного диубиквитина и Табл. 6 относительно K63-связанного диубиквитина). Секвенирование клонов Н3 выявило, что в некоторых клонах мутация T110A присутствовала за пределами участка, служащего мишенью рандомизации в дизайне библиотеки, в дополнение к предусмотренной мутации. Вероятно, это происходило в результате ошибки синтеза олигонуклеотида или ошибки мутагенеза.

Г) Анализ конкуренции фага методом одиночного пятна_ТИФА

Анализ конкуренции фага методом одиночного пятна ТИФА проводили с целью определения того, какие клоны демонстрируют наиболее выраженное улучшение аффинности в отношении линейного диубиквитина, по сравнению с материнским клоном 1Е3. Использовали супернатанты фага их пятна фага ТИФА (Пример 3С). Конкурентный ТИФА проводили, как описано для ТИФА IC₅₀ (Примера ID), за исключением того, что использовали супернатанты фага вместо очищенного фага, и применяли только одну концентрацию (25 нМ) растворимого линейного диубиквитина (Boston Biochem). Конкурентный анализ также проводили для каждого клона без добавления какого-либо растворимого линейного диубиквитина, чтобы определить сигнал связывания с фагом в отсутствие любого конкурирующего антигена. Процент ингибирования связывания в присутствии 25 нМ линейного диубиквитина вычисляли как [1-(OD₄₅₀ Для 25 нМ линейного/OD₄₅₀ в отсутствие линейного)]×100%. Материнские клоны 1Е3 продемонстрировали вариабельный процент ингибирования связывания, варьирующий от 20% до 75% ингибирования в присутствии 25 нМ линейного диубиквитина (см. Табл.5). Это была результатом вариабельности OD₄₅₀ для связывания с линейным диубиквитином в отсутствие любого конкурирующего растворимого линейного диубиквитина. Клоны, демонстрирующие ингибирование 60% или более, или такие, которые были выделены несколько раз в ходе сортировки против линейного диубиквитина, были выбраны для дальнейшего анализа IC₅₀ для фага методом ТИФА.

В Табл. 5 ниже проиллюстрированы последовательности CDR L1, L2, L3, H1, H2 и Н3 из клонов, выделенных в результате сортировки библиотек 1Е3 NNK L1, L2, L3, H1, H2 и Н3, соответственно, против линейного диубиквитин. Также показаны сигналы OD₄₅₀, полученные в результате конкуренции пятна ТИФА в отсутствие и в присутствии 25 нМ растворимого линейного диубиквитина. Процент ингибирования связывания в присутствии 25 нМ линейного диубиквитина вычисляли как [1-(OD₄₅₀ для 25 нМ линейного/OD₄₅₀ в отсутствие линейного)]×100%. В Табл. 6 проиллюстрированы последовательности CDR L1, L2, L3, H1, H2 и Н3 из клонов, выделенных в результате сортировки библиотеки 1Е3 NNK L1, L2, L3, H1, H2 и Н3, соответственно, против K63-связанного диубиквитина.

В Табл. 5 раскрыты последовательности CDR L1 как SEQ ID NO:1, 56, 199, 200, 200, 57, 201, 202, 202, 203, 204, 204-207, 207, 208, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 209, 209, 54, 54, 54, 54, 210, 55, 55, 53, 211, 212, 212, 212-214, 52, 52, 215, 215, 215, 216, 216, 217, 217, 217, 218, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1 и 1, соответственно, в порядке появления. В Табл. 5 раскрыты последовательности CDR L2 как SEQ ID NO:2, 59, 59, 58, 58, 58, 219, 60, 60, 60, 60, 60, 60, 60, 60, 60, 60, 220, 220, 220, 220, 221, 221-223, 223-226, 226, 226, 62, 227, 228, 228, 229,61,61,230-233, 233-237, 237, 238, 238, 238, 239, 239, 239, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2 и 2, соответственно, в порядке появления. В Табл. 5 раскрыты последовательности CDR L3 как SEQ ID NO:3, 6, 6, 240, 240, 240-242, 66, 66, 66, 66, 243, 68, 244, 244-247, 247, 248, 248, 248, 70, 64, 64, 64, 64, 249, 250, 250, 71, 71, 251, 72, 72, 72, 72, 72, 72, 72, 69, 65, 65, 65, 252, 252, 252, 252, 252, 67, 67, 67, 67, 67, 67, 67, 67, 253, 3, 3, 3, 3 и 254, соответственно, в порядке появления. В Табл. 5 раскрыты последовательности CDR H1 как SEQ ID NO:255, 256, 73, 79, 79, 257, 257, 75, 75, 75, 75, 77, 77, 77, 77, 77, 77, 77, 258, 258, 259, 81, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 78, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 80, 80, 80, 260, 260, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255, 255 и 255, соответственно, в порядке появления. В Табл. 5 раскрыты последовательности CDR H2 как SEQ ID NO:8, 17, 84, 261, 261, 261, 261, 261-263, 85, 83, 83, 264, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 82, 86, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8 и 8, соответственно, в порядке появления. В Табл.5 раскрыты последовательности CDR Н3 как SEQ ID NO:265-269, 269, 270-273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 275, 273, 273, 273, 273, 2/3, 2/3, 273, 2/3, 2/3, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 273, 274, 274, 274, 274, 274-278, 278, 278, 278-281, 281, 282, 282, 282, 282, 265, 265, 265, 265, 265, 265 и 265, соответственно, в порядке появления.

В Табл. 6 раскрыты последовательности CDR L1 как SLQ ID NO:1, 283, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 50, 284, 54, 285, 285-288, 55, 55, 55, 53, 289, 289, 290, 290, 290, 290, 290, 290-294, 327, 295, 295, 295, 295-297, 297, 1, 1, 1, 1, 1, 1 и 1, соответственно, в порядке появления. В Табл. 6 раскрыты последовательности CDR L2 как SEQ ID NO:2, 298, 299, 60, 60, 300, 302-305, 305-307, 307, 307-309, 309, 309, 310, 310-314, 314, 314, 314, 314, 314, 314, 314, 314, 314, 314, 315, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2 и 2, соответственно, в порядке появления. В Табл. 6 раскрыты последовательности CDR L3 как SEQ ID NO:3, 6, 6, 6, 6, 6, 316-318, 318, 319, 66, 66, 320, 321, 321, 321, 321-324, 324, 324, 325, 301, 326, 301, 326, 382, 328, 328, 329, 64, 64, 330, 330, 331, 331, 331, 331, 331, 71, 71, 71, 71, 71, 71, 332, 69, 333, 333, 67, 67, 67, 67, 67, 334, 334, 334, 335, 335, 335, 3, 3, 3 и 3, соответственно, в порядке появления. В Табл. 6 раскрыты последовательности CDR H1 как SEQ ID NO:255, 336, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337, 337-340, 340-343, 343, 343, 343, 343, 343, 344, 344, 344, 344, 344, 344, 81, 81, 81, 81, 81, 81, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 74, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76 и 255, соответственно, в порядке появления. В Табл. 6 раскрыты последовательности CDR H2 как SEQ ID NO:8, 346, 347, 345, 348, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349, 349-351, 351, 351, 351, 352, 352, 352, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 353, 354, 8, 8, 8, 8, 8 и 8, соответственно, в порядке появления. В Табл. 6 раскрыты последовательности CDR Н3 как SEQ ID NO:355-358, 358, 359, 359-362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362, 362,3 62, 362, 362, 362, 362-367, 355, 355, 355, 355, 355, 355, 355, 355, 355 и 355, соответственно, в порядке появления. "О" представляет собой охряный стоп ТАА, и "q" представляет собой охряный стоп TAG, который может быть заменен Gin (Q), например, с применением супрессорных линий клеток тРНК.

Д) Определение IC₅₀ для фага методом ТИФА

Для восьми клонов из библиотеки L1, шести из библиотеки L2, девяти из библиотеки L3, девяти из библиотеки H1, пяти из библиотеки Н2 и семи из библиотеки Н3 определяли значение IC₅₀ для фага методом ТИФА, как описано в примере ID. Использовали 8 трехкратных серийных разведении линейного диубиквитина (Boston Biochem) от 500 нМ до 0,23 нМ. В каждый эксперимент включали клоны 1Е3 ДТ для сравнения. Значение IC₅₀ для 1Е3 варьирует в различных экспериментах, однако могут быть идентифицированы клоны, которые демонстрируют более высокую аффинность к линейному диубиквитину, чем материнский клон. С целью идентификации мутантов с улучшенной аффинностью с линейным диубиквитином и минимальным связыванием с K63 диубиквитином, множество клонов, для которых определяли IC₅₀ методом ТИФА, было сужено с учетом того, улучшались ли значения IC₅₀ по сравнению с материнским 1Е3, были ли они выделены в круге сортировки против K63-связанного диубиквитина (пример 3С), а также с учетом их сигнала связывания с K63-связанным диубиквитином в пятне фага ТИФА (пример 3С). Клоны с улучшенными значениями IC₅₀ по сравнению с 1Е3, которые были выделены несколько раз в круге сортировки против линейного диубиквитина, но не были выделены в круге сортировки против K63-связанного диубиквитина и продемонстрировали отсутствие связывания с K63-связанным диубиквитином в пятне ТИФА (OD450 менее 0,1) не отбирали для дальнейшего анализа (1F11, 2А2, 2С11, 2Н5, 3Е4, 4С9, 4Е4 и 4G7) (см. Табл. 7). Клон с улучшенным значением IC₅₀, который был выделен несколько раз в круге сортировки против линейного диубиквитина, был выделен только один раз в круге сортировки против K63-связанного диубиквитина и не демонстрировал связывания с K63-связанным диубиквитином в пятне фага ТИФА, отбирали для дальнейшего анализа (3F5) (см. Табл. 7). Клоны 3А7 и 4С10, которые были выделены несколько раз в круге сортировки против линейного диубиквитина и в круге сортировки против K63-связанного диубиквитина, были выбраны в качестве средств отрицательного контроля. Указанные 11 клонов наряду с 1Е3 далее были протестированы на предмет специфичности в отношении фага методом ТИФА. В Табл. 7 ниже проиллюстрированы последовательности CDR L1, L2, L3, H1, Н2 и Н3 клонов, полученных в результате сортировки библиотек 1Е3 NNK L1, L2, L3, H1, Н2 и Н3, соответственно, против линейного диубиквитина, которые дополнительно были охарактеризованы в анализе IC₅₀ для фага методом ТИФА. Приведены значения IC₅₀ и кратность улучшения ни сравнению с IC₅₀ материнского 1E3. Связывание к K63-связанным диубиквитином определяли как значение OD₄₅₀ более 0,1 в пятне фага ТИФА. Также приведен процент ингибирования связывания в присутствии 25 нМ растворимого линейного диубиквитина в конкурентном пятне фага ТИФА. Указано, сколько раз был выделен каждый клон в кругах сортировки библиотеки против линейного диубиквитина или K63-связанного диубиквитина.

В Табл. 7 раскрыты последовательности CDR L1 как SEQ ID NO:1, 1 и 50-57, соответственно, в порядке появления. В Табл. 7 раскрыты последовательности CDR L2 как SEQ ID NO:2 и 58-63, соответственно, в порядке появления. В Табл. 7 раскрыты последовательности CDR L3 как SEQ ID NO:3, 3, 64, 65, 3 и 66-72, соответственно, в порядке появления. В Табл. 7 раскрыты H1 последовательности CDR как SEQ ID NO:255 и 73-81, соответственно, в порядке появления. В Табл. 7 раскрыты последовательности CDR H2 как SEQ ID NO:8 и 82-86, соответственно, в порядке появления. В Табл. 7 раскрыты последовательности CDR Н3 как SEQ ID NO:368-372, 368 и 373-375, соответственно, в порядке появления.

E) Анализ специфичности и в отношении фага методом ТИФА

1F11, 2А2, 2С11, 2Н5, 3Е4, 4С9, 4Е4, 4G7, 3F5, 3А7 и 4С10, наряду с материнским клоном 1Е3, был протестированы на предмет специфичности в отношении фага методом ТИФА против моноубиквитина (Boston Biochem), линейного диубиквитина (Boston Biochem), K11-связанного диубиквитина (Genentech), K48-связанного диубиквитина (Boston Biochem), K63-связанного диубиквитина (Boston Biochem), анти-gD антитела (Genentech) или непокрытой ячейки. Панель убиквитиновых белков иммобилизировали на 96-луночных иммунопланшетах Maxisorb (NUNC) (см. Фиг.7А и 7В). Планшеты покрывали в течение ночи при 4°С 1 мкг/мл линейного белка в 50 мМ натрий-карбонатном буфере, рН 9,6. Покрытые планшеты блокировали с помощью 200 мкл/лунку 2,5% молока в ФБРТ в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Шесть двукратных серийных разведений фага от OD₂₃₈=1,0 до OD₂₆₈=0,03 готовили в 2,5% молока в ФБРТ. Через 1 час блокирующий буфер удаляли с планшета и добавляли 100 мкл серийных разведений фага. Планшеты инкубировали при 25°С в течение 1 час при встряхивании. Далее планшет промывали 6 раз ФБРТ с помощью устройства для промывания планшетов. Разведение 1:5000 конъюгированного с пероксидазой хрена (ПХ) вторичного антитела против М13 (GE Healthcare) в ФБРТ использовали для обнаружения связывания фага. Добавляли 100 мкл/лунку вторичного разведения, и планшет инкубировали при 25°С в течение 1,25 час при встряхивании. Затем планшет промывали 6 раз ФБРТ с использованием устройства для промывания планшетов, и дважды ФБР вручную. Связанное вторичное антитело обнаруживали с использованием субстрата ТМБ (KPL), с последующим гашением равным объемом 1 М фосфорной кислоты. Оптическую плотность считывали на длине волны 450 нм.

Клоны 3А7 и 4С10, которые были выделены несколько раз в круге сортировки против линейного диубиквитина и в круге сортировки против K63-связанного диубиквитина, использовались в качестве средств отрицательного контроля. Оба продемонстрировали значительное связывание K63-связанного на фаге OD₂₆₈=1,0 (OD₄₅₀=0,44 и OD₄₅₀=0,5 для 3А7 и 4С10, соответственно) (см. Фиг.7А и 7В). 2А2, который был выделен дважды в круге сортировки против K63-связанного диубиквитина, продемонстрировал промежуточные уровни связывания K63-связанного (OD₄₅₀=0,2 на фаге OD₂₆₈=1,0). Все другие клоны продемонстрировали незначительное связывание K63-связанного диубиквитина (OD₄₅₀<0,16 на фаге OD268=1,0).

Ж) Клонирование двойных мутантов легкой цепи/тяжелой цепи

Клоны, которые продемонстрировали улучшенные значения IC₅₀ по сравнению с материнским 1Е3 (пример 3Е) и незначительное связывание с К63-связанным диубиквитином в анализе специфичности в отношении фага методом ТИФА (пример 3F), были отобраны для дальнейшего изучения. Они включали мутантов легкой цепи IF 11, 2С11 и 2Н5 и мутантов тяжелой цепи 3Е4, 3F5 и 4G7. Чтобы определить наличие аддитивного эффекта улучшения аффинности, конструировали двойные мутанты путем объединения различных комбинаций мутаций легкой и тяжелой цепи. Вариабельные домены легкой цепи удаляли путем расщепления фагемид с помощью EcoRV и Kpnl, и далее клонировали в различные мутантные фагемиды тяжелой цепи с использованием тех же сайтов.

З) Определение IC₅₀ двойных мутантов для фага методом ТИФА

Двойные мутанты 1F11/3E4, 1F11/3F5, 1F11/4G7, 2С11/3Е4, 2C11/3F5, 2C11/4G7, 2Н5/3Е4, 2H5/3F5 и 2H5/4G7 сравнивался с соответствующими одинарными мутантами и материнским 1Е3 в анализе IC₅₀ для фага методом ТИФА, как было описано ранее (примеры 1D и 3Е). Двойные мутанты 1F11/3F5 и 2H5/3F5 продемонстрировали аддитивное улучшение аффинности по сравнению с индивидуальными одинарными мутантами (см. Табл. 8). Влияние 2C11/3F5 было погранично аддитивным. Одинарный мутант 3F5 в данном конкретном анализе показал более низкое значение IC₅₀ (9 нМ), чем в двух других экспериментах (12 или 13 нМ), которые могли бы вынудить считать 2С11/3F5 (IC₅₀ 10 нМ) не аддитивным. Таким образом, 2C11/3F5 также был отобран для дальнейшего изучения.

ТАБЛИЦА 8

IC₅₀ (нМ) CDR мутация ДТ 29 1F11 14 L2 S52K 3Е4 44 Н1 I34M 3F5 12 Н2 S56Q 4G7 23 НЗ Y102G 1F11/3E4 12 L2/H1 S52K134M 1F11/3F5 5 L2/H2 S52K S56Q 1F11/4G7 13 L2/H3 S52K Y102G ДТ 24 2С11 20 L3 T94Q 3Е4 33 Н1 I34M 3F5 9 Н2 S56Q 4G7 16 Н3 Y102G 2С11/ЗЕ4 24 L3/H1 T94Q 134M 2C11/3F5 10 L3/H2 T94Q S56Q 2С11/4G7 31 L3/H3 T94Q Y102G ДТ 25 2Н5 17 L3 T94N 3Е4 26 Н1 I34M 3F5 13 Н2 S56Q 4G7 19 Н3 Y102G 2М5/3Е4 26 L3/H1 T94N 134M 2M5/3F5 8 L3/H2 T94N S56Q 2H5/4G7 23 L3/H3 T94N Y102G

И) Специфичность двойных мутантов в отношении фага методом ТИФА

Двойные мутанты 1F11/3F5, 2C11/3F5 и 2H5/3F5 сравнивали с соответствующими одинарными мутантами и материнским 1Е3 в анализе специфичности в отношении фага методом ТИФА, как описано в примере 3F. Все двойные мутанты продемонстрировали незначительное связывание K63-связанного диубиквитина (OD₄₅₀<0,1 на фаге OD₂₆₈=1,0) (см. Фиг.8А и 8В).

К) Получение двойных мутантов Fab

Материнский клон (1E3), одинарные мутанты (1F11, 2C11, 2H5, 3F5) и двойные мутанты (1F11/3F5, 2C11/3F5, 2H5/3F5) клонировали как конструкты экспрессии Fab, вставляя стоп-кодон ТАА в фагемиды в конце домена СН1, как описано в примере 1Е. Полученные Fab экспрессировали в Е. coli и очищали, как описано в примере 1Е.

Л) Превращение в формат IgG

Материнский клон (1Е3), одинарные мутанты (1F11, 2C11, 2H5, 3F5) и двойные мутанты (1F11/3F5, 2C11/3F5, 2H5/3F5) также экспрессировали в клетках HEK293 как человеческие иммуноглобулины (IgG). Конструкты экспрессии генерировали путем клонирования вариабельных доменов Fab в конструкты экспрессии млекопитающих pRK, кодирующие тяжелые и легкие цепи человеческого каппа IgGI (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)). IgG очищали аффинной хроматографией на колонках протеин А-сефарозы стандартными техниками, как описано для очищения Fab в Примере 1Е.

М) Анализ двойных мутантов методом Biacore

Аффинность двойных мутантных Fab (из Примера 3J) анализировали методом резонанса поверхностного плазмона (РПП) с использованием BIACORE™ 3000 (GE Healthcare), и прямого связывания, как описано в примере 1G. Приблизительно 150 единиц резонанса (ЕР) линейного диубиквитина (Boston Biochem), K48-связанного диубиквитина (Boston Biochem), и K63-связанного диубиквитина (Boston Biochem) иммобилизировали на проточной кювете 2, проточной кювете 3 и проточной кювете 4, соответственно, чипа СМ5, с применением протокола аминного сочетания, предложенного производителем. Проточную кювету 1, активированную и блокированную этаноламином, без иммобилизированного белка, использовали для референтного вычитания. Даже при применении 10 мМ глицин, рН 1,7, поверхность чипа не могла быть полностью регенерирована до исходного состояния, и наблюдалось увеличение ЕР, что наводит на мысль об изменении поверхности чипа.

Альтернативный подход тестировали с использованием способа захвата IgG с помощью IgG из примера 3K на BIACORE™ 3000 (GE Healthcare). Приблизительно 8 ООО единит(резонанса (ЕР) антитела захвата против человеческого Fc (GE Healthcare) иммобилизировали на проточных кюветах 1 и 2 чипа СМ5 с использованием протокола аминного сочетания, предоставленного производителем. 60 мкл 1 мкг/мл IgG в 10 мМ Hepes, pH 7,2, 150 мМ NaCl и 0,1% Твина 2U (БГРЦ) вводили инъекционно со скоростью потока 30 мкл/мин над проточной кюветой 2, что приводило к захвату приблизительно 750 ЕР IgG. Проточная кювета 1 содержала только антитело захвата и служила для референтного вычитания. Двукратные серийные разведения (3,9-500 нМ) линейного диубиквитина (Boston Biochem) или K63-связанного диубиквитина (Boston Biochem) в БГРШ вводили инъекционно (всего 60 мкл со скоростью потока 30 мкл/мин) над проточными кюветами 1 и 2. Сигнал для каждой проточной кюветы регистрировали, и референтный сигнал вычитали. После периода диссоциации 4 мин поверхность чипа регенерировали одной инъекцией 15 мкл 3 М MgCl₂, при скорости потока 30 мкл/мин. В существенное мере подобно эксперименту Biacore с захватом Fab (ем. Пример 1G), данные было сложно аппроксимировать к любой модели связывания, поскольку диубиквитин не полностью диссоциировал с чипа. Кроме того, скорости ассоциации были очень высокими, и связывание не достигало фазы плато даже при самой высокой из использованных концентраций диубиквитина. Таким образом, сложно оценить KD для указанных IgG.

Н) Вестерн-блоты очищенного диубиквитина с двойными мутантами

Чтобы классифицировать аффинность и специфичность двойных мутантов, IgG, описанные в примере 3K, тестировали методом Вестерн-блоттинга на предмет связывания с линейным диубиквитином (Boston Biochem) и K63-связанным диубиквитином (Boston Biochem). 1 мкг K63-связанного диубиквитина и 5 серийных трехкратных разведении линейного диубиквитина (1000, 333, 111, 37, 12 нг) в буфере 1X LDS (Invitrogen) с восстановителем нагревали до 70°С, выдерживая при этой температуре в течение 10 мин, и анализировали на гелях 4-12% NuPAGE Бис Трис 1,0 мм в буфере МЭС (Invitrogen). Гели подвергали действию постоянного напряжения 30 В в течение 1 час путем влажного переноса в 10% метанола и буфере переноса IX NuPAGE (Invitrogen) на нитроцеллюлозу 0,2 мкм (Invitrogen). Сайты неспецифичного связывания на мембранах блокировали инкубацией в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С при встряхивании. Далее мембраны инкубировали в 1 мкг/мл 1Е3, 1F11, 2С11, 2Н5, 3F5, 1F11/3F5, 2С11/3F5 или 2H5/3F5 IgG в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Мембраны трижды промывали ФБРТ при встряхивании. IgG обнаруживали путем инкубирования мембраны в разведении 1:10000 вторичного козьего антитела, специфичного в отношении человеческого фрагмента Fc, конъюгированного с красителем 1R Dyc 800CW (Rockland Immunochemicals) в ФБР 1, содержащем 5% молока, в течение 30 мин при 25°С и встряхивании. Далее мембраны трижды промывали ФБРТ, с последующим промыванием ФБР. Вторичное антитело обнаруживали и определяли количественно с использованием системы инфракрасной визуализации LI-COR Odyssey (LI-COR Biosciences).

Одинарные мутанты 1F11 и 3F5 был значительно чувствительнее, чем материнский 1Е3, тогда как для одинарных мутантов 2С11 и 2Н5 наблюдалось только незначительное улучшение (см. Фиг.10). Двойной мутант 1F11/3F5 продемонстрировал аддитивное улучшение чувствительности по сравнению с соответствующими одинарными мутантами, тогда как 2С11/3F5 и 2H5/3F5 не были лучше, чем 3F5.

О) Клонирование тройных мутантов

Чтобы посмотреть, может ли дальнейшее улучшение аффинности быть достигнуто путем сочетания трех мутаций, были сгенерированы тройные мутанты 1F11/2C11/3F5 и 1F11/2H5/3F5. Мутагенные олигонуклеотиды с 5'-1F11 S52K (CCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCAAAGTTCCTCTACTCTGGAGTCCC) (SEQ ID NO:187) и 3'-1F11 S52K (GGGACTCCAGAGTAG AGGAACTTTGCCGAGTAAATCAGAAGCTTCGG) (SEQ ID NO:188) объединяли с конструктами легкой цепи pRK 2С11 или 2Н5 из примера 3K и использовали набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChang® Lightning (Agilent), чтобы генерировать двойные мутантные легкие цепи. Далее были получены тройные мутанты путем объединения конструктов pRK двойных мутантных легких цепей с конструктом pRK тяжелой цепи 3F5, и IgG экспрессировали в клетках НЕК293 и очищали, как описано в примере 3K.

П) Вестерн-блоты очищенного диубиквитина с тройными мутантами

Чтобы классифицировать аффинность и специфичность тройных мутантов 1F11/2C11/3F5 и 1F11/2H5/3F5, IgG, описанные в примере 3N, тестировали методом Вестерн-блоттинга на предмет связывания с линейным диубиквитином (Boston Biochem) и K63-связанным диубиквитином (Boston Biochem), как описано в примере 3М. Ни 1F11/2С11/3F5, ни 1F11/2H5/3F5 не были чувствительнее, чем двойной мутант 1F11/3F5 (см. Фиг.11).

Р) Клонирование дополнительных тройных мутантов

Один мутант Н3, 4Е4, который продемонстрировал улучшенное значение IC₅₀ по сравнению с материнским 1Е3 в примере 3Е, первоначально не рассматривался для создания двойных мутантов, поскольку он продемонстрировал незначительное связывание с K63-связанным диубиквитином в анализе специфичности методом ТИФА (OD₄₅₀=0,16 на фаге OD₂₆₈=1,0, см. пример 3F). Поскольку ни один из протестированных мутантов IgG не демонстрировал связывания с K63-связанным диубиквитином в Вестерн-блотах, клон 4Е4 был проанализирован дополнительно. 4Е4 представлял собой клон Н3, который, фактически, содержал две мутации, Y102L, непосредственно смежную с CDR Н3, и T110A в каркасе 4. Чтобы определить, оказывала ли ненамеренная мутация Т110А какое-либо влияние на аффинность, как одинарный мутант Y102L, так и двойной мутант тяжелой цепи Y 102L Т110А были получены в контексте материнской тяжелой цепи 1Е3 или мутантной тяжелой цепи 3F5. Для вставить мутации Y102L мутагенные олигонуклеотиды 5'-Y102L

(CGGTGGGTTATGGACCTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGG ССТСС) (SEQ ID NO:189)

и 3'-Y102E

(GGAGGCCGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCTTGACCCCACAGGTCCATAACC CACCG) (SEQ ID NO:190) были объединены с конструктом экспрессии pRK тяжелой цепи IgG 1Е3 или 3F5, и мутанты были синтезированы с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChang® Lightning (Agilent). Для вставки мутации Y102L Т110А мутагенные олигонуклеотиды 5'-Y102L Т110А (CGGTGGGTTATGGACCTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCGCGGTCTCCTCGGCCTCC) (SEQ ID NO:191)

и 3'-Y102L Т110А (GGAGGCCGAGGAGACCGCGACCAGGGTTCCTTGACCCCACAGGTCCATAACCCACC G) (SEQ ID NO:192) объединяли с конструктами экспрессии pRK тяжелой цепи IgG 1Е3 или 3F5, и мутанты были синтезированы с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChang® Lightning (Agilent). Полученные конструкты pRK тяжелой цепи IgG объединяли с конструктом pRK легкой цепи IgG материнского 1Е3 или мутантного 1F11, и полученные IgG экпрессировали в клетках НЕК293 и очищали, как описано в примере 3K.

Полученные мутанты (Y012L против Y102L Т110А, 3F5/Y102L против 3F5/Y102L Т110А, IF 11/Y102L против 1F11/Y102L T110A и 1F11/3F5/Y102L против 1F11/3F5/Y102L Т110А) далее сравнивали попарно рядом в Вестерн-блоте на предмет связывания с линейным или K63-связанным диубиквитином, как описано в примере 3М. В общем, наличие мутации Т110А в комбинации с Y102L не улучшило существенно чувствительности, по сравнению с Y102L (см. Фиг.12). Также, исходя из значений IC₅₀ для фага, обнаружено, что Т110А отдельно (клон 4Е1) не улучшает аффинности, по сравнению с материнским 1Е3 (см. Табл. 7). Таким образом, только мутация Y102L рассматривалась для дальнейшего анализа.

Далее тройной мутант 1F11/3F5/Y102L сравнивали с материнским 1Е3, каждым из одинарных мутантов (1F11, 3F5, Y102L), а также с двойными мутантами (1F11/3F5, 1F11/Y102L, 3F5/Y102L) попарно в Вестерн-блоте на предмет связывания с линейным или K63-евязанным диубиквитином, как описано в примере 3М. Тройной мутант был чувствительнее, чем материнский клон 1Е3, все одинарные мутанты и все двойные мутанты, с точки зрения связывания с линейным диубиквитином (см. Фиг.13).

Дополнительно, не продемонстрировано связывания с K63-связанным диубиквитином, что указывает на сохранение специфичности.

ПРИМЕР 4 - Характеристика антитела против линейного полиубиквитина созревшей аффинности

А) Вестерн-блот IgG с очищенными цепями диубиквитина

Материнский 1Е3 и 1F11/3F5/Y102L IgG были протестированы на предмет их способности обнаруживать чистые цепи диубиквитина в Вестерн-блоте. Семь двукратных серийных разведении линейного диубиквитина (Boston Biochem) от 1 мкг до 16 нг и по 1 мкг каждого из моноубиквитина (Boston Biochem), K 11-связанного диубиквитина (Genentech), K48-связанного диубиквитина (Boston Biochem), и К63-связанного диубиквитина (Boston Biochem) в 1X буфере LDS (Invitrogen) с восстановителем (Invitrogen) нагревали до 70°С, выдерживая при этой температуре в течение 10 мин, и проводили анализ на гелях 4-12% NuPAGE Бис Трис 1,0 мм в буфере МЭС (Invitrogen) в трех экземплярах. Один из гелей окрашивали красителем SimplyBlue Coomassie (Invitrogen), чтобы обнаружить все белки. Для сравнения, чтобы получить идею аффинности, второй Вестерн-блот был получен с анти-KбЗ антителом, Apu3.A8, которое обладает известным значением KD 8,7 нМ для K63-связанного диубиквитина (см. Newton, K. et al. (2008) Cell 134:668-678). Для данного Вестерн-блота, семь серийных двукратных разведений K63-связанного диубиквитина (Boston Biochem) от 1 мкг до 16 нг и 1 мкг каждого из моноубиквитина (Boston Biochem), линейного диубиквитина (Boston Biochem), K11-связанного диубиквитина (Genentech) и K48-связанного диубиквитина (Boston Biochem) были проанализированы на геле, как изложено выше. Три геля переносили индивидуально для пропускания постоянного тока 30 В в течение 1 час путем влажного переноса в 10% метанола и 1X буфере переноса NuPAGE (Invitrogen) на нитроцеллюлозу толщиной 0,2 мкм (Invitrogen). Сайты неспецифического связывания на мембранах блокировали путем инкубации в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Далее мембраны инкубировали в 1 мкг/мл 1Е3, 1F11/3F5/Y102L или Apu3.A8 в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Мембраны промывали трижды в ФБРТ при встряхивании. IgG обнаруживали путем инкубирования мембран в разведении 1:10000 козьего антитела против F(ab')₂, специфичного в отношении человеческого фрагмента Fcγ, конъюгированного с ПХ (Jackson Immunoresearch) в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С при встряхивании. Далее мембраны трижды промывали ФБРТ и 1 раз ФБР. Вторичное антитело обнаруживали с использованием хемилюминесцентного субстрата Super Signal West Pico (Thermo Scientific), с последующим приведением блотов в контакт с пленкой.

Предел обнаружения 1Е3 составил ~250 нг линейного диубиквитина (см. Фиг.14). И наоборот, 1F11/3F5/Y102L был гораздо более чувствительным, и мог обнаружить даже 31 нг линейного диубиквитина. Кроме того, 1F11/3F5/Y102L был чрезвычайно специфичным, не демонстрируя связывания с любой из изучаемых других форм убиквитина. Для сравнения, предел обнаружения Apu3.A8 с K_D 8,7 нМ, составлял ~62 нг. K_D 1F11/3F5/Y102L для линейного диубиквитина, таким образом, вероятно находится в диапазоне низких нМ значений.

Б) Вестерн-блот IgG с очищенными цепями полиубиквитииа

Линейно-специфичные антитела генерировались против антигена линейного диубиквитина, так что они, по-видимому распознают непосредственно связь, или окружающие поверхностные остатки на проксимальных и дистальных частях убиквитина, которые размещены в непосредственной близости за счет конформации диубиквитина, которая является результатом линейной связи. Поскольку диубиквитин представляет собой наименьшую единицу распознавания антигена, и линейный полиубиквитин представляет собой полимерную цепь с диубиквитином в качества повторяющейся "мономерной" единицы, антитела должны также связываться с полиубиквитиновой формой. Чтобы проверить это, 1F11/3F5/Y102L IgG был протестирован на предмет его способности обнаруживать чистые цепи полиубиквитина в Вестерн-блоте. По 1 мкг каждого из моноубиквитина (Boston Biochem), линейного полиубиквитина 2-7 (Enzo Lifesciences), K11-связанного полиубиквитина (Genentech), K48-связанного полиубиквитина 2-7 (Boston Biochem) и K63-связанного полиубиквитина 2-7 (Boston Biochem) в IX буфере LDS (Invitrogen) с восстановителем (Invitrogen) нагревали до 70°С, выдерживая при этой температуре в течение 10 мин, и проводили анализ на гелях 4-12% NuPAGE Бис Трис 1,0 мм в буфере МЭС (Invitrogen) в трех экземплярах. Один из гелей окрашивали красителем SimplyBlue Coomassie (Invitrogen), чтобы обнаружить все белки. Два других геля переносили индивидуально для пропускания постоянного тока 30 В в течение 1 час путем влажного переноса в 10% метанола и 1X буфере переноса NuPAGE (Invitrogen) на нитроцеллюлозу толщиной 0,2 мкм (Invitrogen). Сайты неспецифического связывания на мембранах блокировали путем инкубации в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Далее мембраны инкубировали с 1 мкг/мл 1F11/3F5/Y102L IgG или разведением 1:200 мышиного пан-убиквитинового антитела, P4D1 (неспецифичное в отношении связи, Santa Cruz Biotechnology) в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Мембраны промывали трижды в ФБРТ при встряхивании. 1F11/3F5/Y102L IgG обнаруживали путем инкубирования мембраны в разведении 1:10000 козьего антитела против F(ab')₂, специфичного в отношении человеческого фрагмента Fey, конъюгированного с ПХ (Jackson Immunoresearch) в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С при встряхивании. P4D1 IgG обнаруживали путем инкубирования мембраны в разведении 1:10000 козьего антитела против F(ab')₂, специфичного в отношении мышиного фрагмента Fey, конъюгированного с ПХ (Jackson Immunoresearch) в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С при встряхивании. Далее мембраны трижды промывали ФБРТ и 1 раз ФБР. Вторичные антитела обнаруживали с использованием хемилюминесцентного субстрата Super Signal West Pico (Thermo Scientific), с последующим приведением блотов в контакт с пленкой. Хотя контрольное пан-убиквитиновое антитело, P4D1, распознает моноубиквитин, линейный полиубиквитин 2-7 (хотя и слабо), K11-связанный полиубиквитин, K48-связанный полиубиквитин 2-7 и K63-связанный полиубиквитин 2-7, 1F11/3F5/Y102L IgG распознает только линейный полиубиквитин (см. Фиг.15). Таким образом, точно так же, как в случае линейного диубиквитина, антитело 1F11/3F5/Y102L может обнаруживать цепи полиубиквитина, содержащие линейную связь, но не распознает цепей полиубиквитин с другими связями.

В) Вестерн-блот IgG с обработанными TNFα лизатами клеток

Клетки HeLa S3 выращивали в суспензионной культуре в смеси F-12 Кодифицированная Дюльбекко среда Игла (МДСИ) 50:50, с добавлением 10% сыворотки телячьего эмбриона (СТЭ), 2 мМ L-глутамина, 1% раствора глицина/гипоксантина/тимидина (ГГТ) и 1% пенициллина. Накануне эксперимент клетки разделяли в соотношении 1:2. Клетки культивировали на протяжении ночи, до плотности 0,38×106 клеток/мл (жизнеспособность 98%). Клетки делили на 3 колбы, по 1,5 л суспензии клеток в каждой. Колбу 1 предварительно обрабатывали 5,8 мМ MG132 (Cayman Chemicals) в течение 10 мин. Колбы 2 и 3 не подвергали предварительной обработке. В точке времени нуль колбы 2 и 3 также обрабатывали 5,8 мМ MG132. Кроме того, в точке времени нуль, колбы 1 и 3 обрабатывали 100 нг/мл TNFα (Shenandoah Biotechnology), и колбу 2 обрабатывали 500 нг/мл TNFα. В точках времени 0, 5 мин и 20 мин, 444 мл суспензии клеток извлекали из каждой колбы, центрифугировали при 800 об/мин в течение 5 мин при 4°С, и супернатанты извлекали аспирацией. Клетки немедленно промывали 40 мл холодного ФБР, гранулировали со скоростью 800 об/мин в течение 5 мин при 4°С, и еупернатанты извлекали аспирацией. Каждую гранулу подвергали лизису в 13 мл холодного буфера (20 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ Nad, I мМ ЭДТА, 1% Тритона Х-100, 10 мМ N-этилмалеинимида (НЭМ), 25 мМ MG132, 50 мМ NaF, таблетки полного коктейля ингибитора протеазы (Roche), и таблетки коктейля ингибитора фосфатазы PhosSTOP (Roche)) в течение 10 мин при 4°С и покачивании. Осколки гранулировали вращением при 10000×g в течение 5 мин при 4°С. Лизаты предварительно очищали с помощью 133 мкл Dynabeads Белка A (Invitrogen) в течение 1 час при 4 С и покачивании. Осколки гранулировали вращением при 2000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант удаляли и хранили при -80°С.

Существует предположение о том, что линейные цепи полиубиквитина играют сигнальную роль в пути NFΚB. Таким образом, вышеупомянутые лизаты зондировали с помощью 1F11/3F5/Y102L в Вестерн-блоте. По 13 мкл каждого лизата в IX буфере образца LDS (Invitrogen) с восстановителем (Invitrogen) нагревали до 70°С, выдерживая при этой температуре в течение 10 мин, и проводили анализ на гелях 4-12% NuPAGE Бис Трис 1,0 мм в буфере МЭС (Invitrogen) в двух экземплярах. В качестве контроля специфичности на геле анализировали 250 нг очищенных цепей линейного (Enzo Lifesciences) и K63-связанного полиубиквитина (Boston Biochem). Гели переносили индивидуально для пропускания постоянного тока 30 В в течение 1 час путем влажного переноса в 10% метанола и 1X буфере переноса NuPAGE (Invitrogen) на нитроцеллюлозу толщиной 0,45 мкм (Invitrogen). Сайты неспецифического связывания на мембранах блокировали путем инкубации в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Далее мембраны инкубировали с 1 мкг/мл 1F11/3F5/Y102L или Apu3.A8 анти-K63 в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Мембраны промывали трижды в ФБРТ при встряхивании. IgG обнаруживали путем инкубирования мембраны в разведении 1:10000 козьего антитела против F(ab')₂, специфичного в отношении человеческого фрагмента Fey, конъюгированного с ПХ (Jackson Immunoresearch) в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Вторичное антитело обнаруживали с использованием хемилюминесцентного субстрата Super Signal West Pico (Thermo Scientific), с последующим приведением блотов в контакт с пленкой. Дополнительный Вестерн-блот получали для оценки активации пути NFΚB, путем зондирования на предмет уровней 1 кВа. При передаче сигнала TNFα это приводит к убиквитинированию и разложению 1кВа, ингибитора NFΚB. По 5 мкл вышеупомянутых лизатов в 1X буфере образца LDS (Invitrogen) с восстановителем (Invitrogen) нагревали до 70°С, выдерживая при этой температуре в течение 10 мин, и проводили анализ на гелях 4-12% NuPAGE Бис Трис 1,0 мм в буфере МЭС (Invitrogen) в двух экземплярах. Гель переносили для пропускания постоянного тока 30 В в течение 2 час путем влажного переноса в 20% метанола и IX буфере переноса NuPAGE (Invitrogen) на ПВДФ Invitrolon (Invitrogen). Мембрану блокировали путем инкубации в ФБР 1, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С, и далее проводили зондирование с разведениями 1:1000 анти-IκВα (Cell Signaling) и анти-β-тубулинового антитела (Cell Signaling) в качестве контроля нагрузки при 4°С на протяжении ночи при встряхивании. На следующий день пятна трижды промывали ФБРТ при встряхивании. IgG обнаруживали, инкубируя мембраны в разведениях 1:10000 козьего антитела против F(ab')2 кролика, специфичного в отношении Fcγ, конъюгированного с ПХ (Jackson Immunoresearch) в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Затем мембраны трижды промывали ФБРТ и 1 раз ФБР. Вторичное антитело обнаруживали с использованием хемилюминесцентного субстрата Super Signal West Pico (Thermo Scientific), с последующим приведением блотов в контакт с пленкой.

В клетках, которые стимулировали 100 нг/мл TNFα без предварительной обработки MG132, количество цепей линейного полиубиквитина возрастает от нулевой точки времени до 5 мин до 20 мин (см. Фиг.16А). И наоборот, цепи K63-связанного полиубиквитина, которых было намного больше во всех трех точках времени, продемонстрировали возрастание от нулевой точки времени до 5 мин, а затем снижение до начальных уровней в точке 20 мин. В клетках, которые стимулировали 500 нг/мл TNFαα без предварительной обработки MG132, цепи линейного полиубиквитина продемонстрировали такой же характер возрастания от нулевой точки времени до 20 мин, однако количество линейных цепей в каждой точке времени было увеличено, по сравнению с клетками, обработанными 100 нг/мл TNFα. И наоборот, K63-связанные цепи продемонстрировали такой же характер и количество по сравнению с клетками, обработанными 100 нг/мл TNFα. В клетках, предварительно обработанных в течение 10 мин 5,8 мМ MG132, а затем 100 нг/мл TNFα, уровни линейных и K63-связанных цепей оставались очевидно постоянными во всех трех временных точками. Пятно для 1 кВа демонстрирует, что при всех трех условиях эксперимента путь NFκB активизируется, доказательством чего служит разложение 1 кВа при обработке TNFα во времени, однако степень активации выше в отсутствие предварительной обработки MG132 (см. Фиг.16 В). Это демонстрирует, что 1F11/3F5/Y102L может распознавать эндогенные цепи линейного полиубиквитина, и наводит на мысль о том, что такие цепи регулируются вверх в клетках HeLa S3 при стимуляции TNFα.

Г) Иммунопреципитация цепей линейного полиубиквитина

1F11/3F5/Y102L IgG тестировали, чтобы проверить его способность к иммунопреципитации цепей линейного полиубиквитина. В качестве положительного контроля также использовали анти-K63 антитело Apu3.A8 для контроля иммунопреципитацией K63-связанных цепей. В качестве отрицательного контроля использовали не родственное человеческое антитело IgG1 каппа, как контрольный изотип. Тестировали три вида условий иммунопреципитации (ЮТ). В реакционной смеси 1, которая содержала все цепи, смешивали по 2 мкг каждого из моноубиквитина (Boston Biochem), линейного полиубиквитина 2-7 (Enzo Lifesciences), K11-связанного полиубиквитина (Genentech), K48-связанного полиубиквитина 2-7 (Boston Biochem) и K63-связанного полиубиквитина 2-7 (Boston Biochem). В реакционной смеси 2, в которой отсутствовали линейные цепи, смешивали по 2 мкг каждого из моноубиквитина, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина 2-7 и K63-связанного полиубиквитина 2-7. Реакционная смесь 3 содержала только 2 мкг линейных цепей полиубиквитина 2-7. Каждую реакционную смесь разбавляли 500 мкл 4 М мочевинного буфера ИП (4М мочевины, 20 мМ Трис, рН 7,5, 135 мМ NaCl, 1% Тритона Х-100, 10% глицерина, 1 мМ ЭДТА, 1,5 мМ MgCl₂). Реакционные смеси предварительно очищали с помощью 50 мкл Dynabeads Белка A (Invitrogen) в течение 3 часов при 25°С с вращением. Затем гранулы захватывали на магнитной стойке, и супернатанты переносили в новые пробирки. По 20 мкг анти-линейного 1F11/3F5/Y102L, анти-K63 Apu3.A8 или IgG контрольного изотипа добавляли в каждую реакционную смесь ЮТ и инкубировали на протяжении ночи при 25°С с вращением. На следующий день 100 мкл Dynabeads Белка А добавляли к каждой реакционной смеси, и IgG захватывали в течение 15 мин при 25°С с вращением. Затем гранулы промывали трижды, по 1 мл 4 М мочевинного буфера ИП каждый раз, после чего 2 раза промывали ФБР, по 1 мл каждый раз. В ходе заключительного промывания гранулы переносили в новые пробирки, чтобы избежать элюации любых белков, связанных со стенками пробирки. Гранулы ресуспендировали в 30 мкл IX буфера образца LDS (Invitrogen) с восстановителем (Invitrogen), и нагревали до 70°С, выдерживая при этой температуре в течение 10 мин, для элюации иммунопреципитированных белков. Затем гранулы захватывали на магнитной стойке, супернатант делили на 2 равные части и наносили в двух экземплярах на гели 4-12% NuPAGb Бис 1 рис 1,U мм (Invilrogenj. В качестве положительного и отрицательного контроля, по 1 мкг очищенного линейного полиубиквитина 2-7 (Enzo Lifesciences) и K63-связанного полиубиквитина 2-7 (Boston Biochem) также анализировали на гелях. Гели обрабатывали в буфере МЭС (Invitrogen), и затем переносили индивидуально для пропускания постоянного тока 30 В в течение 1 час путем влажного переноса в 10% метанола и 1X буфере переноса NuPAGE (Invitrogen) на нитроцеллюлозу толщиной 0,2 мкм (Invitrogen). Сайты неспецифического связывания на мембранах блокировали путем инкубации в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Далее мембраны инкубировали в 1 мкг/мл 1F11/3F5/Y102L или анти-K63 Apu3.A8 в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Мембраны трижды промывали в ФБРТ при встряхивании. IgG обнаруживали путем инкубации мембраны в разведении 1:10000 вторичного козьего антитела против человеческого фрагмента F(ab')2, специфичного в отношении Fcγ, конъюгированного с ПХ (Jackson Immunoresearch), в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Далее мембраны трижды промывали ФБРТ и 1 раз ФБР. Вторичное антитело обнаруживали с использованием хемилюминесцентного субстрата Super Signal West Pico (Thermo Scientific), с последующим приведением блотов в контакт с пленкой. 1F11/3F5/Y102L способно иммунопреципитировать цепи линейного полиубиквитин в 4 М растворе мочевины, однако не является специфичным в этих условиях, поскольку также может осаждать K63-связанные цепи (см. Фиг.17).

Чтобы определить, могут ли различные концентрации мочевины способствовать улучшению специфичности, иммунопреципитацию проводили в различных буферных условиях. По 2 мкг линейного полиубиквитина 2-7 и K63-связанного полиубиквитина 2-7 смешивали и разбавляли 500 мкл буфера ИП (20 мМ Трис, рН 7,5, 135 мМ NaCl, 1% Тритона Х-100, 10% глицерина, 1 мМ ЭДТА, 1,5 мМ MgCl₂), содержащего 0, 2, 4 или 6 М мочевины. Дополнительную реакцию ИП проводили, используя 500 мкл ФБРТ. Реакционные смеси предварительно очищали с помощью 50 мкл Dynabeads Белка А (Invitrogen) в течение 30 мин при 25°С с вращением. Далее гранулы захватывали на магнитной стойке, и супернатанты переносили в новые пробирки. По 20 мкг антилинейного 1F11/3F5/Y102L или анти-K63 Apu3.A8 IgG добавляли в каждую реакционную смесь ИП и инкубировали в течение 1 час при 25°С с вращением. Далее 100 мкл Dynabeads Белка А добавляли к каждой реакционной смеси, и IgG захватывали в течение 15 мин при 25°С с вращением. Затем гранулы промывали трижды, но 1 мл каждого из соответствующих буферных растворов, используемых для ИГТ (буфер ИП, содержащий 0, 2, 4 или 6 М мочевины или ФБРТ), после чего 2 раза промывали ФБР, по 1 мл каждый раз. В ходе заключительного промывания гранулы переносили в новые пробирки, чтобы избежать элюации любых белков, связанных со стенками пробирки. Гранулы ресуспендировали в 20 мкл IX буфера образца LDS (Invitrogen) с восстановителем (Invitrogen), и нагревали до 70°С, выдерживая при этой температуре в течение 10 мин, для элюации иммунопреципитированных белков. Затем гранулы захватывали на магнитной стойке, супернатант делили на 2 равные части и наносили в двух экземплярах на гели 4-12% NuPAGE Бис Трис 1,0 мм (Invitrogen). В качестве положительного и отрицательного контроля, по 1 мкг очищенного линейного полиубиквитина 2-7 (Enzo Lifesciences) и K63-связанного полиубиквитина 2-7 (Boston Biochem) также анализировали на гелях. Гели обрабатывали в буфере МЭС (Invitrogen), и затем переносили индивидуально для пропускания постоянного тока 30 В в течение 1 час путем влажного переноса в 10% метанола и 1X буфере переноса NuPAGE (Invitrogen) на нитроцеллюлозу толщиной 0,2 мкм (Invitrogen). Сайты неспецифического связывания на мембранах блокировали путем инкубации в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Далее мембраны инкубировали в 1 мкг/мл 1F11/3F5/Y102L или анти-K63 Apu3.A8 в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Мембраны трижды промывали в ФБРТ при встряхивании. IgG обнаруживали путем инкубации мембраны в разведении 1:10000 вторичного козьего антитела против человеческого фрагмента F(ab')2, специфичного в отношении Fey, конъюгированного с ПХ (Jackson Immunoresearch), в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Далее мембраны трижды промывали ФБРТ и 1 раз ФБР. Вторичное антитело обнаруживали с использованием хемилюминесцентного субстрата Super Signal West Pico (Thermo Scientific), с последующим приведением блотов в контакт с пленкой. По мере увеличения концентрации мочевины в буфере ИП, ИП под действием 1F11/3F5/Y102L становится более специфичной (см. Фиг.18А). В 6М растворе мочевины под действием 1F11/3F5/Y102L IgG осаждалось очень небольшое количество К63-связанного полиубиквитина, IgG еще сохранял способность осаждать значительное количество линейного полиубиквитина.

Чтобы определить, могут ли более высокие кинцентрации мочевины дополнительно улучшить специфичность, ИП повторяли с использованием буфера ИП, содержащего 6, 7 или 8 М мочевины. По 2 мкг линейного полиубиквитина 2-7 и K63-связанного полиубиквитина 2-7 смешивали и разбавляли 500 мкл буфера ИП (20 мМ Трис, рН 7,5, 135 мМ NaCl, 1% Тритона Х-100, 10% глицерина, 1 мМ ЭДТА, 1,5 мМ MgCl₂), содержащего 6, 7 или 8 М мочевины. Реакционные смеси предварительно очищали с помощью 50 мкл Dynabeads Белка A (Invitrogen) в течение 15 мин при 25°С с вращением. Далее гранулы захватывали на магнитной стойке, и супернатанты переносили в новые пробирки. По 20 мкг анти-линейного 1F11/3F5/Y102L, анти-K63 Apu3.A8 или IgG контрольного изотипа добавляли в каждую реакционную смесь ИП и инкубировали в течение 1 час при 25°С с вращением. Далее 100 мкл Dynabeads Белка А добавляли к каждой реакционной смеси, и IgG захватывали в течение 15 мин при 25°С с вращением. Затем гранулы промывали трижды, по 1 мл каждого из соответствующих буферных растворов, используемых для ИП (буфер ИП, содержащий 6, 7 или 8 М мочевины), после чего 2 раза промывали ФБР, по 1 мл каждый раз. В ходе заключительного промывания гранулы переносили в новые пробирки, чтобы избежать элюации любых белков, связанных со стенками пробирки. Гранулы ресуспендировали в 30 мкл 1X буфера образца LDS (Invitrogen) с восстановителем (Invitrogen), и нагревали до 70°С, выдерживая при этой температуре в течение 10 мин, для элюации иммунопреципитированных белков. Затем гранулы захватывали на магнитной стойке, супернатант делили на 2 равные части и наносили в двух экземплярах на гели 4-12% NuPAGE Бис Трис 1,0 мм (Invitrogen). В качестве положительного и отрицательного контроля, по 1 мкг очищенного линейного полиубиквитина 2-7 (Enzo Lifesciences) и K63-связанного полиубиквитина 2-7 (Boston Biochem) также анализировали на гелях. Гели обрабатывали в буфере МЭС (Invitrogen), Вестерн-блоты получали, как описано в предыдущем абзаце. Одно пятно зондировали с помощью 1F11/3F5/Y102L для обнаружения линейных цепей, и второе зондировали с помощью анти-K63 Apu3.A8, чтобы обнаружить K63-связанные цепи. В 6 М растворе мочевины присутствует небольшое количество K63-связанных цепей, осажденных 1F11/3F5/Y102L, как наблюдалось в предыдущих реакциях ИП (см. Фиг.18 В). В 7М растворе мочевины 1F11/3F5/Y102L ведет себя точно так же, как контрольный изотип и не осаждает К63-связанных цепей, однако все еще сохраняет способность к ИП значительных количеств линейного полиубиквитина по сравнении с присутствовавшими в исходном материале. Однако, в 8 M растворе мочевины количество линейных цепей, осажденных 1F11/3F5/Y102L, резко уменьшалось. Таким образом, 7М раствор мочевины представляет наиболее специфичные условия, при которых устанавливается баланс между осаждением значительного количества линейных цепей без осаждения K63-связанных цепей.

В предыдущих реакциях ИП тяжелую цепь IgG, используемых для осаждения, элюировали из гранул и обнаруживали с помощью вторичного антитела, используемого в Вестерн-блотах. Настоящая полоса часто может затемнять полосы осажденного материала. Чтобы сделать пятна прозрачнее и быть абсолютно уверенным, что К63-связанные цепи не осаждались, IgG перекрестно сшивали с гранулами перед ИП. По 20 мкг 1F11/3F5/Y102L или контрольного изотипа IgG инкубировали с 200 мкл Dynabeads Белка А в ФБРТ в течение 30 мин при 25°С с вращением. Гранулы захватывали на магнитной стойке и дважды промывали 800 мкл буфера конъюгации (20 мМ натрия фосфата, рН 7,5, 150 мМ NaCl). Гранулы со связанным IgG ресуспендировали в 1 мл 5 мМ бис(сульфосукцинимидил)суберата (BS3) в буфере конъюгации и инкубировали при 25°С с вращением в течение 30 мин для перекрестного сшивания. В хоте перекрестного сшивания IgG с гранулами, готовили реакционные смеси ИП. По 4 мкг линейного полиубиквитин 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина 2-7 и K63-связанного полиубиквитина 2-7 смешивали и разбавляли 500 мкл буфера ИП (20 мМ Трис, рН 7,5, 135 мМ NaCl, 1% Тритона Х-100, 10% глицерина, 1 мМ ЭДТА, 1,5 мМ MgCl₂), содержащего 0, 4 или 7 М мочевины. Смеси предварительно очищали с помощью 50 мкл Dynabeads Белка А в течение 45 мин при 25°С с вращением. Через 30 мин реакцию перекрестного сшивания гасили добавлением 48 мкл 1 М Трис, рН 7,5, и инкубировали при 25°С с вращением в течение 15 мин. Перекрестно сшитые гранулы промывали трижды по 800 мкл буфера ИП, содержащего соответствующее количество мочевины, который использовался для ИП (т.е. 0, 4 или 7 М мочевины). После промывания гранулы с поперечно сшитым IgG ресуспендировали в предварительно очищенных реакционных смесях ИП и инкубировали при 25°С с вращением в течение 1 час. Гранулы с поперечно сшитым IgG далее промывали трижды по 1 мл буфера ИП, содержащего соответствующе количество мочевины, после чего промывали 2 раза по 1 мл ФБР. В ходе заключительного промывания гранулы переносили в новые пробирки, чтобы избежать элюации любых белков, связанных со стенками пробирки. Гранулы ресуспендировали в 50 мкл 1X буфера образца LDS (Invitrogen) с восстановителем (Invitrogen), и нагревали до 70°С, выдерживая при этой температуре в течение 10 мин, для элюации иммунопреципитированных белков. Затем гранулы захватывали на магнитной стойке, супернатант делили и наносили в четырех экземплярах на гели 4-12% NuPAGE Бис Трис 1,0 мм (Invitrogen). В качестве положительного и отрицательного контроля, по 1 мкг очищенного линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина 2-7 также анализировали на гелях. Гели обрабатывали в буфере МЭС (Invitrogen), и Вестерн-блоты получали, как описано выше в данном примере. Одно пятно зондировали с помощью 1F11/3F5/Y102L, чтобы обнаружить линейные цепи, одно пятно зондировали с помощью анти-K11 2А3/2Е6, чтобы обнаружить K11-связанные цепи, одно пятно зондировали с помощью анти-K48 Apu2.07, чтобы обнаружить K48-связанные цепи, и одно пятно зондировали с помощью анти-K63 Apu3.А8, чтобы обнаружить K63-связанные цепи. При сравнении количества материала в ИП с количеством материала, присутствующего в начальных смесях, намного меньшее общее количество линейного полиубиквитина было осаждено в каждой реакции ИП под действием 1F11/3F5/Y102L, по сравнению с реакциями ИП, проведенными со свободным IgG, который был впоследствии захвачен на гранулах, в предыдущих абзацах (см. Фиг. 19). Это может быть результатом того факта, что 1F11/3F5/Y102L входит в состав подгруппы VH3 IgG1 человека, которая содержит второй сайт связывания с Белком А в вариабельном домене тяжелой цепи, в дополнение к обычному сайту связывания в домене Fc. Таким образом, предварительное сочетание и поперечное сшивание IgG с гранулами Белка А перед связыванием с антигеном могло бы уменьшать емкость связывания данного антитела. В указанных условиях предварительного сочетания и поперечного связывания 4 М мочевины представляет собой наиболее специфичное условие, при котором 1F11/3F5/Y102L может осаждать линейные цепи без осаждения каких-либо K11-, K48- или K63-связанных цепей.

Чтобы определить, было ли уменьшение осаждения линейных цепей результатом дополнительного сайта связывания с Белком А в вариабельном домене тяжелой цепи, проводили реакции ИП с использованием IgG, поперечно сшитых с гранулами Белка G. Белок G также содержит два сайта связывания на человеческом IgG1, но оба находятся в константных доменах (СН1 и Fc). Реакции ИП повторяли, как изложено выше, за исключением того, что Белок G Dynabeads (Invitrogen) использовали для предварительного сочетания и поперечного сшивания с IgG. Намного большее количество линейных цепей

полиубиквитина было осаждено при каждом наборе условий 1F1 1/3F5/Y102L, по сравнению с экспериментами с использованием IgG, поперечно сшитых с Белком А (см. Фиг.20). При передержке пятна анти-KбЗ в 4 М мочевине небольшое количество K63-связанных цепей осаждается под действием 1F11/3F5/Y102L. Таким образом, 7М мочевины, по-видимому, является наиболее специфичным условиям при предварительном сочетании с гранулами Белка G, предварительно связанными с 1F11/3F5/Y102L, однако, это происходит за счет осаждения меньшего количества линейного полиубиквитина, по сравнению с проведением реакций ИП со свободным IgG, который впоследствии захватывают на гранулах (по сравнению с Фиг.18В). Возможно, что предварительное сочетание и поперечное сшивание гранул Белка G с доменом СН1 также может уменьшать связывание с линейным полиубиквитином посредством стерической помехи со стороны соседнего домена VH, хотя и менее значимо, чем предварительное сочетание и поперечное сшивание гранул Белка А с доменом VH.

Реакции ИП с использованием свободного IgG с последующим захватом на гранулы Белка А повторяли с использованием смеси цепей полиубиквитина с различными связями в качестве субстрата и анализировали более детально методом Вестерн-блоттинга и масс-спектрометрией. По 2 мкг линейного полиубиквитина 2-7 (Boston Biochem), K11-связанного полиубиквитина (Genentech), K48-связанного полиубиквитина 2-7 (Boston Biochem) и K63-связанного полиубиквитина 2-7 (Boston Biochem) смешивали и разбавляли 500 мкл буфера ИП (20 мМ Трис, рН 7,5, 135 мМ NaCl, 1% Тритона X-100, 10% глицерина, 1 мМ ЭДТА, 1,5 мМ MgCl₂), содержащего 0, 4, 5, 6 или 7 М мочевины. Каждую реакцию ИП проводили в двух экземплярах, один для Встерн-блотов и другой для анализа методом масс-спектрометрии. Реакционные смеси предварительно очищали с помощью 50 мкл гранул Белка A (Invitrogen) в течение 15 мин при 25°С с вращением. Далее гранулы захватывали на магнитной стойке, и супернатанты переносили в новые пробирки. По 20 мкг анти-линейного 1F11/3F5/Y102L или IgG контрольного изотипа добавляли в каждую реакционную смесь ИП и инкубировали в течение 1 час при 25°С с вращением. Далее 100 мкл Dynabeads Белка А добавляли к каждой реакционной смеси, и IgG захватывали в течение 15 мин при 25°С с вращением. Затем гранулы промывали трижды, по 1 мл каждого из соответствующих буферных растворов, используемых для ИП (буфер ИП, содержащий 0, 4, 5, 6 или 7 М мочевины), после чего промывали 2 раза по 1 мл ФБР. В ходе заключительного промывания гранулы переносили в новые пробирки, чтобы избежать элюации любых белков, связанных со стенками пробирки. Гранулы ресуспендировали в 50 мкл IX буфера образца LDS (Invitrogen) с восстановителем (Invitrogen), и нагревали до 70°С, выдерживая при этой температуре в течение 10 мин, для элюации иммунопреципитированных белков. Затем гранулы захватывали на магнитной стойке, супернатант делили и наносили в четырех экземплярах на гели 4-12% NuPAGE Бис Трис 1,0 мм (Invitrogen) для Вестерн-блотов. В качестве положительного и отрицательного контроля, по 500 нг очищенного линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина 2-7 и K63-связанного полиубиквитина 2-7 также анализировали на гелях. Другой набор реакционных смесей ИП анализировали на гелях 4-12% NuPAGE Бис Трис 1,0 мм (Invitrogen) для анализа методом масс-спектрометрии AQUA. Гели анализировали в буфере МЭС (Invitrogen), и Вестерн-блоты получали, как изложено выше в данном примере. Пятна зондировали с помощью 1F11/3F5/Y102L для анти-линейного полиубиквитина, 2А3/2Е6 для анти-K11-связанного полиубиквитина, Apu2.07 для анти-K48-связанного полиубиквитина, и антителами Apu3.A8 против K63-связанного полиубиквитина (см. Фиг.21А). Другие гели для масс-спектрометрии AQUA окрашивали красителем SimplyBlue Coomasie Safe (Invitrogen) (см. Фиг.21В). В отсутствие мочевины, F11/3F5/Y102L способен осаждать ИП цепи со всеми видами связей (см. Фиг.21А). По мере увеличения концентрации мочевины в буфере ИП, 1F11/3F5/Y102L ИП становится более специфичным. При концентрации мочевины 7М K11-связанный, K48-связанный или К63-связанный полиубиквитин не осаждается под действием 1F11/3F5/Y102L IgG, но антитело все еще может осаждать значительное количество линейного полиубиквитина относительно исходной реакционной смеси.

Участки В и С окрашенного Coomassie геля вырезали, обрабатывали расщеплением с помощью трипсина в геле и анализировали методом масс-спектрометрии AQUA (см. Фиг.21В). Краситель удаляли из фрагментов геля с использованием 50 мМ аммония бикарбоната/50% метанола, а затем сушили с помощью ацетонитрила (АЦН). Чтобы позволить эффективный захват трипсина, фрагменты геля инкубировали на льду в течение 2 час с использованием 20 нг/мкл трипсина категории «для секвенирования» (Promega, Мэдисон, Висконсин), разбавленного в 50 мМ аммония бикарбоната/5% АЦН. Расщепление проводили на протяжении ночи при 37°С и останавливали добавлением 50% АЦН/5% муравьиной кислоты (МК). Меченные изотопом пептиды внутреннего стандарта (1 пмоль) добавляли к каждому образцу перед проведением двух кругов экстракции (1-й 51)% АЦН/5% MK, 2-й 100% АЦН). Экстрагированные нептиды сушили до сухого состояния и ресуспендировали в 10% АЦН/5% MK/0,01% H₂O₂ по меньшей мере на 30 мин до проведения анализа методом масс-спектрометрии. Образцы были загружены непосредственно на колонку Thermo AQUASIL С 18 (2,1×150 мм) и разделяли с использованием капиллярной ЖХ Agilent 1200 со скоростью потока 200 мкл/мин с градиентом от 5% до 90% буфера В (98% АЦН/0,1% MK) в течение 26 мин. Обнаружение методом масс-спектрометрии выполнялось на ABI 4000 QTRAP с применением метода сегментированного контроля нескольких реакций (КНР) для обнаружения как меченных, так и немеченных пептидов, содержащих последовательность убиквитина. Количественное определение проводили путем сравнения площади пика для меченных и немеченных версий каждого пептида, с использованием программного обеспечения ABI Multiquant 1.1. Путем измерение количества подписи пептидов -GG, соответствующих модификации 7 остатков лизина в убиквитине и амино-конца, было подтверждено, что 7 М мочевины представляют собой наиболее специфичные условия для иммунопреципитации линейных цепей полиубиквитина (см. Фиг.21C и 21D). В присутствии 7М мочевины антитело способно извлечь 67% линейных цепей, присутствующих в исходном материале из участка В, который содержит более длинные цепи (от тетраубиквитина до гептаубиквитина), однако, оно менее эффективно с точки зрения извлечения коротких цепей, найденных в участке С (диубиквитин и триубиквитин), когда извлекается только 2% линейных цепей (см. Фиг.21Е). Вероятно, это происходит за счет авидности двухвалентного антитела и множественных связей, найденных в более длинных цепях.

Д) Чрезмерная экспрессия КСЛЦУ

Комплекс сборки линейного убиквитина (КСЛЦУ) представляет собой лигазу Е3, которая продемонстрировала сборку цепей линейного полиубиквитина (Kirisako, Т. et al. (2006) ЕМВО J. 25:4877-4887). Открытые рамки считывания (ОРС) двух из членов данного комплекса, Boil-1L и Hoip, были синтезированы (Blue Heron Biotechnology) и клонированы в вектор экспрессии млекопитающих pBI-CMV1 (Clonetech), содержащий двунаправленный промотор ЦМВ. Hoil-IL клонировали в сайт множественного клонирования (MCS) 1, с использованием сайтов рестрикционных ферментов MluI и EcoRV, и Hoip клонировали в MCS2 с использованием сайтов рестрикционных ферментов EcoRI и PstI. Конструкт верифицировали путем секвенирования открытой рамки считывания (OPC). Полученным кинирукшм, pBI-CMV1-Hoil1L-Hoip, или пустым вектором трансфицировали клетки 293Т. Клетки 293Т делили 1:20 на 20 планшетах размером 10 см за два дня до трансфекции и культивировали при 37°С в 5% СO₂. В день трансфекции 150 мкл Липофектамина 2000 разбавляли 2,5 мл свободной от сыворотки среды Opti-MEM для трансфекции каждой плазмиды. Также 50 мкг пустого вектора рВ1-CMV1 или pBI-CMV1-Hoil1L-Hoip разбавляли 2,5 мл свободной от сыворотки среды Opti-MEM. Полученные разведения инкубировали при 25°С в течение 5 мин. Разбавленный Липофектамин и разведенную ДНК объединяли с осторожным перемешиванием переворачиванием и инкубировали при 25°С в течение 30 мин. Затем 500 мкл смеси ДНК/Липофектамин добавляли на каждый планшет размером 10 см (10 планшетов на плазмиду). Через 48 час после трансфекции среды собирали, и клетки соскабливали с планшетов. Клетки осаждали центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Супернатанты удаляли, и клетки промывали 40 мл холодного ФБР. Клетки осаждали центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Супернатанты удаляли, и клетки ресуспендировали в 4 мл буфера для лизиса, содержащего 8 М мочевины, 50 мМ Трис, рН 7,5, 25 мМ NaCl, 10 мкл/мл протеаз HALT и ингибиторов фосфатазы (Thermo Scientific), 5 мМ ЭДТА и 2 мМ НЭМ. Лизат коротко обрабатывали ультразвуком для снижения вязкости, а затем замораживали при -80°С. Чтобы определить наличие чрезмерной экспрессии Hoil-1L и Hoip, и приводит ли она к увеличению сборки цепей линейного полиубиквитина, лизаты анализировали методом Вестерн-блота. По 1 мкл каждого лизата смешивали с буфером образца LDS, содержащим восстановитель, а затем загружали на гели 4-12% NuPAGE Бис Трис 1,0 мм в буфере МЭС (Invitrogen) в четырех экземплярах. Гели переносили индивидуально для пропускания постоянного тока 30 В в течение 2 час в 1X буфере переноса NuPAGE, содержащем 10% метанола, на нитроцеллюлозу толщиной 0,45 мкм (Invitrogen). Мембраны блокировали путем инкубации в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании, после чего инкубировали с первичным антителом. Первый блот зондировали с помощью 1 мкг/мл IgG против линейного полиубиквитина 1F11/3F5/Y102L в ФБРТ, содержащем 5% молока. Второй блот зондировали с помощью разведения 1:500 антитела против Hoil-1L/KBCK (Abeam ab38540) в ФБРТ, содержащем 5% молока. Третий блот зондировали с помощью 1 мкг/мл антитела против Hoip/RNF3 I (Abeam ab85294) в ФБРТ, содержащем 5% молока. Четвертый блот зондировали с помощью разведения 1:1000 антитела против β-тубулина (Cell Signaling 9F3 #2128) в ФБРТ, содержащем 5% молока. Блоты 1, 2 и 3 инкубировали с соответствующими первичными антителами в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Анти-(3-тубулиновый блот инкубировали на протяжении ночи при 4°С с вращением. Далее блоты трижды промывали ФБРТ 0,05, а затем инкубировали с разведениями 1:10000 вторичного антитела в ФБРТ, содержащем 5% молока, в течение 1 час при 25°С и встряхивании. Блот антитела против линейного полиубиквитина зондировали с помощью вторичного козьего антитела против человеческого F(ab)'2-ПХ (Jackson Immunoresearch), и три других блота зондировали с помощью вторичного козьего антитела против кроличьего F(ab)'2-ПХ (Jackson Immunoresearch). Далее блоты трижды промывали ФБРТ, а затем 1 раз ФБР. Вторичное антитело обнаруживали с использованием хемилюминесцентного субстрата Super Signal West Pico (Thermo Scientific), с последующим приведением блотов в контакт с пленкой. Анти-р-тубулиновый блот демонстрирует, что равные количества клеток использовались для трансфекции, и что эквивалентные количества лизата были загружены на гель (см. Фиг.22А). Блоты анти-Hoil-1L и анти-Hoip показывают, что при использовании для трансфекции pBI-CMV1-Hoil1L-Hoip, как Hoil-1L, так и Hoip чрезмерно экспрессируются относительно эндогенных уровней обоих белков. В конечном итоге, чрезмерная экспрессия Hoil-1L и Hoip приводила к резкому повышению уровней цепей линейного полиубиквитина, как и ожидалось. Их обнаружение 1F11/3F5/Y102L IgG показывает, что данное антитело может распознавать эндогенные, синтезированные ферментным способом, цепи линейного полиубиквитина.

В дополнение к зондированию полученных лизатов методом Вестерн-блота, также выполняли иммунопреципитацию линейного полиубиквитина. 500 мкл упомянутых выше лизатов разбавляли до концентрации мочевины 7 М с помощью 71 мкл 50 мМ Трис, рН 7,5, 25 мМ NaCl. Далее лизаты предварительно очищали с помощью 200 мкл Dynabeads Белка A (Invitrogen) в 7 М мочевины, 50 мМ Трис, рН 7,5, 25 мМ NaCl в течение 1 час при 25°С с вращением. Гранулы захватывали на магнитной стойке, и супернатанты переносили в новые пробирки. Далее предварительно очищенные лизаты центрифугировали для гранулирования осадка со скоростью 14 ООО об/мин в течение 5 мин. Супернатанты переносили в новые пробирки, и добавляли 40 мкг 1F11/3F5/Y102L IgG или IgG контрольного изотипа. Затем иммунопреципитаты инкубировали на протяжении ночи при 25°С с вращением. На следующий день IgG захватывали добавлением 2UU мкл Dynabeads Белка А в 7 M мочевины, 50 мМ Трис, рН 7,5, 25 мМ NaCl в течение 15 мин при 25°С с вращением. Гранулы захватывали на магнитной стойке и промывали 5 раз по 1 мл 7 М мочевины, 50 мМ Трис, рН 7,5, 25 мМ NaCl, а затем 3 раза по 1 мл ФБР. После окончательного промывания гранулы переносили в новые пробирки, чтобы избежать элюации любого белка, приставшего к стенкам пробирки. Далее гранулы ресуспендировали в 30 мкл 1X буфера образца LDS с восстановителем (Invitrogen) и элюировали при 70°С в течение 10 мин. Анализировали два геля 4-12% NuPAGE Бис Трис 1,0 мм: один для Вестерн-блота и другой для окрашивания Coomassie с анализом методом масс-спектрометрии AQUA. Для Вестерн-блота 10% каждой реакционной смеси ИП анализировали вместе с 0,1% каждого лизата. Для масс-спектрометрии 90% каждой реакционной смеси ИП анализировали вместе с 1% каждого лизата. Вестерн-блот с 1F11/3F5/Y102L получали, как описано в вышеприведенном абзаце, за исключением того, что перенос производили на 1 час. Гель для анализа методом масс-спектрометрии AQUA окрашивали помощью красителя Simply Blue Safe (Invitrogen). Вестерн-блот показывает, что 1F11/3F5/Y102L IgG может иммунопреципитировать цепи линейного полиубиквитина из лизатов клеток (см. Фиг.22В). Больше количество цепей было осаждено из лизатов чрезмерной экспрессии КСЛЦУ, чем только вектора отдельно, что согласовалось с более высокими уровнями линейных цепей, присутствующих в случае чрезмерной экспрессии КСЛЦУ.

Показанные участки высокой молекулярной массы геля вырезали (см. Фиг.22В) и анализировали методом масс-спектрометрии AQUA, как описано выше в Примере 4D. В контрольных образцах вектора не было идентифицировано линейных связей полиубиквитин в исходных образцах (см. Табл. 9). Большинство идентифицированных цепей полиубиквитина представляли собой цепи со связями K48 и K63.

ТАБЛИЦА 9 Вектор Исходный Вектор Изотип ИП Вектор Линейный ИП КСЛЦУ ОЕ Исходный КСЛЦУ ОЕ Изотип ИП КСЛЦУ ОЕ Линейный ИП Линейный 0 0 0 4808 0 598 K11 1085 0 0 700 0 12 K48 15680 2 7 12420 1 111

K63 5128 0 4 5075 0 76

В соответствии с этим, линейный полиубиквитин не осаждался в ходе ИП с использованием анти-линейного антитела или антитела контрольного изотипа. В клетках, чрезмерно экспрессирующих КСЛЦУ, уровни линейных связей полиубиквитина достигали 4808 пмоль, и их распространенность была сходной с K63-связями (5075 пмоль). Если для ИП используется анти-линейное антитело, оно значительно обогащается линейными связями, и при этом осаждает некоторое дополнительное количество соединений с K11-, K48- и K63-связями (см. Фиг.22С). Вероятно, это является результатом присутствия цепей со смешанными связями или субстратов, модифицированных множественными гомогенными цепями с различными связями, поскольку всего 7 и 4 пмоль цепей с K48- и K63-связями, соответственно, осаждались анти-линейным антителом из клеток контрольного вектора (см. Табл.9). Дополнительно, только 1 пмоль цепей с K48-связями и отсутствие К68-связей было идентифицировано в ходе ИП с антителом контрольного изотипа из чрезмерно экспрессирующих КСЛЦУ клеток; это показывает, что данные связи просто не являются клейкими. Это демонстрирует, что анти-линейное антитело может обогащаться эндогенными цепями линейного полиубиквитина (см. Фиг.22С).

Чтобы определить функциональность 1F11/3F5/Y102L с точки зрения иммунофлуоресценции, клетки HeLa, чрезмерно экспрессирующие Hoil-1L и Hoip, окрашивали с помощью антитела. Клетки HeLa (5000 клеток/100 мкл/лунку) высевали в 96-луночный планшет с прозрачным дном и черными стенками и культивировали в течение 24 час. Клетки трансфицировали плазмидами Hoil/Hoip в течение 18 часов, используя липофектамин 2000 согласно протоколам производителя. Клетками споласкивали ФБР, фиксировали ледяным метанолом при -20°С в течение 10 мин, пермеабилизировали с помощью ФБР/0,1% Тритона Х-100 при комнатной температуре в течение 5 мин, и затем блокировали ФБР/0,3% Тритона Х-100/5% альбумина телячьей сыворотки (АТС) при комнатной температуре в течение 1 час. Антитело против линейного (1 мкг/мл) убиквитина инкубировали с цепями полиубиквитина (5 мкг/мл) или без них при комнатной температуре в течение 1 час, и затем использовали для мечения клеток при комнатной температуре в течение 1 час. После 6 циклов промывания (по 10 мин каждый) ФБР/0,05% Тритона Х-100, клетки окрашивали ослиным анти-человеческим антителом, конъюгированным с DyLight488 (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories), при комнатной температуре в течение 1 час. Далее клетки промывали 6 раз (по 10 мин каждый) ФБР, содержащим 0,05% Тритона Х-100, окрашивали Hoechst (1:10000) при комнатной температуре в течение 10 мин и промывали ФБР. Планшет герметично запечатывали черной пленкой и визуализировали с помощью системы визуализации ImageXpress Micro. Нетрансфицированные клетки не показывали сигнала при окрашивании с помощью 1F11/3F5/Y102L, тогда как чрезмерно экспрессирующие Hoil-1L и Hoip клетки продемонстрировали пятнистый характер окрашивания цитоплазмы (см. Фиг.22D). Данное окрашивание было специфичным для линейных цепей полиубиквитина, поскольку могло быть блокировано добавлением рекомбинантного линейного полиубиквитина.

ПРИМЕР 5 - Структурный анализ связывания Fab с линейным диубиквитином

Чтобы лучше понять взаимодействие анти-линейного Fab с линейным полиубиквитин. Fab 1F11/3F5/Y102L кристаллизовали совместно с линейным диубиквитином. Фрагмент Fab 1F11/3F5/Y102L экспрессировали в Е. coli и очищали на колонке Белка А, как изложено в Примере 1 Е выше. Дополнительно, Fab очищали на колонке SP HiTrap 5 мл (GE Healthcare) в 20 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (МЭС), рН 5,5, с линейным градиентом 0-100% 20 мМ МЭС, рН 5,5, 0,5 М NaCl. Частицы, содержащие фрагмент Fab, объединяли в пул и анализировали на сортирующей по величине колонке S75 320 мл (GE Healthcare) в 25 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl. Частицы, содержащие фрагмент Fab, объединяли в пул и концентрировали до 22 мг/мл.

Слияние голова-к-хвосту двух субъединиц убиквитина посредством канонической пептидной связи (линейный диубиквитин) также экспрессировали в Е. coli. Клетки BL21-Gold (Agilent Technologies) трансформировали с плазмидой экспрессии линейного диубиквитина, сконструированной в векторе pET15b (Novagen). Данный конструкт содержит N-концевую метку His6 (SEQ ID NO:376), с последующим сайтом расщепления тромбина под контролем промотора Т7 и оператора lac. Культуру клеток BL21-Gold, трансформированных плазмидой экспрессии линейного диубиквитина pET15b, выращенную на протяжении ночи в среде LB, разбавляли в 50 раз 1 л нагретого бульона Terrific Broth, содержащего 1% глицерина. 0,1 М (3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты, рН 7,3, и 50 мкг/мл карбенициллина. Культуру выращивали при 37°С и встряхивании со скоростью 250 об/мин в колбах емкостью 2,5 л (Thomson) до OD₆₀₀=1,64. Экспрессию индуцировали добавлением U,3 мМ изопропилтиогалактозида, и культуру выращивали на протяжении ночи при 16°С и встряхивании со скоростью 250 об/мин. На следующий день клетки гранулировали вращением со скоростью 8000 об/мин в течение 10 мин, и гранулы замораживали в жидком азоте. Клетки ресуспендировали и подвергали лизису в 40 мМ Трис, рН 8,0, 0,3 М NaCl, с добавлением таблеток свободного от ЭДТА полного ингибитора протеаз (Roche) путем тройной микрофлюидизации. Обломки клеток гранулировали центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 1 час, и супернатант фильтровали сквозь фильтр с размером пор 0,45 мМ с низким связыванием белка. His₆-diUb ('His₆', раскрытый как SEQ ID NO:376) очищали на колонке агарозы Ni-NTA 5 мл (Qiagen). Колонку промывали 12 объемами колонки Буфера А (20 мМ Трис, рН 8,0, 1 М NaCl, 20 мМ имидазола) и элюировали четырьмя объемами колонки Буфера В (20 мМ Трис, рН 8,0, 1 М NaCl, 250 мМ имидазола). Экспрессия диубиквитина была настолько высокой, что она превышала емкость связывания колонки, и некоторое количество диубиквитина элюировалось при промывании Буфером А. Поэтому промывной материал анализировали на второй колонке агарозы Ni-NTA 5 мл и очищали, как изложено выше. Метку His6 (SEQ ID NO:376) удаляли расщепления с помощью 1800 Ед тромбина (GE Healthcare) при 4°С в течение 3 дней, с диализом в 25 мМ Трис, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 2 мМ CaCl₂, с использованием трубок для диализа 3500 MWCO (Spectrum Medical). Диализированный и расщепленный материал делили на две равные части, и свободный диубиквитин отделяли от метки His6 (SEQ ID NO:376) с использованием двух колонок агарозы Ni-NTA 5 мл. Поток через колонки и все промывные материалы собирали. Колонки промывали четырьмя объемами колонки Буфера С (25 мМ Трис, рН 8,0, 0,5 М NaCl), четырьмя объемами колонки Буфера C (25 мМ Трис, рН 8,0, 0,5 М NaCl, 20 мМ имидазола), а затем одним объемом колонки Буфера Е (25 мМ Трис, рН 8,0, 0,5 М NaCl, 250 мМ имидазола). Присутствие диубиквитина без метки контролировали анализом образцов элюата и каждой порции промывного материала на 18% трис-глициновом геле Novex (Invitrogen) с окрашиванием Simply Blue Safe (Invitrogen). Большинство диубиквитина без метки присутствовало в элюате, промывном материале Буфера С и промывном материале Буфера D. Их объединяли в пул, концентрировали и дополнительно очищали на эксклюзионной колонке S75 320 мл (GE Healthcare) в 25 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl. Частицы, содержащие диубиквитин, объединял в пул и концентрировали до 15,3 мг/мл.

Комплекс Fab/диубиквитин получали с использованием трехкратного молярного избытка линейного диубиквитина к Fab и инкубировали при 4°С на протяжении ночи. Затем комплекс очищали на эксклюзионной колонке S75 320 мл (GE Healthcare) в 25 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl. Частицы, содержащие комплекс, объединяли в пул и концентрировали до 20 мг/мл.

Кристаллы выращивали с использованием метода диффузии паров сидячей капли, в каплях, содержащих 0,2 мкл 1F11/3F5/Y102L комплекса Fab/линейный диубиквитин (20 мг/мл комплекса в 25 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl) и 0,2 мкл маточника (20% изопропанола, 0,1 М МЭС, рН 6,0, 20% полиэтиленгликоля (ПЭГ) 2К монометилового эфира (ММЭ)). Начальные кристаллы росли в указанных условиях при 19°С в течение 27 дней. Кристаллы оптимизировали в сидячих_каплях, используя микромостик с 2 мкл комплекса 1F11/3F5/Y102L Fab/линейный диубиквитин (20 мг/мл комплекса в 25 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl) и 3 мкл маточника (18% изопропанола, 0,09 М МЭС, рН 6,0, 19,8% ПЭГ 2К ММЭ, 10 мМ натрия бромида). Кристаллы росли при 19°С в течение пяти дней, и ими можно было манипулировать для получения одинарных, рассеивающих кристаллов. Проводили криопреципитацию кристаллов, используя 20% изопропанола, 0,1 М МЭС, рН 6,0, 20% ПЭГ 2 ООО ММЭ с добавлением еще 25-30% ПЭГ 2 ООО ММЭ. Кристаллографические данные получали на канале синхронного излучения Berkeley Advanced Light Source 5.0.2 и обрабатывали с использованием HKL2000. Кристаллы, принадлежащие к пространственной группе Р1 с размерами одинарной ячейки а=53 Å, b=60 Å, с=96 Å, α=87°, β=77° и γ=72°, с двумя комплексами в асимметричной ячейке. Структуру исследовали путем молекулярного вытеснения с использованием программы Phaser и координат варианта фрагмента Fab гуманизированного 4D5 (код PDB для 4D5: 1FVE) и человеческого моноубиквитина (код PDB: 1UBQ). Построение модели осуществляли в Coot, и структура была усовершенствована с использованием Phenix. Разрешение структуры составляет 2,43 Å, и комплекс усовершенствован до R 22,8% и Rfree 25,0% (см. Фиг.23. Панель А).

Анализ структуры показывает, что большая часть связывания с диубиквитином опосредована через контакты с CDR тяжелой цепи. Между тяжелой цепью и диубиквитин расположено 785 Ų спрятанною поверхностного домена, в противоположность отсутствию спрятанного поверхностного домена между легкой цепью и диубиквитином. Структурный эпитоп и паратоп определены как остатки, которые прячут по меньшей мере 25% их доступной для растворителя площади поверхности при связывании (см. Фиг.23 Панели В и С) и/или содержат по меньшей мере один атом в пределах 4,5 А взаимодействующей цепи (см. Табл. 10 и 11).

Существует 15 остатков тяжелой цепи, и только 5 остатков легкой цепи, которые составляют паратоп Fab. Эпитоп диубиквитина состоит из 18 остатков дистальной части Ub (С-конец, участвующий в образовании связи) и 8 остатков проксимальной части убиквитина (N-конец, участвующий в образовании связи). Зона контакта также состоит из девяти водородных связей между тяжелой цепью и диубиквитином, и трех водородных связей между легкой цепью и диубиквитином (см. Табл.12).

Вместо осуществления исключительного контакта непосредственно с линейной связью, специфичность, по-видимому, является результатом множественных взаимодействий с поверхностными остатками: как проксимальной, так и дистальной части убиквитинов.

Несмотря на свободные цепи линейного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина, принимающие подобные структуры за счет Lys63 и свободного амино-конца, расположенного всего на расстоянии ~6 Å от структуры моноубиквитина (PDB код 1UBQ), данное антитело предпочтительно связывается с линейными цепями. Такая специфичность достигается посредством двойного распознавания относительных ориентации проксимальных и дистальных субъединиц убиквитина. Распознавание проксимальной части убиквитина достигается через взаимодействие остатков CDR H2 с петлей 60s проксимальной субъединицы. В частности, образуются две водородные связи с боковой цепью Gln62 проксимальной части убиквитина, причем в обоих принимают участие остатки CUR 1-12. Один расположен между карбонильным кислородом основной цепи Pro52a и амином боковой цепи Gln62. Другой расположен между амидом основной цепи Gly55 и карбонилом боковой цепи Gln62. Также существует третья водородная связь между карбонилом основной цепи Ser54 и амидом основной цепи Lys63. В дополнение к трем указанным водородным связям, многочисленные ван-дер-ваальсовские взаимодействия также возникают между CDR H2 и проксимальной частью убиквитина. Хотя дистальная часть убиквитина в K63-связанном диубиквитине теоретически может связываться в такой же ориентации с антителом, проксимальная часть убиквитина была бы слегка повернута за счет разницы ~6 Å в положении Metl и Lys63. Такое вращение, вероятно, разрушило бы водородные связи и ван-дер-ваальсовские взаимодействия между CDR H2 и петлей 60s. Таким образом, специфичность кодируется распознаванием относительных пространственных ориентации проксимальной и дистальной частей убиквитинов, которые являются результатом линейной связи.

Структура также иллюстрирует, почему конкретные мутации, выбранные в ходе созревания аффинности, способствуют увеличению аффинности. Мутация в CDR H2, которая обеспечивала наиболее существенное улучшение чувствительности в Вестерн-блотах пятнах, представляла собой S56Q (см. Фиг.13, клон 3F5). Структура показывает, что Gln56 образует две водородные связи: одну с карбонильным кислородом Gly75 периферической части убиквитина, и вторую с карбонильным кислородом Gly76 периферической части убиквитина, который участвует в линейной связи между дистальной и проксимальной частями убиквитинов (см. Фиг.24, Панель А). Более короткая боковая цепь Ser, вероятно, не позволит этим остаткам образовать водородные связи. Мутация, которая обеспечивала второе по величине улучшение чувствительности в Вестерн-блотах, представляла собой S52K в CDR L2 (см. Фиг.13, клон 1F11). Lys52, расположенный поблизости Asp32, найден на карбокси-конце альфа-спирали периферической части убиквитина. Хотя Lys52 находится слишком далеко для образования солевого мостика с боковой цепью Asp32, он может вступать в благоприятное электростатическое взаимодействие, при условии, что он также ориентирован в направлении отрицательного конца диполя спирали (см. Фиг.24, Панель В). Третья мутация, которая улучшала чувствительность антитела, представляла собой Y102L в CDR Н3 (см. Фиг.13, клон Y102L). Хотя данный остаток не контактирует с диубиквитином, он может способствовать стабилизации благоприятной конформации CDR Н3 для улучшения связывания. Leu102 интеркалирует между Val2 и Leu4 каркаса 1 тяжелой цепи (см. Фиг.24, Панель С). В большей степени гидрофобная боковая цепь Len могла бы обеспечить более благоприятное взаимодействие Val2 и Leu4, чем Tyr, и могла бы способствовать такому положению остальной части CDR Н3, чтобы обеспечить контакты с диубиквитином.

Хотя вышеописанное изобретение описано более подробно посредством иллюстрации и примера для целей ясности понимания, описания и примеры не должны интерпретироваться как ограничение контекста изобретения. Раскрытие всей патентной и научной литературы, цитируемой в данном описании, четко включено путем ссылки в полном объеме.

Изобретение относится к биохимии. Описано выделенное моноклональное антитело, которое специфично связывается с полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом, причем указанное антитело не связывается специфично с моноубиквитином. Описаны нуклеиновая кислота, кодирующая указанное антитело, вектор экспрессии, содержащий указанную кислоту и клетка-хозяин. Описан иммуноконъюгат, содержащий указанное антитело и цитотоксический агент, а также фармацевтический состав. Описано применение указанного антитела для производства лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, связанного с активностью полиубиквитина. Представлен способ определения присутствия полиубиквитина или полиубиквитинированного белка в образце, в котором предполагают содержание полиубиквитина, включающий обеспечение воздействия на образец по меньшей мере одним указанным антителом и определение связывания по меньшей мере одного антитела с полиубиквитином или полиубиквитинированным белком в указанном образце. Представлен способ отделения полиубиквитинированного белка. Изобретение предоставляет антитело, которое специфично связывается с полиубиквитином и не связывается с моноубиквитином. 11 н. и 38 з.п. ф-лы, 38 ил., 12 табл., 5 пр.

1. Выделенное моноклональное антитело, которое специфично связывается с полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом, причем указанное антитело не связывается специфично с моноубиквитином, и где антитело содержит:

a) гипервариабельные последовательность (HVR)-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 58, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 82 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9; или

b) последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2, выбранную из SEQ ID NO: 2, 58 и 60, последовательность HVR-L3, выбранную из SEQ ID NO: 3, 65 и 72, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7 или 80, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8 или 82, и последовательность HVR-H3, выбранную из SEQ ID NO: 9, 87, 89 или 90; или

c) последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 58, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9; или

d) последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 82 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9; или

e) последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 10, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 11 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 12; или

f) последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 19, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 10, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 23 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 12; или

g) последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 20, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 10, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 11 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 12; или

h) последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 21, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 22, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 24 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 12; или

i) последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9; или

j) последовательности HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, и HVR-H3, соответствующие указанным для клонов 1F4 или 1А10 на Фиг. 2А и 2В; или

k) последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, 50, 52-57 или 199-218, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8, и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9; или

l) последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 58-62 или 219-239, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8, и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9; или

m) последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 6, 64-72, или 240-254, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8, и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9; или

n) последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 73-81 или 255-260, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8, и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9; или

о) последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 17, 82-86, или 261-264, и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9; или

p) последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8, и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 265-282; или

q) последовательности HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, и HVR-H3, выбранные из SEQ ID NO: 1, 4, 19 и 50-57; SEQ ID NO: 2 и 58-63; SEQ ID NO: 3, 5, 6, 20, 21 и 64-72; SEQ ID NO: 7, 10, 13, 16, 22 и 73-81; SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 23, 24 и 82-86; и SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18 и 87-93, соответственно.

2. Антитело по п. 1, содержащее последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1 или 4, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3, выбранную из SEQ ID NO: 3, 5 и 6; последовательность HVR-H1, выбранную из SEQ ID NO: 7, 10, 13, 16, 22 и 73-81; последовательность HVR-H2, выбранную из SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 23, 24 и 82-86; и последовательность HVR-H3, выбранную из SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18 и 87-93, соответственно.

3. Антитело по п. 1, содержащее последовательность HVR-L1, выбранную из SEQ ID NO: 1, 4, 19 и 50-57; последовательность HVR-L2, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 58-63; последовательность HVR-L3, выбранную из SEQ ID NO: 3, 5, 6, 20, 21 и 64-72; последовательность HVR-H1, выбранную из SEQ ID NO: 7, 10, 13 и 16, последовательность HVR-H2, выбранную из SEQ ID NO: 8, 11, 14 и 17, и последовательность HVR-H3, выбранную из SEQ ID NO: 9, 12, 15 и 18, соответственно.

4. Антитело по п. 1, содержащее последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1 или 19, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2 и последовательность HVR-L3, выбранную из SEQ ID NO: 3, 20 и 21; последовательность HVR-H1, выбранную из SEQ ID NO: 7, 10, 13, 16, 22 и 73-81; последовательность HVR-H2, выбранную из SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 23, 24 и 82-86; и последовательность HVR-H3, выбранную из SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18 и 87-93, соответственно.

5. Антитело по п. 1, содержащее последовательность HVR-L1, выбранную из SEQ ID NO: 1, 4, 19 и 50-57; последовательность HVR-L2, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 58-63; последовательность HVR-L3, выбранную из SEQ ID NO: 3, 5, 6, 20, 21 и 64-72; последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 10 или 22, последовательность HVR-H2, выбранную из SEQ ID NO: 11, 23 и 24, последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 12, соответственно.

6. Антитело по п. 1, содержащее последовательность HVR-L1, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 50-57, последовательность HVR-L2, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 58-63, последовательность HVR-L3, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 64-72; последовательность HVR-H1, выбранную из SEQ ID NO: 7, 10, 13, 16, 22 и 73-81; последовательность HVR-Н2, выбранную из SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 23, 24 и 82-86; и последовательность HVR-H3, выбранную из SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18 и 87-93, соответственно.

7. Антитело по п. 1, содержащее последовательность HVR-L1, выбранную из SEQ ID NO: 1, 4, 19 и 50-57; последовательность HVR-L2, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 58-63; последовательность HVR-L3, выбранную из SEQ ID NO: 3, 5, 6, 20, 21 и 64-72; последовательность HVR-H1, выбранную из SEQ ID NO: 7 и 73-81, последовательность HVR-H2, выбранную из SEQ ID NO: 8 и 82-86, последовательность HVR-H3, выбранную из SEQ ID NO: 9 и 87-93, соответственно.

8. Антитело по п. 1, содержащее последовательности HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3 соответствующие последовательностям, указанным для клонов 1F4 или 1А10 на Фиг. 2А и 2В, или последовательности HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, и HVR-H3 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 7, 8, и 9, соответственно; SEQ ID NO: 1, 2, 3, 10, 11, и 12, соответственно; SEQ ID NO: 19, 2, 3, 10, 23, и 12, соответственно; SEQ ID NO: 1, 2, 21, 22, 24, и 12, соответственно; SEQ ID NO: 1, 2, 20, 10, 11, и 12, соответственно; SEQ ID NO: 1, 58, 3, 7, 8, и 9, соответственно; SEQ ID NO: 1, 2, 3, 7, 82, и 9, соответственно; или SEQ ID NO: 1, 58, 3, 7, 82, и 9, соответственно.

9. Антитело по п. 1, содержащее последовательности HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, выбранные из SEQ ID NO: 1, 4, 19 и 50-57; SEQ ID NO: 2 и 58-63; SEQ ID NO: 3, 5, 6, 20, 21 и 64-72; SEQ ID NO: 7, 10, 13, 16, 22 и 73-81; SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 23, 24 и 82-86; и SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18 и 87-93, соответственно.

10. Антитело по п. 1, содержащее последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, 50, 52-57, или 199-218, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8, и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9; последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 58-62 или 219-239, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8, и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9; или последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 6, 64-72, или 240-254, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8, и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9.

11. Антитело по п. 1, содержащее последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 73-81 или 255-260, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8, и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9; последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 17, 82-86, или 261-264, и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9; или последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8, и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 265-282.

12. Антитело по п. 1, содержащее последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, HVR-H1 последовательность SEQ ID NO: 10, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 11 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 12.

13. Антитело по п. 1, содержащее последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 19, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 10, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 23 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 12.

14. Антитело по п. 1, содержащее последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 20, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 10, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 11 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 12.

15. Антитело по п. 1, содержащее последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 21, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 22, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 24 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 12.

16. Антитело по п. 1, содержащее последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9.

17. Антитело по п. 1, содержащее последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2, выбранную из SEQ ID NO: 2, 58 и 60, последовательность HVR-L3, выбранную из SEQ ID NO: 3, 65 и 72, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7 или 80, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8 или 82 и последовательность HVR-Н3, выбранную из SEQ ID NO: 9, 87, 89 или 90.

18. Антитело по п. 17, содержащее последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 58, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 8 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9.

19. Антитело по п. 17, содержащее последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 82 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9.

20. Антитело по n. 17, содержащее последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 58, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 82 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 9.

21. Антитело по п. 20, отличающееся тем, что первая аминокислота после С-конца HVR-H3 представляет собой лейцин.

22. Антитело по п. 1, содержащее последовательность аминокислот легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 25-28, 33-35, 94 и 193-195.

23. Антитело по п. 1, содержащее последовательность аминокислот тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 29-32, 36-38, 95 и 196-198.

24. Антитело по п. 1, содержащее последовательности аминокислот легкой цепи и тяжелой цепи, по меньшей мере на 95% идентичные последовательностям аминокислот одной из следующих комбинаций последовательностей: SEQ ID NO: 25 и 29; SEQ ID NO: 26 и 30; SEQ ID NO: 27 и 31; SEQ ID NO: 28 и 32; SEQ ID NO: 33 и 36; SEQ ID NO: 34 и 37; SEQ ID NO: 35 и 38; SEQ ID NO: 94 и 95; SEQ ID NO: 193 и 196; SEQ ID NO: 194 и 197; и SEQ ID NO: 195 и 198.

25. Антитело по п. 24, содержащее аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи, имеющие по меньшей мере 95% идентичности к аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 94 и 95.

26. Антитело по п. 1, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 94.

27. Антитело по п. 24, содержащее аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи SEQ ID NO: 94 и 95.

28. Антитело по п. 1, где антитело не связывается специфично со вторым полиубиквитином, содержащим лизиновую связь.

29. Выделенное антитело по любому из пп. 1-28, отличающееся тем, что антитело специфично связывается с полиубиквитинированным белком, содержащим связь С-конца с N-концом.

30. Выделенное антитело по любому из пп. 1-28, отличающееся тем, что антитело модулирует по меньшей мере один опосредованный полиубиквитином путь передачи сигнала.

31. Выделенное антитело по любому из пп. 1-28, отличающееся тем, что антитело представляет собой человеческое антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело или фрагмент антитела, который связывается с полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом.

32. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из пп. 1-31.

33. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 32.

34. Клетка-хозяин для продуцирования антитела по любому из пп. 1-31, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 32.

35. Способ получения антитела по любому из пп. 1-31, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 34 в условиях, в которых вырабатывается антитело.

36. Способ по п. 35, дополнительно включающий выделение антитела из клетки-хозяина.

37. Иммуноконъюгат, содержащий антитело по любому из пп. 1-31 и цитотоксический агент.

38. Фармацевтический состав для лечения заболевания или расстройства, связанного с активностью полиубиквитина, содержащий антитело по любому из пп. 1-31 и фармацевтически приемлемый носитель.

39. Фармацевтический состав по п. 38, дополнительно содержащий дополнительный терапевтический агент.

40. Антитело по любому из пп. 1-31 для применения в качестве лекарственного средства.

41. Антитело по любому из пп. 1-31 для применения при лечении связанного с клеточным циклом заболевания или расстройства.

42. Антитело по п. 41, отличающееся тем, что связанное с клеточным циклом заболевание или расстройство выбрано из заболевания или расстройства, связанного с аберрантно ускоренным прогрессированием клеточного цикла, и заболевания или расстройства, связанного с аберрантно замедленным прогрессированием клеточного цикла.

43. Антитело по п. 42, отличающееся тем, что заболевание или расстройство, связанное с аберрантно ускоренным прогрессированием клеточного цикла, представляет собой рак.

44. Антитело по п. 42, отличающееся тем, что заболевание или расстройство, связанное с аберрантно замедленным прогрессированием клеточного цикла, выбрано из мышечного дегенеративного расстройства и нейродегенеративного расстройства.

45. Применение антитела по любому из пп. 1-31 для производства лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, связанного с активностью полиубиквитина.

46. Применение по п. 45, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для заболевания или расстройства, выбранного из рака, мышечного дегенеративного расстройства и нейродегенеративного расстройства.

47. Способ определения присутствия полиубиквитина в образце, в котором предполагают содержание полиубиквитина, включающий обеспечение воздействия на образец по меньшей мере одним антителом по любому из пп. 1-31 и определение связывания по меньшей мере одного антитела с полиубиквитином в указанном образце.

48. Способ определения присутствия полиубиквитинированного белка в образце, в котором предполагают содержание полиубиквитинированного белка, включающий обеспечение воздействия на образец по меньшей мере одним антителом по любому из пп. 1-31 и определение связывания по меньшей мере одного антитела с полиубиквитинированным белком в указанном образце.

49. Способ отделения полиубиквитинированного белка, содержащего связь С-конца с N-концом, от полиубиквитинированного белка, не содержащего связи С-конца с N-концом, в образце, включающий приведение образца в контакт с по меньшей мере одним антителом по любому из пп. 1-31.