ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ ПРОИЗВОДНЫЕ БЕНЗОДИАЗЕПИНА Российский патент 2017 года по МПК A61K47/50 C07D487/04 C07D519/00 A61P35/00 

Ссылка на родственные заявки

[01] Настоящая заявка, согласно 35 USC §119 (е), испрашивает приоритет по дате подачи предварительной заявки США №61/443062, поданной 15 февраля 2011 г., предварительной заявки США №61/483499, поданной 6 мая 2011 г., и предварительной заявки США №61/443092, поданной 15 февраля 2011 г., полное содержание которых, включая все чертежи, формулы, описания и формулы изобретения, включены сюда посредством ссылки.

Область техники

[02] Настоящее изобретение относится к новым цитотоксическим соединениям и цитотоксическим конъюгатам, включающим указанные цитотоксические соединения и агенты, связывающиеся с клетками. Конкретнее, настоящее изобретение относится к новым бензодиазепиновым соединениям и их производным, интермедиатам, конъюгатам и фармацевтически приемлемым солям, которые можно использовать в качестве медикаментов, в частности, в качестве антипролиферативных агентов.

Уровень техники

[03] Производные бензодиазепина являются полезными соединениями для лечения различных расстройств и включают такие лекарственные средства, как противоэпилептические препараты (имидазо[2,1-b][1,3,5]бензотиадиазепины, патент США №4444688; патент США №4062852), антибактериальные средства (пиримидо[1,2-с][1,3,5]бензотиадиазепины, GB 1476684), диуретики и гипотензивные средства (пиррол(1,2-b)[1,2,5]бензотиадиазепин-5,5-диоксид, патент США №3506646), гиполипидемические средства (WO 03091232), антидепрессанты (патент США №3453266); средства для лечения остеопороза (JP 2138272).

[04] В последнее время на моделях опухолей у животных показано, что производные бензодиазепина, например, пирролбензодиазепины (PBD), действуют как противоопухолевые агенты (N-2-имидазолилалкил-замещенный 1,2,5-бензотиадиазепин-1,1-диоксид, патент США №6156746), бензо-пиридо- или -дипиридотиадиазепин (WO 2004/069843), пиррол[1,2-b][1,2,5]бензотиадиазепины и производные пиррол[1,2-b][1,2,5]бензодиазепина (WO 2007/015280), производные томаймицина (например, пиррол[1,4]бензодиазепины), например, описанные в WO 00/12508, WO 2005/085260, WO 2007/085930 и ЕР 2019104. Кроме того, известно, что бензодиазепины влияют на рост и дифференцировку клеток (Kamal A., et al., Bioorg Med Chem. 2008 Aug 15; 16(16):7804-10 (и ссылки, упомянутые в ней); Kumar R, Mini Rev Med Chem. 2003 Jun;3(4):323-39 (и ссылки, упомянутые в ней); Bednarski J J, et al., 2004; Sutter A. P, et al., 2002; Blatt N B, et al., 2002), Kamal A. et al., Current Med. Chem., 2002; 2; 215-254, Wang J-J., J.Med. Chem., 2206; 49:1442-1449, Alley M.C. et al., Cancer Res. 2004; 64:6700-6706, Pepper С.J., Cancer Res 2004; 74:6750-6755, Thurston D.E. and Bose D.S., Chem Rev 1994; 94:433-465; и Tozuka, Z., et al., Journal of Antibiotics, (1983) 36; 1699-1708. Общая структура PBD описана в публикации США №20070072846. PBD отличаются по количеству, типу и положению заместителей в их ароматическом кольце А и пиррольном кольце С, а также по степени насыщения кольца С. Их способность к образованию аддукта в малой бороздке и перекрестному связыванию ДНК позволяет им вносить помехи в процессинг ДНК, обуславливая их потенциал для использования в качестве антипролиферативных агентов. [05] Первый пирролбенздиазепин, вошедший в клиническую практику, SJG-136 (NSC 694501) является мощным цитотоксическим агентом, вызывающим перекрестное связывание внутренней цепи ДНК (S.G Gregson et al., 2001, J. Med. Chem., 44: 737-748; M.C. Alley et al., 2004, Cancer Res., 64: 6700-6706; J.A. Hartley et al., 2004, Cancer Res., 64: 6693-6699; С.Martin et al., 2005, Biochemistry., 44: 4135-4147; S. Amould et al., 2006, Mol. Cancer Ther., 5: 1602-1509). Результаты первой фазы клинических исследований SJG-136 показали, что этот препарат был токсичен при очень низких дозах (максимальная переносимая доза 45 мкг/м², и были отмечены несколько побочных эффектов, в том числе синдром пропотевания жидкости через сосуды, периферические отеки, токсическое поражение печени и утомляемость. Во всех дозах было отмечено повреждение ДНК в циркулирующих лимфоцитах (D. Hochhauser et al., 2009, din. Cancer Res; 15: 2140-2147). Таким образом, существует потребность в улучшенных производных бензодиазепина, которые являются менее токсичными и, тем не менее, терапевтически активными при лечении различных пролиферативных болезненных состояний, например, рака.

Сущность изобретения

[06] Цитотоксические димеры бензодиазепинов, описанные в данной области техники, обладают двумя функциональными иминогруппами в свободной форме или обратимо блокированной форме, например, в виде гидрата, алкоксилата или сульфоната. Наличие указанных двух функциональных иминогрупп приводит к перекрестному связыванию ДНК (S.G. Gregson et al., 2001, J. Med. Chem., 44: 737-748). Настоящее изобретение частично основано на неожиданном открытии, заключавшемся в том, что конъюгаты агента, связывающегося с клетками, и новых цитотоксических производных бензодиазепина, например, димеров индолинбензодиазепина, лишенных двух функциональных иминогрупп (например, содержащие одну функциональную иминогруппу и одну функциональную аминогруппу), и поэтому неспособные к перекрестному связыванию ДНК, демонстрируют намного более высокий терапевтический индекс (соотношение максимальной переносимой дозы и минимальной эффективной дозы) in vivo по сравнению с производными бензодиазепина, способными перекрестно связывать ДНК, описанными ранее в данной области техники.

[07] Таким образом, одной целью настоящего изобретения является обеспечение цитотоксического соединения, включающего связывающую группу с присоединенной к ней реакционноспособной группой, способную ковалентно присоединять указанное цитотоксическое соединение к агенту, связывающемуся с клетками (СВА, см. ниже), причем цитотоксическое соединение представлено любой из следующих формул:

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, Х отсутствует, a Y является -Н или линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, а когда она является одинарной связью, Х является -Н, связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой или аминоблокирующей группой;

Y является -Н или уходящей группой, выбранной из -OR, -OCOR', -OCOOR', -OCONR'Rʺ, -NR'Rʺ, -NR'CORʺ, -NR'NR'Rʺ, необязательно замещенным 5- или 6-членным азотсодержащим гетероциклом (например, пиперидином, тетрагидропирролом, пиразолом, морфолином и т.д.), гуанидинием, представленным -NR'(C=NH)NR'Rʺ, аминокислотой или пептидом, представленным -NRCOP', причем Р' является аминокислотой или полипептидом, содержащим от 2 до 20 аминокислотных остатков, -SR, -SOR', -SO₂M, -SO₃M, -OSO₃M, галогеном, цианогруппой и азидной группой; или

Y является сульфитом (HSO₃, HS02 или солью HSO₃^-, SO₃^2- или HSO₂^-, образованной катионом), метабисульфитом (H₂S₁O₅ или солью S₂O₅^2-, образованной катионом), моно-, ди-, три- и тетратиофосфатом (PO₃SH₃, PO₂S₂H₂, PSO₃H₂, PS₄H₂ или солью PO₃S^3-, PO₂S₂^3-, POS₃^3- или PS₄^3-, образованной катионом), сложным эфиром тиофосфата (RⁱO)₂PS(ORⁱ), RⁱS-, RⁱSO, RⁱSO₂, RⁱSO₃, тиосульфатом (HS₂O₃ или солью S₂O₃^2-, образованной катионом), дитионитом (HS₂O₄ или солью S₂O₄^2-, образованной катионом), фосфордитиоатом (P(=S)(OR^k')(S)(OH) или его солью, образованной катионом), гидроксамовой кислотой (R^k'C(=O)NOH или солью, образованной катионом), формальдегидсульфоксилатом (HOCH₂SO₂^- или солью HOCH₂SO₂^-, образованной катионом, например, HOCH₂SO₂^-Na⁺) или их смесью, где Rⁱ является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, и замещен, по меньшей мере, одним заместителем, выбранным из -N(R^j)₂, -CO₂H, -SO₃H и РО₃Н; R¹ необязательно может быть дополнительно замещен заместителем для алкила, описанным здесь; Rⁱ является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода; R^k' является линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, арилом, гетероциклилом или гетероарилом; предпочтительно, Y является аддуктом бисульфита, гидросульфита или метабисульфита или их солей (например, соли натрия);

М является -Н или катионом;

R в каждом случае независимо выбрана из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(CH₂CH₂O)_n-Rc, необязательно замещенного арила, содержащего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, или необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

каждая из R' и Rʺ независимо выбрана из -Н, -ОН, -OR, -NHR, -NR₂, -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(CH₂CH₂O)_n-R^c и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

R^c является -Н или замещенным или незамещенным линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, или связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой;

n является целым числом от 1 до 24;

W выбрана из C=O, C=S, CH₂, ВН, SO и SO₂;

X' выбрана из -Н, аминоблокирующей группы, связывающей группы с присоединенной к ней реакционноспособной группой, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(CH₂CH₂O)_n-R^c, необязательно замещенного арила, содержащего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

Y' выбрана из -Н, оксогруппы, связывающей группы с присоединенной к ней реакционноспособной группой, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенного 6-18-членного арила, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов;

каждая из R₁, R₂, R₃, R₄, R₁', R₂', R₃' и R₄' независимо выбрана из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(OCH₂CH₂)_n-R^c, галогена, гуанидиния [-NH(С=NH)NH₂], -OR, -NR'Rʺ, -NO₂, -NCO, -NR'CORʺ, -SR, сульфоксида, представленного -SOR', сульфона, представленного -SO₂R', сульфоната -SO₃^-M⁺, сульфата -OSO₃^-M⁺, сульфонамида, представленного -SO₂NR'Rʺ, цианогруппы, азидной группы, -COR', -OCOR', -OCONR'Rʺ и связывающей группы с присоединенной к ней реакционноспособной группой;

R₆ является -Н, -R, -OR, -SR, -NR'Rʺ, -NO₂, галогеном или связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой;

Z и Z' независимо выбраны из -(CH₂)_n'-, -(CH₂)_n'-CR₇R₈-(CH₂)_na'-, -(СН₂)_n'-NR₉-(CH₂)_na'-, -(СН₂)_n'-O-(СН₂)_na'- и -(CH₂)_n'-S-(CH₂)_na'-;

n' и na' являются одинаковыми или различными и выбраны из 0, 1, 2 и 3;

R₇ и R₈ являются одинаковыми или различными, и каждая из них независимо выбрана из -Н, -ОН, -SH, -СООН, -NHR', мономера полиэтиленгликоля -(ОСН₂СН₂)_n-, аминокислоты, пептидной единицы, несущей от 2 до 6 аминокислот, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода;

R₉ независимо выбрана из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(OCH₂CH₂)_n;

А и А' являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из -O-, оксо (-С(=О)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -NR₅- и -CRR'N(R₅)-;

R₅ в каждом случае независимо является -Н или необязательно замещенным линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода;

D и D' являются одинаковыми или различными и независимо отсутствуют или выбраны из группы, состоящей из необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, аминокислоты, пептида, несущего от 2 до 6 аминокислот, и мономера полиэтиленгликоля (-ОСН₂СН₂)_n-;

L отсутствует, является связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой, мономером полиэтиленгликоля (-ОСН₂СН₂)_n-, линейным, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, фенильной группой, 3-18-членным гетероциклическим кольцом или 5-18-членным гетероарильным кольцом, содержащим от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р, где алкил или алкенил необязательно замещены связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой, фенил или гетероциклическое или гетероарильное кольцо могут быть необязательно замещены, причем заместитель может являться связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой.[08] В некоторых вариантах воплощения Х не является связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой. В некоторых вариантах воплощения двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь, Y не является -Н.

[09] В некоторых вариантах воплощения соединение не является любым из следующих соединений:

[10] В некоторых вариантах воплощения Y является уходящей группой, выбранной из -OR, -OCOR', -OCOOR', -OCONR'Rʺ, -NR'Rʺ, -NR'CORʺ, -NR'NR'Rʺ, необязательно замещенным 5- или 6-членным азотсодержащим гетероциклом (например, пиперидином, тетрагидропирролом, пиразолом, морфолином и т.д.), гуанидинием, представленным -NR'(C=NH)NR'Rʺ, аминокислотой или пептидом, представленным -NRCOP', причем Р' является аминокислотой или полипептидом, содержащим от 2 до 20 аминокислотных остатков, -SR, -SOR', -SO₂M, -SO₃M, -OSO₃M, галогеном, цианогруппой и азидной группой.

[11] Второй целью настоящего изобретения является получение конъюгатов агентов, связывающихся с клетками, с новыми бензодиазепиновыми соединениями или их производными согласно настоящему изобретению. Указанные конъюгаты можно использовать в качестве терапевтических агентов, специфически доставляющихся к клеткам-мишеням и являющихся цитотоксическими.

[12] В частности, конъюгат согласно изобретению может включать: цитотоксическое соединение и агент, связывающийся с клетками (СВА), причем указанное цитотоксическое соединение включает связывающую группу, ковалентно присоединяющую цитотоксическое соединение к СВА, и указанное цитотоксическое соединение представлено любой из следующих формул:

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, Х отсутствует, a Y является -Н или линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, а когда она является одинарной связью, Х является -Н, связывающей группой или аминоблокирующей группой;

Y является -Н или уходящей группой, выбранной из -OR, -OCOR', -OCOOR', -OCONR'Rʺ, -NR'Rʺ, -NR'CORʺ, -NR'NR'Rʺ, необязательно замещенным 5- или 6-членным азотсодержащим гетероциклом (например, пиперидином, тетрагидропирролом, пиразолом, морфолином), гуанидинием, представленным -NR'(C=NH)NR'Rʺ, аминокислотой или пептидом, представленным -NRCOP', причем Р' является аминокислотой или полипептидом, содержащим от 2 до 20 аминокислотных остатков, -SR, -SOR', -SO₂M, -SO₃M, -OSO₃M, галогеном, цианогруппой и азидной группой; или

Y является сульфитом (HSO₃, HSO₂ или солью HSO₃^-, SO₃^2- или HSO₂^-, образованной катионом), метабисульфитом (H₂S₂O₅ или солью S₂O₅^2-, образованной катионом), моно-, ди-, три- и тетратиофосфатом (PO₃SH₃, PO₂S₂H₂, POS₃H₂, PS₄H₂ или солью PO₃S^3-, PO₂S₂^3-, POS₃^3- или PS4^3-, образованной катионом), сложным эфиром тиофосфата (RⁱO)₂PS(ORⁱ), RⁱS-, RⁱSO, RⁱSO₂, RⁱSO₃), тиосульфатом (HS₂O₃ или солью S₂O₃^2-, образованной катионом), дитионитом (HS₂O₄ или солью S₂O₄^2-, образованной катионом), фосфордитиоатом (P(=S)(OR^k')(S)(OH) или его солью, образованной катионом), гидроксамовой кислотой (R^k'C(=O)NOH или солью, образованной катионом), формальдегидсульфоксилатом (HOCH₂SO₂^- или солью HOCH₂SO₂^-, образованной катионом, например, HOCH₂SO₂^-Na⁺) или их смесью, где R' является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, и замещен, по меньшей мере, одним заместителем, выбранным из -N(R^j)₂, -CO₂H, -SO₃H и РО₃Н; Rⁱ необязательно может быть дополнительно замещен заместителем для алкила, описанным здесь; R³ является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода; R является линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, арилом, гетероциклилом или гетероарилом; предпочтительно, Y является аддуктом бисульфита, гидросульфита или метабисульфита или их солей (например, соли натрия);

М является -Н или катионом;

R в каждом случае независимо выбрана из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(CH₂CH₂O)_n-R^c, необязательно замещенного арила, содержащего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, или необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

каждая из R' и Rʺ независимо выбрана из -Н, -ОН, -OR, -NHR, -NR2, -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(CH₂CH₂O)_n-R^c и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

R' является -И или замещенным или незамещенным линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода или связывающей группой;

n является целым числом от 1 до 24;

W выбрана из С=O, C=S, CH₂, BH, SO и SO₂;

X' выбрана из -Н, аминоблокирующей группы, связывающей группы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(CH₂CH₂O)_n-R^c, необязательно замещенного арила, содержащего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

Y' выбрана из -Н, оксогруппы, связывающей группы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенного 6-18-членного арила, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов;

каждая из R₁, R₂, Р₃, R₄, R₁', R₂', R₃' и R₄' независимо выбрана из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(OCH₂CH₂)_nR^c, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH₂], -OR, -NR'Rʺ, -NO₂, -NCO, -NR'CORʺ, -SR, сульфоксида, представленного -SOR', сульфона, представленного -SO₂R', сульфоната -SO₃^-M⁺, сульфата -OSO₃^-M⁺ сульфонамида, представленного -SO₂NR'Rʺ, цианогруппы, азидной группы, -COR', -OCOR', -OCONR'Rʺ и связывающей группы;

R₆ является -Н, -R, -OR, -SR, -NR'Rʺ, -NO₂, галогеном или связывающей группой;

Z и Z' независимо выбраны из -(CH₂)_n'-, -(CH₂)_n'-CR₇R₈-(CH₂)_na'-, -(CH₂)_n'-NR₉-(CH₂)_na'-, -(СН₂)_n'-O-(СН₂)_na'- и -(CH₂)_na'-;

n' и na' являются одинаковыми или различными и выбраны из 0, 1, 2 и 3;

R₇ и R₈ являются одинаковыми или различными, и каждая из них независимо выбрана из -Н, -ОН, -SH, -СООН, -NHR', мономера полиэтиленгликоля -(ОСН₂СН₂)_n-, аминокислоты, пептидной единицы, несущей от 2 до 6 аминокислот, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода;

R₉ независимо выбрана из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(ОСН₂СН₂)_n-;

А и А' являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из -O-, оксо (-С(-О)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -NR₅- и -CRR'N(R₅)-,

R₉ в каждом случае независимо является -Н или необязательно замещенным линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода;

D и D' являются одинаковыми или различными и независимо отсутствуют или выбраны из группы, состоящей из необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, аминокислоты, пептида, несущего от 2 до 6 аминокислот, и мономера полиэтиленгликоля (-ОСН₂СН₂)_n-;

L отсутствует, является связывающей группой, мономером полиэтиленгликоля (-ОСН₂СН₂)_n-, линейным, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, фенильной группой, 3-18-членным гетероциклическим кольцом или 5-18-членным гетероарильным кольцом, содержащим от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р, где алкил или алкенил необязательно замещены связывающей группой; фенил или гетероциклическое или гетероарильное кольцо могут быть необязательно замещены, причем заместитель может являться связывающей группой.

[13] В некоторых вариантах воплощения Х не является связывающей группой. В некоторых вариантах воплощения двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь, Y не является -Н.

[14] В некоторых вариантах воплощения Y является -Н или уходящей группой, выбранной из -OR, -OCOR', -OCOOR', -OCONR'Rʺ, -NR'Rʺ, -NR'CORʺ, -NR'NR'Rʺ, необязательно замещенным 5- или 6-членным азотсодержащим гетероциклом (например, пиперидином, тетрагидропирролом, пиразолом, морфолином и т.д.), гуанидинием, представленным -NR'(C=NH)NR'Rʺ, аминокислотой или пептидом, представленным -NRCOP', причем Р' является аминокислотой или полипептидом, содержащим от 2 до 20 аминокислотных остатков, -SR, -SOR', -SO₃M, -SO₃M, -OSO₃M, галогеном, цианогруппой и азидной группой. В некоторых вариантах воплощения Y не является -Н.

[15] В некоторых вариантах воплощения соединение конъюгата не является любым из следующих соединений (волнистая связь представляет собой связь, посредством которой соединение присоединено к СВА)

[16] Настоящее изобретение также включает композицию (например, фармацевтическую композицию), включающую новые бензодиазепиновые соединения, их производные или конъюгаты (и/или сольваты, гидраты и/или соли) и носитель (фармацевтически приемлемый носитель). Настоящее изобретение дополнительно включает композицию (например, фармацевтическую композицию), включающую новые бензодиазепиновые соединения, их производные или конъюгаты (и/или сольваты, гидраты и/или соли) и носитель (фармацевтически приемлемый носитель), а также включающую второй терапевтический агент. Композиции по настоящему изобретению можно использовать для ингибирования аномального клеточного роста или лечения пролиферативного расстройства у млекопитающего (например, человека). Композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения таких состояний, как рак, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, реакция трансплантат против хозяина (РТПХ), отторжение трансплантата, волчанка, миозит, инфекция, иммунодефицит, например СПИД, и воспалительные заболевания у млекопитающих (например, человека).

[17] Настоящее изобретение включает способ ингибирования аномального клеточного роста или лечения пролиферативного расстройства у млекопитающего (например, человека), включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества новых бензодиазепиновых соединений, их производных или конъюгатов (и/или сольватов и солей) или их композиции отдельно или в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

Настоящее изобретение включает способ синтеза и применения новых бензодиазепиновых соединений, их производных и конъюгатов для диагностики или обработки клеток млекопитающих, организмов или ассоциированных патологических состояний in vitro, in situ и in vivo.

[18] Соединения по настоящему изобретению, их производные или конъюгаты и композиции, включающие их, можно использовать для лечения или уменьшения тяжести заболеваний, например, характеризующихся аномальным ростом клеток (например, рака). Другие варианты применения соединений и конъюгатов по данному изобретению включают лечение таких состояний, как рак, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, реакция трансплантат против хозяина (РТПХ), отторжение трансплантата, волчанка, миозит, инфекция, иммунодефицит, например, СПИД и воспалительные заболевания у млекопитающих (например, человека), но не ограничиваются ими.

[19] Как используется здесь по отношению к группе (например, R^c, L, X' и т.д.), "является/являться" (или "не является") связывающей группой или связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой означает, что группа "включает" (или "не включает") связывающую группу или связывающую группу с присоединенной к ней реакционноспособной группой.

Краткое описание чертежей

[20] На Фиг.1-6 показаны схемы синтеза бензодиазепиновых соединений и соответствующих присоединяемых соединений, пригодных для конъюгирования по настоящему изобретению.

[21] На Фиг.7 показана схема синтеза типичных соединений с ПЭГ-модифицированными линкерами по настоящему изобретению.

[22] На Фиг.8 показана схема синтеза типичных соединений с метилтио-линкером по настоящему изобретению.

[23] На Фиг.9-10 показаны схемы синтеза типичных соединений, содержащих третичный амин, по настоящему изобретению.

[24] На Фиг.11 показана схема синтеза типичных соединений с пептидным линкером по настоящему изобретению.

[25] На Фиг.12-19 показаны схемы синтеза типичных соединений, подходящих для способов одноэтапного конъюгирования по настоящему изобретению.

[26] На Фиг.20 показана схема двухэтапного синтеза моноиминового димера.

[27] На Фиг.21 показана схема двухэтапного синтеза дивосстановленного димера.

[28] На Фиг.22 показана схема одноэтапного синтеза типичных конъюгатов антитело/лекарственное вещество.

[29] На Фиг.23 показана схема двухэтапного синтеза типичных конъюгатов антитело/лекарственное вещество.

[30] На Фиг.24 показана цитотоксичность метилдитио-димера Id in vitro против линий клеток Namalwa, KB и HL60/QC.

[31] На Фиг.25 показана цитотоксичность и специфичность in vitro конъюгатов huMy9-6-SPDB-1f против различных клеточных линий. Следует отметить, что к реакционной среде для изготовления конъюгата добавляли бисульфит натрия.

[32] На Фиг.26 показана цитотоксичность и специфичность in vitro конъюгатов huFOLR1-SPDB-1f.

[33] На Фиг.27 показано, что конъюгирование димера не снижает сродство связывания антитела. Следует отметить, что к реакционной среде для изготовления конъюгата добавляли бисульфит натрия.

[34] На Фиг.28 показана антиопухолевая активность т vivo конъюгата huMy9-6. Следует отметить, что к реакционной среде для изготовления конъюгата добавляли бисульфит натрия.

[35] На Фиг.29 показана цитотоксичность in vitro конъюгата huMy9-6-SPDB-1f против антиген-положительных клеток. Следует отметить, что к реакционной среде для изготовления конъюгата добавляли бисульфит натрия.

[36] На Фиг.30 показана схема синтеза для получения тиоэфир-содержащего дисульфидного линкера 27e-h.

[37] На Фиг.31 показана схема синтеза для получения димеров 28c-f.

[38] На Фиг.32 показана схема синтеза для получения фенил-присоединенных димеров 29b-с.

[39] На Фиг.33 показана схема альтернативного двухэтапного синтеза моноиминовых димеров.

[40] На Фиг.34 показана цитотоксичность in vitro для huMy9-6-SPDB-1f (A), huMy9-6-сульфоSРDВ-1f (В) и huMy9-6-BMPS-1f (С) против клеток HL60/QC (Ag⁺) с и без блокирования антиген-связывающих сайтов. Следует отметить, что во всех трех экспериментах (34А, 34В и 34С) к реакционной среде для изготовления конъюгата добавляли бисульфит натрия.

[41] На Фиг.35 показана цитотоксичность in vitro для chB38.1-SPDB-1f (А) и chB38.1-сульфоSРDВ-1f (В) против клеток COL0205 (Ag⁺). Следует отметить, что в обоих экспериментах к реакционной среде для изготовления конъюгата добавляли бисульфит натрия.

[42] На Фиг.36 показана эффективность huMy9-6-SPDB-1f in vivo на мышах, несущих HL60/QC. Следует отметить, что к реакционной среде для конъюгирования добавляли бисульфит натрия.

[43] На Фиг.37 показана эффективность huFOLR1-SPDB-1f in vivo на мышах, несущих опухоли KB.

[44] На Фиг.38 показана схема синтеза соединения 1.

[45] На Фиг.39 показана схема синтеза соединения 1d с использованием 5-этил-2-метилпиридинборана (РЕМВ).

[46] На Фиг.40 показана схема синтеза соединения 1d с использованием триацетоксиборгидрида натрия (STAB).

[47] На Фиг.41 показана схема синтеза соединения 31а-с.

[48] На Фиг.42 показана схема синтеза соединения 32c,d.

[49] На Фиг.43 показана схема синтеза соединений И и 12а.

[50] На Фиг.44 показана антипролиферативная активность путем сравнения (A) huMy9-6-SPDB-1f, (В) 1 huMy9-6-сульфоSРDВ-1f и (С) huMy9-6-BMPS-1f против клеток OCI-AML3 (Ag⁺) с и без блокирования антиген-связывающих сайтов. Следует отметить, что во всех трех экспериментах к реакционной среде для изготовления конъюгата добавляли бисульфит натрия.

[51] На Фиг.45 показана альтернативная схема синтеза 4-(бензилокси)-5-метокси-2-нитробензойной кислоты, используемой при получении мономера IBD.

[52] Фиг.46 является альтернативной схемой синтеза (5-((2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)(2-метил-2-(метилдисульфанил)пропил)амино)-1,3-фенилен)диметанола (1b).

[53] Фиг.47 является альтернативной схемой синтеза (5-((2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)(2-метил-2-(метилдисульфанил)пропил)амино)-1,3-фенилен)диметанола (1b).

[54] Фиг.48 является альтернативной схемой двухэтапного синтеза моноиминового димера.

[55] На Фиг.49 показана активность различных конъюгатов по отношению к различным линиям клеток. Значения IC₅₀, перечисленные в таблице, приведены в нМ.

[56] На Фиг.50 показана эффективность huMy9-6-сульфо-SPDB-1f in vivo на мышах, несущих опухоли MOLM-13.

[57] На Фиг.51 показана эффективность huMy9-6-сульфо-SPDB-1f in vivo на мышах, несущих опухоль NB4.

[58] На Фиг.52 показана эффективность huMy9-6-BMPS-1f in vivo на мышах, несущих опухоль HL60/QC.

[59] На Фиг.53 показана эффективность huMy9-6-BMPS-1f in vivo на мышах, несущих опухоль MOLM-13. Следует отметить, что к реакционной среде для изготовления конъюгата добавляли бисульфит натрия.

[60] На Фиг.54 показана типичная схема синтеза конъюгата сульфированный фолат/цитотоксическое соединение.

[61] На Фиг.55 показано несколько типичных конъюгатов сульфированное лекарственное вещество-антитело с различными линкерами.

[62] На Фиг.56 показана эффективность ЬиМу9-6-лекарственное вещество 2 in vivo на мышах, несущих опухоль HL60/QC. Следует отметить, что к реакционной среде для изготовления конъюгата добавляли бисульфит натрия.

[63] На Фиг.57 показана эффективность huMy9-6-лекарственное вещество 2 in vivo на мышах, несущих опухоль MOLM-13. Следует отметить, что к реакционной среде для изготовления конъюгата добавляли бисульфит натрия.

[64] На Фиг.58 показана аналогичная цитотоксичность in vitro конъюгатов huMy9-6/лекарственное вещество 2, полученных без и с использованием бисульфита натрия, против клеток HL60, экспрессирующих антиген CD33.

[65] На Фиг.59 показана аналогичная цитотоксичность in vitro конъюгатов антитело против CD22/лекарственное вещество 2, полученных без и с использованием бисульфита натрия, против клеток BJAB, экспрессирующих антиген CD22.

[66] На Фиг.60 показано получение huMy9-6-сульфо-SPDB-1d с использованием линкера 4-нитроРу-сульфо-SPDB, обладающего высокой реакционной способностью.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[67] В данном разделе приведено подробное описание со ссылками на конкретные варианты воплощения изобретения, примеры которых нашли отражение в прилагаемых структурах и формулах. Хотя настоящее изобретение описано применительно к конкретным приведенным вариантам воплощения, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено указанными вариантами воплощения. Напротив, подразумевается, что изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем настоящего изобретения, как определено формулой изобретения. Для специалиста в данной области техники очевидны многочисленные способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь, которые можно использовать для осуществления настоящего изобретения.

[68] Следует понимать, что любой из описанных здесь вариантов воплощения, включая варианты, описанные в различных аспектах настоящего изобретения (например, соединения, молекулы соединение-линкер, конъюгаты, композиции, способы их получения и применения), и различные части описания (включая варианты воплощения, описанные только в Примерах) можно объединять с одним или более других вариантов воплощения изобретения, если они не отрицаются или не являются несоответствующими явным образом. Комбинация вариантов воплощения изобретения не ограничивается указанными специфическими комбинациями, заявленными в нескольких зависимых пунктах формулы изобретения.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[69] "Линейный или разветвленный алкил", как используется здесь, относится к насыщенному линейному или разветвленному одновалентному углеводородному радикалу из от одного до двадцати атомов углерода. Примеры алкилов включают метил, этил, 1-пропил, 2-пропил, 1-бутил, 2-метил-1-пропил, -СН₂СН(СН₃)₂), 2-бутил, 2-метил-2-пропил, 1-пентил, 2-пентил, 3-пентил, 2-метил-2-бутил, 3-метил-2-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-1-бутил, 1-гексил, 2-гексил, 3-гексил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 3-метил-3-пентил, 2-метил-3-пентил, 2,3-диметил-2-бутил, 3,3-диметил-2-бутил, 1-гептил, 1-октил и т.п., но не ограничиваются ими. Предпочтительно, алкил содержит от одного до десяти атомов углерода. Более предпочтительно, алкил содержит от одного до четырех атомов углерода.

[70] "Линейный или разветвленный алкенил" относится к линейному или разветвленному одновалентному углеводородному радикалу из от двух до двадцати атомов углерода и с, по меньшей мере, одним ненасыщенным сайтом, т.е. двойной связью углерод-углерод, причем алкенил-радикал включает радикалы с "цис-" и "транс-" ориентацией или, в качестве альтернативы, в ориентациях "Е" и "Z". Примеры включают этиленил или винил (-CH=CH₂), аллил (-СН₂СН=СН₂) и т.п., но не ограничиваются ими. Предпочтительно, алкенил содержит от двух до десяти атомов углерода. Более предпочтительно, алкенил содержит от двух до четырех атомов углерода.

[71] "Линейный или разветвленный алкинил" относится к линейному или разветвленному одновалентному углеводородному радикалу из от двух до двадцати атомов углерода и с, по меньшей мере, одним ненасыщенным сайтом, т.е. тройной связью углерод-углерод. Примеры включают этинил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-пентинил, гексинил и т.п., но не ограничиваются ими. Предпочтительно, алкинил содержит от двух до десяти атомов углерода. Более предпочтительно, алкинил содержит от двух до четырех атомов углерода.

[72] Термин "карбоцикл", "карбоциклил" и "карбоциклическое кольцо" относятся к одновалентному неароматическому, насыщенному или частично ненасыщенному кольцу, содержащему от 3 до 12 атомов углерода в случае моноциклического кольца или от 7 до 12 атомов углерода - в случае бициклического кольца. Бициклические карбоциклы, содержащие от 7 до 12 атомов, могут быть организованы, например, в виде системы бицикло[4,5], [5,5], [5,6] или [6,6], а бициклические карбоциклы, содержащие 9 или 10 атомов в кольце, могут быть организованы в виде системы бицикло[5,6] или [6,6], или в виде мостиковых систем, например, бицикло[2.2.1]гептана, бицикло[2.2.2]октана и бицикло[3.2.2]нонана. Примеры моноциклических карбоциклов включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, 1-циклопент-1-енил, 1-циклопент-2-енил, 1-циклопент-3-енил, циклогексил, 1-циклогекс-1-енил, 1-циклогекс-2-енил, 1-циклогекс-3-енил, циклогексадиенил, циклогептил, циклооктил, циклононил, циклодецил, циклоундецил, циклододецил и т.п., но не ограничиваются ими.

[73] Термины "циклический алкил" и "циклоалкил" можно использовать на равных основаниях. Они относятся к одновалентному насыщенному карбоциклическому кольцевому радикалу. Предпочтительно, циклический алкил является 3-7-членным моноциклическим кольцевым радикалом. Более предпочтительно, циклический алкил является циклогексилом.

[74] Термин "циклический алкенил" относится к карбоциклическому кольцевому радикалу, содержащему, по меньшей мере, одну двойную связь в составе кольцевой структуры.

[75] Термин "циклический алкинил" относится к карбоциклическому кольцевому радикалу, содержащему, по меньшей мере, одну тройную связь в составе кольцевой структуры.

[76] "Арил" означает одновалентный ароматический углеводородный радикал из 6-18 атомов углерода, полученный удалением одного атома водорода от одного атома углерода исходной ароматической кольцевой системы. Некоторые арильные группы представлены в типичных структурах как "Ar". Арил включает бициклические радикалы, включающие ароматическое кольцо, конденсированные с насыщенным, частично ненасыщенным кольцом, или ароматическим карбоциклическим или гетероциклическим кольцом. Типичные арильные группы включают радикалы, происходящие от бензола (фенил), замещенные бензолы, нафталин, антрацен, инденил, инданил, 1,2-дигидронафталин, 1,2,3,4-тетрагидронафтил и т.п., но не ограничиваются ими. Предпочтительно, арил является фенильной группой.

[77] Термины "гетероцикл", "гетероциклил" и "гетероциклическое кольцо" используются здесь на равных основаниях и относятся к насыщенному или частично ненасыщенному (т.е., содержащему одну или более двойных и/или тройных связей в составе кольца) карбоциклическому радикалу из от 3 до 18 атомов в составе кольца, причем, по меньшей мере, один атом в составе кольца является гетероатомом, выбранным из азота, кислорода, фосфора и серы, а остальные атомы в составе кольца являются атомами С, где один или более атомов в составе кольца, необязательно, независимо замещены одним или более заместителями, описанными ниже. Гетероцикл может являться моноциклической структурой, содержащей от 3 до 7 членов кольца (2-6 атомов углерода и 1-4 гетероатома, выбранных из N, О, Р и S) или бициклической структурой, содержащей от 7 до 10 членов кольца (4-9 атомов углерода и 1 -6 гетероатомов, выбранных из N, О, Р и S), например: системой бицикло[4,5], [5,5], [5,6] или [6,6]. Гетероциклы описаны в Paquette, Leo A.; "Principles of Modem Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), в частности, в главах 1, 3, 4, 6, 7, и 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, с 1950 по настоящее время), в частности, томах 13, 14, 16, 19 и 28; и J. Am. Chem. Soc. (I960) 82:5566. "Гетероциклил" также включает радикалы, где гетероциклические радикалы конденсированы с насыщенным, частично ненасыщенным кольцом или ароматическим карбоциклическим или гетероциклическим кольцом. Примеры гетероциклических колец включают пирролидинил, тетрагидрофуранил, дигидрофуранил, тетрагидротиенил, тетрагидропиранил, дигидропиранил, тетрагидротиопиранил, пиперидино, морфолино, тиоморфолино, тиоксанил, пиперазинил, гомопиперазинил, азетидинил, оксетанил, тиетанил, гомопиперидинил, оксепанил, тиепанил, оксазепинил, диазепинил, тиазепинил, 2-пирролинил, 3-пирролинил, индолинил, 2Н-пиранил, 4Н-пиранил, диоксанил, 1,3-диоксоланил, пиразолинил, дитианил, дитиоланил, дигидропиранил, дигидротиенил, дигидрофуранил, пиразолидинил, имидазолинил, имидазолидинил, 3-азабицикло[3.1.0]гексанил, 3-азабицикло[4.1.0]гептанил и азабицикло[2.2.2]гексанил, но не ограничиваются ими. В рамки данного определения также входят спирогруппы. Примерами гетероциклических групп, где кольцевые атомы замещены оксогруппами (=O), являются пиримидинонил и 1,1-диоксотиоморфолинил.

[78] Термин "гетероарил" относится к одновалентному ароматическому радикалу из 5- или 6-членных колец и включает системы конденсированных колец (по меньшей мере, одно из которых является ароматическим) из 5-18 атомов, содержащих один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы. Примерами гетероарильных групп являются пиридинил (включая, например, 2-гидроксипиридинил), имидазолил, имидазопиридинил, пиримидинил (включая, например, 4-гидроксипиримидинил), пиразолил, триазолил, пиразинил, тетразолил, фурил, тиенил, изоксазолил, тиазолил, оксазолил, изотиазолил, пирролил, хинолинил, изохинолинил, индолил, бензимидазолил, бензофуранил, циннолинил, индазолил, индолизинил, фталазинил, пиридазинил, триазинил, изоиндолил, птеридинил, пуринил, оксадиазолил, триазолил, тиадиазолил, фуразанил, бензофуразанил, бензотиофенил, бензотиазолил, бензоксазолил, хиназолинил, хиноксалинил, нафтиридинил и фуропиридинил.

[79] Гетероциклическая или гетероарильная группы могут при возможности присоединяться через атом углерода (углерод-связанная группа) или азота (азот-связанная группа). В качестве неограничивающего примера, гетероциклы или гетероарилы, присоединенные через атом углерода, присоединены по положению 2, 3, 4, 5 или 6 пиридина, положению 3, 4, 5 или 6 пиридазина, положению 2, 4, 5 или 6 пиримидина, положению 2, 3, 5 или 6 пиразина, положению 2, 3, 4 или 5 фурана, тетрагидрофурана, тиофурана, тиофена, пиррола или тетрагидропиррола, положению 2, 4 или 5 оксазола, имидазола или тиазола, положению 3, 4 или 5 изоксазола, пиразола или изотиазола, положению 2 или 3 азиридина, положению 2, 3 или 4 азетидина, положению 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 хинолина или положению 1, 3,4, 5, 6, 7 или 8 изохинолина.

[80] В качестве неограничивающего примера, гетероциклы или гетероарилы, присоединенные через атом азота, присоединены по положению 1 азиридина, азетидина, пиррола, пирролидина, 2-пирролина, 3-пирролина, имидазола, имидазолидина, 2-имидазолина, 3-имидазолина, пиразола, пиразолина, 2-пиразолина, 3-пиразолина, пиперидина, пиперазина, индола, индолина, 1H-индазола, положению 2 изоиндола или изоиндолина, положению 4 морфолина и положению 9 карбазола или O-карболина.

[81] Гетероатомы, присутствующие в составе гетероарила или гетероциклила, включают окисленные формы, например, NO, SO и SO₂.

[82] Термин "гало" или "галоген" относится к F, Cl, Br или I.

[83] Алкил, алкенил, алкинил, циклический алкил, циклический алкенил, циклический алкинил, карбоциклил, арил, гетероциклил и гетероарил, описанные выше, могут быть необязательно замещены одним или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или более) заместителями.

[84] Если заместитель описан как "замещенный", то вместо атома водорода при атоме углерода, кислорода, серы или азота в составе заместителя присутствует заместитель, не являющийся атомом водорода. Так, например, замещенный алкильный заместитель является алкильным заместителем, где, по меньшей мере, один заместитель, не являющийся атомом водорода, присутствует вместо атома водорода в составе указанного алкильного заместителя. С целью иллюстрации, монофторалкил является алкилом, замещенным фтор-заместителем, а дифторалкил является алкилом, замещенным двумя фтор-заместителями. Следует понимать, что если в составе заместителя присутствует более одной замены, каждый заместитель, не являющийся атомом водорода, может быть одинаковым или отличающимся (если не указано иное).

[85] Если заместитель описан как "необязательно замещенный", указанный заместитель может быть либо (1) не замещен, либо (2) замещен. Если атом углерода заместителя описан как необязательно замещенный одним или несколькими заместителями из списка, один или несколько атомов водорода при атоме углерода (если таковые имеются) по отдельности и/или совместно могут быть замещены независимо выбранным необязательным заместителем. Если атом азота заместителя описан как необязательно замещенный одним или несколькими заместителями из перечня, каждый из одного или нескольких атомов водорода при атоме азота (если таковые имеются) может быть замещен независимо выбранным необязательным заместителем. Один типичный заместитель может быть изображен как -NR'R'ʺ, где R' и Rʺ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать гетероциклическое кольцо. Гетероциклическое кольцо, образованное R' и Rʺ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, может быть частично или полностью насыщенным. В одном варианте воплощения указанное гетероциклическое кольцо содержит от 3 до 7 атомов. В другом варианте воплощения гетероциклическое кольцо выбрано из группы, состоящей из пирролила, имидазолила, пиразолила, триазолила, тетразолила, изоксазолила, пиридила и тиазолила.

[86] В настоящем описании термины "заместитель", "радикал" и "группа" используются взаимозаменяемо.

[87] Если группа заместителей совместно описана как необязательно замещенная одним или более заместителей из перечня, указанная группа может включать: (1) незамещаемые заместители, (2) замещаемые заместители, не замещенные необязательными заместителями, и/или (3) замещаемые заместители, замещенные одним или более необязательных заместителей.

[88] Если заместитель описан как необязательно замещенный определенным количеством заместителей, которые не являются атомами водорода, то заместители могут быть либо (1) незамещенными; либо (2) замещенными указанным определенным количеством заместителей, не являющихся атомами водорода, или по максимальному количеству замещаемых положений в составе заместителя, в зависимости от того, какое значение из указанных является меньшим. Так, например, если заместитель описан как гетероарил, необязательно замещенный до 3 заместителями, не являющимися атомами водорода, то любой гетероарил с менее чем 3 замещаемыми положениями может необязательно быть замещенным лишь до такого количества заместителями, не являющихся атомами водорода, сколько замещаемых положений содержит указанный гетероарил. Такие заместители в неограничивающих примерах могут быть выбраны из линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, арила, гетероарила, гетероциклила, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH₂], -OR¹⁰⁰, NR¹⁰¹R¹⁰², -NO₂, -NR¹⁰¹COR¹⁰², -SR¹⁰⁰, сульфоксида, представленного -SOR¹⁰¹, сульфона, представленного -SO₂R¹⁰¹, сульфоната -SO₃M, сульфата -OSO₃M, сульфонамида, представленного -SO₂NR¹⁰¹R¹⁰², цианогруппы, азидной группы, -COR¹⁰¹, -OCOR¹⁰¹, -OCONR¹⁰¹R¹⁰² и мономера полиэтиленгликоля (-OCH₂CH₂)_nR¹⁰¹, где М является Н или катионом (например, Na⁺ или K⁺); каждая из R¹⁰¹, R¹⁰² и R¹⁰³ независимо выбраны из Н, линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля (-OCH₂CH₂)_n-R¹⁰⁴, где n является целым числом от 1 до 24, арила, содержащего от 6 до 10 атомов углерода, гетероциклического кольца, содержащего от 3 до 10 атомов углерода, и гетероарила, содержащего от 5 до 10 атомов углерода; а R¹⁰⁴ является Н или линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, где алкил, алкенил, алкинил, арил, гетероарил и гетероциклил в группах, представленных R¹⁰⁰, R¹⁰¹, R¹⁰², R¹⁰³ и R¹⁰⁴, необязательно замещены одним или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или более) заместителей, независимо выбранных из галогена, -ОН, -CN, -NO₂ и незамещенного линейного или разветвленного алкила, содержащего от 1 до 4 атомов углерода. Предпочтительно, заместители необязательно замещенного алкила, алкенила, алкинила, циклического алкила, циклического алкенила, циклического алкинила, карбоциклила, арила, гетероциклила и гетероарила, описанных выше, включают галоген, -CN, -NR¹⁰²R¹⁰³, -CF₃, -OR¹⁰¹, арил, гетероарил, гетероциклил, -SR¹⁰¹, -SOR¹⁰¹, -SO₂R¹⁰¹ и -SO₃M.

[89] Термины "соединение" или "цитотоксическое соединение", "цитотоксический димер" и "цитотоксическое димерное соединение" используется на равных основаниях. Подразумевается, что они включают соединения, для которых в настоящем изобретении описана структура или формула или любое производное, или их структура или формула или любое производное включены посредством ссылки. Указанный термин также включает стереоизомеры, геометрические изомеры, таутомеры, сольваты, метаболиты, соли (например, фармацевтически приемлемые соли) и пролекарства и соли пролекарств соединений всех формул, описанных в настоящем изобретении. Указанный термин также включает любые сольваты, гидраты и полиморфы любого из вышеуказанного. Конкретное перечисление "стереоизомеров", "геометрических изомеров", "таутомеров", "сольватов", "метаболитов", "соли", "пролекарства", "соли пролекарства", "конъюгатов", "солей конъюгатов", "сольвата", "гидрата" или "полиморфа" в некоторых аспектах изобретения, описанного в настоящей заявке, не должно толковаться как предполагаемое отсутствие указанных форм в других аспектах изобретения, где термин "соединение" используют без перечисления указанных других форм.

[90] Термин "конъюгат", как используется здесь, относится к соединению, описанному здесь, или его производному, присоединенному к агенту, связывающемуся с клетками.

[91] Термин "связываемый с агентом, связывающимся с клеткой", как используется здесь, относится к соединениям, описанным здесь, или их производным, включающим, по меньшей мере, одну связывающую группу, или ее предшественник, пригодную для связывания этих соединений или их производных с агентом, связывающимся с клетками.

[92] Термин "предшественник" данной группы относится к любой группе, которая может привести к получению указанной группы за счет деблокирования, химической модификации или реакции присоединения.

[93] Термин "присоединенный к агенту, связывающемуся с клетками" относится к молекуле конъюгата, включающей, по меньшей мере, одно из соединений, описанных здесь (например, соединений формулы (I)-(IV) и (VIII)-(XI) и соединений лекарственное вещество-линкер, описанных здесь), или его производное, связанное с агентом, связывающимся с клетками, посредством соответствующей связывающей группы или ее предшественника.

[94] Термин "хиральный" относится к молекулам, обладающим свойством не совпадать при наложении со своим зеркальным отображением, в то время как термин "ахиральный" относится к молекулам, которые при наложении совпадают со своим зеркальным отображением.

[95] Термин "стереоизомер" относится к соединениям, характеризующимся одинаковым химическим составом и внутримолекулярными связями, но различными типами ориентации атомов в пространстве, которые не могут взаимопревращаться путем поворота вокруг одинарных связей.

[96] "Диастереомеры" относится к стереоизомерам с двумя или более центров хиральности, молекулы которых не являются зеркальными отображениями друг друга. Диастереоизомеры имеют различные физические свойства, например, температуры плавления, температуры кипения, спектральные свойства и реакционную способность. Смеси диастереоизомеров можно разделить с помощью аналитических методик с высокой степенью разделения, таких как кристаллизация, электрофорез и хроматография.

[97] "Энантиомеры" относится к двум стереоизомерам соединения, которые являются зеркальными отображениями друг друга, не совпадающими при наложении.

[98] Стереохимические определения и условные обозначения, используемые здесь, в целом соответствуют S.P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; и Eliel, E. and Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds," John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994. Соединения согласно изобретению могут содержать асимметричные или хиральные центры и, следовательно, существуют в различных стереоизомерных формах. Предполагается, что все стереоизомерные формы соединений согласно изобретению, включая диастереомеры, энантиомеры и атропизомеры, а также их смеси, например, рацемические смеси, не ограничиваясь ими, образуют часть настоящего изобретения. Многие органические соединения существуют в виде оптически активных форм, т.е. обладают способностью вращать плоскость плоскополяризованного света. При описании оптически активных соединений для обозначения абсолютной конфигурации молекулы относительно ее хирального(ых) центра(ов) используют префиксы D и L или R и S. Префиксы d и I или (+) и (-) используют для обозначения знака поворота плоскополяризованного света соединением, при этом префиксы (-) или 1 означают, что соединение является левовращающим. Соединение с префиксом (+) или d является правовращающим. Для данной химической структуры эти стереоизомеры являются одинаковыми, за исключением того, что они представляют собой зеркальные отражения друг друга. Конкретный стереоизомер также можно рассматривать в качестве энантиомера, при этом смесь таких изомеров часто называют энантиомерной смесью. Смесь энантиомеров 50:50 называют рацемической смесью или рацематом; указанная смесь может образовываться в случае, если в химической реакции или процессе отсутствуют стереоизбирательность или стереоспецифичность. Термины "рацемическая смесь" и "рацемат" относятся к эквимолярной смеси двух типов энантиомеров, не обладающей оптической активностью.

[99] Термин "таутомер" или "таутомерная форма" относится к структурным изомерам с различной энергией, взаимопревращающимся при переходе низкоэнергетического барьера. Например, протонные таутомеры (также известные как прототропные таутомеры) включают взаимопревращение посредством миграции протона, например, при кето-енольной и имин-енаминной изомеризации. Валентные таутомеры включают взаимопревращения путем реорганизации некоторых электронных связей.

[100] Термин "пролекарство", как используется в настоящей заявке, относится к предшественнику или производному соединения по изобретению, которое способно ферментативно или гидролитически активироваться или превращаться в более активную исходную форму. См., например, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast (1986) и Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp.247-267, Humana Press (1985). Пролекарства по настоящему изобретению включают сложноэфирные пролекарства, фосфат-содержащие пролекарства, тиофосфат-содержащие пролекарства, сульфат-содержащие пролекарства, пептид-содержащие пролекарства, пролекарства, модифицированные D-аминокислотами, гликозилированные пролекарства, β-лактам-содержащие пролекарства, пролекарства, содержащие необязательно замещенный феноксиацетамид, пролекарства, содержащие необязательно замещенный фенилацетамид, 5-фторцитозиновые и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые можно преобразовать в более активные цитотоксические свободные лекарственные вещества, но не ограничиваются ими. Примеры цитотоксических лекарственных веществ, которые можно преобразовать в форму пролекарства для использования в настоящем изобретении, включают соединения по изобретению и химиотерапевтические агенты, например, описанные выше, но не ограничиваются ими.

[101] Кроме того, подразумевают, что термин "пролекарство" включает производное соединения, способное подвергаться гидролизу, окислению или иным образом вступать в реакцию в биологических условиях (w vitro или т vivo) с получением соединения по настоящему изобретению. Пролекарства могут быть активными только после такой реакции в биологических условиях или могут обладать активностью в непрореагировавшей форме. Примеры пролекарств, рассматриваемые в настоящем изобретении, включают аналоги или производные соединений любой из формул, описанных здесь, включающие биогидролизуемые молекулы, например, биогидролизуемые амидные, биогидролизуемые сложноэфирные, биогидролизуемые карбаматные, биогидролизуемые карбонатные, биогидролизуемые уреидные, а также биогидролизуемые фосфатные аналоги, но не ограничиваются ими. Другие примеры пролекарств включают производные соединений любой из формул, описанных здесь, включающие -NO, -NO₂, -ONO или -ONO₂-группы. Пролекарства обычно можно получить, используя широко известные способы, например, способы, описанные в Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (1995) 172-178, 949-982 (Manfred E. Wolff ed., 5th ed); см. также Goodman and Oilman's, The Pharmacological basis of Therapeutics, 8th ed., McGraw-Hill, Int. Ed. 1992, "Biotransformation of Drugs".

[102] Одна предпочтительная форма пролекарства по изобретению включает соединения (с или без линкерных групп) и конъюгаты по изобретению, содержащие аддукт, образованный между иминной связью соединений/конъюгатов и реагентом, способным взаимодействовать с иминами. Еще одна предпочтительная форма пролекарства по изобретению включает такие соединения, как соединения формулы (I)-(IV), причем, когда двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь, Х является Н или аминоблокирующей группой, и соединение становится пролекарством. Пролекарства по изобретению могут содержать одну или обе формы пролекарства, описанные здесь (например, содержать аддукт, образованный между иминной связью соединений/конъюгатов и имин-реакционноспособным реагентом, и/или содержать уходящую группу Y, когда Х является -Н).

[103] Термин "реагент, способный взаимодействовать с иминами" относится к реагенту, способному взаимодействовать с иминогруппой. Примеры реагентов, способных взаимодействовать с иминами, включают сульфиты (H₂SO₃, H₂SO₂ или соль HSO₃^-', SO₃^2- или HSO₂^-, образованную катионом), метабисульфит (H₂S₂O₅ или соль S₂O₅^2-, образованную катионом), моно-, ди-, три- и тетратиофосфаты (PO₃SH₃, PO₂S₂H₃, POS₃H₃, PS₄H₃ или соль PO₃S^3-, PO₂S₂^3-, POS₃^3- или PS₄^3-, образованную катионом), сложные эфиры тиофосфата ((RⁱO)₂PS(ORⁱ), RⁱSH, RⁱSOH, RⁱSOH, RⁱSO₃H), различные амины (гидроксиламин (например, NH₂OH), гидразин (например, NH₂NH₂), NH₂O-Rⁱ, Rⁱ'NH-Rⁱ, NH₂-Rⁱ), NH₂-CO-NH₂, NH₂-C(=S)-NH₂, тиосульфат (H₂S₂O₄ или соль S₂O₄^2-, образованную катионом), дитионит (H₂S₂O₄ или соль S₂O₄^2-, образованную катионом), фосфордитиоат (P(=S)(OR^k)(SH)(OH) или его соль, образованную катионом), гидроксамовую кислоту (R^kC(=O)NHOH или соль, образованную катионом), гидразид (R^kCONHNH₂), формальдегидсульфоксилат (HOCH₂SO₂H или соль HOCH₂SO₂^-, образованную катионом, например, HOCH2SO₂^-N^a), гликозилированный нуклеотид (например, GDP-маннозу), флударабин или их смесь, где Rⁱ и Rⁱ', независимо, являются линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, и замещены, по меньшей мере, одним заместителем, выбранным из -N(R^j)₂, -CO₂H, -SO₃H и РО₃Н; Rⁱ и Rⁱ', необязательно, могут быть дополнительно замещены заместителем для алкила, описанным здесь; R^j является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода; a R^k является линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, арилом, гетероциклилом или гетероарилом (предпочтительно, R^k является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода; более предпочтительно, R^k является метилом, этилом или пропилом), но не ограничиваются ими. Предпочтительно, катион является одновалентным катионом, например, Na⁺ или K⁺. Предпочтительно, реагент, способный взаимодействовать с иминами, выбирают из сульфитов, гидроксиламина, мочевины и гидразина. Более предпочтительно, реагент, способный взаимодействовать с иминами, является NaHSO₃ или KHSO₃.

[104] Как используется здесь, если не указано иное, термины "биогидролизуемый амидный", "биогидролизуемый сложноэфирный", "биогидролизуемый карбаматный", "биогидролизуемый карбонатный", "биогидролизуемый уреидный" и "биогидролизуемый фосфатный аналог" означает амидный, сложноэфирный, карбаматный, карбонатный, уреидный или фосфатный аналог, соответственно, который либо; 1) не нарушает биологическую активность соединения и придает указанному соединению выгодные свойства in vivo, например, поглощение, продолжительность действия или начало действия, либо 2) сам по себе является биологически неактивным, но преобразуется in vivo в биологически активное соединение. Примеры биогидролизуемых амидов включают амиды низших алкилов, амиды α-аминокислот, алкоксиациламиды и алкиламиноалкилкарбониламиды, но не ограничиваются ими. Примеры биогидролизуемых сложных эфиров включают сложные эфиры низших алкилов, алкоксиацилоксиэфиры, алкилациламиноалкиловые сложные эфиры и сложные эфиры холина, но не ограничиваются ими. Примеры биогидролизуемых карбаматов включают низшие алкиламины, замещенные этилендиамины, аминокислоты, гидроксиалкиламины, гетероциклические и гетероароматические амины и полиэфирные амины, но не ограничиваются ими. Особенно предпочтительными пролекарствами и солями пролекарств являются пролекарства, повышающие биодоступность соединений по изобретению при введении таких соединений в организм млекопитающего.

[105] Фраза "фармацевтически приемлемая соль", как используется здесь, относится к фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим солям соединения по настоящему изобретению. Типичные соли включают сульфат, цитрат, ацетат, оксалат, хлорид, бромид, иодид, нитрат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, лактат, салицилат, кислый цитрат, тартрат, олеат, таннат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкуронат, сахарат, формиат, бензоат, глутамат, метансульфонат "мезилат", этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат, памоат (т.е. 1,1'-метилен-бис-(2-гидрокси-3-нафтоат)), соли щелочных металлов (например, натрия и калия), соли щелочноземельных металлов (например, магния) и соли аммония, но не ограничиваются ими. Фармацевтически приемлемые соли могут содержать включение другой молекулы, например, ацетат-иона, сукцинат-иона или другого противоиона. Противоион может являться любой органической или неорганической группой, стабилизирующей заряд исходного соединения. Кроме того, фармацевтически приемлемая соль может содержать более одного заряженного атома в своей структуре. В случае, когда несколько заряженных атомов являются частью фармацевтически приемлемой соли, она может содержать несколько противоионов. Таким образом, фармацевтически приемлемая соль может содержать один или более заряженных атомов и/или один или более противоионов.

[106] Если соединение по изобретению является основанием, желательную фармацевтически приемлемую соль можно получить любым подходящим способом, доступным в данной области техники, например, обработкой свободного основания неорганической кислотой, например, соляной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, азотной кислотой, метансульфоновой кислотой, фосфорной кислотой и т.п., или органической кислотой, например, уксусной кислотой, малеиновой кислотой, янтарной кислотой, миндальной кислотой, фумаровой кислотой, малоновой кислотой, пировиноградной кислотой, щавелевой кислотой, гликолевой кислотой, салициловой кислотой, пиранозидной кислотой, например, глюкуроновой кислотой или галактуроновой кислотой, альфа-гидроксикислотой, например, лимонной кислотой или винной кислотой, аминокислотой, например, аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой, ароматической кислотой, например, бензойной кислотой или коричной кислотой, сульфоновой кислотой, например, п-толуолсульфоновой кислотой или этансульфоновой кислотой или т.п.

[107] Если соединение по изобретению является кислотой, желательную фармацевтически приемлемую соль можно получить любым подходящим способом, например, обработкой свободной кислоты неорганическим или органическим основанием, например, амином (первичным, вторичным или третичным), гидроксидом щелочного металла или гидроксидом щелочноземельного металла или т.п. Иллюстративные примеры подходящих солей включают органические соли, являющиеся производными аминокислот, например, глицина и аргинина, аммиака, первичных, вторичных и третичных аминов и циклических аминов, например, пиперидина, морфолина и пиперазина, и неорганические соли, являющиеся производными натрия, кальция, калия, магния, марганца, железа, меди, цинка, алюминия и лития, но не ограничиваются ими.

[108] Как используется здесь, термин "сольват" означает соединение, дополнительно включающее в стехиометрических или нестехиометрических количествах растворитель, например, воду, изопропанол, ацетон, этанол, метанол, ДМСО, этилацетат, уксусную кислоту и этаноламин, дихлорметан, 2-пропанол или т.п., связанный за счет нековалентных межмолекулярных сил. Сольваты или гидраты соединений легко получить путем добавления, по меньшей мере, одного молярного эквивалента гидроксильного растворителя, например, метанола, этанола, 1-пропанола, 2-пропанола или воды к соединению, что приводит к сольватированию или гидратированию иминогруппы.

[109] В настоящей заявке термины "аномальный рост клеток" и "пролиферативное расстройство" используются взаимозаменяемо. "Аномальный рост клеток", как используется здесь, если не указано иное, относится к росту клеток, не зависящему от нормальных регуляторных механизмов (например, утраты контактного ингибирования). Указанный термин включает, например, аномальный рост: (1) опухолевых клеток (опухолей), пролиферирующих за счет экспрессии мутантной тирозинкиназы или сверхэкспрессии рецепторной тирозинкиназы, (2) доброкачественных и злокачественных клеток при других пролиферативных заболеваниях, при которых происходит аберрантная активация тирозинкиназы, (3) любых опухолей, пролиферирующих за счет рецепторных тирозинкиназ, (4) любых опухолей, пролиферирующих за счет активации аберрантной серин/треонинкиназы, и (5) доброкачественных и злокачественных клеток при других пролиферативных заболеваниях, при которых происходит аберрантная активация серин/треонинкиназы.

[110] Термины "рак" и "раковый" относятся к или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, обычно характеризующееся нерегулируемым ростом клеток. "Опухоль" включает одну или более раковых клеток, и/или доброкачественных или предраковых клеток. Примеры рака включают, но не ограничиваются этим, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз или лимфонеоплазию. Конкретные примеры таких видов рака включают плоскоклеточный рак (например, эпителиальный плоскоклеточный рак), рак легких, включая мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких ("НМРЛ"), аденокарциному легких и плоскоклеточную карциному легких, рак брюшины, печеночноклеточный рак, рак желудка, включая рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак ободочной и прямой кишки, рак эндометрия или матки, карциному слюнных желез, рак почек, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, карциному анального канала, рак полового члена, острый лейкоз, рак головы/головного мозга и шеи, злокачественные заболевания лимфатических органов и гематологические злокачественные новообразования, включая лейкоз (острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), острый миелобластный лейкоз (ОМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), хронический миелолейкоз (ХМЛ), острый моноцитарный лейкоз (AMOL), волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ), Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз (Т-ПЛЛ), крупноклеточный гранулолимфоцитарный лейкоз, Т-клеточный лейкоз взрослых), лимфому (мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), ходжкинскую лимфому (с нодулярным склерозом, смешанноклеточную, богатую лимфоцитами, обедненную или необедненную лимфоцитами и нодулярную ходжкинскую лимфому с преобладанием лимфоцитов), неходжкинские лимфомы (всех подтипов), хронический лимфоцитарный лейкоз/мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмоцитарную лимфому (например, макроглобулинемию Вальденстрема), лимфому из клеток пограничной зоны селезенки, плазмоцитарные новообразования (плазмаклеточную миелому, плазмацитому, болезни отложения моноклональных иммуноглобулинов, болезни тяжелых цепей), экстранодальную В-клеточную лимфому из клеток пограничной зоны (MALT-лимфому), В-клеточную лимфому из клеток пограничной зоны лимфоузлов (NMZL), фолликулярную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, крупноклеточную В-клеточную лимфому средостения (тимуса), внутрисосудистую крупноклеточную В-клеточную лимфому, первичную выпотную лимфому, лимфому/лейкоз Беркитта, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, Т-клеточный крупноклеточный гранулолимфоцитарный лейкоз, агрессивный NK-клеточный лейкоз, Т-клеточный лейкоз/лимфому взрослых, экстранодальную NK/T-клеточную лимфому (назального типа), Т-клеточную лимфому энтеропатического типа, печеночно-селезеночную Т-клеточную лимфому, бластную NK-клеточную лимфому, фунгоидную гранулему/синдром Сезари, первичные кожные CD30-положительные Т-клеточные лимфопролиферативные расстройства, первичную кожную анапластическую крупноклеточную лимфому, лимфоматоидный папулез, ангиоиммунобластную Т-клеточную лимфому, периферическую Т-клеточную лимфому (неопределенную), анапластическую крупноклеточную лимфому), множественную миелому (плазмаклеточную миелому или болезнь Калера).

[111] Термин "терапевтический агент" охватывает биологический агент, например, антитело, пептид, белок, фермент или химиотерапевтический агент.

[112] "Химиотерапевтический агент" является химическим соединением, пригодным для лечения рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают эрлотиниб (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm,), бортезомиб (VELCADE®, Millennium Pharm.), фулвестрант (FASLODEX®, AstraZeneca), сутент (SU11248, Pfizer), летрозол (FEMARA®, Novartis), иматиниба мезилат (GLEEVEC®, Novartis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), оксалиплатин (Eloxatin®, Sanofi), 5-ФУ (5-фторурацил), лейковорин, рапамицин (сиролимус, RAPAMUNE®, Wyeth), лапатиниб (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), лонафарниб (SCH 66336), сорафениб (BAY43-9006, Bayer Labs) и гефитиниб (IRESSA®, AstraZeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), алкилирующие агенты, например, тиотепа и CYTOXAN® циклофосфамид; алкилсульфонаты, например, бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилмеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (в том числе его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (в том числе синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1), элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, например, хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамина оксид-гидрохлорид, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; производные нитрозомочевины, например, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, например, энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, в частности, калихеамицин гаммалл и калихеамицин омегалл (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); динемицин, включая динемицин А; бисфосфонаты, например, клодронат; эсперамицин; а также неокарциностатиновый хромофор и родственные хромопротеиновые энедииновые антибиотики-хромофоры), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, каминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-Ь-норлейцин, ADRIAMYCIN® (доксорубицин), морфолиндоксорубицин, цианморфолиндоксорубицин, 2-пирролиндоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, например, митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, например, метотрексат и 5-фторурацил (5-ФУ); аналоги фолиевой кислоты, например, деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, например, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамниприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, например, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, например, калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналовые средства, например, аминоглютетимид, митотан, трилостан; пополнитель фолиевой кислоты, например, фролиновую кислоту; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элформитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтансиноиды, например, майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Юджин, штат Орегон, США);, разоксан; ризоксин; сизофуран; спирогерманий; тенуазониевую кислоту; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-С"); циклофосфамид, тиотепа; таксоиды, например, TAXOL® (паклитаксел; Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, штат Нью-Джерси, США), ABRAXANE® (без кремофора), составы паклитаксела на основе наночастиц, сконструированных с использованием альбумина (American Pharmaceutical Partners, Шаумберг, штат Иллинойс, США) и TAXOTERE® (доксетаксел; Rhone-Poulenc Rorer, Антони, Франция); хлорамбуцил; GEMZAR® (гемцитабин), 6-тиогуанин; меркаптопурин, метотрексат; аналоги платины, например, цисплатин и карбоплатин; винбластин; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; NAVELBINE® (винорелбин); новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин, аминоптерин; капецитабин (XELODA®); ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, например, ретиноевую кислоту, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеперечисленных.

[113] Кроме того, определение "химиотерапевтического агента" включает: (i) антигормональные препараты, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли, например, антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогенов (СМРЭ), включая, например, тамоксифен (включая NOLVADEX®; тамоксифена цитрат), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и FARESTON® (торемифина цитрат); (ii) ингибиторы ароматазы, ингибирующие фермент ароматазу, регулирующий продукцию эстрогенов в надпочечниках, например, 4(5)-имидазолы, аминоглютетимид, MEGASE® (мегестрола ацетат), AROMASIN® (экземестан; Pfizer), форместан, фадрозол, RIVISOR® (ворозол), FEMARA® (летрозол; Novartis) и ARIMIDEX® (анастрозол; AstraZeneca), (in) антиандрогены, например, флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин, а также троксацитабин (аналог цитозина 1,3-диоксоланнуклеозид); (iv) ингибиторы протеинкиназ; (v) ингибиторы липидкиназ; (vi) антисмысловые олигонуклеотиды, в частности, олигонуклеотиды, ингибирующие экспрессию генов сигнальных путей, участвующих в аберрантной пролиферации клеток, например, РКС-альфа, Ralf и H-Ras; (vii) рибозимы, например, ингибиторы экспрессии ФРЭС (например, ANGIOZYME®) и ингибиторы экспрессии HER2; (viii) вакцины, например, вакцины для генной терапии, например, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® и VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; ингибитор топоизомеразы 1, например, LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) антиангиогенные агенты, например, бевацизумаб (AVASTIN®, Genentech); и (х) фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеперечисленных. Другие антиангиогенные агенты включают ингибиторы ММР-2 (металлопротеиназы 2 матрикса), ингибиторы ММР-9 (металлопротеиназы 9 матрикса), ингибиторы COX-II (циклооксигеназы II) и ингибиторы ФРЭС-рецепторной тирозинкиназы. Примеры таких ингибиторов металлопротеиназ матрикса, которые можно использовать в комбинации с соединениями/композициями по настоящему изобретению, описаны в WO 96/33172, WO 96/27583, ЕР 818442, ЕР 1004578, WO 98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/34915, WO 98/33768, WO 98/30566, ЕР 606,046, ЕР 931,788, WO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, WO 99/07675, ЕР 945864, патенте США №5863949, патенте США №5861510 и ЕР 780386, каждый из которых полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Примеры ингибиторов ФРЭС-рецепторной тирозинкиназы включают 4-(4-бром-2-фторанилин)-6-метокси-7-(1 -метилпиперидин-4-илметокси)хиназолин (ZD6474; Пример 2 в WO 01/32651), 4-(4-фтор-2-метилиндол-5-илокси)-6-метокси-7-(3-пирролидин-1-илпропокси)-хиназолин (AZD2171; Пример 240 в WO 00/47212), ваталаниб (РТК787, WO 98/35985) и SU11248 (сунитиниб, WO 01/60814), и такие соединения, как соединения, описанные в публикациях РСТ под номерами WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 и WO 98/13354).

[114] Другие примеры химиотерапевтических агентов, которые можно использовать в комбинации с соединениями по настоящему изобретению, включают ингибиторы PI3K (фосфоинозитид-3-киназы), например, описанные в Yaguchi et al (2006) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 98(8):545-556; патенте США №7173029; патенте США №7037915; патенте США №6608056; патенте США №6608053; патенте США №6838457; патенте США №6770641; патенте США №6653320; патенте США №6403588, WO 2006/046031; WO 2006/046035; WO 2006/046040; WO 2007/042806; WO 2007/042810; WO 2004/017950; US 2004/092561; WO 2004/007491; WO 2004/006916; WO 2003/037886; US 2003/149074; WO 2003/035618; WO 2003/034997; US 2003/158212; ЕР 1417976; US 2004/053946; JP 2001247477; JP 08175990; JP 08176070; патенте США №6703414; и WO 97/15658, полностью включенных в настоящий документ посредством ссылок. Конкретные примеры таких ингибиторов PI3K включают SF-1126 (ингибитор PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (ингибитор PI3K, Novartis), XL-147 (ингибитор PI3K, Exelixis, Inc.).

[115] Химиотерапевтические средства также могут включать любое из воспроизведенных лекарственных средств или биоаналогов фирменных лекарственных средств, упомянутых в настоящем документе, или их усовершенствованных вариантов, в том числе улучшенных составов, пролекарств, средств доставки (замедленного высвобождения, биоадгезивное покрытие, адресной доставки и т.д.) и дозированных лекарственных форм.

[116] "Метаболит" является продуктом, полученным за счет метаболизма указанного соединения, его производного или его конъюгата, или его соли в организме. Метаболиты соединения, его производного или его конъюгата можно идентифицировать с помощью обычных методик, известных в данной области техники, и определить их активность с помощью тестов, например, описанных здесь. Такие продукты могут образовываться, например, в результате окисления, гидроксилирования, восстановления, гидролиза, амидирования, дезамидирования, этерификации, деэтерификации, ферментативного расщепления и т.п. введенного соединения. Соответственно, настоящее изобретение включает метаболиты соединений, их производных или их конъюгата по изобретению, включая соединения, их производные или их конъюгаты, полученные способом, включающим осуществление контакта соединения, его производного или его конъюгата по настоящему изобретению, с млекопитающим в течение времени, достаточного для получения его метаболического продукта.

[117] Фраза "фармацевтически приемлемый" означает, что вещество или композиция должны быть совместимы химически и/или токсикологически с другими ингредиентами, содержащимися в составе, и/или млекопитающим, подвергаемым лечению с использованием вещества или композиции.

[118] Термин "защитная группа" или "блокирующая группа" относится к заместителю, обычно используемому для блокирования или защиты определенной функциональной группы при взаимодействии других функциональных групп с соединением, его производным или его конъюгатом. Например, "аминозащитная группа" или "аминоблокирующая группа" является заместителем, присоединенным к аминогруппе, который блокирует или защищает функциональную аминогруппу в соединении. Такие группы хорошо известны в данной области техники (см., например, Р. Wuts and Т. Greene, 2007, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 7, J. Wiley & Sons, NJ) и представлены карбаматами, например, метил- и этилкарбаматом, FMOC, замещенными этилкарбаматами, карбаматами, расщепляемыми посредством 1,6-β-элиминирования (также называемые "жертвующими собой"), производными мочевины, амидами, пептидами, алкильными и арильными производными. Подходящие аминоблокирующие группы включают ацетил, трифторацетил, трет-бутоксикарбонил (ВОС), бензилоксикарбонил (CBZ) и 9-флуоренилметиленоксикарбонил (Fmoc). Общее описание защитных групп и их использования см. в Р.G.M. Wuts & Т.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 2007.

[119] Термин "уходящая группа" относится к заряженной или незаряженной группе, отсоединяющейся во время замены или замещения. Такие уходящие группы хорошо известны в данной области техники и включают галогены, сложные эфиры, алкокси, гидроксил, тозилаты, трифлаты, мезилаты, нитрилы, азид, карбамат, дисульфиды, сложные тиоэфиры, простые тиоэфиры и соединения диазония, но не ограничиваются ими.

[120] Термин "бифункциональный сшивающий агент", "бифункциональный линкер" или "сшивающий агент" относится к модифицирующим агентам, обладающим двумя реакционноспособными группами, одна из которых способна взаимодействовать с агентом, связывающимся с клетками, а другая реагирует с цитотоксическим соединением, чтобы присоединить указанные две молекулы друг к другу. Такие бифункциональные сшивающие агенты хорошо известны в данной области техники (см., например, Isalm and Dent in Bioconjugation chapter 5, р.218-363, Groves Dictionaries Inc. New York, 1999). Например, бифункциональные сшивающие агенты, обеспечивающие присоединение посредством тиоэфирной связи, включают N-сукцинимидил-4-(N-малеимидметил)-циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) для внедрения малеимидогрупп, либо N-сукцинимидил-4-(иодацетил)-аминобензоат (SIAB) для внедрения иодацетильных групп. Другие бифункциональные сшивающие агенты, внедряющие малеимидные группы или галоацетильные группы в агент, связывающийся с клетками, хорошо известны в данной области техники (см. заявки на патент США 2008/0050310, 20050169933, доступные в Pierce Biotechnology Inc., п/я 117, Рокленд, штат Иллинойс 61105, США) и включают бис-малеимидполиэтиленгликоль (ВМРЕО), ВМ(РЕО)₂, ВМ(РЕО)₃, N-(β-малеимидпропилокси)сукцинимидный эфир (BMPS), N-сукцинимидильный эфир γ-малеимидмасляной кислоты (GMBS), N-гидроксисукцинимидный эфир ε-малеимидкапроновой кислоты (EMCS), NHS 5-малеимидвалериановой кислоты, HBVS, N-сукцинимидил-4-(N-малеимидметил)-циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроат), являющийся "длинноцепочечным" аналогом SMCC (LC-SMCC), м-малеимидбензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир (MBS), гидразид или соль HCl и 4-(4-Н-малеимидфенил)-масляной кислоты (МРВН), N-сукцинимидил-3-(бромацетамид)пропионат (SBAP), N-сукцинимидилиодацетат (SIA), N-сукцинимидильный эфир κ-малеимидундекановой кислоты (KMUA), N-сукцинимидил-4-(п-малеимидфенил)-бутират (SMPB), сукцинимидил-6-(β-малеимидпропионамид)гексаноат (SMPH), сукцинимидил-(4-винилсульфонил)бензоат (SVSB), дитиобис-малеимидэтан (DTME), 1,4-бис-малеимидбутан (ВМВ), 1,4-бис-малеимидил-2,3-дигидроксибутан (BMDB), бис-малеимидгексан (ВМН), бис-малеимидэтан (ВМОЕ), сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидметил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC), сульфосукцинимидил(4-иодацетил)аминобензоат (сульфо-SIAB), м-малеимидбензоил-N-гидроксисульфосукцинимидный эфир (сульфо-MBS), N-(γ-малеимидбутирилокси)сульфосукцинимидный эфир (сульфо-GMBS), N-(ε-малеимидкапроилокси)сульфосукцинимидный эфир (сульфо-EMCS), N-(κ-малеимидундеканоилокси)сульфосукцинимидный эфир (сульфо-KMUS) и сульфосукцинимидил-4-(п-малеимидфенил)бутират (сульфо-SMPB), но не ограничиваются ими.

[121] Гетеробифункциональные сшивающие агенты являются бифункциональными сшивающими агентами, содержащими две различные реакционноспособные группы. Гетеробифункциональные сшивающие агенты, содержащие N-гидроксисукцинимидную группу (NHS-группу), реагирующую с аминогруппами, и гидразиновую группу, реагирующую с карбонильными группами, также можно использовать для соединения цитотоксических соединений, описанных здесь, с агентом, связывающимся с клетками (например, антитела). Примеры таких коммерчески доступных гетеробифункциональных сшивающих агентов включают гидразон сукцинимидил-6-гидразинникотинамида ацетона (SANH), гидрохлорид сукцинимидил-4-гидразидтерефталата (SHTH) и гидрохлорид сукцинимидилгидразинийникотината (SHNH). Конъюгаты, несущие кислотнолабильную связь, также можно получить с использованием гидразин-несущего производного бензодиазепина согласно настоящему изобретению. Примеры бифункциональных сшивающих агентов, которые можно использовать, включают сукцинимидил-п-формилбензоат (SFB) и сукцинимидил-п-формилфеноксиацетат (SFPA).

[122] Бифункциональные сшивающие агенты, обеспечивающие присоединение агента, связывающегося с клетками, с цитотоксическими соединениями посредством дисульфидных связей, известны в данной области техники и включают N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)пентаноат (SPP), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноат (SPDB), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)-2-сульфобутаноат (сульфо-SPDB) для внедрения дитиопиридильных групп. Другие бифункциональные сшивающие агенты, которые можно использовать для внедрения дисульфидных групп, известны в данной области техники и описаны в патентах США 6913748, 6716821 и публикациях патентов США 20090274713 и 20100129314, все из которых включены в настоящее описание посредством ссылки. В альтернативном случае также можно использовать сшивающие агенты, например, 2-иминотиолан, гомоцистеинтиолактон или S-ацетилянтарный ангидрид, внедряющие тиоловые группы.

[123] "Линкер", "линкерная группа" или "связывающая группа", как определено здесь, относится к группе, соединяющей две группы, например, агент, связывающий клетки, и цитотоксическое соединение, друг с другом. Как правило, линкер является практически инертным в условиях, когда две группы, соединяемые им, связаны между собой. Бифункциональный сшивающий агент может включать две реакционноспособные группы, по одной на каждом из концов линкерной группы, такой, что одна реакционноспособная группа может вначале взаимодействовать с цитотоксическим соединением, обеспечивая соединение, несущее линкер и вторую реакционноспособную группу, которая затем может взаимодействовать с агентом, связывающимся с клетками. В альтернативном случае один конец бифункционального сшивающего агента может вначале взаимодействовать с агентом, связывающимся с клетками, несущим линкерную группу и вторую реакционноспособную группу, которая затем может взаимодействовать с цитотоксическим соединением. Связывающая группа может содержать химическую связь, обеспечивающую высвобождение цитотоксической группы, в конкретном положении. Подходящие химические связи хорошо известны в данной области техники и включают дисульфидные связи, тиоэфирные связи, кислотолабильные связи, фотолабильные связи, пептидазолабильные связи и эстеразолабильные связи (см., например, патенты США 5208020; 5475092; 6441163; 6716821; 6913748; 7276497; 7276499; 7368565; 7388026 и 7414073). Предпочтительными являются дисульфидные связи, тиоэфирные и пептидазолабильные связи. Другие линкеры, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают нерасщепляемые линкеры, например, подробно описанные в публикации патента США номер 20050169933, или заряженные линкеры или гидрофильные линкеры, и описаны в US 2009/0274713, US 2010/01293140 и WO 2009/134976, каждый из которых специально включен в настоящий документ посредством ссылки.

[124] В одном варианте воплощения связывающая группа с реакционноспособной группой, присоединенной к одному концу, такой как реакционноспособный сложный эфир, выбрана из следующих:

-O(CR₂₀R₂₁)_m(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-O(CR₂₀R₂₁)_m(CR₂₆=CR₂₇)_m'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-O(CR₂₀R₂₁)_m(алкинил)_n'-(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-O(CR₂₀R₂₁)_m(пиперазин)_t'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-O(CR₂₀R₂₁)_m(пиррол)_t'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ (CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-O(CR₂₀R₂₁)_mAʺ_mʺ (CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-S(CR₂₀R₂₁)_m(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-S(CR₂₀R₂₁)_m(CR₂₆=CR₂₇)_m'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-S(CR₂₀R₂₁)_m(алкинил)_n'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)q(CO)tXʺ,

-S(CR₂₀R₂₁)_m(пиперазин)_t'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-S(CR₂₀R₂₁)_m(пиррол)_t'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-S(CR₂₀R₂₁)mAʺ_mʺ(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)q(CO)tXʺ,

-NR₃₃(C=O)_pʺ(CR₂₀₂₁)_m(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tX'',

-NR₃₃(C=O)_pʺ(CR₂₀R₂₁)_m(CR₂₆=CR₂₇)_m'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ (CR₂₄R₂₅)q

(CO)_tXʺ,

-NR₃₃(C=O)_pʺ(CR₂₀R₂₁)_m(алкинил)_n'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q-(CO)_tXʺ,

-NR₃₃(C=O)_pʺ(CR₂₀R₂₁)_m(пиперазин)_t'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q

(CO)_tXʺ,

-NR₃₃(C=O)_pʺ(CR₂₀R₂₁)_m(пиррол)_t'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q^-(CO)_tXʺ,

-NR₃₃(C=O)_pʺ(CR₂₀R₂₁)_mAʺ_mʺ(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q

(CO)_tXʺ,

-(CR₂₀R₂₁)_m(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-(CR₂₀R₂₁)_m(CR₂₆=CR₂₇)_m'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-(CR₂₀R₂₁)_m(алкинил)_n'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-(CR₂₀R₂₁)_m(пиперазин)_t'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-(CR₂₀R₂₁)_mAʺ_mʺ(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-(CR₂₀R₂₁)_m(CR₂₉=N-NR₃₀)_nʺ(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-(CR₂₀R₂₁)_m(CR₂₉=N-NR₃₀)_n"(CR₂₆=CR₂₇)_m'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ (CR₂₄R₂₅)_q(CO)_tXʺ,

-(CR₂₀R₂₁)_m(CR₂₉=N-NR₃₀)_nʺ(алкинил)_n'(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)_q^-(CO)_tXʺ,

-(CR₂₀R₂₁)_m(CR₂₉=N-NR₃₀)_nʺAʺ_mʺ(CR₂₂R₂₃)_n(OCH₂CH₂)_p(CR₄₀R₄₁)_pʺYʺ(CR₂₄R₂₅)q

(CO)_tXʺ, где:

m, n, p, q, m', n', t' являются целыми числами от 1 до 10, или необязательно равны 0;

t, m", n" и pʺ равны 0 или 1;

Xʺ выбрана из OR₃₆, SR₃₇, NR₃₈R₃₉, где R₃₆, R₃₇, R₃₈, R₃₉ являются Н или линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 20 атомов углерода, и/или мономером полиэтиленгликоля -(ОСН₂СН₂)_n, R₃₇ необязательно является тиол-блокирующей группой, если t=1, СОХ" образует реакционноспособный сложный эфир, выбранный из N-гидроксисукцинимидных эфиров, N-гидроксифталимидных эфиров, N-гидроксисульфосукцинимидных эфиров, пара-нитрофениловых эфиров, динитрофениловых эфиров, пентафторфениловых эфиров и их производных, причем указанные производные облегчают образование амидной связи;

Yʺ отсутствует или выбрана из О, S, S-S или NR₃₂, где R₃₂ соответствует определению, приведенному выше для R; либо

если Yʺ не является S-S и t=O, Xʺ выбран из малеимидогруппы, галогенацетильной группы или SR₃₇, где R₃₇ соответствует вышеприведенному определению;

Аʺ является аминокислотой, выбранной из глицина, аланина, лейцина, валина, лизина, цитруллина и глутамата, или является полипептидом, содержащим от 2 до 20 аминокислот;

R₂₀, R₂₁, R₂₂, R₂₃, R₂₄, R₂₅, R₂₆ и R₂₇ являются одинаковыми или различными, и являются -Н или линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 5 атомов углерода;

R₂₉ и R₃₀ являются одинаковьши или различными, и являются -Н или алкилом, содержащим от 1 до 5 атомов углерода;

R₃₃ является -Н или линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 12 атомов углерода, мономером полиэтиленгликоля R-(OCH₂CH₂)_n-, либо R₃₃ является -COR₃₄, -CSR₃₄, -SOR₃₄, или -SO₂R₃₄, где R₃₄ является Н или линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 20 атомов углерода, или мономером полиэтиленгликоля -(OCH₂CH₂)_n; и

одна из R₄₀ и R₄₁ является необязательно отрицательно или положительно заряженной функциональной группой, а другая является Н или алкилом, алкенилом, алкинилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода.

[125] Любая из вышеуказанных связывающих групп может присутствовать в любом из соединений, соединений лекарственное вещество-линкер или конъюгатов по изобретению, включая замену связывающих групп любой из формул, описанных здесь.

[126] Термин "аминокислота" относится к природной аминокислоте или неприродной аминокислоте, представленной NH₂-C(R^aa'R^aa)-C(=O)OH, где каждая из R^aa и R^aa' независимо является Н, необязательно замещенным линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, арилом, гетероарилом или гетероциклилом. Термин "аминокислота" также относится к соответствующему остатку, когда с N- и/или С-конца аминокислоты удален один атом водорода, например, -NH-C(R^aa'R^aa)-C(=O)O-.

[127] Термин "катион" относится к иону с положительным зарядом. Катион может быть одновалентным (например, Na⁺ K⁺ и т.д.), двухвалентным (например, Са²⁺, Mg²⁺ и т.д.) или поливалентным (например, Al³⁺ и т.д.). Предпочтительно, катион является одновалентным.

[128] Термин "терапевтически эффективное количество" означает количество активного соединения или конъюгата, вызывающее желательную биологическую реакцию у субъекта. Такая реакция включает облегчение симптомов заболевания или расстройства, подлежащего лечению, предотвращение, ингибирование или задержку рецидива симптома заболевания или самого заболевания, увеличение продолжительности жизни субъекта по сравнению с отсутствием лечения или предотвращение, ингибирование или задержку прогрессирования симптома заболевания или самого заболевания. Определение эффективного количества находится в пределах возможностей специалистов в данной области техники, особенно в свете приведенного здесь подробного описания. Токсичность и терапевтическую эффективность соединения I можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур в культурах клеток и на экспериментальных животных. Эффективное количество соединения или конъюгата по настоящему изобретению или другого терапевтического агента, подлежащего введению субъекту, зависит от стадии, категории и состояния множественной миеломы и характеристик субъекта, например, общего состояния здоровья, возраста, пола, массы тела и переносимости лекарств. Эффективное количество соединения или конъюгата по настоящему изобретению или другого терапевтического агента, подлежащего введению, также зависит от пути введения и дозированной лекарственной формы. Количество и интервал дозировки можно регулировать индивидуально, обеспечивая уровни активного соединения в плазме, достаточные для поддержания желательного терапевтического эффекта.

ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ

[129] Настоящее изобретение направлено на цитотоксические соединения, описанные здесь (например, соединения формул (I), (II), (III) и (IV)). В одном варианте воплощения цитотоксические соединения по настоящему изобретению не включают любые соединения, описанные в US 2010/0203007 (полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки), например, соединения, специально упомянутые в исключениях ниже.

[130] В первом специфическом варианте воплощения настоящее изобретение обеспечивает цитотоксическое соединение, включающее связывающую группу с присоединенной к ней реакционноспособной группой, способную ковалентно присоединять указанное цитотоксическое соединение к агенту, связывающемуся с клетками (СВА), причем указанное цитотоксическое соединение представлено любой из следующих формул (I), (II), (III) или (IV):

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, Х отсутствует, a Y является -Н или линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, а когда она является одинарной связью, Х является -Н, связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой или аминоблокирующей группой; предпочтительно, двойная линия между N и С представляет собой двойную связь;

Y является -Н или уходящей группой, выбранной из -OR, -OCOR', -OCOOR', -OCONR'Rʺ, -NR'Rʺ, -NR'CORʺ, -NR'NR'Rʺ, необязательно замещенным 5- или 6-членным азотсодержащим гетероциклом (например, пиперидином, тетрагидропирролом, пиразолом, морфолином и т.д.), гуанидинием, представленным -NR'(C=NH)NR'Rʺ, аминокислотой или пептидом, представленным -NRCOP', причем Р' является аминокислотой или полипептидом, содержащим от 2 до 20 аминокислотных остатков, -SR, -SOR', -SO₂M, -SO₃M, -OSO₃M, галогеном, цианогруппой и азидной группой, причем М является -Н или катионом, например, Na⁺ или K⁺. Предпочтительно, М является -Н или Na⁺; Предпочтительно, Y выбрана из -SO₃M, -ОН, -ОМе, -OEt или -NHOH. Более предпочтительно, Y является -SO₃M или -ОН; либо

Y является сульфитом (HSO₃, HSO₂ или солью HSO₃^-, SO₃^2- или HSO₂^-, образованной катионом), метабисульфитом (H₂S₂O₅ или солью S₂O₅^2-, образованной катионом), моно-, ди-, три- и тетратиофосфатом (PO₃SH₃, PO₂S₂H₂, POS₃H₂, PS₄H₂ или солью PO₃S^3-, PO₂S₂^3-, POS₄^3- или PS₄^3-, образованной катионом), сложным эфиром тиофосфата (RⁱO)₂PS(ORⁱ), RⁱS-, RⁱSO, RⁱSO₂, RⁱSO₃, тиосульфатом (HS₂O₃ или солью S₂O₃^2-, образованной катионом), дитионитом (HS₂O₄ или солью S₂O₄^2-, образованной катионом), фосфордитиоатом (P(=S)(OR^k')(S)(OH) или его солью, образованной катионом), гидроксамовой кислотой (R^k'C(=O)NOH или солью, образованной катионом), формальдегидсульфоксилатом (HOCH₂SO₂^- или солью HOCH₂SO₂^-, образованной катионом, например, HOCH₂SO₂^-Na⁺) или их смесью, где Rⁱ является линейньш или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, и замещен, по меньшей мере, одним заместителем, выбранным из -N(R^j)₂, -CO₂H, -SO₃H и -РО₃Н; Rⁱ необязательно может быть дополнительно замещен заместителем для алкила, описанным здесь; R^j является линейньш или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода; R^k' является линейньш, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, арилом, гетероциклилом или гетероарилом; предпочтительно, Y является аддуктом бисульфита, гидросульфита или метабисульфита или их солей (например, соли натрия);

R в каждом случае независимо выбрана из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(CH₂CH₂O)_n-R^c, необязательно замещенного арила, содержащего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, или необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

R' и Rʺ являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из -Н, -ОН, -OR, -NHR, -NR₂, -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(CH₂CH₂O)_n-R^c и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

R^c является -Н или замещенным или незамещенным линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, или связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой;

n является целым числом от 1 до 24;

W выбрана из С=0, C=S, CH₂, ВН, SO и SO₂;

X' выбрана из группы, состоящей из -Н, -ОН, аминоблокирующей группы, связывающей группы с присоединенной к ней реакционноспособной группой, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(CH₂CH₂O)_n-R^c, необязательно замещенного арила, содержащего от 6 до 18 атомов углерода (например, фенила), необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р. Предпочтительно, X' является -Н, -ОН, -Me или связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой. Более предпочтительно, X' является -Н;

Y' выбрана из группы, состоящей из -Н, оксогруппы, связывающей группы с присоединенной к ней реакционноспособной группой, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенного 6-18-членного арила, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов. Предпочтительно, Y' выбрана из -Н или оксогруппы. Более предпочтительно, Y' является -Н;

каждая из R₁, R₂, R₃, R₄, R₁', R₂', R₃' и R₄' независимо выбрана из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(OCH₂CH₂)_n-R^c, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH₂], -OR, -NR'Rʺ, -NO₂, -NCO, -NR'CORʺ, -SR, сульфоксида, представленного -SOR', сульфона, представленного -SO₂R', сульфоната -SO₃^-M⁺, сульфата -OSO₃^-M⁺, сульфонамида, представленного -SO₂NR'Rʺ, цианогруппы, азидной группы, -COR', -OCOR', -OCONR'Rʺ и связывающей группы с присоединенной к ней реакционноспособной группой. Предпочтительно, одна из R₂, R₃, R₂' и R₃' является связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой, а остальные являются -Н;

R₆ является -Н, -R, -OR, -SR, -NR'Rʺ, -NO₂, галогеном, связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой, -OR^c или -SR^c, где R^c является -Н, линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода. Предпочтительно, R₆, является -ОМе или -SMe. Еще более предпочтительно, R₆ является -ОМе;

Z и Z' независимо выбраны из -(CH₂)_n'-, -(CH₂)_n'-CR₇R₈-(CH₂)_na'-, (СН₂)_n'-NR₉-(CH₂)_na'-, -(СН₂)_n-O-(СН₂)_na'- и -(CH₂)_n'-S-(CH₂)_na' -;

n' и _na' являются одинаковыми или различными и выбраны из 0, 1, 2 и 3;

R₇ и R₈ являются одинаковыми или различными, и каждая из них независимо выбрана из -Н, -ОН, -SH, -СООН, -NHR', мономера полиэтиленгликоля -(ОСН₂СН₂)_n-, аминокислоты, пептидной единицы, несущей от 2 до 6 аминокислот, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода;

R₉ независимо выбрана из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(ОСН₂СН₂)_n-;

А и А' являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из -O-, оксо (-С(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, - CRR'S-, -N(R₅)- и -CRR'N(R₅)-. Предпочтительно, А и А' являются одинаковыми или различными и выбраны из -О- и -S-. Более предпочтительно, А и А' являются -O-;

R₅ в каждом случае независимо является -Н или необязательно замещенным линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода;

D и D' являются одинаковыми или различными и независимо отсутствуют или выбраны из группы, состоящей из аминокислоты, пептида, несущего от 2 до 6 аминокислот, и мономера полиэтиленгликоля (-ОСН₂СН₂)_n-, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, где алкил, алкенил и алкинил необязательно замещены одним или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или более) заместителей, независимо выбранных из группы, состоящей из галогена, -OR, -NR'CORʺ-SR и-COR';

предпочтительно, D и D' являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода. Более предпочтительно, D и D' являются линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода. Еще более предпочтительно, D и D' являются одинаковыми или различными, и выбраны из линейного алкила, содержащего от 1 до 4 атомов углерода;

L отсутствует, является связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой, мономером полиэтиленгликоля (-ОСНзСН₂)_n-, линейным, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода (например, 1-6 атомов углерода), фенильной группой, 3-18-членным гетероциклическим кольцом или 5-18-членным гетероарильным кольцом, содержащим от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р, где алкил или алкенил необязательно замещены связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой, фенил или гетероциклическое или гетероарильное кольцо могут быть необязательно замещены, причем заместитель может являться связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой.

[131] В некоторых вариантах воплощения Х не является связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой. В некоторых вариантах воплощения двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь, Y не является -H.

[132] В некоторых вариантах воплощения цитотоксические соединения по настоящему изобретению не являются любым из следующих соединений:

[133] В некоторых вариантах воплощения Y является -Н или уходящей группой, выбранной из -OR, -OCOR', -OCOOR', -OCONR'Rʺ, -NR'Rʺ, -NR'CORʺ, -NR'NR'Rʺ, необязательно замещенным 5- или 6-членным азотсодержащим гетероциклом (например, пиперидином, тетрагидропирролом, пиразолом, морфолином и т.д.), гуанидинием, представленным -NR'(C=NH)NR'Rʺ, аминокислотой или пептидом, представленным -NRCOP', причем Р' является аминокислотой или полипептидом, содержащим от 2 до 20 аминокислотных остатков, -SR, -SOR', -SO₂M, -SO₃M, -OSO₃M, галогеном, цианогруппой и азидной группой. Предпочтительно, Y является аддуктом бисульфита натрия, аддуктом гидросульфита натрия или аддуктом метабисульфита натрия. В некоторых вариантах воплощения Y не является -Н.

[134] В некоторых вариантах воплощения L отсутствует или выбрана из необязательно замещенной фенильной группы и необязательно замещенной пиридильной группы, где фенильная и пиридильная группа несет связывающую группу с присоединенной к ней реакционноспособной группой, либо L является аминогруппой, несущей связывающую группу с присоединенной к ней реакционноспособной группой (т.е. -N(связывающая группа)-), либо L является линейным, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода и несущим связывающую группу с присоединенной к ней реакционноспособной группой.

[135] Во втором специфическом варианте воплощения для цитотоксических димеров (I), (II), (III) и (IV) переменные описаны ниже:

двойная линия между N и С представляет собой двойную связь;

Y является -Н;

W является С=0;

R₁, R₂, R₁', R₂', R₄ и R₄' являются -Н;

одна из R₃ или R₃' необязательно является связывающей группой, а другая является

-Н;

R₆ является -ОМе;

Z и Z' являются -СН₂-;

X' является -Н;

Y' является -Н;

А и А' являются -O-; а остальные переменные соответствуют описанию в первом специфическом варианте воплощения.

[136] В третьем специфическом варианте воплощения цитотоксические димеры формулы (I), (II), (III) и (IV) представлены следующими формулами:

где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, Х отсутствует, a Y является -Н, а когда она является одинарной связью, Х выбрана из

-Н, связывающей группы с присоединенной к ней реакционноспособной группой или аминоблокирующей группы (предпочтительно, Х является -Н);

Y выбрана из -Н, -OR, -OCOR', -SR, -NR'Rʺ, -SO₃M, -SO₂M или -OSO₃M, где М является -Н или катионом, например, Na⁺, K⁺. Предпочтительно, Y выбрана из -ОН, -ОМе, -OEt, -NHOH или -SO₃M. Еще более предпочтительно, Y является -ОН или -SO₃M, предпочтительно, М является -Н или Na⁺;

R является -Н, необязательно замещенным линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, или ПЭГ-группой -(CH₂CH₂O)_n-R^c, где n является целым числом от 1 до 24, a R^c является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода;

R' и Rʺ являются одинаковыми или различными и выбраны из -Н, -ОН, -OR, -NRR^g', -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенного арила, содержащего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из О, S, N и Р, ПЭГ-группы -(CH₃CH₂O)_n-R^c, где n является целым числом от 1 до 24, предпочтительно n равен 2, 4 или 8; a R^g' является -Н, необязательно замещенным линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, или ПЭГ-группой (CH₂CH₂O)_n-R^c;

X' выбрана из группы, состоящей из -Н, -ОН, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, фенила и аминоблокирующей группы. Предпочтительно, X' является -Н, -ОН или -Me. Более предпочтительно, X' является -Н;

Y' выбрана из группы, состоящей из -Н, оксогруппы, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода. Предпочтительно, Y' выбрана из -Н или -Me. Более предпочтительно, Y' является -Н;

R₆ является -OR^c или -SR^c, где R^c является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода. Предпочтительно, R₆ является -ОМе или -SMe. Еще более предпочтительно, R₆ является -ОМе;

А и А' выбраны из -О- и -S-. Предпочтительно, А и А' являются -O-;

L', L" и L'" являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(OCH₂CH₂)_n-R^c, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH₂], -OR, -NR'Rʺ, -NO₂, -NR'CORʺ, -SR, сульфоксида, представленного -SOR', сульфона, представленного -SO₂R', сульфоната -SO₃^-M⁺, сульфата -OSO₃⁺M^-, сульфонамида, представленного SO₂NR'Rʺ, цианогруппы, азидной группы, -COR', -OCOR', -OCONR'Rʺ и связывающей группы с присоединенной к ней реакционноспособной группой, при условии, что только одна из L', Lʺ и L'ʺ является связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой; Предпочтительно, L' является связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой. В качестве альтернативы, одна из L', Lʺ или L'ʺ является связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой, в то время как другие являются -Н. Более предпочтительно, L' является связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой, а Lʺ и L'ʺ являются -Н;

G выбрана из -СН- или -N-; а остальные переменные соответствуют описанию в первом специфическом варианте воплощения.

[137] В некоторых вариантах воплощения Х не является связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой. В некоторых вариантах воплощения двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь, Y не является -Н.

[138] В некоторых вариантах воплощения А и А' обе являются -O-, Re является -ОМе, а G является -СН-.

[139] В четвертом специфическом варианте воплощения для цитотоксических димеров

формулы (IA), (НА), (IIIA) или (IVA) L' представлена формулой:

-W'-R^x-V-R^y-J,

где:

W и V являются одинаковыми или различными, и каждая из них независимо отсутствует или выбрана из -CR^eR^e'-, -O-, -O-С(=O)-, -С(=O)-O-, -S-, -SO-, -SO₂-, -CH₂-S-, -CH₂O-, -CH₂NR^e-, -O-(C=O)O-, -О-(С=О)N(R^e)-, -N(R^e)-, -N(R^e)-C(=O)-, -C(=O)-N(R^e)-, -N(R^e)-C(=O)O-, -N(C(=O)R^e)C(=O)-, -N(C(=O)R^e)-, -(O-CH₂-CH₂)_n-, -SS- или -С(=O)- или аминокислоты или пептида, содержащего от 2 до 8 аминокислот;

R^x и R^y являются одинаковыми или различными, и каждая из них независимо отсутствует или является необязательно замещенным линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, арилом, содержащим от 6 до 10 атомов углерода, или 3-8-членным гетероциклическим кольцом, несущим от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из О, N или S;

R^e и R^e' являются одинаковыми или различными и выбраны из -Н, линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k является -Н, линейным, разветвленным, циклическим алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущим вторичную аминогруппу (например, -NHR¹⁰¹) или третичную аминогруппу (-NR¹⁰¹R¹⁰²) или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, например, пиперидин или морфолин, где каждая из R¹⁰¹ и R¹⁰² независимо является линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода. Предпочтительно, каждая из R¹⁰¹ и R¹⁰² независимо является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода;

n является целым числом от 1 до 24; а

j включает реакционноспособную группу, связанную с ней, и выбрана из малеимида, галоацетамидо, -SH, -SSR^d, -CH₂SH, -CH(Me)SH, -C(Me)₂SH, -NHR^c1, -CH_zNHR^c1', -NR^c1NH₂, -COOH и -СОЕ, где -СОЕ является реакционноспособным сложным эфиром, выбранным из N-гидроксисукцинимидным эфиром, N-гидроксисульфосукцинимидным эфиром, нитрофениловым (например, 2- или 4-нитрофениловым) эфиром, динитрофениловым (например, 2,4-динитрофениловым) эфиром, сульфотетрафторфениловым (например, 4-сульфо-2,3,5,6-тетрафторфениловым) эфиром и пентафторфениловым эфиром, но не ограничивающимся ими, a R'¹ является -Н или замещенным или незамещенным линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, а

R^d выбрана из фенила, нитрофенила (например, 2- или 4-нитрофенила), динитрофенила (например, 2- или 4-нитрофенила), карбоксинитрофенила (например, 3-карбокси-4-нитрофенила), пиридила или нитропиридила (например, 4-нитропиридила).

[140] В некоторых вариантах воплощения J является -SH, -SSR'¹, малеимидом или N-гидроксисукцинимидным эфиром.

[141] В некоторых вариантах воплощения R^e' является -Н или -Me; R^e является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода, или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k; n является целым числом от 2 до 8; предпочтительно, R^k является -Н, -Me или -CH₂CH₂-NMe₂, а остальные переменные соответствуют описанию, приведенному выше в четвертом специфическом варианте воплощения.

[142] В некоторых вариантах воплощения V является аминокислотой или пептидом, содержащим от 2 до 8 аминокислот. В некоторых вариантах воплощения V является валин-цитруллином, gly-gly-gly или ala-leu-ala-leu.

[143] В некоторых вариантах воплощения

W' является -O-, -N(R^e)- или -N(R^e)-C(=O)-;

R^e является -Н, линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, или -(СН₂-СН₂-O)_n-R^k;

R^x является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода;

V отсутствует или является -(O-CH₂-CH₂)_n-, -C(=O)-NH-, -S-, -NH-C(=O)-;

R^y отсутствует или является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода; а

J является -SH, -SSR'¹ или -СОЕ (предпочтительно, N-гидроксисукцинимидным эфиром). Остальные переменные соответствуют описанию в четвертом специфическом варианте воплощения.

[144] В некоторых вариантах воплощения

W является -O-, -W)- или -N(R^e)-C(=O)-;

R' является Н, Me или -(СН₂-СН₂-O)_n-Ме;

n является целым числом от 2 до 6;

R^x является линейным или разветвленным алкилом, несущим от 1 до 6 атомов углерода;

V и R^y отсутствуют; а

J является -СОЕ, предпочтительно, N-гидроксисукцинимидным эфиром. Остальные переменные соответствуют описанию в четвертом специфическом варианте воплощения.

[145] В пятом специфическом варианте воплощения L' представлена следующей формулой:

-W'-[CR_1ʺR_2ʺ]_a-V-[Cy]_0-1-[CR_3ʺR_4ʺ]_b-COE,

где:

каждая из R_1ʺ, R_2ʺ и R_3ʺ независимо является -Н или линейным или разветвленным алкилом, несущим от 1 до 4 атомов углерода, предпочтительно -Me;

R_4ʺ является -Н, линейным или разветвленным алкилом, несущим от 1 до 4 атомов углерода (предпочтительно -Me), -SO₃H или SO₃^-M⁺ где М⁺ является фармацевтически приемлемым катионом;

а является целым числом от 0 до 5 (например, от 0 до 2, 3, 4 или 5), a b - целым числом от 0 до 6 (например, от 0 до 3, 4, 5 или 6); а

Cy является необязательно замещенным 5-членным гетероциклическим кольцом, несущим гетероатом N, предпочтительно Cy является

[146] В некоторых вариантах воплощения W' является -N(R^e)-.

[147] В некоторых вариантах воплощения, например, в четвертом и/или пятом специфическом варианте воплощения, R^e является -(СН₂-СН₂-O)_2-6-R^k, где R^k является -Н, линейным, разветвленным, циклическим алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода.

[148] В некоторых вариантах воплощения, например, в четвертом и/или пятом специфическом варианте воплощения, V является -S- или -SS-.

[149] В шестом специфическом варианте воплощения, как и в четвертом и/или пятом специфическом варианте воплощения, L' представлена следующей формулой:

-NR^e-[CR_1ʺR_2ʺ]_a-S-[CR_3ʺR_4ʺ]_b-COE.

[150] В некоторых вариантах воплощения соединение является любым из следующих:

где Y является -Н или -SO₃M, а М является -Н или фармацевтически приемлемым катионом, В некоторых вариантах воплощения Y является -SO₃M.

[151] В седьмом специфическом варианте воплощения, как и в четвертом и/или пятом специфическом варианте воплощения, L' представлена следующей формулой:

-NR^e-[CR_1ʺR_2ʺ]_a-S-Cy-[CR_3ʺR_4ʺ]_b-COE.

[152] В некоторых вариантах воплощения соединение является любым из следующих:

где Y является -Н или -SO₃M, а М является -Н или фармацевтически приемлемым катионом. В некоторых вариантах воплощения Y является -SO₃M.

[153] В восьмом специфическом варианте воплощения цитотоксические димеры формулы (I), (II), (III) и (IV) представлены следующими формулами:

где:

W отсутствует или выбрана из -O-, -N(R^e)-, -N(R^e)-C(=O)-, -N(C(=O)R^e)-, -S- или -CH₂-S-, -CH₂NR^e-;

R^x отсутствует или выбрана из линейного, разветвленного или циклического алкила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода;

R^y является -Н, линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, или -(СН₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k является -H, линейным, разветвленным, циклическим алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущим вторичную аминогруппу (например, -NHR¹⁰¹) или третичную аминогруппу (-NR¹⁰¹R¹⁰²) или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, например, пиперидин или морфолин, где каждая из R¹⁰¹ и R¹⁰² независимо является линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода. Предпочтительно, каждая из R¹⁰¹ и R¹⁰² независимо является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода;

Z^s является -Н, -SR^m;

R^m является R^d или замещенным или незамещенным линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, несущим реакционноспособный сложный эфир, выбранный из N-гидроксисукцинимидных эфиров, N-гидроксифталимидных эфиров, N-гидроксиссульфосукцинимидных эфиров, пара-нитрофениловых эфиров, динитрофениловых эфиров, пентафторфениловых эфиров;

R^d выбрана из фенила, нитрофенила, динитрофенила, карбоксинитрофенила, пиридила или нитропиридила; а

n является целым числом от 1 до 24, а остальные переменные соответствуют описанию, приведенному выше в третьем специфическом варианте воплощения.

[154] Предпочтительно, R^k является -Н или -Me, a n является целым числом от 2 до 8. Предпочтительно, R^x является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода, а остальные переменные соответствуют описанию, приведенному выше в третьем, четвертом и/или пятом специфическом варианте воплощения.

[155] В девятом специфическом варианте воплощения цитотоксические димеры формулы (I), (II), (III) и (IV) представлены следующими формулами:

где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, Х отсутствует, a Y является -Н, а когда она является одинарной связью, Х выбрана из -Н, связывающей группы с присоединенной к ней реакционноспособной группой или аминоблокирующей группы (предпочтительно, Х является -Н или аминоблокирующей группой; более предпочтительно, Х является -Н);

Y выбрана из -Н, -OR, -OCOR', -SR, -NR'Rʺ, -SO₃M, -SO₂M или -OSO₃M (например, Y является -OR, -OCOR', -SR, -NR'Rʺ, -SO₃M, -SO₂M или -OSO₃M), где М является -Н или катионом, например, Na⁺ или K⁺;

R является -Н, необязательно замещенным линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, или ПЭГ-группой -(CH₂CH₂O)_n-R^c, где n является целым числом от 1 до 24, a R^c является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода;

R' и Rʺ являются одинаковыми или различными и выбраны из -Н, -ОН, -OR, -NRR^g', -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенного арила, содержащего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из О, S, N и Р, ПЭГ-группы -(CH₂CH₂O)_n-R_c, где n является целым числом от 1 до 24, предпочтительно n равен 2, 4 или 8; а R^g' является -Н, необязательно замещенным линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, или ПЭГ-группой (CH₂CH₂O)_n-R^c;

X' выбрана из группы, состоящей из -Н, -ОН, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, фенила и аминоблокирующей группы;

Y' выбрана из группы, состоящей из -Н, оксогруппы, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода;

А и А' выбраны из -О- и -S-;

W отсутствует или выбрана из -O-, -N(R^e)-, -N(R^e)-C(=O)-, -N(C(=O)R^e)-, -S- или -CH₂-S-, -CH₂-NR^e-;

R^x отсутствует или выбрана из линейного, разветвленного или циклического алкила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода;

R^e является -Н, линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, или -(СН₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k является -Н, линейным, разветвленным, циклическим алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущим вторичную аминогруппу (например, -NHR¹⁰¹) или третичную аминогруппу (-NR¹⁰¹R¹⁰²) или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, например, пиперидин или морфолин, где каждая из R¹⁰¹ и R¹⁰² независимо является линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода;

G выбрана из -СН- или -N-;

Z^s является -Н или выбрана из любой из следующих формул:

где:

q является целым числом от 1 до 5;

n является целым числом от 2 до 6;

D является -Н или -SO₃M;

М является -В или катионом, например, Na⁺ или K⁺.

[156] В некоторых вариантах воплощения 7^s представлена любой из следующих формул:

[157] В некоторых вариантах воплощения W' является -N(R^e)-.

[158] В некоторых вариантах воплощения R^e является -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k является -Н, линейным, разветвленным, циклическим алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода.

[159] В некоторых вариантах воплощения R^k является -Н или -Me, n равен 4, а q равен 2.

[160] В некоторых вариантах воплощения R^x является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода.

[161] В некоторых вариантах воплощения R^x может являться -(СН₂)_р-(CR^fR^g)-, где каждая из R^f и R^g независимо выбрана из Н или линейного или разветвленного алкила, содержащего от 1 до 4 атомов углерода; а р равен 0, 1, 2 или 3.

[162] В некоторых вариантах воплощения R^f и R^g являются одинаковыми или различными, и выбраны из -Н и -Me; а р равен 1.

[163] В десятом специфическом варианте воплощения для соединений формулы (VIII), (IX), (X) и (XI), описанных в девятом специфическом варианте воплощения, переменные соответствуют описанию, приведенному ниже:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, Х отсутствует, a Y является -Н, а когда она является одинарной связью, Х является -Н; Y является -Н, -ОН или -SO₃M;

М является -Н или фармацевтически приемлемым катионом (например, Na⁺);

X' и Y' обе являются -Н;

А и А' обе являются -O-;

R₆ является -ОМе; а

Rʺ является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода.

[164] В родственном варианте воплощения Y является -ОН или -SO₃M.

[165] В еще одном варианте воплощения соединения формулы (VIII), (IX), (X) и (XI), описанные в девятом специфическом варианте воплощения, переменные соответствуют описанию, приведенному ниже:

W является -O-, -N(R^e)-, -N(R^e)-C(=O)-, -N(COR^e)-, -S- или -CH₂-S-;

R^x отсутствует или выбрана из линейного, разветвленного или циклического алкила, содержащего от 1 до 6 атомов углерода;

R^e является -Н, линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, или -(СН₂-CH₂-O)_n-R, где R^k является -Н, линейным, разветвленным или циклическим алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущим первичную, вторичную или третичную аминогруппу или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, например, пиперидин или морфолин;

n является целым числом от 1 до 24, а остальные переменные соответствуют описанию, приведенному выше в девятом специфическом варианте воплощения.

[166] Предпочтительно, R^k является -Н или -Me, a n является целым числом от 2 до 8. Предпочтительно, R^x является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода.

[167] Предпочтительно, R^x является -(CH₂)_p-(CR^fR^g)-, где каждая из R^f и R⁸ независимо выбрана из Н или линейного или разветвленного алкила, содержащего от 1 до 4 атомов углерода; р равен 0, 1, 2 или 3. Более предпочтительно, R и R⁸ являются одинаковыми или различными и выбраны из -Н и -Me, а р равен 1.

[168] В еще одном предпочтительном варианте воплощения линкер представлен любой формулой, выбранной из формул (а1), (а4), (а5), (а10) и (a11), показанных выше, а остальные переменные соответствуют описанию, приведенному выше в десятом специфическом варианте воплощения.

[169] В одиннадцатом специфическом варианте воплощения для соединений формулы (IB), (IIB), (IIIB) и (IVB), описанных в восьмом специфическом варианте воплощения, переменные соответствуют описанию, приведенному ниже:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, Х отсутствует, a Y является -Н, а когда она является одинарной связью, Х является -Н; Y является -Н, -ОН или -SO₃M (например, Y является -ОН или -SO₃M);

М является -Н или Na⁺;

X' и Y' обе являются -Н;

А и А' обе являются -O-;

R₆ является -ОМе;

R^x является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода, а остальные переменные соответствуют описанию, приведенному выше в третьем, четвертом или пятом специфическом варианте воплощения.

[170] Предпочтительно, R^x является -(СН₂)_р-(CR^fR^g)-, где каждая из R^f и R^g независимо выбрана из Н или линейного или разветвленного алкила, содержащего от 1 до 4 атомов углерода; р равен 0, 1, 2 или 3. Более предпочтительно, R^f и R^g являются одинаковьми или различными и выбраны из -Н и -Me, а р равен 1.

[171] В любом из вышеприведенных специфических вариантов воплощения (например, в специфических вариантах воплощения с первого по 11-й), двойная линия между N и С может представлять собой двойную связь.

[172] В любом из вышеприведенных специфических вариантов воплощения (например, в специфических вариантах воплощения с первого по 11-й), двойная линия между N и С может представлять собой одинарную связь, Х является -Н, связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой, или аминоблокирующей группой (например, Х является -Н или аминоблокирующей группой); а Y выбрана из -Н, -OR, -OCOR', -SR, -NR'Rʺ, необязательно замещенного 5- или 6-членного азотсодержащего гетероцикла, -SO₃M, -SO₂M и сульфата -OSO₃M (например, Y является -OR, -OCOR', -SR, -NR'Rʺ, необязательно замещенным 5- или 6-членным азотсодержащим гетероциклом, -SO₃M, -SO₂M и сульфатом -OSO₃M).

[173] В некоторых вариантах воплощения Y выбрана из -Н, -SO₃M, -ОН, -ОМе, -OEt или -NHOH (например, Y является -SO₃M, -ОН, -ОМе, -OEt или -NHOH).

[174] В некоторых вариантах воплощения Y является -Н, -SO₃M или -ОН (например, Y является -SO₃M или -ОН).

[175] В некоторых вариантах воплощения М является -Н, Na⁺ или K⁺.

[176] В любом из вышеприведенных специфических вариантов воплощения (например, в специфических вариантах воплощения с первого по 11-й) W, если присутствует, является С=O.

[177] В любом из вышеприведенных специфических вариантов воплощения (например, в специфических вариантах воплощения с первого по 11-й) Z и Z', если присутствуют, являются -CH₂.

[178] В любом из вышеприведенных специфических вариантов воплощения (например, в специфических вариантах воплощения с первого по 11-й) X' выбрана из группы, состоящей из -Н, -ОН, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, фенила, связывающей группы с присоединенной к ней реакционноспособной группой, и аминоблокирующей группы.

[179] В некоторых вариантах воплощения, X' является -Н, -ОН, -Me или связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой.

[180] В некоторых вариантах воплощения X' является -Н.

[181] В любом из вышеприведенных специфических вариантов воплощения (например, в специфических вариантах воплощения с первого по 11-й) Y' выбрана из группы, состоящей из -Н, оксогруппы, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода.

[182] В некоторых вариантах воплощения Y' является -Н или оксогруппой.

[183] В некоторых вариантах воплощения Y' является -Н.

[184] В любом из вышеприведенных специфических вариантов воплощения (например, в специфических вариантах воплощения с первого по 11-й) А и А' являются одинаковыми или различными и выбраны из О, S, NR₅ и оксо (С=O). А и А' могут являться одинаковыми или различными и выбраны из -О- и -S-. Предпочтительно, как А, так и А' обе являются -O-.

[185] В любом из вышеприведенных специфических вариантов воплощения (например, в специфических вариантах воплощения с первого по 11-й), D и D', если присутствуют, являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из мономера полиэтиленгликоля (-ОСН₂СН₂)_n, где n является целым числом от 1 до 24, аминокислоты, пептида, несущего от 2 до 6 аминокислот, или линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, где алкил, алкенил и алкинил необязательно замещены одним или более заместителей, независимо выбранных из группы, состоящей из галогена, -OR, -NR'CORʺ, -SR и -COR'. Предпочтительно, D и D' являются линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода.

[186] В двенадцатом варианте воплощения цитотоксическое соединение по настоящему изобретению, соответствующее описанию в первом, третьем и девятом варианте воплощения, представлено следующим:

двойная линия между N и С представляет собой двойную связь;

Y является -Н;

W является С=O;

R₁, R₂, R₁', R₂', R₄ и R₄' являются -Н;

одна из R₃ или R₃' необязательно является связывающей группой с присоединенной к ней реакционноспособной группой, а другая является -Н;

R₆ является -ОМе;

Z и Z' являются -СН₃;

X' является -Н;

Y' является -Н; а

А и А' являются -O-.

[187] В тринадцатом варианте воплощения цитотоксическое соединение по настоящему изобретению является:

или его фармацевтически приемлемой солью.

[188] В одном варианте воплощения соединение 29b можно использовать в способах по настоящему изобретению, описанных здесь. В предпочтительном варианте воплощения соединение 29b можно использовать для лечения пролиферативного расстройства, например, рака.

[189] В еще одном варианте воплощения соединение 29b можно использовать для скрининга линий клеток с целью идентификации линий клеток, чувствительных к бензодиазепиновым соединениям, например, производным бензодиазепина, описанным здесь.

ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И СОЕДИНЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЕ ВЕЩЕСТВО-ЛИНКЕР

[190] Цитотоксические соединения, описанные выше, включают связывающую группу с присоединенной к ней реакционноспособной группой; указанные соединения могут возникать в результате взаимодействия бифункционального сшивающего реагента с "безлинкерными" соединениями с образованием так называемых соединений лекарственное вещество-линкер. В качестве альтернативы, лекарственные соединения, которые в других отношениях идентичны соединениям лекарственное вещество-линкер, но не содержат линкера, также входят в рамки настоящего изобретения.

[191] Так, в некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение обеспечивает цитотоксическое соединение, не содержащее связывающей группы, но, возможно, способное взаимодействовать с бифункциональным сшивающим агентом с образованием соединения по изобретению, например, любого из соединений по вышеописанным специфическим вариантам воплощения с 1-го по 12-й; или с образованием конъюгата с агентом, связывающимся с клетками, по изобретению (например, конъюгата, описанного ниже). Типичное безлинкерное цитотоксическое соединение по настоящему изобретению включает соединение 29b по 13-му специфическому варианту воплощения, описанному выше. Безлинкерные цитотоксические соединения по настоящему изобретению представлены любой из следующих формул (I'), (II'), (III') или (IV):

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, Х отсутствует, a Y является -Н или линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, а когда она является одинарной связью, Х является -Н или аминоблокирующей группой; предпочтительно, двойная линия между N и С представляет собой двойную связь;

Y является -Н или уходящей группой, выбранной из -OR, -OCOR', -OCOOR', -OCONR'Rʺ, -NR'Rʺ, -NR'CORʺ, -NR'NR'Rʺ, необязательно замещенным 5- или 6-членным азотсодержащим гетероциклом (например, пиперидином, тетрагидропирролом, пиразолом, морфолином и т.д.), гуанидинием, представленным -NR'(C=NH)NR'Rʺ, аминокислотой или пептидом, представленным -NRCOP', причем Р' является аминокислотой или полипептидом, содержащим от 2 до 20 аминокислотных остатков, -SR, -SOR', -SO₂M, -SO₃M, -OSO₃M, галогеном, цианогруппой и азидной группой, причем М является -Н или катионом, например, Na⁺ или K⁺. Предпочтительно, М является -Н или Na⁺; Предпочтительно, Y выбрана из -SO₃M, -ОН, -ОМе, -OEt или -NHOH. Более предпочтительно, Y является -SO₃M или -ОН; либо

Y является сульфитом (HSO₃, HSO₂ или солью HSO₃^-, SO₃^2- или HSO₂^-, образованной катионом), метабисульфитом (H₂S₂O₅ или солью S₂O₅^2-, образованной катионом), моно-, ди-, три- и тетратиофосфатом (PO₃SH₃, PO₂S₂H₂, POS₃H₂, PS₄H₂ или солью PO₃S^3-, PO₂S₂^3-, POS₃^3- или PS₄^3-, образованной катионом), сложным эфиром тиофосфата (RⁱO)₂PS(ORⁱ), RⁱS-, RⁱSO, RⁱSO₂, PⁱSO₃, тиосульфатом (HS₂O₃ или солью 820з²ʺ, образованной катионом), дитионитом (HS₂O₄ или солью S₂O₄^2-, образованной катионом), фосфордитиоатом (P(=S)(OR^k')(S)(OH) или его солью, образованной катионом), гидроксамовой кислотой (R^k'C(=O)NOH или солью, образованной катионом), формальдегидсульфоксилатом (HOCH₂SO₂^- или солью HOCH₂SO₂^-, образованной катионом, например, HOCH₂SO₂^-Na⁺) или их смесью, где R' является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, и замещен, по меньшей мере, одним заместителем, выбранным из -N(R^j)₂, -CO₂H, -SO₃H и -РО₃Н;

Rⁱ необязательно может быть дополнительно замещен заместителем для алкила, описанным здесь; R^j является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода; R^k' является линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, арилом, гетероциклилом или гетероарилом; предпочтительно, Y является аддуктом бисульфита, гидросульфита или метабисульфита или их солей (например, соли натрия);

R в каждом случае независимо выбрана из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(CH₂CH₂O)_n-R^c, необязательно замещенного арила, содержащего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, или необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

R' и Rʺ являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из -Н, -ОН, -OR, -NHR, -NR₂, -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(CH₂CH₂O)_n-R^c и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

R^c является -Н или замещенным или незамещенным линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода;

n является целым числом от 1 до 24;

W выбрана из С=O, C-S, CH₂, BH, SO и SO₂;

X' выбрана из группы, состоящей из -Н, -ОН, аминоблокирующей группы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(CH₂CH₂O)_n-R^c, необязательно замещенного арила, содержащего от 6 до 18 атомов углерода (например, фенила), необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р. Предпочтительно, X' является -Н, -ОН или -Me. Более предпочтительно, X' является -Н;

Y' выбрана из группы, состоящей из -Н, оксогруппы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенного 6-18-членного арила, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов. Предпочтительно, Y' выбрана из -Н или оксогруппы. Более предпочтительно, Y' является -Н;

Каждая из R₁, R₂, R₃, R₄, R₁', R₂', R₃' и R₄' независимо выбрана из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(OCH₂CH₂)_n-R^c, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH₂], -OR, -NR'Rʺ, -NO₂, -NCO, -NR'CORʺ, -SR, сульфоксида, представленного -SOR', сульфона, представленного -SO₂R', сульфоната -SO₃^-М⁺, сульфата -OSO₃^-М⁺, сульфонамида, представленного -SO₂NR'Rʺ, цианогруппы, азидной группы, -COR', -OCOR' и -OCONR'Rʺ. Предпочтительно, 1, 2, 3 или все из R₂, R₃, R₂' и R₃' являются -Н;

R₆ является -Н, -R, -OR, -SR, -NR'Rʺ, -NO₂, галогеном, -OR^c или -SR^c, где R^c является -Н, линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода. Предпочтительно, R₆ является -ОМе или -SMe. Еще более предпочтительно, R₆ является -ОМе;

Z и Z' независимо выбраны из -(CH₂)_n'-, -(CH₂)_n'-CR₇R₈-(CH₂)_na'-, -(СН₂)_n'-NR₉-(CH₂)_na'-, -(СН₂)_n'-O-(СН₂)_na'- и -(CH₂)_n'-S-(CH₂)_na'-;

n' и _na' являются одинаковыми или различными и выбраны из 0, 1, 2 и 3;

R₇ и R₈ являются одинаковыми или различными, и каждая из них независимо выбрана из -Н, -ОН, -SH, -СООН, -NHR', мономера полиэтиленгликоля -(ОСН₂СН₂)_n-, аминокислоты, пептидной единицы, несущей от 2 до 6 аминокислот, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода;

R₉ независимо выбрана из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(OCH₂CH₂)_n-;

А и А' являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из -O-, оксо (-С(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, - CRR'S-, -N(R₅)- и -CRR'N(R₅)-. Предпочтительно, А и А' являются одинаковьши или различными и выбраны из -О- и -S-. Более предпочтительно, А и А' являются -O-;

R₅ в каждом случае независимо является -Н или необязательно замещенным линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода;

L', Lʺ и L'ʺ являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из -Н, галогена, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, галоалкила, алкокси, галоалкокси, -NO₂ или -CN;

G выбрана из -СН- или -N-.

[192] В некоторых вариантах воплощения двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь, Y не является -Н.

[193] В некоторых вариантах воплощения двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, Х отсутствует и Y является -Н, а когда она является одинарной связью, Х выбрана из -Н или аминоблокирующей группы (предпочтительно, Х является -Н); W является С=O; R₁, R₂, R₃, R₄, R_1', R_2', R_3' и R_4' являются -Н; Z и Z' являются -СН₂-; как А, так и А' являются -O-; W является -(С=O)-; G является -СН-; R₆ является -Н или необязательно замещенным С1-С10 линейным, С1-С10 разветвленным или С3-С7 циклическим алкилом, -O-алкилом или -O-галоалкилом, например, -ОМе; X' выбрана из группы, состоящей из -Н, -ОН, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, фенила и аминоблокирующей группы; а Y' выбрана из группы, состоящей из -Н, оксогруппы, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода.

[194] Предпочтительно, если Y не является -Н, Y выбрана из -OR, -OCOR', -SR, -NR'Rʺ, -SO₃M, -SO₂M или -OSO₃M, где М является -Н или катионом, например, Na⁺. K⁺. Предпочтительно, Y выбрана из -Н, -ОН, -ОМе, -OEt, -NHOH или -SO₃M (например, Y является -ОН, -ОМе, -OEt, -NHOH или -SO₃M). Еще более предпочтительно, Y является -Н, -ОН или -SO₃M (например, Y является -ОН или -SO₃M), предпочтительно, М является -Н или Na⁺.

[195] В некоторых вариантах воплощения двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, Х отсутствует и Y является -Н, а когда она является одинарной связью, Х выбрана из -Н или аминоблокирующей группы (предпочтительно, Х является -Н); W является С=O; R₁, R₂, R₃, R₄, R_1', R_2', R_3', R_4', X' и Y' являются -Н; Z и Z' являются -СН₂-; как А, так и А' являются -O-; W является -(С=O)-; G является -СН-; R₆ является -Н или необязательно замещенным С1-С10 линейным, С1-С10 разветвленным или С3-С7 циклическим алкилом, -O-алкилом или -O-галоалкилом, например, -ОМе.

[196] Бифункциональные сшивающие агенты могут являться любыми бифункциональными линкерами, известными в данной области техники. Например, бифункциональные линкеры, которые можно использовать для изготовления соединений лекарственное вещество-линкер, являются линкерами, образующими дисульфидные связи, простые тиоэфирные связи, кислотнолабильные связи, фотолабильные связи, пептидазолабильные связи и эстеразолабильные связи с цитотоксическими соединениями (см., например, патенты США 5208020; 5475092; 6441163; 6716821; 6913748; 7276497; 7276499; 7368565; 7388026 и 7414073, включенные в настоящий документ посредством ссылки). Предпочтительно, бифункциональные сшивающие агенты являются агентами, образующими дисульфидные связи, простые тиоэфирные связи и пептидазолабильные связи с цитотоксическими соединениями. Другие бифункциональные сшивающие агенты, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают нерасщепляемые линкеры, например, линкеры, описанные в публикации патента США №2005/0169933, или заряженные линкеры или гидрофильные линкеры и описаны в US 2009/0274713, US 2010/01293140 и WO 2009/134976, каждый из которых специально включен в настоящий документ посредством ссылки. Бифункциональные сшивающие агенты, которые можно использовать для изготовления соединений (лекарственное вещество-линкер) по настоящему изобретению, также включают соединения, описанные в Thermo Scientific Pierce Crosslinking Technical Handbook, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

СИНТЕЗ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

[197] Типичные способы получения цитотоксических димерных соединений по настоящему изобретению показаны на Фиг.1-11. Димеры получили путем взаимодействия мономера с линкерными соединениями, обладающими двумя уходящими группами, например, атомом галогена, трифлатом, мезилатом или тозилатом, например, описанными для синтеза 1 с на Фиг.1. Синтез типичных димеров, несущих тиольную или дисульфидную группу для обеспечения присоединения к агенту, связывающемуся с клетками посредством восстанавливаемых или невосстанавливаемых связей, показан на Фиг.1-5, 7, 8 и 10. На Фиг.1 линкер, содержащий короткую полиэтиленгликолевую группу и алкилдисульфид, получен посредством восстановительного аминирования 1а. Преобразование 1b в соответствующий мезилат и присоединение к мономеру IBD (индолбензодиазепина) позволило получить димер 1с, который восстанавливали до моноимина, преобразовывали в свободную тиольную группу, и присоединяли к 2 с получением соединения 1g по настоящему изобретению. На Фиг.3 получали и присоединяли модифицированную форму мономера IBD с получением димера по настоящему изобретению, в котором восстановленный имин преобразовывали в линкер. На Фиг.4 описан димер, обладающий короткий полиэтиленгликолевой группой и амиддисульфидом, который восстанавливали до тиола 4с и преобразовывали в реакционноспособный сложный эфир. На Фиг.5 описан синтез пиридилдисульфид-содержащего линкера 5е, который преобразовывали в моноиминовый тиол 5i по настоящему изобретению перед преобразованием в реакционноспособный сложный эфир. Синтез типичных димеров, обладающих линкерами, способными взаимодействовать с агентами, связывающимися с клетками, полученных путем преобразования метиловых эфиров в соответствующие реакционноспособные эфиры уходящей группы, например, но не ограничиваясь, N-гидроксисукцинимидные эфиры, N-гидроксифталимидные эфиры, N-гидроксисульфосукцинимидные эфиры, пара-нитрофениловые эфиры, пентафторфениловые эфиры, показан на Фиг.6, 9 и 11.

[198] Типичные способы получения цитотоксических димерных соединений по настоящему изобретению, подходящие для одноэтапного конъюгирования с агентом, связывающимся с клетками, показаны на Фиг.1 и 12-19. Во всех указанных примерах димер, содержащий тиольную группу, подвергают взаимодействию с бифункциональным сшивающим реагентом, обладающим реакционноспособной группой, например, но не ограничиваясь, тиопиридилом, малеимидом, иодидом, бромидом или тозилатом, с одной стороны, и реакционноспособным заместителем, подходящим для взаимодействия с агентом, связывающимся с клетками, например, но не ограничиваясь, N-гидроксисукцинимидными эфирами, N-гидроксифталимидными эфирами, N-гидроксисульфосукцинимидными эфирами, паранитрофениловыми эфирами, пентафторфениловыми эфирами.

[199] Альтернативные способы синтеза для получения типичных цитотоксических димерных соединений по настоящему изобретению показаны на Фиг.20-21. На Фиг.20 синтез моновосстановленного димера (т.е., содержащего одну иминогруппу) осуществляют согласно способу двухэтапного присоединения, при котором восстановленную форму мономера вначале присоединяют к линкеру с последующим присоединением к мономеру IBD, либо получают димер, используя при присоединении к реакционноспособному линкеру смесь как восстановленного мономера, так и мономера IBD. В то время как дивосстановленный димер потенциально является побочным продуктом второго пути синтеза, описанного выше, на Фиг.21 показан более прямой путь, при котором восстановленный мономер непосредственно присоединен к обеим группам линкера.

АГЕНТЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С КЛЕТКАМИ

[200] Эффективность конъюгатов по изобретению в качестве терапевтических агентов зависит от тщательного подбора соответствующего агента, связывающегося с клетками. Агенты, связывающиеся с клетками, могут являться агентами любого типа, известного в настоящее время, или исследуемыми агентами, и включают пептиды и непептидные соединения. В общем случае они могут являться антителами (особенно моноклональными антителами), лимфокинами, гормонами, факторами роста, витаминами (например, фолатом и т.д., способным связываться с рецептором поверхности клеток, например, рецептором фолата), молекулами-переносчиками питательных веществ (например, трансферрином) или любой другой молекулой или веществом, связывающимся с клетками.

[201] В некоторых вариантах воплощения агенты, связывающиеся с клетками, являются белками или полипептидами, или соединениями, включающими белки или полипептиды. Предпочтительно, белки или полипептиды включают один или более остатков Lys с NHz-группами боковой цепи. В качестве альтернативы или дополнения, белки или полипептиды включают один или более остатков Cys. -SH-группы боковой цепи остатков Cys могут являться интактными или могут находиться в составе дисульфидной связи, которую можно восстановить. Предпочтительно, восстановление дисульфидной(ых) связи(ей) не оказывает существенного отрицательного влияния на функцию связывания с клетками белков или полипептидов (например, в случае антитела или его антиген-связывающего фрагмента восстановление дисульфидных связей не приводит к существенному усилению диссоциации легких цепей/тяжелых цепей).

[202] -NH₂-группы боковой цепи Lys и/или -SH-группы боковой цепи Cys могут быть ковалентно соединены с линкерами, которые, в свою очередь, соединены с димерными соединениями по изобретению, тем самым осуществляя конъюгирование агентов, связывающихся с клетками, с димерными соединениями по изобретению. Каждые белковые агенты, связывающиеся с клетками, могут содержать несколько -NH₂-групп боковых цепей Lys и/или -SH-групп боковой цепи Cys, доступных для связывания соединения по изобретению посредством бифункциональных сшивающих агентов.

[203] В частности, примеры агентов, связывающихся с клетками, которые можно использовать, включают:

поликлональные антитела;

моноклональные антитела;

фрагменты антител, например. Fab, Fab' и F(ab')₂, Fv, минитела, диатела, тритела, тетратела (Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983); Spring et ей. J. Immunol. 113:470-478 (1974); Nisonoff et al. Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244 (1960), Kirn et al., Mol, Cancer Ther., 7: 2486-2497 (2008), Carter, Nature Revs., 6: 343-357 (2006));

интерфероны (например α, β, γ);

лимфокины, например, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6;

гормоны, например, инсулин, TRH (тиреотропин-рилизинг-гормон), МСГ (меланотропин), стероидные гормоны, например, андрогены и эстрогены;

факторы роста и колониестимулирующие факторы, например, ЭФР, ТФР-альфа, FGF, ФРЭС, ГКСФ, МКСФ и ГМ-КСФ (Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984));

трансферрин (O'Keefe et al. J. Biol. Chem. 260:932-937 (1985));

витамины, например, фолат;

белковые каркасные структуры на основе консенсусной последовательности повторов фибронектина III типа (FN3) (также известных как Centyrins; см. публикацию патента США 2010/0255056, включенную в настоящий документ посредством ссылки);

сконструированные белки с анкириновым повтором (DARPin; заявки на патент США под номерами 20040132028; 20090082274; 20110118146; 20110224100, включенные в настоящий документ посредством ссылки), С. Zahnd et al. 2010, Cancer Res., 70; 1595-1605, включенная в настоящий документ посредством ссылки); и

каркасные белки домена фибронектина (аднектины: заявки на патент США под номерами 20070082365; 20080139791, включенные в настоящий документ посредством ссылки).

[204] Методики моноклональных антител обеспечивают продукцию чрезвычайно специфических агентов, связывающихся с клетками, в виде специфических моноклональных антител. Особенно хорошо известны в данной области техники методики создания моноклональных антител, продуцируемых путем иммунизации мышей, крыс, хомяков или любого другого млекопитающего представляющим интерес антигеном, например, интактной клеткой-мишенью, антигенами, выделенными из клетки-мишени, цельным вирусом, ослабленным цельным вирусом и вирусными белками, например, белками оболочки вируса. Кроме того, можно использовать сенсибилизированные клетки человека. Еще одним способом создания моноклональных антител является использование фаговых библиотек scFv (одноцепочечных вариабельных областей), в частности, scFv человека (см., например, Griffiths et al., патенты США под номерами 5885793 и 5969108; McCafferty et al., WO 92/01047; Liming et al., WO 99/06587). Кроме того, можно использовать антитела с модифицированной поверхностью, описанные в патенте США №5639641, а также химерные и гуманизированные антитела. Выбор подходящего агента, связывающегося с клетками, зависит от конкретной популяции клеток, являющейся потенциальной мишенью, однако в целом предпочтительны моноклональные антитела человека, если доступно соответствующее антитело.

[205] Например, моноклональное антитело MY9 является IgG1-антителом мыши, специфически связывающимся с антигеном CD33 {J.D. Griffin et al 8 Leukemia Res., 521 (1984)} и может использоваться, если клетки-мишени экспрессируют CD33, как при остром миелобластном лейкозе (ОМЛ). Агент, связывающий клетки, может являться любым соединением, способным связывать клетку специфическим или неспецифическим образом. Как правило, указанные агенты могут являться антителами (в частности, моноклональными антителами и фрагментами антител), интерферонами, лимфокинами, гормонами, факторами роста, витаминами, транспортными молекулами питательных веществ (например, трансферрином) или любой другой молекулой или веществом, связывающимся с клетками.

[206] Если агент, связывающийся с клетками, является антителом, он связывается с антигеном, который является полипептидом и может являться трансмембранной молекулой (например, рецептором) или лигандом, например, фактором роста. Типичные антигены включают такие молекулы, как ренин; гормон роста, включая гормон роста человека и бычий гормон роста; рилизинг-фактор гормона роста; паратиреоидный гормон; тиреотропный гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; А-цепь инсулина; В-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, например, фактор vmc, фактор IX, тканевый фактор (TF) и фактор Виллебранда; антикоагулянты, например, протеин С; предсердный натрийуретический фактор; сурфактант легких; активатор плазминогена, например, урокиназу мочи человека или тканевый активатор плазминогена (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; факторы некроза опухолей-альфа и -бета; энкефалиназу; RANTES (хемокин, экспрессируемый и выделяемый Т-клетками при активации); макрофагальный белок воспаления человека (MIP-1-альфа); сывороточный альбумин, например, человеческий сывороточный альбумин; мюллерову ингибирующую субстанцию; А-цепь релаксина; В-цепь релаксина; прорелаксин; пептид, связанный с гонадотропином мыши; микробный белок, например, бета-лактамазу; ДНКазу; IgE; антиген, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA), например, CTLA-4; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС); рецепторы гормонов или факторов роста; белок А или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, например, нейротрофический фактор костей (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5, или NT-6) или фактор роста нервов, например, NGF-β; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, например, aFGF и bFGF; рецептор 2 фактора роста фибробластов (FGFR2); эпидермальный фактор роста (ЭФР); трансформирующий ростовой фактор (ТРФ), например, ТРФ-альфа и ТРФ-бета, включая ТРФ-β1, ТРФ-β2, ТРФ-β3, ТРФ-β4 или ТРФ-β5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (ИФР-I и ИФР-II); дез(1-3)-ИФР-I (ИФР-I головного мозга); белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста, меланотрансферрин, ЕрСАМ, GD3, FLT3, PSMA, PSCA, MUC1, MUC16, STEAP, СЕА, TENB2, рецепторы EphA, рецепторы EphB, рецептор фолата, FOLR1, мезотелин, cripto, альфаубетаб, интегрины, ФРЭС, VEGFR, EGFR, рецептор трансферрина, IRTA1, IRTA2, IRTA3, IRTA4, IRTA5; CD-белки, такие как CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80. CD81, СОЮЗ, CDIOS, CD134, CD137, CD138, CD152 или антитело, связывающееся с одним или более опухоль-ассоциированных антигенов или рецепторов поверхности клеток, описанные в публикации патента США №20080171040 или публикации патента США №20080305044 и полностью включенные посредством ссылки; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (КМБ); интерферон, например, интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (КСФ), например, МКСФ, ГМ-КСФ и ГКСФ; интерлейкины (IL), например, от IL-1 до IL-10; супероксиддисмутазу; Т-клеточные рецепторы; поверхностные белки мембран; стимулятор гемолиза (DAF-фактор); вирусный антиген, например, фрагмент оболочки ВИЧ; транспортные белки; "хоминг"-рецепторы; адрессины; регуляторные белки; интегрины, например, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM; опухоль-ассоциированный антиген, например, рецептор HER2, HER3 или HER4; эндоглин, c-Met, c-kit, 1GF1R, PSGR, NGEP, PSMA, PSCA, LGR5, B7H4 и фрагменты любого из вышеперечисленных полипептидов.

[207] Кроме того, ГМ-КСФ, связывающийся с миелоидными клетками, можно использовать в качестве агента, связывающего больные клетки при остром миелолейкозе. IL-2, связывающийся с активированными Т-клетками, можно использовать для профилактики отторжения трансплантата, для лечения и профилактики реакции трансплантат против хозяина, а также для лечения острого Т-клеточного лейкоза. МСГ, связывающийся с меланоцитами, можно использовать для лечения меланомы, как и антитела против меланомы. Фолиевую кислоту можно использовать для направленного воздействия на рецептор фолата, экспрессирумый опухолями яичников и другими опухолями. Эпидермальный фактор роста можно использовать для направленного воздействия на виды плоскоклеточного рака, например, рак легких, и головы и шеи. Соматостатин можно использовать для направленного воздействия на нейробластому и другие типы опухолей.

[208] Рак молочной железы и яичек может являться мишенью эстрогена (или аналогов эстрогена) или андрогена (или аналогов андрогена), соответственно, используемых в качестве агентов, связывающихся с клетками.

[209] В одном варианте воплощения агент, связывающийся с клетками, является гуманизированными моноклональными антителами. В еще одном варианте воплощения агент, связывающийся с клетками, является huMy9-6 или другими родственными антителами, описанными в патентах США под номерами 7342110 и 7557189 (включенных в настоящее описание посредством ссылки). В еще одном варианте воплощения агент, связывающийся с клетками, является антителом против рецептора фолата, описанным в предварительных заявках США под номерами 61/307797, 61/346595, 61/413172 и заявке на патент США №13/033723 (опубликованной как US 2012-0009181 А1). Содержание всех указанных заявок полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

[210] В некоторых вариантах воплощения агент, связывающийся с клетками, может являться моноклональным антителом или его антиген-связывающими фрагментами, критическими для связывания антигена с антителом, описанных здесь, например, huMy9-6 или родственных ему антител, описанных в патентах США под номерами 7342110 и 7557189 (включенных в настоящий документ посредством ссылки). Указанные производные антител могут содержать практически одинаковые или идентичные (1) CDR3-области легкую цепь и/или тяжелой цепи; (2) CDR1, CDR2 и CDR3-области легкой цепи и/или тяжелой цепи; или (3) области легкой цепи и/или тяжелой цепи, по сравнению с антителом, описанным здесь. Последовательности в пределах этих областей могут содержать консервативные аминокислотные замены, в том числе замены внутри CDR-областей. Предпочтительно, чтобы было не более 1, 2, 3, 4 или 5 консервативных замен. В некоторых вариантах воплощения производные антител содержат область легкой цепи и/или область тяжелой цепи, по меньшей мере, на 90%, 95%, 99% или 100% идентичные антителу, описанному здесь. Указанные производные антител могут обладать практически аналогичной специфичностью связывания и/или сродством к антигену-мишени по сравнению с антителом, описанным здесь. Предпочтительно, значения K_d и/или k_off производных антител находятся в пределах 10-кратных (выше или ниже), 5-кратных (выше или ниже), 3-кратных (выше или ниже), либо 2-кратных (выше или ниже) значений для антител, описанных здесь. Указанные производные антител могут являться полностью человеческими антителами или гуманизированными антителами, или химерными антителами. Производные антител можно получить любым из способов, известных в данной области техники.

[211] В одном варианте воплощения антитело против рецептора является гуманизированным антителом или его антиген-связывающим фрагментом, специфически связывающим рецептор 1 фолата человека, причем указанное антитело включает: (а) CDR1 тяжелой цепи, включающий GYFMN (SEQ ID NO:1); CDR2 тяжелой цепи, включающий RIHPYDGDTFYNQXaa₁FXaa₂Xaa₃ (SEQ ID NO:2); и CDR3 тяжелой цепи, включающий YDGSRAMDY (SEQ ID NO:3) и (б) CDR1 легкой цепи, включающий KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO:4), CDR2 легкой цепи, включающий RASNLEA (SEQ ID NO:5); и CDR3 легкой цепи, включающий QQSREYPYT (SEQ ID NO:6); где Xaa₁ выбрана из К, Q, И, и R; Хаа₂ выбрана из Q, Н, N и R; а Хаа₃ выбрана из G, Е, Т, S, А и V. Предпочтительно, последовательность CDR2 тяжелой цепи включает RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO:7).

[212] В еще одном варианте воплощения антитело против рецептора фолата является гуманизированым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, специфически связывающим рецептор 1 фолата человека, включающим тяжелую цепь, обладающую аминокислотной последовательностью:

QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDT

FYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVT

VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL

QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL

LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP

PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV

DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:8).

[213] В еще одном варианте воплощения антитело против рецептора фолата является гуманизированым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, кодируемым плазмидной ДНК, депонированной в АТСС 7 апреля 2010 года и имеющей номера депонирования АТСС РТА-10772 и РТА-10773 или 10774.

[214] В еще одном варианте воплощения антитело против рецептора фолата является гуманизированым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, специфически связывающим рецептор 1 фолата человека, включающим легкую цепь, обладающую аминокислотной последовательностью

DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEA

GVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVF

IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:9); или

DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEA

GVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFI

FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS

STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:10).

[215] В еще одном варианте воплощения антитело против рецептора фолата является гуманизированым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, специфически связывающим рецептор 1 фолата человека, включающим тяжелую цепь, обладающую аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, и легкую цепь, обладающую аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10. Предпочтительно, антитело включает тяжелую цепь, обладающую аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, и легкую цепь, обладающую аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10 (hu FOLR1).

[216] В еще одном варианте воплощения антитело против рецептора фолата является гуманизированым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, кодируемым плазмидной ДНК, депонированной в АТСС 7 апреля 2010 года и имеющей номера депонирования АТСС РТА-10772 и РТА-10773 или 10774.

[217] В еще одном варианте воплощения антитело против рецептора фолата является гуманизированным антителом или его антиген-связывающим фрагментом, включающим вариабельный домен тяжелой цепи, по меньшей мере, приблизительно на 90%, 95%, 99% или 100% идентичный QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO:11), и вариабельный домен легкой цепи, по меньшей мере, приблизительно на 90%, 95%, 99% или 100% идентичный DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEA GVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO:12); или DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO:13).

КОНЪЮГАТЫ "АГЕНТ, СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С КЛЕТКАМИ - ЛЕКАРСТВЕННОЕ ВЕЩЕСТВО"

[218] Настоящее изобретение также обеспечивает конъюгаты связывающийся с клетками агент/лекарственное вещество, включающие агент, связывающийся с клетками, присоединенный к одному или более цитотоксических соединений по настоящему изобретению с помощью различных линкеров, включая дисульфидные линкеры, простые тиоэфирные линкеры, линкеры на основе амидных связей, пептидазолабильные линкеры, кислотолабильные линкеры, эстеразолабильные линкеры, но не ограничиваясь ими.

[219] Типичные конъюгаты по изобретению, являются конъюгатами антитело/цитотоксическое соединение, фрагмент антитела/цитотоксическое соединение, эпидермальный фактор роста (ЭФР)/цитотоксическое соединение, меланотропин (МСГ)/цитотоксическое соединение, тиреотропин (ТТГ)/цитотоксическое соединение, соматостатин/цитотоксическое соединение, фолат/цитотоксическое соединение, эстроген/цитотоксическое соединение, аналог эстрогена/цитотоксическое соединение, андроген/цитотоксическое соединение и аналог андрогена/цитотоксическое соединение. Типичный конъюгат фолат/цитотоксическое соединение, содержащий необязательный аддукт -SO₃^-Na⁺ при иминной связи одного из двух мономеров лекарственного вещества, изображен ниже. Типичная схема синтеза указанного конъюгата показана на Фигуре 54.

коньюгат фолат/цитотоксическое соединение

[220] В предпочтительном варианте воплощения настоящее изобретение обеспечивает конъюгаты, включающие индолинбензодиазепиновое димерное соединение (например, соединения формул (I)-(IV), (IA)-(IVA) и (IB)-(IVB)) и агент, связывающийся с клетками, соединенные посредством ковалентной связи. Линкер может расщепляться в области опухоли/нежелательных пролиферирующих клеток, доставляя цитотоксический агент к его мишени различными путями. Линкер может расщепляться, например, при низком рН (гидразон), в восстанавливающей среде (дисульфид), путем протеолиза (амидная/пептидная связь) или путем ферментативной реакции (эстеразной/гликозидазной).

[221] В предпочтительном аспекте типичные цитотоксические конъюгаты по изобретению являются конъюгатами антитело/индолинбензодиазепиновое димерное соединение, фрагмент антитела/индолинбензодиазепиновое димерное соединение, эпидермальный фактор роста (ЭФР)/индолинбензодиазепиновое димерное соединение, меланотропин (МСГ)/индолинбензодиазепиновое димерное соединение, тиреотропин (ТТГ)/индолинбензодиазепиновое димерное соединение, соматостатин/индолинбензодиазепиновое димерное соединение, фолат/индолинбензодиазепиновое димерное соединение, эстроген/индолинбензодиазепиновое димерное соединение, аналог эстрогена/индолинбензодиазепиновое димерное соединение, ингибитор простатоспецифического мембранного антигена (PSMA)/индолинбензодиазепиновое димерное соединение, ингибитор матриптазы/индолинбензодиазепиновое димерное соединение, сконструированные белки с анкириновыми повторами (DARPin)/индолинбензодиазепиновое димерное соединение, андроген/индолинбензодиазепиновое димерное соединение и аналог андрогена/индолинбензодиазепиновое димерное соединение.

[222] Так, в четырнадцатом специфическом варианте воплощения настоящее изобретение обеспечивает конъюгат, включающий: цитотоксическое соединение и агент, связывающийся с клетками (СВА), причем указанное цитотоксическое соединение включает связывающую группу, ковалентно присоединяющую цитотоксическое соединение к СВА, и указанное цитотоксическое соединение представлено любой из следующих формул:

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, Х отсутствует, a Y является -Н или линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, а когда она является одинарной связью, Х является -Н, связывающей группой или аминоблокирующей группой;

Y является -Н или уходящей группой, выбранной из -OR, -OCOR', -OCOOR', -OCONR'Rʺ, -NR'Rʺ, -NR'CORʺ, -NR'NR'Rʺ, необязательно замещенным 5- или 6-членным азотсодержащим гетероциклом (например, пиперидином, тетрагидропирролом, пиразолом, морфолином), гуанидинием, представленным -NR'(C=NH)NR'Rʺ, аминокислотой или пептидом, представленным -NRCOP', причем Р' является аминокислотой или полипептидом, содержащим от 2 до 20 аминокислотных остатков, -SR, -SOR', -SO₂M, -SO₃M, -OSO₃M, галогеном, цианогруппой и азидной группой; или

Y является сульфитом (HSO₃, HSO₂ или солью HSO₃^-, SO₃^2- или HSO₂^-, образованной катионом), метабисульфитом (H₂S₂O₅ или солью S₂O₅^2-, образованной катионом), моно-, ди-, три- и тетратиофосфатом (PO₃SH₃, PO₂S₂H₂, POS₃H₂, PS₄H₂ или солью PO₃S^3-, PO₂S₂^3-, POS₃^3- или PS₄^3-, образованной катионом), сложным эфиром тиофосфата (RiO)₂PS(ORⁱ), RⁱS-, RⁱSO, RⁱSO₂, RⁱSO₃, тиосульфатом (HS₂O₄ или солью 820з²', образованной катионом), дитионитом (HS₂O₄ или солью S₂O₄^2-, образованной катионом), фосфордитиоатом (P(=S)(OR^k')(S)(OH) или его солью, образованной катионом), гидроксамовой кислотой (R^k'C(=O)NOH или солью, образованной катионом), формальдегидсульфоксилатом (HOCH₂SO₂^- или солью HOCH₂SO₂^-, образованной катионом, например, HOCH₂SO₂^-Na⁺) или их смесью, где R' является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, и замещен, по меньшей мере, одним заместителем, выбранным из -N(R^j)₂, -CO₂H, -SO₃H и -РО₃Н; Rⁱ необязательно может быть дополнительно замещен заместителем для алкила, описанным здесь; R^j является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода; R^k' является линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, арилом, гетероциклилом или гетероарилом; предпочтительно, Y является аддуктом бисульфита, гидросульфита или метабисульфита или их солей (например, соли натрия);

М является -Н или катионом;

R в каждом случае независимо выбрана из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(CH₂CH₂O)_n-R^c, необязательно замещенного арила, содержащего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, или необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

каждая из R' и Rʺ независимо выбрана из -Н, -ОН, -OR, -NHR, -NR₂, -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(CH₂CH₂O)_n-R^c и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

R^c является -Н или замещенным или незамещенным линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода или связывающей группой;

n является целым числом от 1 до 24;

W выбрана из С=0, C=S, СН₂, ВН, SO и SO₂;

X' выбрана из -Н, аминоблокирующей группы, связывающей группы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(CH₂CH₂O)_nR^c, необязательно замещенного арила, содержащего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

Y' выбрана из -Н, оксогруппы, связывающей группы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенного 6-18-членного арила, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов;

каждая из R₁, R₂, R₃, R₄, R₁', R₂', R₃' и R₄' независимо выбрана из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(OCH₂CH₂)_n-R^c, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH₂], -OR, -NR'Rʺ, -NO₂, -NCO, -NR'CORʺ, -SR, сульфоксида, представленного -SOR', сульфона, представленного -SO₂R', сульфоната -SO₃^-M⁺, сульфата -OSO₃^-M⁺, сульфонамида, представленного -SO₂NR'Rʺ, цианогруппы, азидной группы, -COR', -OCOR', -OCONR'Rʺ и связывающей группы;

R₆ является -Н, -R, -OR, -SR, -NR'Rʺ, -NO₂, галогеном или связывающей группой;

Z и Z' независимо выбраны из -(CH₂)_n'-, -(CH₂)_n'-CR₇R₈-(CH₂)_na'-, -(СН₂)_n'-NR₉-(CH₂)_na'-, -(СН₂)_n-O-(СН₂)_na'- и -(CH₂)_n'-S-(CH₂)_na'-;

n' и _na' являются одинаковыми или различными и выбраны из 0, 1, 2 и 3;

R₇ и R₈ являются одинаковыми или различными, и каждая из них независимо выбрана из -Н, -ОН, -SH, -СООН, -NHR', мономера полиэтиленгликоля -(ОСН₂СН₂)_n-, аминокислоты, пептидной единицы, несущей от 2 до 6 аминокислот, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода;

R₉ независимо выбрана из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(ОСН₂СН₂)_n-;

А и А' являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из -O-, оксо (-С(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -NR₅- и -CRR'N(R₅)-;

R₅ в каждом случае независимо является -Н или необязательно замещенным линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода;

D и D' являются одинаковыми или различными и независимо отсутствуют или выбраны из группы, состоящей из необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, аминокислоты, пептида, несущего от 2 до 6 аминокислот, и мономера полиэтиленгликоля (-ОСН₂СН₂)_n-;

L отсутствует, является связывающей группой, мономером полиэтиленгликоля (-ОСН₂СН₂)_n-, линейным, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, фенильной группой, 3-18-членным гетероциклическим кольцом или 5-18-членным гетероарильным кольцом, содержащим от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р, где алкил или алкенил необязательно замещены связывающей группой; фенил или гетероциклическое или гетероарильное кольцо могут быть необязательно замещены, причем заместитель может являться связывающей группой.

[223] В некоторых вариантах воплощения Х не является связывающей группой. В некоторых вариантах воплощения двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь, Y не является -Н.

[224] В некоторых вариантах воплощения Y является уходящей группой, выбранной из -OR, -OCOR', -OCOOR', -OCONR'Rʺ, -NR'Rʺ, -NR'CORʺ, -NR'NR'Rʺ, необязательно замещенным 5- или 6-членным азотсодержащим гетероциклом (например, пиперидином, тетрагидропирролом, пиразолом, морфолином и т.д.), гуанидинием, представленным -NR'(C=NH)NR'Rʺ, аминокислотой или пептидом, представленным -NRCOP', причем Р' является аминокислотой или полипептидом, содержащим от 2 до 20 аминокислотных остатков, -SR, -SOR', -SO₂M, -SO₃M, -OSO₃M, галогеном, цианогруппой и азидной группой.

[225] В некоторых вариантах воплощения соединение не является любым из следующих соединений:

[226] В некоторых вариантах воплощения конъюгаты по изобретению включают:

где:

СВА является агентом, связывающимся с клетками, г является целым числом от 1 до 10, Y является -Н, аддуктом бисульфита, гидросульфита или метабисульфита или их солей, или -SO₃M, а М является -Н или фармацевтически приемлемым катионом.

[227] В некоторых вариантах воплощения L отсутствует или выбрана из необязательно замещенной фенильной группы и необязательно замещенной пиридильной группы, где фенильная и пиридильная группа несет связывающую группу, либо L является аминогруппой, несущей связывающую группу (т.е. -N(связывающая группа)-), либо L является линейным, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода и несущим связывающую группу.

[228] В пятнадцатом специфическом варианте воплощения соединение представлено любой из следующих формул:

где:

L', Lʺ и L'ʺ являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, мономера полиэтиленгликоля -(OCH₂CH₂)_n-R^c, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH₂], -OR, -NR'Rʺ, -NO₂, -NR'CORʺ, -SR, сульфоксида, представленного -SOR', сульфона, представленного -SO₂R', сульфоната -SO₃M, сульфата -OSO₃M, сульфонамида, представленного -SO₂NR'Rʺ, цианогруппы, азидной группы, -COR', -OCOR', -OCONR'Rʺ и связывающей группы, при условии, что только одна из L', Lʺ и L'ʺ является связывающей группой; а

G выбрана из -СН- или -N-. Остальные группы соответствуют описанию, приведенному выше в четырнадцатом специфическом варианте воплощения.

[229] В некоторых вариантах воплощения одна из L', Lʺ или L'ʺ является связывающей группой, а другие являются -Н. Предпочтительно, L' является связывающей группой, а Lʺ и L'ʺ являются -Н.

[230] В некоторых вариантах воплощения А и А' обе являются -O-, R₆ является -ОМе, а G является -СН-.

[231] В шестнадцатом специфическом варианте воплощения L' представлена следующей формулой:

-W'-R^x-V-R^y-J, где:

W' и V являются одинаковыми или различными, и каждая из них независимо отсутствует или выбрана из -CR^eC^e'-, -O-, -O-С(=O)-, -С(=O)-O-, -S-, -SO-, -SO₂-, -CH₂-S-, -CH₂O-, -CH₂NR^e-, -O-(С=O)O-, -O-(C=O)N(R^e)-, -N(R^e)-, -N(R^e)-C(=O)-, -C(=O)-N(R^e)-, -N(R^e)-C(=O)O-, -N(С(=O)R^e)C(=O)-, -N(C(=O)R^e')-, -(O-CH₂-CH₂)_n-, -SS- или -С(=O)- или аминокислоты или пептида, содержащего от 2 до 8 аминокислот;

R^x и R^y являются одинаковыми или различными, и каждая из них независимо отсутствует или является необязательно замещенным линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, арилом, содержащим от 6 до 10 атомов углерода, или 3-8-членным гетероциклическим кольцом, несущим от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из О, N или S;

R^e и R^e' являются одинаковыми или различными и выбраны из -Н, линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k является -Н, линейным, разветвленным, циклическим алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущим вторичную аминогруппу (например, -NHR¹⁰¹) или третичную аминогруппу (-NR¹⁰¹R¹⁰²) или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, например, пиперидин или морфолин, где каждая из R¹⁰¹ и R¹⁰² независимо является линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода; предпочтительно, каждая R¹⁰¹ и R¹⁰² независимо является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода;

n является целым числом от 1 до 24; а

J ковалентно связана с СВА и выбрана из сукцинимида, ацетамидо, -S-, -SS-, -CH₂S-, -CH(Me)S-, -C(Me)₂S-, -NR^c1-, -CH₂NR^c1-, -NR^c1N- и -С(=O)-, где R^c1 является -Н или замещенным или незамещенным линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода.

[232] В некоторых вариантах воплощения J является -S-, -SS-, сукцинимидом или -С(=O)-.

[233] В некоторых вариантах воплощения R^e' является -Н или -Me; R^e является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода, или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k; n является целым числом от 2 до 8; R^k является -Н, -Me или -СН₂СН₂-NMe₂, а остальные переменные соответствуют описанию, приведенному выше в пятнадцатом специфическом варианте воплощения.

[234] В некоторых вариантах воплощения V является аминокислотой или пептидом, содержащим от 2 до 8 аминокислот.

[235] В некоторых вариантах воплощения V является валин-цитруллином, gly-gly-gly или ala-leu-ala-leu.

[236] В некоторых вариантах воплощения

W' является -O-, -N(R^e)- или -N(R^e)-C(=O)-;

R^e является -Н, линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k;

R^x является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода;

V отсутствует или является -(O-CH₂-CH₂)_n-, -C(=O)-NH-, -S-, -NH-C(=O)-;

R^y отсутствует или является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода; а

J является -S-, -SS- или -С(=O)-, а остальные группы соответствуют определению в шестнадцатом специфическом варианте воплощения.

[237] В некоторых вариантах воплощения

W' является -O-, -N(R^e)- или -N(R^e)-C(=O)-;

R^e является -Н, -Me или -(CH₂-CH₂-O)_n-Me;

n является целым числом от 2 до 6;

R^x является линейным или разветвленным алкилом, несущим от 1 до 6 атомов углерода;

V и R^y отсутствуют; а

J является -С(=O)-. Остальные группы соответствуют определению в шестнадцатом специфическом варианте воплощения.

[238] В семнадцатом специфическом варианте воплощения L' из шестнадцатого специфического варианта воплощения представлена следующей формулой:

-W'-[CR_1ʺ-R_2ʺ]_a-V-[Cy]_0-1-[CR_3ʺR_4ʺ]_b-C(=O)-,

где:

каждая из R_1ʺ, R_2ʺ и R_3ʺ независимо является -Н или линейным или разветвленным алкилом, несущим от 1 до 4 атомов углерода, предпочтительно -Me;

R_4ʺ является -Н, линейным или разветвленным алкилом, несущим от 1 до 4 атомов углерода (предпочтительно -Me), -SO₃H или -SO₃^-M⁺, где M⁺ является фармацевтически приемлемым катионом;

а является целыми числами от 0 до 5 (например, от 0 до 2, 3, 4 или 5), a b - целым числом от 0 до 6 (например, от 0 до 3, 4, 5 или 6); а

Cy является необязательно замещенным 5-членным гетероциклическим кольцом, несущим гетероатом N, предпочтительно Cy является

[239] В некоторых вариантах воплощения, например, в шестнадцатом или семнадцатом специфическом варианте воплощения, W' является -N(R^e)-.

[240] В некоторых вариантах воплощения, например, в шестнадцатом или семнадцатом специфическом варианте воплощения, R^e является -(CH₂-CH₂-O)_2-6-R^k, где R^k' является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода.

[241] В некоторых вариантах воплощения, например, в шестнадцатом или семнадцатом специфическом варианте воплощения, V является -S- или -SS-.

[242] В восемнадцатом специфическом варианте воплощения, L' из шестнадцатого или семнадцатого специфического варианта воплощения представлена следующей формулой:

-NR^e-[CR_1ʺR_2ʺ]_a-S-[CR_3ʺR_4ʺ]_b-C(=O)-.

[243] В некоторых вариантах воплощения, например, в шестнадцатом-восемнадцатом специфических вариантах воплощения, конъюгат является:

где r является целым числом от 1 до 10, Y является -Н или -SO₃M (например, Y является -SO₃M), а М является -Н или фармацевтически приемлемым катионом.

[244] В некоторых вариантах воплощения, например, в шестнадцатом-восемнадцатом специфических вариантах воплощения, антитело является huMy9-6.

[245] В девятнадцатом специфическом варианте воплощения L' из шестнадцатого или семнадцатого специфического варианта воплощения представлена следующей формулой:

-NR^e-[CR_1ʺR_2ʺ]_a-S-Cy-[CR_3ʺR_4ʺ]_b-C(=O)-.

[246] В некоторых вариантах воплощения, например, в шестнадцатом, семнадцатом и девятнадцатом специфических вариантах воплощения, конъюгат является:

где r является целым числом от 1 до 10, Y является -Н или -SO₃M (например, Y является -SO₃M), а М является -Н или фармацевтически приемлемым катионом.

[247] В некоторых вариантах воплощения, например, в шестнадцатом, семнадцатом и девятнадцатом специфических вариантах воплощения, антитело является huMy9-6.

[248] В двадцатом специфическом варианте воплощения соединение представлено следующей формулой:

где:

W отсутствует или выбрана из -O-, -N(R⁶)-, -N(R^e)-C(=O)-, -N(C(=O)R^e)-, -S-, -CH₂-S- или -CH₂NR^e-;

R^x отсутствует или выбрана из линейного, разветвленного или циклического алкила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода;

R^e является -И, линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, или -(СН₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k является -Н, линейным, разветвленным, циклическим алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущим вторичную аминогруппу (например, -NHR¹⁰¹) или третичную аминогруппу (-NR¹⁰¹R¹⁰²) или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, например, пиперидин или морфолин, где каждая из R¹⁰¹ и R¹⁰² независимо является линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода;

Z^s присоединена к СВА и является углерод-углеродной связью или -SR^m-;

R^m является R^d или замещенным линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, несущим реакционноспособный сложный эфир, выбранный из N-гидроксисукцинимидных эфиров, N-гидроксифталимидных эфиров, N-гидроксисульфосукцинимидных эфиров, пара-нитрофениловых эфиров, динитрофениловых эфиров и пентафторфениловых эфиров;

R^d выбрана из фенила, нитрофенила, динитрофенила, карбоксинитрофенила, пиридила или нитропиридила; а

n является целым числом от 1 до 24, а остальные переменные соответствуют описанию, приведенному выше в восьмом или пятнадцатом специфическом варианте воплощения.

[249] В двадцать первом специфическом варианте воплощения соединение представлено следующей формулой:

где:

W отсутствует или выбрана из -O-, -N(R^e)-, -N(R^e)-C(=O)-, -N(C(=O)R^e)-, -S-, -CH₂-S- или -CH₂NR^e-;

R^x отсутствует или выбрана из линейного, разветвленного или циклического алкила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода;

R^e является -Н, линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, или -(СНз-СН₂-O)_n-R^k, где R^k является -Н, линейным, разветвленным, циклическим алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущим вторичную аминогруппу (например, -NHR¹⁰¹) или третичную аминогруппу (-NR¹⁰¹R¹⁰²) или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, например, пиперидин или морфолин, где каждая из R¹⁰¹ и R¹⁰² независимо является линейным, разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, содержащим от 1 до 10 атомов углерода;

n является целым числом от 2 до 6;

Z^s присединена к СВА и выбрана из:

углерод-углеродной связи;

где:

q является целым числом от 1 до 5; а

М является -H или катионом, например, Na⁺ или K⁺.

[250] В некоторых вариантах воплощения Z^s представлена любой из следующих формул:

[251] В некоторых вариантах воплощения W' является -N(R^e)-.

[252] В некоторых вариантах воплощения R^e является -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k где R^k является -Н, линейным, разветвленным, циклическим алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода.

[253] В некоторых вариантах воплощения R^k является -Н или -Me, n равен 4, а q равен 2.

[254] В некоторых вариантах воплощения R^x является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода.

[255] В некоторых вариантах воплощения R^x является -(CH₂)_p-(CR^fR^g)-, где каждая из R^f и R^g независимо выбрана из Н или линейного или разветвленного алкила, содержащего от 1 до 4 атомов углерода; а р равен 0, 1, 2 или 3.

[256] В некоторых вариантах воплощения R^f и R^g являются одинаковыми или различными, и выбраны из -Н и -Me; а р равен 1.

[257] В двадцать втором специфическом варианте воплощения для конъюгата формулы (VIII), (IX), (X) и (XI), описанные в двадцать первом специфическом варианте воплощения, переменные соответствуют описанию, приведенному ниже:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, Х отсутствует, a Y является -Н, а когда она является одинарной связью, Х является -Н; Y является -Н, -ОН или -SO₃M (например, Y является -ОН или -SO₃M);

М является -Н или фармацевтически приемлемым катионом (например, Na⁺);

X' и Y' обе являются -Н;

А и А' обе являются -O-;

R₆ является -ОМе; а

R^x является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода.

[258] В двадцать третьем специфическом варианте воплощения для соединений формулы (IB), (IIB), (IIIB) и (IVB), описанных в двадцатом специфическом варианте воплощения, переменные соответствуют описанию, приведенному ниже:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, Х отсутствует, а Y является -Н, а когда она является одинарной связью, Х является -Н; Y является -Н, -ОН или -SO₃M (например, Y является -ОН или -SO₃M);

М является -Н или Na⁺;

X' и Y' обе являются -Н;

А и А' обе являются -O-;

R₆ является -ОМе;

R^x является линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода.

[259] Предпочтительно, Rʺ является -(CH₂)_p-(CR^fR^g)-, где каждая из R^f и R^g независимо выбрана из -Н или линейного или разветвленного алкила, содержащего от 1 до 4 атомов углерода; р равен 0, 1, 2 или 3. Более предпочтительно, R^f и R^g являются одинаковыми или различными и выбраны из -Н и -Me, а р равен 1.

[260] В любом из вышеприведенных специфических вариантов воплощения, например, в специфических вариантах воплощения с четырнадцатого по двадцать третий, двойная линия между N и С может представлять собой двойную связь.

[261] В любом из вышеприведенных специфических вариантов воплощения, например, в специфических вариантах воплощения с четырнадцатого по двадцать третий, двойная линия между N и С может представлять собой одинарную связь, Х является -Н, связывающей группой или аминоблокирующей группой (например, Х является -Н), a Y является -Н или выбрана из -OR, -OCOR', -SR, -NR'Rʺ, необязательно замещенного 5- или 6-членного азотсодержащего гетероцикла, -SO₃M, -SO₂M и сульфата -OSO₃M. В некоторых вариантах воплощения Y не является -Н.

[262] В некоторых вариантах воплощения Y выбрана из -Н, -SO₃M, -ОН, -ОМе, -OEt или -NHOH (например, Y является -SO₃M, -ОН, -ОМе, -OEt или -NHOH).

[263] В некоторых вариантах воплощения Y является -Н, -SO₃M или -ОН (например, Y является -SO₃M или -ОН),

[264] В некоторых вариантах воплощения М является -Н, Na⁺ или K⁺.

[265] В любом из вышеописанных специфических вариантов воплощения конъюгата по настоящему изобретению, например, в специфических вариантах воплощения с четырнадцатого по двадцать третий, W, если присутствует, является С=O.

[266] В любом из вышеописанных специфических вариантов воплощения конъюгата по настоящему изобретению, например, в специфических вариантах воплощения с четырнадцатого по двадцать третий, Z и Z', если присутствуют, являются -СН₂-.

[267] В любом из вышеописанных специфических вариантов воплощения конъюгата по настоящему изобретению, например, в специфических вариантах воплощения с четырнадцатого по двадцать третий, X' выбрана из группы, состоящей из -Н, -ОН, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, фенила, связывающей группы и аминоблокирующей группы.

[268] В некоторых вариантах воплощения X' является -Н, -ОН, -Me или связывающей группой.

[269] В некоторых вариантах воплощения X' является -Н.

[270] В любом из вышеописанных специфических вариантов воплощения конъюгата по настоящему изобретению, например, в специфических вариантах воплощения с четырнадцатого по двадцать третий, Y' выбрана из группы, состоящей из -Н, океогруппы, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода.

[271] В некоторых вариантах воплощения Y' является -Н или оксогруппой.

[272] В некоторых вариантах воплощения Y' является -Н.

[273] В любом из вышеописанных специфических вариантов воплощения конъюгата по настоящему изобретению, например, в специфических вариантах воплощения с четырнадцатого по двадцать третий, А и А' являются одинаковыми или различными, и выбраны из -O-, -S-, -N(R₅)- и оксогруппы (С=O).

[274] В некоторых вариантах воплощения А и А' являются одинаковыми или различными и выбраны из -О- и -S-.

[275] В некоторых вариантах воплощения А и А' являются -O-.

[276] В любом из вышеописанных специфических вариантов воплощения конъюгата по настоящему изобретению, например, в специфических вариантах воплощения с четырнадцатого по двадцать третий, D и D', если присутствуют, являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из мономера полиэтиленгликоля (ОСН₂СН₂)_n, где n является целым числом от 1 до 24, аминокислоты, пептида, несущего от 2 до 6 аминокислот, или линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, содержащего от 1 до 10 атомов углерода, где алкил, алкенил и алкинил необязательно замещены одним или более заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, -OR, -NR'CORʺ, -SR и -COR'.

[277] В некоторых вариантах воплощения D и D' являются линейным или разветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода.

[278] В двадцать четвертом специфическом варианте воплощения конъюгат по настоящему изобретению, соответствующий описанию в четырнадцатом, пятнадцатом или двадцать первом специфическом варианте воплощения, представлен следующим образом:

двойная линия между N и С представляет собой двойную связь;

Y является -Н;

W является С=O;

R₁, R₂, R₁', R₂', R₄ И R₄' являются -Н;

одна из R₃ или R₃' необязательно является связывающей группой, а другая является -Н;

R₆ является -ОМе;

Z и Z' являются -СН₂;

X' является -Н;

Y' является -Н; а

А и А' являются -O-.

[279] В некоторых вариантах воплощения конъюгат по любому из описанных вариантов воплощения, например, специфических вариантов воплощения с четырнадцатого по двадцать третий, может включать 1-10 цитотоксических соединений, 2-9 цитотоксических соединений, 3-8 цитотоксических соединений, 4-7 цитотоксических соединений или 5-6 цитотоксических соединений, причем каждое цитотоксическое соединение включает связывающую группу, присоединяющую цитотоксическое соединение к СВА, и все цитотоксические соединения в составе конъюгата одинаковы.

[280] В любом из вариантов воплощения конъюгатов, например, специфических вариантах воплощения с четырнадцатого по двадцать третий, агент, связывающийся с клетками, может связываться с клетками-мишенями, выбранными из опухолевых клеток, клеток, инфицированных вирусом, клеток, инфицированных микроорганизмами, клеток, инфицированных паразитами, аутоиммунных клеток, активированных клеток, миелоидных клеток, активированных Т-клеток, В-клеток или меланоцитов; клеток, экспрессирующих CD4, CD6, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, ЕрСАМ, CanAg, CALLA или антигены Her-2, антигены Her-3; или клеток, экспрессирующих рецептор инсулиноподобного фактора роста, рецептор эпидермального фактора роста, рецептор фолата.

[281] В любом из вариантов воплощения конъюгатов, например, специфических вариантах воплощения с четырнадцатого по двадцать четвертый, агент, связывающийся с клетками, может являться антителом, одноцепочечным антителом, фрагментом антитела, специфически связывающимся с клеткой-мишенью, моноклональным антителом, одноцепочечным моноклональным антителом или фрагментом моноклонального антитела, специфически связывающимся с клеткой-мишенью, химерным антителом, фрагментом химерного антитела, специфически связывающимся с клеткой-мишенью, доменным антителом, фрагментом доменного антитела, специфически связывающимся с клеткой-мишенью, лимфокином, гормоном, витамином, фактором роста, колониестимулирующим фактором или молекулой транспорта питательных веществ.

[282] Антитело может являться антителом с модифицированной поверхностью, одноцепочечным антителом с модифицированной поверхностью или фрагментом антитела с модифицированной поверхностью,

[283] Антитело может являться моноклональным антителом, одноцепочечным моноклональным антителом или фрагментом моноклонального антитела.

[284] Антитело может являться гуманизированным антителом, гуманизированным одноцепочечным антителом или фрагментом гуманизированного антитела.

[285] Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую любой из конъюгатов, описанных здесь, и фармацевтически приемлемый носитель.

[286] Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает соединение лекарственное вещество-линкер, включающее любое из рассматриваемых соединений, ковалентно присоединенное к бифункциональному линкеру.

[287] Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает конъюгат, включающий любое из рассматриваемых соединений или рассматриваемых соединений лекарственное вещество-линкер, присоединенных к агенту, связывающемуся с клетками.

[288] Кроме того, изобретение обеспечивает способ ингибирования аномального клеточного роста или лечения пролиферативного расстройства, аутоиммунного расстройства, деструктивного расстройства костей, инфекционного заболевания, вирусного заболевания, фиброзного заболевания, нейродегенеративного заболевания, панкреатита или заболевания почек у млекопитающего, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества любого из соединений (с или без линкерной группы) или конъюгата по изобретению и, необязательно, второго химиотерапевтического агента.

[289] В некоторых вариантах воплощения соединение или конъюгат является:

где r является целым числом от 1 до 10, Y является -И или -SO₃M (например, Y является -SO₃M), а М является -Н или фармацевтически приемлемым катионом.

[290] В некоторых вариантах воплощения второй химиотерапевтический агент вводят млекопитающему последовательно или друг за другом.

[291] В некоторых вариантах воплощения указанный способ предназначен для лечения состояния, выбранного из рака, ревматоидного артрита, рассеянного склероза, реакции трансплантат против хозяина (РТПХ), отторжения трансплантата, волчанки, миозита, инфекции и иммунодефицита.

[292] В некоторых вариантах воплощения способ или конъюгат предназначен для лечения рака.

[293] В некоторых вариантах воплощения рак выбран из рака молочной железы, рак толстой кишки, рака головного мозга, рака предстательной железы, рака почек, рака поджелудочной железы, рака яичников, рака головы и шеи, меланомы, рака ободочной и прямой кишки, рака желудка, плоскоклеточного рака, мелкоклеточного рака легких, немелкоклеточного рака легких, рака яичек, карциномы из клеток Меркеля, глиобластомы, нейробластомы, злокачественных заболеваний лимфатических органов и гематологических злокачественных новообразований, включая лейкоз (острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), острый миелобластный лейкоз (ОМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), хронический миелолейкоз (ХМЛ), острый моноцитарный лейкоз (AMOL), волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ), Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз (Т-ПЛЛ), крупноклеточный гранулолимфоцитарный лейкоз, Т-клеточный лейкоз взрослых), лимфому (мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), ходжкинскую лимфому (с нодулярным склерозом, смешанноклеточную, богатую лимфоцитами, обедненную или необедненную лимфоцитами и нодулярную ходжкинскую лимфому с преобладанием лимфоцитов), неходжкинские лимфомы (всех подтипов), хронический лимфоцитарный лейкоз/мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмоцитарную лимфому (например, макроглобулинемию Вальденстрема), лимфому из клеток пограничной зоны селезенки, плазмоцитарные новообразования (плазмаклеточную миелому, плазмацитому, болезни отложения моноклональных иммуноглобулинов, болезни тяжелых цепей), экстранодальную В-клеточную лимфому из клеток пограничной зоны (MALT-лимфому), В-клеточную лимфому из клеток пограничной зоны лимфоузлов (NMZL), фолликулярную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, крупноклеточную В-клеточную лимфому средостения (тимуса), внутрисосудистую крупноклеточную В-клеточную лимфому, первичную выпотную лимфому, лимфому/лейкоз Беркитта, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, Т-клеточный крупноклеточный гранулолимфоцитарный лейкоз, агрессивный NK-клеточный лейкоз, Т-клеточный лейкоз/лимфому взрослых, экстранодальную NK/T-клеточную лимфому (назального типа), Т-клеточную лимфому энтеропатического типа, печеночно-селезеночную Т-клеточную лимфому, бластную NK-клеточную лимфому, фунгоидную гранулему/синдром Сезари, первичные кожные СВЗО-положительные Т-клеточные лимфопролиферативные расстройства, первичную кожную анапластическую крупноклеточную лимфому, лимфоматоидный папулез, ангиоиммунобластную Т-клеточную лимфому, периферическую Т-клеточную лимфому (неопределенную), анапластическую крупноклеточную лимфому), множественную миелому (плазмаклеточную миелому или болезнь Калера).

ПОЛУЧЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С КЛЕТКАМИ АГЕНТ-ЛЕКАРСТВЕННОЕ ВЕЩЕСТВО

[294] С целью присоединения цитотоксического соединения или его производного по настоящему изобретению к агенту, связывающемуся с клетками, цитотоксическое соединение может включать связывающую группу с присоединенной к ней реакционноспособной группой. В одном варианте воплощения бифункциональный сшивающий реагент может вначале взаимодействовать с цитотоксическим соединением с получением соединения, несущего связывающую группу с одной реакционноспособной группой, присоединенной к ней (т.е. соединения лекарственное вещество-линкер), которое затем может взаимодействовать с агентом, связывающимся с клетками. В качестве альтернативы, один конец бифункционального сшивающего реагента может взаимодействовать с первым агентом, связывающимся с клетками, с получением агента, связывающегося с клетками, несущего связывающую группу с одной реакционноспособной группой, присоединенной к ней, который может взаимодействовать с цитотоксическим соединением. Связывающая группа может содержать химическую связь, обеспечивающую высвобождение цитотоксической группы, в конкретном положении. Подходящие химические связи хорошо известны в данной области техники и включают дисульфидные связи, тиоэфирные связи, кислотолабильные связи, фотолабильные связи, пептидазолабильные связи и эстеразолабильные связи (см., например, патенты США 5208020; 5475092; 6441163; 6716821; 6913748; 7276497; 7276499; 7368565; 7388026 и 7414073). Предпочтительными являются дисульфидные связи, тиоэфирные и пептидазолабильные связи. Другие линкеры, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают нерасщепляемые линкеры, например, подробно описанные в публикации патента США номер 2005/0169933, или заряженные линкеры или гидрофильные линкеры, и описаны в US 2009/0274713, US 2010/01293140 и WO 2009/134976, каждый из которых специально включен в настоящий документ посредством ссылки.

[295] Соединения формулы (I)-(IV), (IA)-(IVA) и (IB)-(IVB) можно присоединять через R₁, R₂, R₃, R₄, R₁', R₂’, R₃', R₄', L', Lʺ, L'ʺ или Х (если указанные группы присутствуют). Предпочтительными связываемыми группами из указанных являются R₂', R₃', R₄', L', Lʺ, L'ʺ, а наиболее предпочтительными связываемыми группами являются R₂', R₃' и L'. Примеры связывающих групп для соединений формулы (I)-(IV), (IA)-(IVA) и (IB)-(IVB) описаны выше.

[296] В одном варианте воплощения раствор антител в водном буфере можно инкубировать с молярным избытком антитело-модифицирующего агента, например, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионата (SPDP) или N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноата (SPDB) с целью внедрения дитиопиридильных групп. Затем модифицированное антитело подвергают взаимодействию с тиолсодержащим цитотоксическим соединением, например, соединением 2а, получая конъюгат антитело-индолинбензодиазепиновый димер, соединенный посредством дисульфидной связи. Хатем конъюгат связывающийся с клетками агент-лекарственное вещество можно очистить, используя любые способы очистки, известные в данной области техники, например, способы, описанные в патенте США №7811572 и публикации США №2006/0182750, оба из которых включены в настоящий документ посредством ссылок. Например, конъюгат связывающийся с клетками агент/лекарственное вещество можно очистить с помощью тангенциальной проточной фильтрации, адсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, избирательного осаждения, неабсорбционной фильтрации или их комбинации. Для очистки конъюгатов предпочтительно используют тангенциальную проточную фильтрацию (TFF, также известную как фильтрация в тангенциальном потоке, ультрафильтрация и диафильтрация) и/или смолы для адсорбционной хроматографии.

[297] В качестве альтернативы, антитело можно инкубировать с молярным избытком антитело-модифицирующего агента, например, 2-иминтиолана, тиолактона L-гомоцистеина (или его производных) или N-сукцинимидил-3-ацетилтиоацетата (SATA) с целью внедрения сульфгидрильных групп. Затем модифицированное антитело подвергают взаимодействию с соответствующим дисульфидсодержащим цитотоксическим агентом, получая конъюгат антитело-цитотоксический агент, соединенный посредством дисульфидной связи. Затем конъюгат антитело-цитотоксический агент можно очистить с помощью вышеописанных способов. Агент, связывающийся с клетками, также можно подвергать направленной модификации с целью внедрения тиоловых групп, например, цистеин-модифицированные антитела, описанные в патентах США под номерами 7772485 и 7855275.

[298] В еще одном варианте воплощения раствор антител в водном буфере можно инкубировать с молярным избытком антитело-модифицирующего агента, например, N-сукцинимидил-4-(N-малеимидметил)-циклогексан-1-карбоксилата, с целью внедрения малеимидогрупп или N-сукцинимидил-4-(иодацетил)-аминобензоата (SIAB) с целью внедрения иодацетильных групп. Затем модифицированное антитело подвергают взаимодействию с тиолсодержащим цитотоксическим агентом, получая конъюгат антитело-цитотоксический агент, соединенный посредством простой тиоэфирной связи. Затем конъюгат антитело-цитотоксический агент можно очистить с помощью вышеописанных способов.

[299] Количество цитотоксических молекул, связанных на молекулу антитела, можно определить спектрофотометрически, измеряя отношение оптической плотности при 280 нм и 330 нм. С помощью способов, описанных здесь, можно присоединить в среднем 1-10 цитотоксических соединений/молекулу(ы) антитела. Предпочтительное среднее количество присоединенных цитотоксических соединений на молекулу антитела составляет 2-5, а наиболее предпочтительным количеством является 2,5-4,0.

[300] Цитотоксические агенты, содержащие линкеры, заканчивающиеся N-гидроксисукцинимидиловой (NHS) сложноэфирной группой, например, соединения 1g и 10, могут взаимодействовать с антителом с получением конъюгатов, непосредственно соединенных посредством амидной связи, например, huMy9-6-SPDB-1f или huMy9-6-BMPS-1f. Затем конъюгат антитело-цитотоксический агент можно очистить с помощью гель-фильтрации любым из вышеописанных способов.

[301] Типичные способы получения конъюгатов связывающийся с клетками агент-лекарственное вещество по настоящему изобретению показаны на Фиг.22 и 23. Цитотоксическое димерное соединение по настоящему изобретению можно конъюгировать с агентом, связывающимся с клетками, путем одноэтапного или двухэтапного способа конъюгирования. На Фиг.22а и 22b описаны типичные примеры, в которых димерное соединение, содержащее линкер, например, N-гидроксисукцинимидный эфир, непосредственно взаимодействует с агентом, связывающимся с клетками, с получением желательного конъюгата. На Фиг.22с связываемый димер 1g вначале обрабатывали раствором бисульфата натрия, обеспечивая получение модифицированного димерного соединения 26 до добавления антитела с целью образования конъюгата huMy9-6-SBDP-1f по настоящему изобретению.

[302] Типичный пример двухэтапного способа конъюгирования описан на фиг.23, где антитело вначале модифицировали бифункциональным сшивающим агентом, получая антитело, обладающее желательным количеством линкеров, подходящих для реакции с димерным соединением, содержащим свободную тиоловую группу. В указанном примере антитело huMy9-6 вначале модифицировали SPDB, получая антитело с линкерами, содержащими дитиопиридиловую группу. Затем модифицированное антитело подвергали воздействию свободного тиола, например, 2а, получая требуемый конъюгат huMy9-6-SPDB-2a.

[303] Способы синтеза соединений лекарственное вещество-линкер и конъюгатов по изобретению также описаны в предварительной патентной заявке США №61/443092, поданной 15 февраля 2011 г., и заявке на изобретение США, испрашивающей приоритет даты их подачи, и поданной в тот же день заявке, рассматриваемой в настоящий момент, под названием "METHODS OF PREPARATION OF CONJUGATES", причем полное содержание указанных заявок, включая все чертежи, формулы, схемы синтеза, технические характеристики и формулы изобретения, включено в настоящий документ посредством ссылок.

[304] Структуры типичных соединений и конъюгатов по настоящему изобретению показаны в Таблицах 1-8. Указанные соединения и конъюгаты можно получить в соответствии со способами, описанными здесь.

ЦИТОТОКСИЧНОСЬ СОЕДИНЕНИЙ И КОНЪЮГАТОВ IN VITRO

[305] Можно выполнить оценку способности цитотоксических соединений и конъюгатов агент, связывающийся с клетками/лекарственное вещество по настоящему изобретению, подавлять пролиферацию различных линий раковых клеток in vitro. Например, для оценки цитотоксичности указанных соединений и конъюгатов можно использовать такие линии клеток, как линия карциномы ободочной кишки человека COLO 205, линия клеток рабдомиосаркомы RH-30 и линия клеток множественной миеломы MOLP-8. Клетки, используемые для оценки, можно подвергать воздействию соединений или конъюгатов в течение 1-5 суток, а фракции выживших клеток измерять путем прямого анализа с помощью известных способов. Затем на основании результатов анализов можно рассчитать значения IC₅₀. В качестве альтернативы или дополнения, в качестве одного из руководств по определению типов рака, которые могут обладать чувствительностью к лечению соединениями или конъюгатами по изобретению, можно использовать скрининг чувствительности линий клеток in vitro, например, описанный в Национальном институте рака США (см. Voskoglou-Nomikos et al., 2003, Clinical Cancer Res. 9: 42227-4239, включенный в настоящий документ посредством ссылки).

[306] Примеры оценки in vitro активности и специфичности конъюгатов антитело/цитотоксический агент по настоящему изобретению по отношению к мишени показаны на Фиг.25-26. Все конъюгаты являются чрезвычайно цитотоксическими по отношению к антиген-положительным раковым клеткам с 1С5о в низком диапазоне. Антиген-отрицательные линии клеток остаются жизнеспособными при воздействии этих же конъюгатов. Показано, что направленная специфическая активность индолбензодиазепиновых димеров снижалась в 160 раз при блокировании неконъюгированным антителом huMy9-6 (против CD33) и снижалась в 40 раз при блокировании неконъюгированным антителом FOLR1 (антитело против рецептора фолата). Например, конъюгат huMy9-6-SPDB-1f уничтожал антиген-положительные клетки HL60/QC со значением IC₅₀, равным 10,5 пМ, в то время как добавление избытка неконъюгированного антитела huMy9-6 антитело ослабляло цитотоксическое действие (IC₅₀=1,69 нМ), демонстрируя специфичность к антигену (Фиг.25А). Кроме того, конъюгат huMy9-6-SPDB-1f также обладает высокой активностью как к линии клеток HL60/ATCC со значением IC₅₀ 21 пМ, так и к линии клеток NB-4 со значением IC50 190 пМ (Фиг.25 В и 25С).

[307] Аналогично, конъюгат huFOLR1-SPDB-1f обладал высокой активностью со значением ICso, составлявшим 55 пм по отношению к антиген-положительным клеткам KB (Фиг.26). Добавление избытка неконъюгированного антитела huFOLR1 ослабляло указанный цитотоксический эффект более чем в 40 раз, демонстрируя специфичность к антигену.

[308] Действие конъюгирования на связывание антител измеряли путем сравнения связывания как неконъюгированного антитела huMy9-6, так и конъюгата huMy9-6-SPDB-1f с линией клеток HL60/QC (Фиг.27). FACS-анализ выявил, что изменения связывающей способности конъюгата со свободными антителами отсутствуют, что указывает на отсутствие нарушений связывания, вызванных конъюгированием цитотоксического агента с антителом.

[309] В одном примере измеряли активность конъюгата "агент, связывающий клетки/цитотоксический агент" in vivo. Бестимусных мышей, несущих опухоли HL60/QC человека, лечили конъюгатом huMy9-6-SPDB-1f и при многократных дозах наблюдали значительный регресс опухоли, в то время как у необработанных мышей наблюдали быстрый рост опухоли (Фиг.28). Активность наблюдалась при дозах 20 мкг/кг, что, по меньшей мере, в 35 раз ниже, чем максимально переносимая доза.

[310] Действие насыщения иминогрупп на переносимость показано в Таблице 9. Дииминовый конъюгат huFOLR1-лекарственное вещество 1 испытывали при многократных дозах, все из которых были признаны высокотоксичными, причем выжившие оставались только в группе, подвергавшейся воздействию минимальных протестированных доз 50 мкг/кг. В противоположность этому обнаружено, что частично восстановленные моноиминовые конъюгаты huFOLR1-лекарственное вещество 2 и huFOLR1-SPDB-IGN (huFOLR1-SPDB-1f) обладали значительно улучшенной переносимостью, причем конъюгат huFOLR1-SPDB-IGN (huFOLR1-SPDB-1f) демонстрировал 100% выживаемость животных при максимальных протестированных дозах 560 мкг/кг.

КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

[311] Настоящее изобретение включает композицию (например, фармацевтическую композицию), включающую новые бензодиазепиновые соединения, описанные здесь (например, индолинбензодиазепин или оксазолидинбензодиазепин), их производные или конъюгаты (и/или сольваты, гидраты и/или соли) и носитель (фармацевтически приемлемый носитель). Настоящее изобретение также включает композицию (например, фармацевтическую композицию), включающую новые бензодиазепиновые соединения, описанные здесь, их производные или конъюгаты (и/или сольваты, гидраты и/или соли) и носитель (фармацевтически приемлемый носитель), а также включающую второй терапевтический агент. Композиции по настоящему изобретению можно использовать для ингибирования аномального клеточного роста или лечения пролиферативного расстройства у млекопитающего (например, человека). Композиции по настоящему изобретению также можно использовать для лечения депрессии, тревоги, стресса, фобий, паники, дисфории, психиатрических расстройств, боли и воспалительных заболеваний у млекопитающего (например, человека).

[312] Настоящее изобретение включает способ ингибирования аномального клеточного роста или лечения пролиферативного расстройства у млекопитающего (например, человека), включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества новых бензодиазепиновых соединений, описанных здесь (например, индолинбензодиазепина или оксазолидинбензодиазепина), их производных или конъюгатов (и/или сольватов и солей) или их композиции отдельно или в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

[313] Настоящее изобретение также обеспечивает способы лечения, включающие введение субъекту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества любого из вышеописанных конъюгатов.

[314] Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ индукции гибели клеток в выбранных популяциях клеток, включающий обеспечение контакта клеток-мишеней или тканей, содержащих клетки-мишени, с эффективным количеством цитотоксического агента, включающим любой из конъюгатов цитотоксическое соединение-агент, связывающийся с клетками (например, индолинбензодиазепиновый или оксазолидинбензодиазепиновый димер, присоединенный к агенту, связывающемуся с клетками) по настоящему изобретению, его соль или сольват. Клетками-мишенями являются клетки, с которыми может связываться агент, связывающийся с клетками.

[315] При желании вместе с конъюгатом можно вводить другие активные агенты, например, другие противоопухолевые агенты.

[316] Подходящие фармацевтически приемлемые носители, разбавители и вспомогательные вещества хорошо известны и могут быть определены специалистом в данной области техники, как требует клиническая ситуация.

[317] Примеры подходящих носителей, разбавителей и/или вспомогательных веществ включают: (1) физиологический раствор с фосфатным буфером по Дульбекко, рН 7,4, содержащий или не содержащий приблизительно от 1 мг/мл до 25 мг/мл человеческого сывороточного альбумина, (2) 0,9% раствор Nacl (0,9% масса/объем NaCl), и (3) 5% (масса/объем) раствор декстрозы, а также может содержать антиоксидант, например, триптамин и стабилизирующий агент, например, Твин 20.

[318] Способ индуцирования гибели клеток в выбранных клеточных популяциях можно осуществлять in vitro, in vivo или ex vivo.

[319] Примеры использования in vitro включают обработку аутологичного костного мозга перед его трансплантацией этому же пациенту с целью уничтожения больных или злокачественных клеток; обработку костного мозга перед его трансплантацией с целью уничтожения компетентных Т-клеток и предотвратить реакцию трансплантат против хозяина (РТПХ); обработку клеточных культур с целью уничтожения всех клеток, кроме желательных разновидностей, не экспрессирующих антиген-мишень; или уничтожения разновидностей, экспрессирующих нежелательный антиген.

[320] Условия неклинического использования in vitro может легко определить специалист в данной области техники.

[321] Примерами клинического использования ех vivo является использование с целью удаления опухолевых клеток или лимфоидных клеток из костного мозга перед аутологичной трансплантацией при лечении рака или при лечении аутоиммунных заболеваний, или для удаления Т-клеток и других лимфоидных клеток из аутологичного или аллогенного костного мозга или ткани перед трансплантацией с целью предотвращения РТПХ. Обработку можно проводить следующим образом. Выполняют отбор костного мозга у пациента или другого лица, а затем инкубируют в среде, содержащей сыворотку, к которой добавляют цитотоксический агент по изобретению в диапазоне концентраций в интервале от приблизительно 10 мкМ до 1 пМ, в течение от приблизительно 30 минут до приблизительно 48 часов при температуре приблизительно 37°С. Точную концентрацию и время инкубирования, т.е. дозу, может легко определить специалист в данной области техники. После инкубирования клетки костного мозга промывают средой, содержащей сыворотку, и возвращают в организм пациента путем внутривенной инъекции в соответствии с известными способами. В случаях, когда пациент получает другое лечение, например, курс абляционной химиотерапии или тотальное облучение между моментом отбора костного мозга и повторным введением обработанных клеток, обработанные клетки костного мозга хранят в замороженном виде в жидком азоте с использованием стандартного медицинского оборудования.

[322] Для клинического использования in vivo цитотоксический агент по изобретению поставляют в виде растворов или лиофилизированных порошков, которые проверяют на стерильность и уровни эндотоксинов. Примеры подходящих протоколов введения конъюгатов приведены ниже. Конъюгаты вводят раз в неделю в течение 4 недель в виде внутривенного болюсного вливания. Болюсные дозы вводят в объеме от 50 до 1000 мл физиологического раствора, к которому можно добавить от 5 до 10 мл человеческого сывороточного альбумина. Дозировки составляют от 10 мкг до 2000 мг на введение, внутривенно (в диапазоне от 100 нг до 20 мг/кг в день). После четырех недель лечения пациент может продолжать получать лечение на еженедельной основе. Специалист в данной области техники может определить специфические клинические протоколы по отношению к способу введения, вспомогательным веществам, разбавителям, дозировкам, времени и т.д., как требует клиническая ситуация.

[323] Примеры медицинских состояний, которые можно лечить в соответствии со способами индукции гибели клеток в выбранных популяциях клеток in vivo или ех vivo включают злокачественное новообразование любого типа, включая, например, рак легкого (мелкоклеточный и немелкоклеточный), молочной железы, толстой кишки, головного мозга, предстательной железы, почек, поджелудочной железы, яичников, головы и шеи, кожи (меланому), карциному из клеток Меркеля, глиобластому, нейробластому и рак лимфатических органов; аутоиммунные заболевания, например, системную красную волчанку, ревматоидный артрит и рассеянный склероз; отторжение трансплантата, например, отторжение трансплантата почки, отторжение трансплантата печени, отторжение трансплантата легкого, отторжение трансплантата сердца и отторжение трансплантата костного мозга, реакцию трансплантат против хозяина; вирусные инфекции, напрмиер, инфекцию ЦМВ, ВИЧ-инфекцию, СПИД и т.д. и паразитарные инфекции, например, лямблиоз, амебиаз, шистосомоз и др., как может определить специалист в данной области техники.

[324] Средства лечения рака и их дозировки, пути введения и рекомендуемые способы применения известны в данной области техники и описаны в такой литературе, как Physician's Desk Reference (PDR). В PDR описаны дозировки агентов, используемых при лечении различных видов рака. Режим дозирования и дозировки вышеуказанных химиотерапевтических лекарственных средств, являющиеся терапевтически эффективными, зависят от конкретного типа рака, подвергаемого лечению, степени развития заболевания и других факторов, известных врачам-специалистам, которые может определить врач. Содержание PDR специально включено в настоящий документ посредством ссылки. Специалист в данной области техники может выполнить обзор PDR, используя один или более из следующих параметров для определения схемы дозирования и дозировок химиотерапевтических агентов и конъюгатов, которые можно использовать в соответствии с принципами настоящего изобретения. Указанные параметры включают:

Подробный индекс

По производителю

Продукты (по названию, используемому в компании, или товарному знаку препарата)

Индекс категории

Общий/химический индекс (общепринятые названия препарата, не являющиеся товарным знаком)

Цветные изображения лекарств

Информация о продукте, в соответствии с обозначениями FDA

Химическая информация

Функция/действие

Показания и противопоказания

Испытания, побочные эффекты, предупреждения

АНАЛОГИ И ПРОИЗВОДНЫЕ

[325] Специалист в области цитотоксических агентов легко поймет, что каждый из цитотоксических агентов, описанных здесь, можно модифицировать таким образом, что полученное соединение по-прежнему сохраняет специфичность и/или активность исходного соединения. Специалист в данной области техники также должен понимать, что многие из указанных соединений можно использовать вместо цитотоксических агентов, описанных здесь. Таким образом, цитотоксические агенты по настоящему изобретению включают аналоги и производные соединений, описанных здесь.

[326] Все ссылки, приведенные здесь и в приведенных ниже примерах, специально полностью включены посредством ссылки.

ПРИМЕРЫ

[327] Изобретение проиллюстрировано посредством ссылки на неограничивающие примеры. Если не указано иное, все проценты, соотношения, части и т.д. являются массовыми. Все реагенты были приобретены в Aldrich Chemical Co, Нью-Джерси, США, или других коммерческих источниках. Спектры ядерного магнитного резонанса ('Н-ЯМР) получали на устройстве Bruker 400 МГц, а масс-спектры получали на устройстве Broker Daltonics Esquire 3000, используя ионизацию электрораспылением.

Пример 1

[328] Соединение 1b:

[329] К перемешиваемому раствору анилина 1а (1,55 г, 5,18 ммоль) и 2-(метилдитио)-изобутиральдегида (0,7 мл, 5,18 ммоль) в безводном 1,2-дихлорметане (20 мл) добавляли триацетоксиборгидрид натрия (1,1 г, 5,18 ммоль) и порошок хлорида цинка (353 мг, 2,59 ммоль) с последующим добавлением безводного сульфата магния (800 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре (кт) в течение 6 часов, затем добавляли вторую порцию 2-(метилдитио)-изобутиральдегида (0,7 мл, 5,18 ммоль) и триацетоксиборгидрида натрия (1,1 г, 5,18 ммоль). Смесь продолжали перемешивать при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали через целит и промывали дихлорметаном. Фильтрат концентрировали и остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (Combiflash, колонка 40 г, дихлорметан/МеОН), получая соединение 1b (487 мг, выход=22%) в виде бесцветного масла. Кроме того, восстанвливали непрореагировавший исходный материал анилин 1а (1,02 г) с выходом 65%. ¹Н ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 6,76 (с, 2Н), 6,63 (с, 1Н), 4,55 (с, 4Н), 3,65-3,51 (м, 14Н), 3,35 (с, 3Н), 2,44 (с, 3Н), 1,33 (с, 6Н); ¹³С ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 149,0, 142,35, 114,0, 111,1, 71,98, 70,7, 70,6, 70,5, 67,6, 65,5, 59,75, 59,1, 53,9, 51,9, 26,6, 25,7, 20,75; MC (m/z): найденное значение 456,2 (М+Na)⁺. См. Фиг.1.

[330] Соединение 1с:

[331] К перемешиваемому раствору 1b (243 мг, 0,56 ммоль) в безводном дихлорметане (3,5 мл) добавляли триэтиламин (234 мкл, 1,68 ммоль). Смесь охлаждали до -10°С и медленно добавляли метансульфонилхлорид (113 мкл, 1,46 ммоль) в течение 15 минут с помощью шприца. Раствор продолжали перемешивать в течение 60 минут при -10~-7°С и останавливали реакцию добавлением смеси лед/вода. Раствор разбавляли этилацетатом и промывали холодной водой. Органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия, отфильтровывали, концентрировали и подвергали воздействию глубокого вакуума, получая мезилаты в виде светло-желтоватого масла (340 мг). Мезилаты переносили в 10-мл круглодонную колбу со смесью этилацетат/дихлорметан, концентрировали и подвергали воздействию глубокого вакуума. Добавляли мономер IBD (412 мг, 1,4 ммоль) с последующим добавлением безводного диметилформамида (3 мл) и безводного карбоната калия (232 мг, 1,68 ммоль). Полученную желтоватую смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и промывали насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток растворяли в дихлорметане, наносили на колонку с силикагелем и элюировали смесью дихлорметан/метанол (15:1, затем 10:1). Фракции, содержавшие соединение 1с, объединяли и концентрировали, получая 705 мг неочищенного продукта, который затем очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка С 18, элюирование смесью ацетонитрил/вода), получая соединение 1 с в виде желтоватого рыхлого твердого вещества (181 мг, выход=33%). ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 8,28 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,86 (д, J=3,6 Гц, 2Н), 7,59 (с, 2Н), 7,31-7,26 (м, 4Н), 7,12 (т, J=7,6 Гц, 2Н), 6,87-6,80 (м, 5Н), 5,18 (дд, J₁=20,8 Гц, J₂=12,4 Гц, 4Н), 4,50-4,47 (м, 2Н), 3,99 (с, 6Н), 3,75-3,48 (м, 18Н), 3,37 (с, 3Н), 2,44 (с, 3Н), 1,32 (с, 6Н); МС (m/z): найденное значение 1025,9 (М+H₂O+Na)⁺, 1043,9 (М+2H₂O+Na)⁺, 983,8 (М-Н)^-, 1055,8 (М+4H₂O-Н)^-.

См. Фиг.1.

[332] Соединение 1d:

[333] К перемешиваемому раствору соединения 1 с (112 мг, 0,114 ммоль) в безводном дихлорметане (0,3 мл) и абсолютном этаноле (0,6 мл) добавляли боргидрид натрия (0,9 мг, 0,023 ммоль) при 0°С.Ледяную баню удаляли через 5 минут и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 3 часов, затем охлаждали до 0°С и останавливали реакцию насыщенным раствором хлорида аммония, разбавляли дихлорметаном, разделяли и промывали органический слой насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным NazS04, фильтровали через целит и концентрировали. Остаток очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка С 18, ацетонитрил/вода). Соответствующие фракции экстрагировали дихлорметаном и концентрировали, получая продукты 1d, 1e и непрореагировавший исходный материал 1с. Соединение 1d: 37,1 мг (выход=33%), МС (m/z): найденное значение 1010,4 (М+Na)⁺, 1028,4 (М+H₂O+Na)⁺, 1040,3 (М+3H₂O - Н)^-; соединение 1е: 6,4 мг (выход=5,7%), МС (m/z): найденное значение 1012,4 (М+Na)⁺; соединение 1 с: 44,1 мг (выход=39%).

См. Фиг.1.

[334] Соединение 1g:

[335] К перемешиваемому раствору 1d (23,6 мг, 0,024 ммоль) в ацетонитриле (3 мл) и метаноле (3 мл) добавляли свежеприготовленный раствор ТСЕР (17 мг соли ТСЕР и HCl нейтрализовали насыщенным раствором бикарбоната натрия до рН 6~6,5, затем разбавляли 0,5 мл фосфатного буфера, рН 6,5) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, затем разбавляли дихлорметаном и деионизированной водой, разделяли, органический слой промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали и подвергали воздействию глубокого вакуума, получая 22 мг 1f в виде светло-желтоватой пены. Еще 18 мг 1f получали из 19 мг 1d, следуя той же процедуре. Объединенные 40 мг (0,042 ммоль) 1f растворяли в безводном дихлорметане (0,5 мл) и перемешивали. К указанному перемешиваемому раствору добавляли NHS эфир SPDB 2 (34,6 мг, 80% чистоты, 0,085 ммоль) и диизопропилэтиламин (15 мкл, 0,085 ммоль). Смесь продолжали перемешивать при комнатной температуре в течение ночи, останавливали реакцию насыщенным раствором хлорида аммония, разбавляли дихлорметаном, разделяли и промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка С 18, ацетонитрил/вода). Фракции, содержащие продукт, объединяли, экстрагировали дихлорметаном и концентрировали, получая соединение 1g в виде белого твердого вещества (29,7 мг, выход=60%). ¹Н-ЯМР (400 Гц, CD₃CN): δ 8,28-8,25 (м, 1Н), 8,20-8,17 (м, 1Н), 7,87-7,84 (м, 1Н), 7,49 (д, J=4,4 Гц, 1Н), 7,39 (д, J=4,4 Гц, 1Н). 7,31-7.19 (м, 4Н), 7,13-7,01 (м, 2Н), 6,92-6,87 (м, 3Н), 6,77 (шс, 1Н), 6,31-6,29 (м, 1Н), 5,16-5,09 (м, 2Н), 5,00 (д, J=4,4 Гц, 2Н), 4,94 (шс, -NH), 4,48-4,43 (м, 1Н), 4,40-4,34 (м, 1Н), 3,90 (д. J=4,4 Гц, 3Н), 3,77 (д, J=4,4 Гц, 3Н), 3,64-3,39 (м, 18Н), 3,26 (д, J=4,4 Гц, 3Н), 2,82-2,70 (м, 8Н), 2,17 (д, J=4,4 Гц, 1Н), 2,08-2,01 (м, 3Н), 1,30 (д, J=4,4 Гц, 6Н); МС (m/z): найденное значение 1025,9 (М+H₂O+Na)⁺, 1043,9 (М+2H₂O+Na)⁺, 983,8 (М-Н)^-, 1055,8 (М+4H₂O-Н)^-; МС (m/z), найденное значение 1179,5 (М+Na)⁺. См. Фиг.1.

Пример 2

[336] Соединение 1e:

[337] К перемешиваемому раствору 1 с (8 мг, 0,0081 ммоль) в безводном 1,2-дихлорметане (0,2 мл) добавляли триацетоксиборгидрид натрия (3,8 мг, 0,018 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч, затем разбавляли дихлорметаном, останавливали реакцию насыщенным раствором бикарбоната натрия, разделяли, органический слой промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали и остаток очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка С 18, ацетонитрил/вода), получая соединение 1е в виде белого твердого вещества (4,7 мг, выход=58%). МС (m/z), найденное значение 1012,4 (М+Na)⁺, 1024,2 (М+2H₂O-Н)^-. См. Фиг.2.

[338] Соединение 2а:

[339] К перемешиваемому раствору соединения 1е (12 мг, 0,012 ммоль) в ацетонитриле (1 мл) и метаноле (3 мл) добавляли свежеприготовленный раствор ТСЕР (11 мг соли ТСЕР и НС1 нейтрализовали насыщенным раствором бикарбоната натрия до рН ~6,5, затем разбавляли 0,4 мл фосфатного буфера, рН 6,5) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3,5 часов, затем разбавляли дихлорметаном и деионизированной водой, разделяли, органический слой промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали и остаток очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка С 18, ацетонитрил/вода), получая соединение 2а в виде белого твердого вещества (4,9 мг, выход=43%). МС (m/z), найденное значение 966,4 (М+Na)⁺, 978,2 (М+2Н₂О-Н)^-. См. Фиг.2.

Пример 3

[340] Соединение 3b:

[341] К раствору соединения 3а (830 мг, 1,9 ммоль) в метаноле (15 мл) добавляли Pd/C (10%, 204 мг, 0,19 ммоль). Воздух в колбе удаляли с помощью вакуума, а затем заменяли водородом из баллона. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь фильтровали через целит и промывали целит/Pd/C дихлорметаном и метанолом. Фильтрат концентрировали, остаток разбавляли дихлорметаном и упаривали в течение нескольких циклов, а затем очищали с помощью хроматографии на силикагеле (дихлорметан/метанол), получая соединение ЗЬ в виде светло-желтоватого твердого вещества (558 мг, выход=98%). ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 8,34 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,40 (с, 1Н), 7,22 (дд, J₁=8,0 Гц, J₂=7,6 Гц, 1Н), 7,17 (д, J=7,2 Гц, 1Н), 7,02 (дд, J₁=7,2 Гц, J₂=7,6 Гц, 1Н), 6,16 (с, 1Н), 4,37 (тт, J₁=10,4 Гц, J₂=7,2 Гц, 1Н), 3,76 (с, 3Н), 3,49-3,36 (м, 3Н), 2,73 (дд, J₁=16,8 Гц, J₂=3,6 Гц, 1Н); ¹³С-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 167,0, 150,4, 142,6, 141,2, 140,8, 129,9, 127,7. 124,8, 123,96, 117,4, 113,7, 112,5, 104,7, 57,3, 56,3, 54,7, 33,0; MC (m/z), найденное значение 295,1 (М-Н)^-. См. Фиг.3.

[342] Соединение 3с:

[343] К раствору 2-(метилдитио)-изобутиральдегида (113 мг, 0,75 ммоль) и соединения 3b (148 мг, 0,5 ммоль) в безводном 1,2-дихлорэтане (2 мл) добавляли триацетоксиборгидрид натрия (212 мг, 1,0 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 дней. В течение этого времени добавляли еще две порции (0,05 мл, 0,5 ммоль/порцию) 2-(метилдитио)изобутиральдегида вместе с одной порцией триацетоксиборгидрида натрия (106 мг, 0,5 ммоль). Реакцию останавливали насыщенным раствором бикарбоната натрия, смесь разбавляли дихлорметаном и водой. Органический слой промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (Combiflash, колонка 24 г, гексан/этилацетат), получая соединение 3с в виде белого рыхлого твердого вещества (92,5 мг, выход=43%). Кроме того, восстанавливали непрореагировавший исходный материал 3b (49,3 мг, выход=33%). ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 8,30 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,28 (дд, J₁=6,8 Гц, J₂=7,6 Гц, 1Н), 7,25-7,20 (м, 2Н), 7,07 (т, J=7,6 Гц, 1Н), 6,80 (с, 1Н), 6,17 (с, 1Н), 4,36-4,28 (м, 1Н), 3,89 (с, 3Н), 3,78 (д, J=14,4 Гц, 1Н), 3,46-3,34 (м, 3Н), 2,90 (д, J=14,4 Гц, 1Н), 2,73 (дд, J₁=16,4 Гц, J₂=2,8 Гц, 1Н), 2,34 (с, 3Н), 1,17 (с, 3Н), 1,05 (с, 3Н); 1³С-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 167,2, 149,0, 142,5, 142,2, 141,9, 129,9, 128,0, 125,3, 124,5, 124,1, 117,1, 112,0, 108,5, 64,8, 61,4, 58,1, 56,3, 53,4, 32,0, 26,3, 25,7, 25,4; MC (m/z), найденное значение 453,3 (М+Na)⁺, 429,2 (М-Н)^-. См. Фиг.3.

[344] Соединение 3d:

[345] К перемешиваемому раствору мономера IBD (125 мг, 0,425 ммоль) и 1,5-дииодпентана (0,63 мл, 4,25 ммоль) в безводном диметилформамиде (3 мл) добавляли карбонат калия (59 мг, 0,425 ммоль) и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение ночи. Реакционный раствор разбавляли дихлорметаном, промывали насыщенным раствором NaCl и высушивали над безводным сульфатом натрия. Раствор фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (гексан/этилацетат), получая соединение 3d в виде желтоватой пены (94 мг, выход=45%). ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 8,27 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,86 (д, J=4,8 Гц, 1Н), 7,56 (с, 1Н), 7,27 (дд, J,=8,4 Гц, J2=7,6 Гц, 2Н), 7.10 (дд, J₁=7,6 Гц, J₂=7,2 Гц, 1Н), 6,82 (с, 1Н). 4,48 (dt, J₁=10,8 Гц, J₂=4,4 Гц, 1Н), 4,15-4,07 (м, 2Н), 3,96 (с, 3Н), 3,70 (дд, J,=16,8 Гц,;2=10,8 Гц, 1Н), 3,49 (дд, J₁=16,8 Гц, J₂=4,0 Гц, 1Н), 3,22 (т, J=7,2 Гц, 2Н), 1,96-1,87 (м, 4Н), 1,64-1,57 (м, 2Н); ¹³С-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 164,0, 163,2, 151,4, 148,3, 142,2, 140,3, 129,6, 128,3, 124,9, 120,5, 117,0, 112,0, 110,6, 68,8, 56,4, 55,1, 33,3, 32,7, 28,0, 27,2, 6,6; MC (m/z), найденное значение 513,3 (М+Na)+, 543,2 (М+3H₂O-Н)^-. См. Фиг.3.

[346] Соединение 3е:

[347] К перемешиваемому раствору исходных материалов 3с (91 мг, 0,21 ммоль) и 3d (94 мг, 0,19 ммоль) в безводном диметилформамиде (1 мл) добавляли карбонат калия (29 мг, 0,21 ммоль) и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение ночи. Реакционный раствор разбавляли дихлорметаном, промывали насыщенным раствором NaCl и высушивали над безводным сульфатом натрия. Раствор фильтровали, концентрировали и очищали остаток с помощью хроматографии на силикагеле (гексан/этилацетат), получая соединение 3е в виде желтоватой пены (89,1 мг, выход=58%). ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 8,32-8,28 (м, 2Н), 7,91 (шс, 1Н), 7,57 (с, 1Н), 7,36-7,21 (м, 5Н), 7,15-7,05 (м, 2Н), 6,85 (с, 1Н), 6,74 (с, 1Н), 4,53-4,48 (м, 1Н), 4,37-4,31 (м, 1Н), 4,21-4,03 (м, 4Н), 3,98 (с, 3Н), 3,88 (с, 3Н), 3,86-3,70 (м, 2Н), 3,55-3,35 (м, 4Н), 2,93 (д, J=4,0 Гц, 1Н), 2,73 (дд, J₁=16,4 Гц, J₂=2,4 Гц, 1Н), 2,36 (с, 3Н), 2,03-1,96 (м, 3Н), 1,77-1,67 (м, 3Н), 1,21 (с, 3Н), 1,06 (с, 3Н); МС (m/z), найденное значение 815,3 (М+Na)⁺. См. Фиг.3.

[348] Соединение 3g:

[349] К перемешиваемому раствору соединения 3е (33,1 мг, 0,042 ммоль) в ацетонитриле (2 мл) и метаноле (4 мл) добавляли свежеприготовленный раствор ТСЕР (36 мг соли ТСЕР и НС1 нейтрализовали насыщенным раствором бикарбоната натрия до рН ~6,5, затем разбавляли 0,4 мл фосфатного буфера, рН 6,5) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, затем разбавляли дихлорметаном и деионизированной водой, разделяли, органический слой промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали и подвергали воздействию глубокого вакуума, получая 31 мг соединения 3f в виде твердого желтоватого вещества. Его растворяли в безводном дихлорметане (0,5 мл). Последовательно добавляли NHS эфир SPDB 2 (26 мг, 80% чистоты, 0,063 ммоль) и диизопропилэтиламин (11 мкл, 0,063 ммоль). Смесь продолжали перемешивать при комнатной температуре в течение ночи, останавливали реакцию насыщенным раствором хлорида аммония, разбавляли дихлорметаном, разделяли и промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка С 18, ацетонитрил/вода). Фракции, содержавшие продукт, объединяли, экстрагировали дихлорметаном и концентрировали, получая соединение 3g в виде желтоватого твердого вещества (15,2 мг, выход=38%). МС (m/z), найденное значение 984,3 (М+Na)⁺. 1014,2 (М+3H₂O-Н)^-. См. Фиг.3.

Пример 4

[350] Соединение 4b:

[351] Перемешиваемый раствор соединения 4а (111 мг, 0,108 ммоль) в абсолютном этаноле (720 мкл) и безводном дихлорметане (360 мкл) охлаждали до 0°С на ледяной бане. Боргидрид натрия (0,817 мг, 0,022 ммоль) в 50 мкл абсолютного этанола добавляли при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов. Смесь охлаждали до 0°С на ледяной бане, останавливали реакцию насыщенным раствором хлорида аммония и экстрагировали дихлорметаном. Органические экстракты промывали насыщенным раствором Nacl, высушивали над безводным сульфатом натрия и фильтровали через целит. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и очищали неочищенный продукт с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (С 18, деионизированная вода/ацетонитрил), получая соединение 4b (43 мг, 38%). ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 8,26 (д, 1Н, J=8,0 Гц), 8,18 (д, 1Н, J=8,0 Гц), 7,77 (д, 1Н, J=4,4 Гц), 7,51 (с, 1Н), 7,41 (с, 2Н), 7,17 (м, 6Н), 7,03 (т, 1Н, J=7,2 Гц), 6,96 (т, 1Н, J=7,2 Гц), 6,76 (с, 1Н), 6,04 (с, 1Н), 5,13 (м, 4Н), 4,38 (м, 2Н), 3,90 (с, 3Н), 3,81 (с, 3Н), 3,79 (м, 2Н), 3,63 (м, 1Н), 3,51 (м, 8Н), 3,43 (м, 6Н), 3,25 (с, 3Н), 2,73 (дд, 1Н, J=3,6, 16,4 Гц), 2,22 (с, 3Н), 2,04 (м, 2Н), 1,81 (м, 2Н), 1,18 (с, 6Н); МС (m/z) найденное значение 1051,9 (M+Na), 1069,9 (M+Na+H₂O). См. Фиг.4.

[352] Соединение 4с:

[353] К перемешиваемому раствору соединения 4b (40 мг, 0,039 ммоль) в метаноле (4,45 мл) и ацетонитриле (2,225 мл) добавляли ТСЕР.HCl (39,0 мг, 0,136 ммоль) в натрий-фосфатном буфере (0,89 мл, рН 6,5). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Смесь разбавляли дихлорметаном и промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органические экстракты высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Очистка ОФ-ВЭЖХ (С 18, деионизованная вода/ацетонитрил) и экстракция дихлорметаном позволяла получить соединение 4 с (26,5 мг, 64%); МС (m/z) найденное значение 1006,0 (М Na). См. Фиг.4.

[354] Соединение 4d:

[355] К перемешиваемому раствору соединения 4 с (24 мг, 0,024 ммоль) в безводном дихлорметане (800 мкл) добавляли РВА (11,18 мг, 0,049 ммоль) и диизопропилэтиламин (20,18 мкл, 0,116 ммоль). После перемешивания в течение 18 часов при комнатной температуре реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и останавливали реакцию насыщенным раствором хлорида аммония. Слои разделяли, органический слой промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Очистка с помощью препаративной ТСХ (5% метанол/дихлорметан) позволяла получить соединение 4d (17 мг, 63%); МС (m/z) найденное значение 1123,9 (M+Na) 1139,9 (М+K); 1099,8 (М-Н) 117,9 (М-Н+H₂O). См. Фиг.4.

[356] Соединение 4е:

[357] К смеси соединения 4d (15 мг, 0,014 ммоль) и N-гидроксисукцинимида (4,70 мг, 0,041 ммоль) в безводном дихлорметане (1,0 мл) добавляли EDC.HCl (7,83 мг, 0,041 ммоль). После перемешивания в течение 18 часов при комнатной температуре реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и останавливали реакцию насыщенным раствором хлорида аммония. Смесь промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный материал очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ (С 18, деионизованная вода/ацетонитрил). Фракции, содержавшие продукт, объединяли и экстрагировали дихлорметаном, высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали, получая соединение 4е (13 мг, 80%); МС (m/z) найденное значение 1220,8 (M+Na) 1238,8 (M+Na+H₂O), 1254,8 (M+K+H₂O). См. Фиг.4.

Пример 5

[358] Соединение 5а:

[359] Смесь гидрата хелидамовой кислоты (3,0 г, 15,56 ммоль) и серной кислоты (0,6 мл, 11,26 ммоль) в абсолютном этаноле (40 мл) нагревали с обратным холодильником в течение 20 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, нейтрализовали водным раствором карбоната натрия, а затем подкисляли концентрированной НС1. Добавляли воду и экстрагировали смесь дихлорметаном. Экстракты высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Неочищенный материал очищали с помощью хроматографии на силикагеле (5% метанол/дихлорметан) с получением диэтил-4-гидроксипиридин-2,6-дикарбоксилата (5а) (2,5 г, 68%) в виде белого твердого вещества. См. Фиг.5.

[360] Соединение 5с:

[361] Раствор 4-метил-4-(метилдисульфанил)пентан-1-ола (5b) (2,0 г, 11,09 ммоль) в безводном дихлорметане (55,5 мл) охлаждали до 0°С на ледяной бане. Триэтиламин (5,41 мл, 38,8 ммоль) и толуолсульфонилхлорид (3,17 г, 16,64 ммоль) добавляли при 0°С. Реакционную смесь перемешивали в течение трех часов при комнатной температуре. Смесь экстрагировали этилацетатом и промывали насыщенным раствором NaCl. Органические экстракты высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Очистка хроматографией на силикагеле (5% этилацетат/гексаны), приводила к получению 4-метил-4-(метилдисульфанил)пентил-4-метилбензолсульфоната (5 с) (1,5 г, 40%). 5b: ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 3,42 (м, 2Н), 2,19 (с, 3Н), 1,77 (шс, 1Н), 1,43 (м, 4Н), 1,09 (с, 6Н). 5с: ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): 67,66 (д, 2Н, J=7,6 Гц), 7,22 (д, 2Н, J=8,0 Гц), 3,90 (т, 2Н, J=6,4 Гц), 2,32 (с, 3Н), 2,23 (с, 3Н), 1,60 (м, 2Н), 1,44 (м, 2Н), 1,11 (с, 6Н). См. Фиг.5.

[362] Соединение 5d:

[363] К перемешиваемому раствору 4-метил-4-(метилдисульфанил)пентил-4-метилбензолсульфоната (5 с) (0,48 г, 1,435 ммоль) и диэтил-4-гидроксипиридин-2,б-дикарбоксилата (5а) (0,343 г, 1,435 ммоль) в безводном диметилформамиде (6,5 мл) добавляли карбонат калия (0,297 г, 2,152 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 90°С в течение 18 часов. Затем давали остыть до комнатной температуры и останавливали реакцию насыщенным раствором хлорида аммония. Смесь трижды экстрагировали этилацетатом. Экстракты высушивали безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Очистка хроматографией на силикагеле (30% гексан/этилацетат) позволяла получить диэтил-4-(4-метил-4-(метилдисульфанил)пентилокси)-пиридин-2,6-дикарбоксилат (5d) (300 мг, 52%); ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 7,70 (с, 2Н), 4,40 (кв, 4Н, J=7,2, 14,4 Гц), 4,07 (т, 2Н, J=6. Гц), 2,35 (с, 3Н), 1,86 (м, 2Н), 1,70 (м, 2Н), 1,38 (т, 6Н, J=7,2 Гц), 1,27 (с, 6Н); МС (m/z), найденное значение 424,1 (M+Na), 440,1 (M+K). См. Фиг.5.

[364] Соединение 5е:

[365] К перемешиваемому раствору диэтил-4-(4-метил-4-(метилдисульфанил)пентилокси)-пиридин-2,6-дикарбоксилата (5d) (270 мг, 0,672 ммоль) в абсолютном этаноле (7,0 мл) добавляли хлорид кальция (224 мг, 2,017 ммоль) и боргидрид натрия (76 мг, 2,017 ммоль). Реакционную смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 90 минут, после чего реакцию останавливали водой и концентрировали смесь в вакууме с целью удаления этанола. Затем смесь дважды экстрагировали дихлорметаном. Органические экстракты объединяли, промывали водой, высушивали безводным сульфатом магния и фильтровали через целит. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и очищали неочищенный материал путем хроматографии на силикагеле с элюированием 10% метанолом/дихлорметаном, получая (4-(4-метил-4-(метилдисульфанил)пентилокси)-пиридин-2,б-диил)диметанол (5е) (75 мг, 35%); ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 6,63 (с, 2Н), 4,60 (с, 4Н), 3,95 (т, 2Н, J=6,2 Гц), 3,54 (шс, 2Н), 2,35 (с, 3Н), 1,82 (м, 2Н), 1,66 (м. 2Н), 1,26 (с, 6Н); МС (m/z), найденное значение 340,1 (M+Na). См. Фиг.5.

[366] Соединение 5f:

[367] Перемешиваемый раствор (4-(4-метил-4-(метилдисульфанил)пентилокси)пиридин-2,6-диил)диметанола (5е) (51 мг, 0,161 ммоль) в безводном дихлорметане (1,6 мл) охлаждали до -5°С на ацетон/ледяной бане. Добавляли триэтиламин (0,112 мл, 0,803 ммоль) и метансульфонилхлорид (0,031 мл, 0,402 ммоль). Смесь перемешивали в течение 60 минут при -5°С. Реакцию останавливали водой со льдом и экстрагировали смесь холодным этилацетатом. Органические экстракты промывал ледяной водой, высушивали безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая димезилат. К перемешиваемой смеси димезилатного интермедиата (179 мг, 0,378 ммоль) и мономера IBD (256 мг, 0,869 ммоль) в безводном диметилформамиде (3,8 мл) добавляли карбонат калия (261 мг, 1,890 ммоль) и иодид калия (31,4 мг; 0,189 ммоль). Реакционную смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 18 ч. Реакцию останавливали водой и трижды экстрагировали дихлорметаном. Органические экстракты высушивали сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Неочищенный материал растворяли в ацетонитриле и очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ (С 18, деионизированная вода/ацетонитрил). Фракции, содержащие продукт, объединяли и экстрагировали дихлорметаном, высушивали безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая соединение 5f (65 мг, 20%); ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 8,20 (д, 2Н, J=8,0 Гц), 7,78 (м, 2Н), 7,53 (с, 2Н), 7,20 (м, 4Н), 7,04 (т, 2Н, J=7,4 Гц), 6,91 (м, 2Н), 6,80 (с, 2Н), 5,22 (с, 4Н), 4,40 (м, 2Н), 3,94 (с, 6Н), 3,93 (м, 2Н), 3,63 (м, 2Н), 3,42 (дд, 2Н, J=Гц), 2,32 (с, 3Н), 1,80 (м, 2Н), 1,64 (м, 2Н), 1,24 (с, 6Н); МС (m/z), найденное значение 892,3 (M+Na) 910,3 (M+Na+H₂O) 928,3 (M+Na+2H₂O). См. Фиг.5.

[368] Соединение 5g u 5h:

[369] Раствор соединения 5f (74 мг, 0,085 ммоль) в абсолютном этаноле (600 мкл) и безводном дихлорметане (300 мкл) охлаждали до 0°С на ледяной бане. Боргидрид натрия (0,644 мг, 0,017 ммоль) в 50 мкл абсолютного этанола добавляли при 0°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов, а затем охлаждали до 0°С. Реакцию останавливали насыщенным раствором хлорида аммония и экстрагировали смесь дихлорметаном. Органические экстракты промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали через целит и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный материал растворяли в диметилформамиде и очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ (С 18, деионизированная вода/ацетонитрил). Фракции, содержавшие соединения 5g и 5h, объединяли по отдельности и экстрагировали дихлорметаном, высушивали безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали, получая соединение 5g (20 мг, 27%) и соединение 5h. 5g: ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 8,25 (м, 1Н), 8,18 (м, 1Н), 7,77 (м, 1Н), 7,51 (cc, 1Н), 7,40 (cc, 1Н), 7,18 (м, 4Н), 7,08 (м, 1Н), 7,03 (м, 1Н), 6,92 (м, 2Н), 6,86 (cc, 1Н) 5,98/6,06 (cc, 1Н), 5,24 (м, 4Н), 4,40 (м, 1Н), 4,30 (м, 1Н), 3,94 (с, 3Н), 3,92 (м, 2Н), 3,84 (с, 3Н), 3,62 (м, 1Н), 3,37 (м, 4Н), 2,65 (м или дд, 1Н), 2,32 (cc, 3Н), 1,77 (м, 2Н), 1,64 (м, 2Н), 1,24 (с, 6Н). 5h: ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 8,24 (д, 2Н, J=8,0 Гц), 7,39 (с, 2Н), 7,14 (м, 4Н), 6,97 (м, 2Н), 6,93 (м, 2Н), 6,15 (cc, 2Н), 5,25 (с, 4Н), 4,37 (м или т, 2Н, J=9,8 Гц), 4,2 (шс, 2Н), 3,94 (м, 2Н), 3,83 (с, 6Н), 3,40 (м, 6Н), 2,72 (дд, 2Н, J=Гц), 2,32 (с, 3Н), 1,79 (м, 2Н), 1,64 (м, 2Н), 1,24 (с, 6Н). См. Фиг.5.

[370] Соединение 5i:

[371] К перемешиваемому раствору соединения 5g (20 мг, 0,023 ммоль) в метаноле (5,25 мл) и ацетонитриле (1,750 мл) добавляли ТСЕР.HCl (19,72 мг, 0,069 ммоль) в натрий-фосфатном буфере (0,7 мл, рН 6,5). Смесь перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре, а затем разбавляли дихлорметаном и водой. Слои разделяли, органический слой промывали насыщенным раствором NaCl. Неочищенный продукт очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ (С 18, деионизованная вода/ацетонитрил). Фракции, содержавшие продукт, объединяли, экстрагировали дихлорметаном и упаривали, получая соединение 5i (7 мг, 37%). МС (m/z), найденное значение 848,3 (M+Na) 866,3 (M+Na+H₂O) 880,3 (M+Na+MeOH). См. Фиг.5.

[372] Соединение 5j:

[373] К перемешиваемому раствору соединения 5i (7 мг, 8,47 мкмоль) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-4-(пиридин-2-илдисульфанил)бутаноата (8,64 мг, 0,021 ммоль) в безводном дихлорметане (113 мкл) добавляли диизопропилэтиламин (3,69 мкл, 0,021 ммоль). После перемешивания в течение 18 часов при комнатной температуре реакцию останавливали насыщенным раствором хлорида аммония и экстрагировали смесь дихлорметаном. Органические экстракты промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный материал очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (С18, деионизованная вода/ацетонитрил). Фракции, содержавшие продукт, экстрагировали дихлорметаном, фильтровали и выпаривали, получая соединение 5j (3 мг, 34%). МС (m/z), найденное значение 1063,3 (M+Na) 1081,3 (M+Na+H₂O). См. Фиг.5.

Пример 6

[374] Получение конъюгата антитело-ЗРОВ-лекарственное вещество:

[375] Соединение lg предварительно обрабатывали 3 молярными эквивалентами бисульфита натрия (используя свежеприготовленный раствор NaHSO₃ в воде) в 96-98% растворе ДМА в воде в течение 4-5 ч при 25°С. Для конъюгирования гуманизированное антитело в концентрации 2 мг/мл подвергали взаимодействию с 5-7 молярными эквивалентами соединения lg (предварительно обработанного NaHSOs) в течение 6 ч при 25°С в 85-90% водном PBS-буфере, рН 7,4, или 50 мМ водном HEPES-буфере, рН 8,5, содержавшем 10-15% N,N-диметилацетамида (ДМА), а затем очищали фильтрацией через колонку G25 для гель-фильтрации в PBS, рН 7,4, для удаления непрореагировавшего или гидролизованного лекарственного соединения. Конъюгаты гуманизированное антитело-SPDB-лекарственное вещество диализовали в буфере, содержавшем 10 мМ гистидина, 250 мМ глицина, 1% сахарозы, рН 6,5. Измеренное за счет УФ-поглощения при 280 и 320 нм с использованием коэффициентов экстинкции лекарственного вещества и антитела при 280 нм (215000 М^-1см^-1) и 320 нм (9137 М^-1см^-1) соотношение лекарственное вещество/антитело (DAR) конъюгатов составило 2,2-2,9. Определенное с помощью SEC (эксклюзионной хроматографии) при использовании колонки TSK-Gel G300SWXL (7,8 мм × 300 мм, размер частиц 5 мкм) процентное содержание мономера в конъюгатах составило >90%. На основе УФ-поглощения пика мономера, полученного с помощью SEC, также продемонстрировали, что пики мономера конъюгата содержал присоединенные молекулы лекарственного вещества. Для анализа свободного (неконъюгированного) лекарственного вещества конъюгат экстрагировали ацетоном для удаления белка, высушивали, восстанавливали в подвижной фазе, впрыскивали в ОФ-ВЭЖХ-колонку VYDAC 208TP С8 (4,6×250 мм, размер частиц 7 мкм), и сравнивали со стандартами. Определили, что процент свободного лекарственного соединения в конъюгате составил <0,5% от содержания конъюгированного лекарственного соединения. См. Фиг.22.

[376] Получение конъюгата гуманизированное антитело-SPDB-2а:

[377] Гуманизированное антитело в концентрации 8 мг/мл модифицировали 4-6 молярными эквивалентами гетеробифункционального линкера SPDB в течение 1,5 ч при 25°С в 95% PBS, рН 7,4, содержащем 5% ДМА (об/об), а затем очищали на обессоливающей колонке G25 в цитратном буфере (35 мМ цитратный буфер, рН 5,5, содержащий 2 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl) для удаления непрореагировавшего линкера. LAR (соотношение линкер-антитело), определеемое путем измерений УФ-поглощения при 280 и 343 нм без и с добавлением 50 мМ дитиотреитола (для измерения общего содержания антитела и дитиотеитол-высвобождаемого SPy), составило 2,7-4,1. SPDB-модифицированное антитело в концентрации 2 мг/мл подвергали взаимодействию с 2 молярными эквивалентами соединения 2а (соли HCl) на присоединенный SPDB в течение 20 ч при комнатной температуре в 85% цитратном буфере, 15% ДМА (объем/объем), а затем очищали на обессоливающей колонке G25 в PBS, рН 7,4, для удаления неконъюгированного лекарственного соединения. DAR конечного конъюгата гуманизированное антитело-SPDB-2а измеряли с помощью УФ-спектрофотометрии при 280 и 350 нм; рассчитанное значение DAR составило ~1,7-2,1. Процентное содержание мономера и присоединенного лекарственного соединения на мономер в конъюгате определяли с помощью ВЭЖХ, используя колонку для SEC (эксклюзионной хроматографии). См. Фиг.23.

Пример 7

[378] Активность свободных лекарственных веществ и конъюгатов in vitro:

[379] Общая используемая процедура: Образцы неконъюгированных свободных лекарственных соединений или конъюгатов лекарственных веществ добавляли в 96-луночные плоскодонные планшеты для культивирования тканей и титровали, используя серийные разведения для перекрывания желательного молярного диапазона. Антиген-положительные (Ag⁺) или антиген-отрицательные (Ag^-) клетки добавляли в лунки из расчета определенной плотности клеток, обеспечивая трехкратные повторности образцов для каждой концентрации лекарственного вещества и для каждой соответствующей линии клеток. Затем планшеты инкубировали при 37°С в атмосфере 5% С0₂ в течение 4-5 дней в зависимости от линии клеток. COLO 205 (1000 клеток/лунку), Namalwa (3000 клеток/лунку), HEL 92.1.7 (3000 клеток/лунку) - 4 дня; RH30 (1000 клеток/лунку), HL60/QC (5000 клеток/лунку), Ramos (10000 клеток/лунку), KB (2000 клеток/лунку), BJAB (2000 клеток/лунку), NB4 (3000 клеток/лунку) - 5 дней, RPMI 8226 (8000 клеток/лунку) - 6 дней.

[380] В конце инкубационного периода оценивали цитотоксическую активность с помощью анализа жизнеспособности клеток на основе WST-8, и выжившие клетки определяли по развитию окраски с WST-8 (2-7 часов). Измеряли оптическую плотность в каждой лунке, долю выживших клеток при каждой концентрации наносили на график для выявления цитотоксичности и/или антигенной специфичности (конъюгатов).

[381] Используя общую методику, описанную выше, измеряли цитотоксичность неконъюгированных свободных лекарственных соединений по отношению к семи линиям клеток: KB, клеток-загрязнителей HeLa, HL60/QC, линии клеток острого миелолейкоза, Namalwa, линии клеток лимфомы Беркитта, NB4, линии клеток острого промиелоцитарного лейкоза, HEL92.1.7, линии клеток эритролейкоза, RPMI8226, линии клеток множественной миеломы и BJAB, линии клеток В-клеточного лейкоза. Результаты, показанные на Фиг.24 и в Таблице 10 демонстрируют высокую активность указанных соединений в широком диапазоне типов клеток. Активность и специфичность конъюгатов антитело-лекарственное вещество измеряли по отношению к антиген-экспрессирующим клеткам с добавлением и без добавления избыточного количества блокирующего неконъюгированного антитела с целью демонстрации специфичности цитотоксического действия. Конъюгат МУ9-6-лекарственное вещество являлся чрезвычайно активным по отношению к трем различным антиген-экспрессирующим клеткам: HL60/ATCC, HL60/QC и NB-4, несмотря на очень низкую экспрессию антигена в клетках NB4. Специфическую активность можно было блокировать добавлением избытка неконъюгированного антитела, что демонстрирует антиген-специфичность цитотоксического действия. Аналогично, конъюгат huFOLR1-лекарственное вещество эффективно уничтожал антиген-экспрессирующие клетки KB специфичным образом. Результаты показаны на Фигурах 25 и 26.

Таблица 10. Активность свободных лекарственных веществ по отношению к различным линиям клеток. Значения 1С5о, перечисленные в таблице, приведены в нМ. Namalwa KB HL60/QC NB4 HEL92.1.7 RPMI8226 BJAB 1с 0,056 0,16 0,023 1d 0,069 0,18 0,032 1е 2,4 >3,0 0,67 27d 0,23 0,05 0,039 0,14 0,07 0,04 27е 0,39 0,09 0,13 0,2 0,24 0,12 27f 4,4 1,7 1,1 1,8 >3,0 1 29а 0,002 0,004 0,001 0,0023 0,0031 0,011 0,001 29b 0,003 0,007 0,006 0,007 0,007 0,005 0,003 29с 0,013 0,057 0,03 0,023 0,027 0,16 0,015

[382] Аналогичные результаты также были получены с использованием других линий клеток и других конъюгатов по изобретению, включая: huMY9-6-SPDB-1f по отношению к клеткам HL60/QC (Ag⁺), клеткам HL60/ATCC (Ag⁺) и клеткам NB-4 (Ag⁺) (Фиг.25); huFOLR1-SPDB-1f по отношению к клеткам KB (Ag⁺) (Фиг.26); huMY9-6-SPDB-1f по отношению к антиген-положительным клеткам HL60/QC, клеткам HL60/ATCC, клеткам NB-4 и клеткам HEL 92.1.7 (Фиг.29); huMy9-6-SPDB-1f, huMy9-6-сульфоSРDВ-1f и huMy9-6-BMPS-1f по отношению к клеткам HL60/QC (Ag⁺) (Фиг.34); chB38.1-SPDB-1f и chB38.1-сульфоPDB-1f по отношению к клеткам COL0205 (Ag⁺) (Фиг.35); huMy9-6-SPDB-1f, huMy9-6-сульфоSРОВ-1f и huMy9-6-BMPS-1f по отношению к клеткам OCI-AML3 (Ag) (Фиг.44). Активность различных конъюгатов по отношению к различным линиям клеток, выраженную в виде значений IC₅₀ (нМ) см. также на Фиг.49. Следует отметить, что на Фиг.25, 29, 34, 35 и 44 конъюгаты получали в присутствии бисульфита натрия.

[383] Для сравнения измерений активности in vitro для рассматриваемых конъюгатов, полученных с и без реагента, способного взаимодействовать с иминами, например, бисульфита натрия, получали huMy9-6-BMPS-1f, huMy9-6-сульфо-SPDB-1f и huMy9-6-лекарственное вещество 2 с и без бисульфита натрия, используя способ сульфирования in situ (где соответствующие соединения по изобретению вначале смешивали с бисульфитом натрия и бифункциональным сшивающим агентом, несущим реакционноспособную группу, а затем реакционную смесь без дополнительной очистки подвергали взаимодействию с моноклональным антителом huMy9-6 в качестве агента, связывающегося с клетками). Значения IC₅₀ для конъюгатов по отношению к клеткам HL60-QC показаны ниже. Данные показывают, что включение группы, способной взаимодействовать с иминами (например, бисульфита натрия) на этапе получения конъюгата не оказывало отрицательного влияния на активность рассматриваемых конъюгатов in vitro.

Конъюгат Обработка NaHSO₃ IC₅₀ (пМ) IC₅₀ (ПМ)блокирующего huMy9-6 huMy9-BMPS-1f - 2 130 + 1,5 55 huMy9-6-сульфо-SPDB-1f - 5,6 1200 + 7,1 610 huMy9-6-лекарственное вещество 2 - 16 >3000 + 6,8 >3000

[384] Очевидно, что предварительная обработка лекарственных соединений бисульфитом натрия (5 молярных эквивалентов, 22 ч, 4°С, 90:10 ДМА: вода рН 5,5) перед конъюгированием с huMy9-6 не оказывает значительного влияния на антиген-зависимую или антиген-независимую (блокирование антигена 1 мкМ неконъюгированного huMy9-6) активность конъюгатов in vitro.

Пример 8

[385] Связывание конъюгата антитело-лекарственное вещество аналогично связыванию немодифицированного антитела:

[386] Связывание конъюгата huMY9-6-лекарственное вещество сравнивали со связыванием немодифицированного антитела huMY9-6 по отношению к антиген-экспрессирующим клеткам HL60/QC с использованием проточной цитометрии. Вкратце, антиген-положительные клетки инкубировали с конъюгатами или немодифицированными антителами при 4°С, затем с конъюгатом вторичное антитело-ПТС при 4°С, фиксировали формальдегидом (1% в PBS) и анализировали с помощью проточной цитометрии. Между связыванием конъюгата и связыванием немодифицированного антитела не наблюдалось существенных различий. На Фиг.27 показан пример, в котором конъюгат huMY9-6-лекарственное вещество, связывался с антиген-положительными клетками с высоким сродством, аналогичным сродству немодифицированного антитела.

Пример 9

[387] Активность конъюгата huMY9-6-SPDB-1f in vivo у голых мышей, несущих опухоли HL60/QC:

[388] В настоящем исследовании изучали противоопухолевую активность huMY9-6-SPDB-1f на самках голых мышей, несущих опухоли HL60/QC, модели острого миелолейкоза человека. Опухолевые клетки HL60/QC из расчета 2×10⁶ клеток/мышь подкожно инокулировали в объеме 0,1 мл/мышь в область над правым плечом самок бестимусных голых мышей 5-недельного возраста. Через восемь дней после инокуляции опухолевых клеток мышей случайным образом распределяли на группы (п=6 на группу) по объему опухоли. Лечение начинали в день распределения, группы, включая контрольную группу, получали PBS (200 мкл/инъекцию), или однократное лечение различными дозами (от 5 до ЮО.мкг/кг) huMY9-6-SPDB-1f (доза 1f 50 мкг/кг соответствовала дозе антитела 2,5 мг/кг). Все процедуры хорошо переносились при средней потере массы тела, сравнимой с потерей, наблюдаемой у контрольных мышей, получавших PBS. Показана зависимость среднего объема опухоли от времени (Фиг.28 и 36); данные демонстрируют зависимую от дозы противоопухолевую активность конъюгата huMY9-6-SPDB-1f. Минимальная эффективная доза, по оценкам, составила 20 мкг/кг, что приблизительно в 35 раз ниже максимальной переносимой дозы.

Пример 10

[389] Переносимость конъюгатов huFOLR-1 исследовали на самках мышей CD-1. Животных наблюдали в течение семи дней до начала исследования и признали здоровыми. Мышам вводили однократную в/в инъекцию конъюгата и ежедневно отслеживали у животных потерю массы тела, заболеваемость или смертность. В Таблице 9 показано, что конъюгат huFOLR1-лекарственное вещество 1 переносился только в минимальной протестированной дозе 50 мкг/кг. В противоположность этому обнаружено, что оба моноиминных конъюгата huFOLR1-лекарственное вещество 2 и huFOLR1-SPDB-1f переносились лучше, причем их максимальная переносимая доза составила <198 мкг/кг и >560 мкг/кг, соответственно.

Таблица 9. Данные по сравнению переносимости конъюгатов (А) huFOLR1-лекарственное вещество 1, (В) huFOLR1-лекарственное вещество 2 и (С) huFOLR1-SPDB-1f.

[390] Соединение 10:

[391] К перемешиваемому раствору 1f (18 мг, 0,019 ммоль) и N-(β-малеимидпропилокси)сукцинимидного (BMPS) эфира (9,2 мг, 0,034 ммоль) в безводном дихлорметане (0,3 мл) добавляли безводный диизопропилэтиламин (5 мкл, 0,029 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 27 часов, останавливали реакцию насыщенным раствором хлорида аммония и разбавляли смесь дихлорметаном. Органический слой промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка С 18, CH₃CN/H₂O). Фракции, содержащие продукт, объединяли, экстрагировали дихлорметаном и упаривали, получая соединение 10 в виде белого твердого вещества (7,6 мг, выход=33%). МС (m/z): найденное значение 1208,3 (М+Н)⁺. См. Фиг.13.

Пример 12

[392] Соединение 12:

[393] К перемешиваемому раствору 1f (16,5 мг, 0,018 ммоль) и сульфо-SPDB (14,2 мг, 0,036 ммоль) в безводном дихлорметане (0,3 мл) добавляли безводный диизопропилэтиламин (9 мкл, 0,054 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка С 18, CH₃CN/H₂O). Фракции, содержавшие продукт, объединяли, экстрагировали дихлорметаном и упаривали, получая 6,6 мг соединения 12 в виде желтоватой пены. Водный слой лиофилизировали, получая еще 0,5 мг соединения 12 в виде белого твердого вещества. МС (m/z): найденное значение 1235,0 (М-Н)^-. См. Фиг.15.

Пример 13

[394] Получение конъюгата гуманизированное антитело-сульфо8РОВ-1f

[395] В реакционной смеси, содержащей 2,5 мг/мл антитела huMy9-6 и 10 молярных эквивалентов 10 (предварительно обработанную 5-кратным избытком бисульфита натрия в 90:10 смеси ОМА:вода) в 50 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота)-буфере с рН 8,5 и сорастворителе 15% об/об ДМА (N,N-диметилацетамиде), обеспечивали образование конъюгата в течение 6 часов при 25°С. После реакции конъюгат очищали и заменяли буфер на буфер для состава, содержавший 250 мМ глицина, 10 мМ гистидина, 1% сахарозу, 0,01% Твин, 50 мкМ бисульфита натрия, с помощью обессоливающей колонки NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Диализ осущестляли в этом же буфере в течение 4 часов при комнатной температуре, используя кассеты для диализа Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 20000 MWCO). Было установлено, что очищенный конъюгат характеризовался значением DAR 2,4 (согласно UV-Vis при использовании молярных коэффициентов экстинкции ε_{330 нм}=15,484 см^-1 М^-1, ε_{280 нм}=30,115 см^-1 М^-1 для 1f, и ε_{280 нм}=146,000 см^-1 М^-1 для антитела My9-6), содержанием мономера 96,7% (согласно эксклюзионной хроматографии), содержанием неконъюгированного свободного лекарственного вещества <1% (согласно экстракции ацетоном/обращенно-фазовой ВЭЖХ) и конечной концентрацией белка 1,4 мг/мл.

[396] Активность конъюгатов антитело-сульфоЗРОВ-И in vitro измеряли в соответствии с общей методикой, описанной в Примере 7; данные показаны на Фигурах 34 и 35. Конъюгаты антитело-сульфоSPDВ-1f обладали сопоставимой или более высокой активностью по сравнению с конъюгатами антитело-SPDB-1f.

[397] Использование реагентов, способных к образованию ковалентных связей с иминами, например, бисульфита натрия, улучшало характеристики конъюгата антитело-соединение (например, % мономера и медикаментозную нагрузку). В одном эксперименте образование аддукта проводили с использованием 5 молярных эквивалентов иминного реагента по отношению к NHS-BMPS-1f в 90% ДМСО/10% PBS, рН 7,4, в течение 4 ч при 25°С. Затем реакционную смесь добавляли к антителу huMy9-6 (4 молярных эквивалента IGN, 2 мг/мл, 10% объем/объем ДМСО, 50 мМ HEPES-буфера, рН 8,5, 5 ч, 25°С). Конъюгаты, полученные с использованием гидросульфита натрия, бисульфита натрия или метабисульфита натрия обладали аналогичным соотношением IGN/антитело и процентным содержанием мономера, в то время как конъюгаты, полученные без обработки вспомогательной добавкой, обладали крайне низким уровнем встраивания лекарственного вещества. См. таблицу ниже.

Реагент IGN/антитело (UV) % мономера(ЭХ) % 1f на мономер Гидросульфит натрия 2,6 88 82 Бисульфит натрия 2,6 88 83 Метабисульфит натрия 2,7 88 82 Без добавки 0,1 98 94

Пример 14

[398] Получение конъюгата гуманизированное антитело-BMPS-1f [399] В реакционной смеси, содержащей 2,0 мг/мл антитела huMy9-6 и 5 молярных эквивалентов 12 (предварительно обработанного 5-кратным избытком бисульфита натрия в 90:10 смеси ДМА:вода) в 50 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота)-буфере с рН 8,5 и сорастворителе 15% об/об ДМА (N,N-диметилацетамиде), обеспечивали осуществление реакции в течение 6 часов при 25°С. После реакции конъюгат очищали и заменяли буфер на буфер для состава, содержавший 250 мМ глицина, 10 мМ гистидина, 1% сахарозу, 0,01% Твин, 50 мкМ бисульфита натрия, с помощью обессоливающей колонки NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Диализ осуществляли в этом же буфере в течение 4 часов при комнатной температуре, используя кассеты для диализа Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 20000 MWCO). Было установлено, что очищенный конъюгат характеризовался значением DAR 2,8 (согласно UV-Vis при использовании молярных коэффициентов экстинкции ε_{330 нм}=15,484 см^-1 М^-1, ε_{280 нм}=30,115 см^-1 М^-1 для 1f, и ε_{330 нм}=146,000 см^-1 М^-1 для антитела My9-6), содержанием мономера 91,7% (согласно эксклюзионной хроматографии), содержанием неконъюгированного свободного лекарственного вещества <1% (согласно экстракции ацетоном/обращенно-фазовой ВЭЖХ) и конечной концентрацией белка 1,2 мг/мл.

[400] Активность конъюгатов антитело-BMPS-1f т vitro измеряли в соответствии с общей методикой, описанной в Примере 7; данные показаны на Фиг.34 и 35. Конъюгаты антитело-BMPS-1f обладали сопоставимой активностью по сравнению с конъюгатами антитело-SPDB-1f.

Пример 15

[401] Активность конъюгата hu FOLR1-SPDB-1f m vivo у голых мышей, несущих опухоли KB:

[402] В настоящем исследовании изучали противоопухолевую активность hu FOLR1-SPDB-1f на самках голых мышей, несущих опухоли KB, модели карциномы шейки матки человека. Клетки KB из расчета 1×10⁷ клеток/мышь подкожно инокулировали в объеме 0,1 мл/мышь в область над правым плечом самок бестимусных голых мышей 6-недельного возраста. Через щесть дней после инокуляции опухолевых клеток мышей случайным образом распределяли на группы (n=6 на группу) по объему опухоли. Лечение начинали на следующий день после распределения, группы, включая контрольную группу, получали PBS (200 мкл/инъекцию), или однократное лечение различными дозами (от 20 до 200. мкг/кг) hu FOLR1-SPDB-1f (доза присоединенного лекарственного вещества 50 мкг/кг соответствовала дозе антитела 2,8 мг/кг). Все процедуры хорошо переносились, причем ни в одной из экспериментальных групп не наблюдали потери массы тела. Показана зависимость среднего объема опухоли от времени (Фиг.37); данные демонстрируют зависимую от дозы противоопухолевую активность конъюгата hu FOLR1-SPDB-1f. Минимальная эффективная доза, по оценкам, составила <50 мкг/кг, что приблизительно в 14 раз ниже максимальной переносимой дозы.

[403] Аналогичные результаты также были получены т vivo с использованием других конъюгатов по изобретению по отношению к другим моделям рака, включая huMy9-6-сульфо-SPDB-1f у мышей, несущих опухоли MOLM-13 (Фиг.50); huMy9-6-сульфо-SPDB-1f у мышей, несущих опухоли NB4 (Фиг.51); huMy9-6-BMPS-1f у мышей, несущих опухоли HL60/QC (Фиг.52); huMy9-6-BMPS-1f у мышей, несущих опухоли MOLM-13 (Фиг.53); пиМу9-6-лекарственное вещество 2 у мышей, несущих опухоли HL60/QC (Фиг.56), а также huMy9-6-лекарственное вещество 2 у мышей, несущих опухоли MOLM-13 (фиг.57). Следует отметить, что на Фиг.53, 54, 56 и 57 конъюгаты получали в присутствии бисульфита натрия.

[404] Для сравнения активности in vivo рассматриваемых конъюгатов, полученных с использованием или без использования группы, способной взаимодействовать с иминами, получали huMy9-6-лекарственное вещество 2 с или без использования 50 мкМ бисульфита натрия, и указанные конъюгаты использовали для лечения мышей, несущих ксенотрансплантаты опухоли HL60-QC. Приведенные ниже данные показывают, что конъюгат, составленный с или без 50 мкМ бисульфита натрия, обладал сопоставимым Т/С% при дозе лекарственного вещества ~20 мкг/кг, что указывает на отсутствие отрицательного влияния включения бисульфита натрия на этапе получения конъюгата на активность рассматриваемого конъюгата in vivo.

NaHSO₃ Минимальная эффективная доза (мкг/кг лекарственного вещества) Т/С % - 18 20 + 19 16

Пример 16

[405] Соединение 27b:

[406] (5-((2-меркапто-2-метилпропилтио)метил)-1,3-фенилен)диметанол: (5-(меркаптометил)-1,3-фенилен)диметанол (0,163 г, 0,885 ммоль) растворяли в метаноле (3 мл) в небольшом флаконе и добавляли мешалку. К указанному раствору добавляли триэтиламин (0,016 мл, 0,118 ммоль) с последующим добавлением 2,2-диметилтиирана (0,058 мл, 0,590 ммоль), полученную смесь закрывали и перемешивали в течение ночи (16 часов) при комнатной температуре. Затем реакционную смесь концентрировали, повторно растворяли в дихлорметане, загружали на пластину с силикагелем для препаративной ТСХ (1000 микрон) и проявляли пластину, используя 10% метанол в дихлорметане. Полосу, соответствующую продукту, собирали, фильтровали с чистым этилацетатом и концентрировали, получая (5-((2-меркапто-2-метилпропилтио)метил)-1,3-фенилен)диметанол (0,095 г, 0,349 ммоль, выход 59,1%). ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 7,26 (с, 3Н), 4,69 (с, 4Н), 3,82 (с, 2Н), 2,74 (с, 2Н), 2,17 (с, 1Н), 2,12 (шс, 2Н), 1,43 (с, 6Н); ¹³С-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 141,6, 138,9, 126,7, 124,3, 65,0, 49,0, 45,4, 38,4, 31,5; MC (m/z), прогнозируемое значение: 272,4, найденное значение 295,0 (M+Na). См. Фиг.30.

[407] Соединение 27 с:

[408] (5-((2-метил-2-(метилдисульфанил)пропилтио)метил)-1,3-фенилен)диметанол: (5-((2-меркапто-2-метилпропилтио)метил)-1,3-фенилен)диметанол (0,120 г, 0,440 ммоль) растворяли в этаноле (5 мл) и 1,0 М калий-фосфатном буфере (рН 7) (5,00 мл) и охлаждали на ледяной бане (образованием продукта на уровне триллионных долей пренебрегали). Добавляли S-метилметансульфонотиоат (0,083 мл, 0,881 ммоль) и перемешивали смесь в течение ночи с постепенным (в течение 30 минут) нагреванием до комнатной температуры. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном, органический слой отделяли, промывали водой, высушивали над безводным сульфатом натрия и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в дихлорметане, наносили на 500-микронные пластины для препаративной ТСХ и проявляли 66% этилацетатом в гексане. Полосу, соответствующую продукту, собирали, фильтровали с этилацетатом и концентрировали, получая (5-((2-метил-2-(метилдисульфанил)пропилтио)метил)-1,3-фенилен)диметанол (0,091 г, 0,286 ммоль, выход 64,9%). 1Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 7,27 (с, 3Н), 4,71 (с, 4Н), 3,78 (с, 2Н), 2,77 (с, 2Н), 2,41 (с, 3Н), 1,94 (br s, 2Н), 1,38 (с, 6Н); ¹³С-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 141,6, 139,0, 126,7, 124,2, 65,0, 51,8, 44,0, 38,2, 26,7, 25,3; MC (m/z), прогнозируемое значение: 341,5, найденное значение 341,1 (M+Na). См. Фиг.30.

[409] Соединение 27d:

[410] (5-((2-метил-2-(метилдисульфанил)пропилтио)метил)-1,3-фенилен)диметанол (80 мг, 0,251 ммоль) в безводном дихлорметане (1,75 мл) охлаждали до -5°С на бане насыщенный раствор NaCl/лед. Добавляли триэтиламин (105 мкл, 0,753 ммоль) с последующим добавлением метансульфонилхлорида (50,7 мкл, 0,653 ммоль) при -5°С. Реакционную смесь перемешивали при -5°С в течение одного часа, после чего ее разбавляли холодным этилацетатом и добавляли лед. Смесь переносили в делительную воронку и экстрагировали холодным этилацетатом. Органические экстракты промывали ледяной водой, а затем высушивали над безводным сульфатом магния и натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный (5-((2-метил-2-(метилдисульфанил)пропилтио)метил)-1,3-фенилен)-бис-(метилен)диметансульфонат использовали без дальнейшей очистки.

[411] К (5-((2-метил-2-(метилдисульфанил)пропилтио)метил)-1,3-фенилен)-бис-(метилен)диметансульфонату (119 мг, 0,251 ммоль) добавляли мономер IBD (177 мг, 0,602 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (1,75 мл) при комнатной температуре. Добавляли карбонат калия (173 мг, 1,253 ммоль) и оставляли перемешиваться реакционную смесь при комнатной температуре в течение 20 часов. Реакцию останавливали водой и экстрагировали реакционную смесь дихлорметаном. Экстракты промывали насыщенным раствором NaCl, а затем высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в глубоком вакууме. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией на силикагеле (чистый ДХМ→2% МеОН/ДХМ). Фракции, содержавшие продукт, объединяли, концентрировали и очищали с помощью полупрепаративной ОФ-ВЭЖХ (С 18, А=деионизованная вода, В=ACN, 20 мл/мин). Фракции, содержавшие желательный продукт, объединяли, экстрагировали дихлорметаном, высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали, получая желательный продукт (46 мг, 21%). ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 8,19 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,77 (м, d, J=4,4 Гц, 2Н), 7,50 (с, 2Н), 7,34 (с, 1Н), 7,31 (с, 2Н), 7,19 (м, 4Н), 7,03 (т, J=7,2, 7,6 Гц, 2Н), 6,77 (с, 2Н), 5,14 (м, 4Н), 4,40 (м, 2Н), 3,91 (с, 6Н), 3,70 (м, 2Н), 3,63 (м, 2Н), 3,41 (м. 2Н), 2,65 (с, 2Н), 2,29 (с, 3Н), 1,26 (с, 6Н). МС (m/z), рассч. значение 893,2 (М+Na)⁺; найденное значение 893,2 (М+Na)⁺, 911,2 (М+Н₂О+Na)⁺, 929,2 (М+2H₂O+Na)⁺, 945,1 (М+2H₂O+K)⁺. См. Фиг.30.

[412] Соединение 27е и 27f:

[413] К охлажденному раствору (0°С) 27d (50 мг, 0,057 ммоль) в безводном дихлорметане (225 мкл) и этаноле (450 мкл) добавляли боргидрид натрия (0,651 мг, 0,017 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение пяти минут при 0°С, а затем при комнатной температуре в течение 2,5 ч. Реакционную смесь охлаждали до 0°С, реакцию останавливали насыщенным раствором хлорида аммония и экстрагировали смесь дихлорметаном. Органические экстракты промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали через целит и концентрировали. Неочищенный материал очищали с помощью полупрепаративной ОФ-ВЭЖХ (С 18, А=деионизованная вода, В=ACN, 20 мл/мин). Фракции, содержащие желательный продукт, объединяли, экстрагировали дихлорметаном, высушивали безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали, получая моновосстановленный амин 27е (11 мг, 22%) МС (m/z), рассч. значение 895,3 (M+Na)⁺ найденное значение 895,2 (М+Na)⁺, 913,2 (М+H₂O+Na)⁺, 929,2 (М+W+K)⁺, и дивосстановленный амин 27f (5 мг, 10%) МС (m/z), рассч. значение 897,3 (M+Na)⁺, найденное значение 897,3 (М+Na)⁺. См. Фиг.30.

[414] Соединение 27g:

[415] К перемешиваемому раствору 27е (10 мг, 0,011 ммоль) в метаноле (733 мкл) и ацетонитриле (880 мкл) добавляли трис(2-карбоксиэтил)фосфингидрохлорид (9,85 мг, 0,034 ммоль) в буфере 6,5 (147 мкл). Смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном. Добавляли воду и разделяли слои. Органический слой промывали насыщенным раствором Nad, высушивали безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая соединение 27g (9 мг, 95%). МС (m/z), рассч. значение 849,3 (М+Na)⁺; найденное значение 849,2 (М+Na)⁺, 867,2 (М+K)⁺. См. Фиг.30.

[416] Соединение 27h:

[417] К перемешиваемому раствору 27g (9 мг, 10,88 мкмоль) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-4-(пиридин-2-илдисульфанил)бутаноата (9,3 мг, 0,023 ммоль) в безводном дихлорметане (0,4 мл) добавляли безводный диизопропилэтиламин (9 мкл, 0,054 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Реакцию останавливали насыщенным раствором хлорида аммония и экстрагировали смесь дихлорметаном. Экстракты промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали безводным сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка С 18, CH₃CN/H₂O). Фракции, содержавшие продукт, объединяли, экстрагировали дихлорметаном и упаривали, получая соединение 27h (5 мг, 44%). МС (m/z), рассч. значение 1064,3 (М+Na)⁺; найденное значение 1064,1 (М+Na)⁺, 1082,1 (М+H₂O+Na)⁺, 1098,1 (М+H₂O+K)⁺. См. Фиг.30.

Пример 17

[418] Соединение 28b:

[419] (5-(метил(2-метил-2-(метилдисульфанил)пропил)амино)-1,3-фенилен)диметанол (52 мг, 0,172 ммоль) растворяли в безводном дихлорметане (1,7 мл) и охлаждали до -5 на ацетон/ледяной бане. Вначале добавляли триэтиламин (0,120 мл, 0,862 ммоль), а затем метансульфонилхлорид (0,040 мл, 0,517 ммоль). Смесь перемешивали на бане в течение 1 часа. Затем реакционную смесь разбавляли холодным этилацетатом и трижды промывали холодной водой, а затем высушивали над безводным сульфатом магния. Димезилат отфильтровывали, концентрировали в вакууме и помещали в глубокий вакуум до полного высыхания. Указанный продукт использовали как есть непосредственно на следующем этапе.

[420] К (5-(метил(2-метил-2-(метилдисульфанил)пропил)амино)-1,3-фенилен)-бис-(метилен)диметансульфонату (72 мг, 0,156 ммоль) добавляли мономер IBD (115 мг, 0,39 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (1,5 мл) при комнатной температуре. Добавляли карбонат калия (108 мг, 0,780 ммоль) и оставляли перемешиваться реакционную смесь при комнатной температуре в течение 20 часов. Непосредственно в смесь при перемешивании добавляли воду (10 мл), что приводило к образованию белого осадка. Смесь фильтровали, а твердые вещества промывали дополнительными порциями воды. Затем твердое вещество растворяли в дихлорметане, экстрагировали водой, органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме, получая соединение 28b (104 мг, 78%), которое использовали на следующем этапе без дальнейшей обработки. МС (m/z), найденное значение 912,1 (М+2H₂O+Na). См фиг.31.

[421] Соединение 28с и 28d:

[422] Соединение 28b (55 мг, 0,064 ммоль) растворяли в безводной смеси дихлорметана (0,4 мл) и этанола (0,8 мл) и охлаждали до 0°С на ледяной бане. Затем добавляли боргидрид натрия (0,731 мг, 0,019 ммоль), растворенный в этаноле (100 мкл), смесь перемешивали в течение 5 минут и удаляли ледяную баню. Реакционную смесь оставляли перемешиваться в течение 2 часов, останавливали реакцию при низкой температуре путем добавления насыщенного раствора хлорида аммония и дихлорметана, разделяли, органический слой промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали с помощью полупрепаративной ОФ-ВЭЖХ (С18, А=деионизованная вода, В=ACN, 20 мл/мин). Фракции, содержавшие желательные продукты, экстрагировали дихлорметаном и концентрировали с получением моноимина 28с (19 мг, 32%), МС (m/z), прогнозированное значение: 855,1, найденное значение: 896,2 (М+H₂O+Na) и дивосстановленного амина 28d (22 мг, 38%) MS (m/z), прогнозированное значение: 857,1, найденное значение: 880,2 (М+Na)⁺. См. Фиг.31.

Пример 18

[423] Соединение 29b и 29с:

[424] Соединение 29а (60 мг, 0,043 ммоль) растворяли в безводной смеси дихлорметана (0,25 мл) и этанола (0,5 мл) и охлаждали до 0°С на ледяной бане. Затем добавляли боргидрид натрия (0,493 мг, 0,013 ммоль), растворенный в этаноле (50 мкл), смесь перемешивали в течение 5 минут и удаляли ледяную баню. Реакционную смесь оставляли перемешиваться в течение 3 часов, останавливали реакцию при низкой температуре путем добавления насыщенного раствора хлорида аммония и дихлорметана, разделяли, органический слой промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали с помощью полупрепаративной ОФ-ВЭЖХ (С 18, А=деионизованная вода, В=ACN, 20 мл/мин). Фракции, содержавшие желательные продукты, экстрагировали дихлорметаном и концентрировали с получением моноимина 29b (20 мг, 33%), МС (m/z), прогнозированное значение: 715,7, найденное значение: 715,2 (М+Na)⁺, 733,2 (М+Н₂О+Na)⁺, 749,2 (M+H₂O+K)⁺, и дивосстановленного амина 29 с (12 мг, 20%) МС (m/z), прогнозированное значение: 694,7, найденное значение: 717,2 (М+Na)⁺. См. Фиг.32.

Пример 19

[425] Соединение 30а:

[426] (5-((2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)(2-метил-2-(метилдисульфанил)пропил)амино)-1,3-фенилен)-бис-(метилен)диметансульфонат (0,566 г, 0,960 ммоль) растворяли в ацетоне (30 мл) и при энергичном перемешивании добавляли раствор иодида натрия (0,544 г, 3,63 ммоль), растворенного в ацетоне (2 мл). Реакцию контролировали с помощью ТСХ (50% этилацетат в гексане), через 2 часа реакционную смесь фильтровали, концентрировали в вакууме и к остатку добавляли дихлорметан. Остающуюся в осадке твердую соль отфильтровали, фильтрат концентрировали и полученный остаток очищали на силикагеле с помощью смеси этилацетат:гексан:дихлорметан 3:5:2, получая 3,5-бис-(иодметил)-N-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)-N-(2-метил-2-(метилдисульфанил)пропил)анилин (0,505 г, 0,773 ммоль, 74,5% выход) в виде желтого масла. ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 6,75 (с, 2Н), 6,73 (с, 1Н), 4,38 (с, 4Н), 3,63 (м, 14Н), 3,40 (с.3Н), 2,50 (с, 3Н), 1,38 (с, 6Н); ¹³С-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 148,7, 140,3, 117,3, 113,4, 71,9, 70,7, 70,6, 67,2, 59.8, 59,1, 53,5, 53,4, 51,8, 26,5, 25,6, 6,11; МС (m/z), рассч. значение 676,0 (М+Na)⁺. найденное значение 675,8 (М+Na)⁺. См. Фиг.33.

[427] Соединение 30b:

[428] Мономер IBD (0,060 г, 0,204 ммоль) растворяли в ацетоне (4 мл) в небольшом флаконе, добавляли мешалку с последующим добавлением 3,5-бис-(иодметил)-N-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)-N-(2-метил-2-(метилдисульфанил)пропил)анилина (0,167 г, 0,255 ммоль) и карбоната калия (0,070 г, 0,510 ммоль). Флакон закрывали и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Твердые вещества отфильтровывали, а фильтрат концентрировали. Остаток растворяли в дихлорметане, экстрагировали водой, органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме, получая 108 мг неочищенного материала. Неочищенный материал очищали на силикагеле с использованием 30% этилацетата с целью удаления дииодированного исходного материала, а затем 10% метанола в дихлорметане, получая желательный продукт 30b (21 мг, 0,026 ммоль, 13%). МС (m/z), прогнозированное значение: 819,1, найденное значение: 858,0 (М+K)⁺, 890,0 (М+СН₃ОН+K)⁺. См. Фиг.33.

[429] Соединение 1d:

[430] Восстановленный мономер 3b (4,16 мг, 0,014 ммоль) растворяли в ацетоне (2 мл) в небольшом флаконе, добавляли мешалку с последующим добавлением 30b (10 мг, 0,012 ммоль) и карбоната калия (4,21 мг, 0,030 ммоль). Флакон закрывали и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали с целью удаления ацетона, а затем растворяли в дихлорметане, экстрагировали водой, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на С18, получая 1d (2,1 мг, 2,125 мкмоль, выход 17,42%). МС (m/z): найденное значение 1010,4 (М+Na)⁺. 1028,4 (М+H₂O+Na)⁺. См. Фиг.33.

Пример 20 Синтез соединения 1

[431] Соединение 1:

[432] К перемешиваемой суспензии 1f (226 мг, 0,24 ммоль) в IPA (20 мл) и деионизированной воде (10 мл) добавляли бисульфит натрия (50 мг, 0,48 ммоль). Смесь интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Смесь замораживали сухим льдом/ацетоном и лиофилизировали. Полученное белое рыхлое твердое вещество растворяли в CH₃CN/H₂O и очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка С18, CH₃CN/H₂O). Фракции, содержавшие желательный продукт, объединяли, замораживали сухим льдом/ацетоном и лиофилизировали, получая желательное соединение 1 в виде белого рыхлого твердого вещества (179,6 мг, 5=71,6%). MC (m/z): найденное значение 1022,0 (М-Н)^-. См. Фиг.38.

Пример 21 Синтез соединения 9с

[433] Соединение 9с:

[434] К перемешиваемому раствору 1 с (60 мг, 0,061 ммоль) в CF^CN (3 мл) добавляли свежеприготовленный раствор ТСЕР (49 мг, 0,17 ммоль соли ТСЕР и HCl нейтрализовали насыщенным раствором бикарбоната натрия до рН ~6,5, затем разбавляли 0,5 мл фосфатного буфера, рН 6,5) при комнатной температуре. Добавляли МеОН (2,5 мл) и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и деионизированной водой, разделяли, органический слой промывали насыщенным раствором Nad, высушивали над безводным Na₂SO₄ и фильтровали. Фильтрат упаривали и подвергали воздействию глубокого вакуума, получая 60 мг 1h в виде светло-желтоватой пены. MC (m/z): найденное значение 940,1 (М+Н)⁺. Его растворяли в метаноле (1,0 мл) и CH₃CN (1,4 мл) с последующим добавлением иодуксусной кислоты (24 мг, 0,13 ммоль), деионизированной воды (0,1 мл) и карбоната калия (27 мг, 0,19 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи (под контролем ЖХМС). Реакцию останавливали насыщенным раствором хлорида аммония с целью закисления раствора, затем разбавляли дихлорметаном, разделяли и промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным Na₂SO₄, фильтровали и упаривали, получая соединение 9 с (57,8 мг, выход=91%), которое непосредственно использовали на следующем этапе без дополнительной очистки. MC (m/z): найденное значение 998,1 (М+Н)⁺. См. Фиг.12А.

[435] Соединение 9а:

[436] К перемешиваемому раствору соединения 9с (57,8 мг, 0,058 ммоль) в безводном дихлорметане (0,2 мл) и абсолютном этаноле (0,6 мл) добавляли NaBH₄ (2,5 мг, 0,066 ммоль) при 0°С. Ледяную баню удаляли и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 3 часов, затем останавливали реакцию насыщенным раствором хлорида аммония, разбавляли дихлорметаном, разделяли и промывали органический слой насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным Na2S04, фильтровали через целит и упаривали. Остаток очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка С18, CH₃CN/H₂O). Фракции, содержащие продукт, экстрагировали дихлорметаном и упаривали, получая соединение 9а (13,0 мг, выход=22%). МС (m/z), найденное значение 1000,0 (М+Н)⁺, 1015,9 (М+Н₂О-Н)^-. См. Фиг.12А.

[437] Соединение 9а:

[438] К раствору свободного тиола 1f (45 мг, 0,048 ммоль) и иодуксусной кислоты (18 мг, 0,096 ммоль) в метаноле (1,0 мл) и CH₃CN (1,4 мл) добавляли деионизованную воду (0,1 мл) и карбонат калия (20 мг, 0,14 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи (под контролем ЖХМС). Реакцию останавливали насыщенным раствором хлорида аммония с целью закисления раствора, затем разбавляли дихлорметаном, разделяли и промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным Na₂SO₄, фильтровали и упаривали. Остаток очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (С 18, CH₃CN/H₂O). Фракции чистого продукта (согласно МС) экстрагировали дихлорметаном, упаривали до получения желательной кислоты 9а (18 мг, выход=38%). МС (m/z): найденное значение 1000,1 (М+H)⁺. См. Фиг.12В.

Пример 22 Синтез соединения 1d

[439] Соединение 1d:

[440] К перемешиваемому раствору соединения 1с (178 мг, 0,18 ммоль) в безводном дихлорметане (1,2 мл) и абсолютном этаноле или безводном метаноле (0,1 мл) по каплям добавляли 5-этил-2-метилпиридинборан (РЕМВ, 0,017 мл, 0,11 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа и останавливали реакцию 88% муравьиной кислотой. Смесь подщелачивали насыщенным раствором NaHCO₃, разбавляли дихлорметаном, разделяли, органический слой промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным Na₂SO₄, фильтровали через целит и упаривали. Остаток растворяли в CH₃CN/H₂O/88% НСООН (5:1:0,05) и очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (С 18, CH₃CN/H₂O). Фракции, содержавшие чистый продукт, экстрагировали дихлорметаном и упаривали, получая соединение 1d (56 мг, выход=31%). МС (m/z): найденное значение 988,1 (М+Н)⁺. См. Фиг.39.

[441] Соединение 1d:

[442] К перемешиваемому раствору соединения 1 с (71 мг, 0,072 ммоль) в безводном 1,2-дихлорэтане (0,8 мл) добавляли триацетоксиборгидрид натрия (14 мг, 0,65 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, останавливали реакцию насыщенным раствором NaHCO₃, разбавляли смесь дихлорметаном, разделяли, органический слой промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным Na₂SO₄, фильтровали через целит и упаривали. Остаток растворяли в CH₃CN/H₂O/88% НСООН (5:1:0,05) и очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (С18, СН₃СН/Н₂О). Фракции, содержавшие чистый продукт, экстрагировали дихлорметаном и упаривали, получая соединение 1d (17 мг, выход=24%). МС (m/z): найденное значение 988,1 (М+Н)⁺. Кроме того, восстанавливали непрореагировавший исходный материал 1с (24 мг, выход=34%). См. Фиг.40.

Пример 23 Синтез соединения 31с

[443] Соединение 31а:

[444] К раствору соединения 1f (57,8 мг, 0,061 ммоль) и метил-4-бромбутирата (22 мг, 0,12 ммоль) в метаноле (1,0 мл) и CH₃CN (1,0 мл) добавляли деионизованную воду (0,1 мл) и карбонат калия (17 мг, 0,12 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем останавливали реакцию насыщенным раствором хлорида аммония, смесь разбавляли дихлорметаном, разделяли и промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным Na₂SO₄, фильтровали и упаривали. Остаток очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (С18, CH₃CN/H₂O), получая желательный продукт 31а (14 мг, выход=22%) в виде желтоватой пены. МС (m/z): найденное значение 1042,1 (М+Н)⁺. См. Фиг.41.

[445] Соединение 31b:

[446] К раствору метилового эфира 31а (14 мг, 0,013 ммоль) в безводном 1,2-дихлорэтане (1,5 мл) добавляли гидроксид триметилолова (36 мг, 0,2 ммоль). Смесь перемешивали в течение ночи на 80°С масляной бане до полного израсходования исходного материала. Смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли дихлорметаном, промывали насыщенным раствором NaCl/капельным добавлением 5%-ной HCl и насыщенным раствором NaCl, высушивали и фильтровали. Фильтрат упаривали и очищали с помощью хроматографии на силикагеле (дихлорметан/МеОН), получая кислоту 31b в виде желтоватого твердого вещества (10,2 мг, выход=74%). МС (m/z): найденное значение 1028,2 (М+Н)⁺, 1044,1 (М+H₂O-Н)^-. См. Фиг.41.

[447] Соединение 31с:

[448] К раствору кислоты 31b (10,2 мг, 0,0099 ммоль) в безводном дихлорметане (0,5 мл) добавляли N-гидроксисукцинимид (3,4 мг, 0,03 ммоль) и PL-DCC (26 мг, 0,04 ммоль, 1,55 ммоль/г). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и фильтровали для удаления смолы. Смолу промывали дихлорметаном, затем этилацетатом. Фильтрат упаривали, а остаток очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (С18, CH₃CN/H₂O). Фракции, содержавшие продукт, объединяли и лиофилизировали, получая NHS-эфир 31с в виде белого твердого вещества (3,6 мг, выход=32%). МС (m/z): найденное значение 1125,1 (M+H)⁺. См. Фиг.41.

Пример 24 Синтез соединения 32с

[449] Соединение 32а:

[450] К перемешиваемому раствору анилина 1а (339 мг, 1,1 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (4,0 мл) добавляли Вос-ангидрид (272 мг, 1,2 ммоль). Смесь продолжали перемешивать при комнатной температуре в течение трех дней. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали хроматографией на силикагеле (CH₂Cl₂/МеОН), получая соединение 32а (405 мг, выход=90%) в виде бесцветного масла. ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₂): δ 7,00 (с, 2Н), 6,97 (с, 1Н), 4,38 (с, 4Н), 4,12 (с, 2h), 3,64 (т, J=5,6 Гц, 2Н), 3,48-3,44 (м, 8Н), 3,40-3,38 (м, 2Н), 3,21 (с, 3Н), 1,31 (с, 9Н); ¹С-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 154,65. 142,3, 142,1, 124,1, 122,7, 80,2, 71,6, 70,3, 70,1, 69,9, 68,5, 63,9, 58,65, 49,4, 28,1. См. Фиг.42.

[451] Соединение 32b:

[452] К перемешиваемому раствору соединения 32а (51 мг, 0,128 ммоль) в безводном дихлорметане добавляли триэтиламин (0,053 мл, 0,383 ммоль) при -5~-10°С. Затем медленно добавляли метансульфонилхлорид (0,026 мл, 0,332 ммоль) в течение 15 минут с помощью шприца. Смесь перемешивали при -5-10°С в течение 1 ч (ТСХ, ДХМ/МеОН 10:1). Реакцию останавливали смесью лед/вода, смесь разбавляли холодным этилацетатом, разделяли, органический слой промывали холодной водой, высушивали над безводным Na₂SO₄/MgSO₄, фильтровали и упаривали. Остаток переносили в небольшую реакционную колбу с дихлорметаном, упаривали и подвергали воздействию глубокого вакуума. Остаток растворяли в безводном ДМФ (0,8 мл) с последующим добавлением мономера IBD (90 мг, 0,31 ммоль) и калия (53 мг, 0,38 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь разбавляли дихлорметаном, промывали насыщенным раствором Nad, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и упаривали. Остаток очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (С18, CH₃CN/H₂O), получая соединение 32b (56 мг, 46%) в виде желтоватого твердого вещества. %). ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl³): δ 8,29 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,87 (д, J=4,8 Гц, 2Н), 7,60 (с, 2Н), 7,38-7,36 (м, 3Н), 7,33-7,27 (м, 4Н), 7,13 (т, J=7,6 Гц, 2Н), 6,88 (с, 2Н), 5,21 (дд, J₁=20,0 Гц, J₂=12,4 Гц, 4Н), 4,49 (дт, J₁=11,2 Гц, J₂=4,0 Гц, 2Н), 3,99 (с, 6Н), 3,83 (т, J=6,0 Гц, 2Н), 3,76-3,48 (м, 14Н), 3,35 (с, 3Н), 1,43 (с, 9Н); МС (m/z): найденное значение 992,2 (М+H₂O+Na)⁺, 1010,2 (М+H₂O+Na)⁺. См. Фиг.42.

[453] Соединение 32с:

[454] К перемешиваемому раствору соединения 32b (56 мг, 0,059 ммоль) в безводном дихлорметане (0,3 мл) и абсолютном этаноле (0,9 мл) добавляли NaBH₄ (2,7 мг, 0,07 ммоль) при 0°С. Ледяную баню удаляли и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 3 часов, затем останавливали реакцию насыщенным раствором хлорида аммония, разбавляли дихлорметаном, разделяли и промывали органический слой насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным Na₂SO₄, фильтровали через целит и упаривали. Остаток очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка С18, CH₃CN/Н₂О). Выделенный исходный материал 32b массой 12 мг вновь подвергали воздействию восстановительных условий и очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ. Все фракции, содержавшие чистый продукт, экстрагировали дихлорметаном и упаривали, получая соединение 32с (20,7 мг, выход=37%) в виде твердого светло-желтоватого вещества. МС (m/z): найденное значение 954,2 (М+Н)⁺. См. Фиг.42.

Пример 25

[455] Переносимость конъюгатов huMy9-6 исследовали на самках мышей CD-1. Животных наблюдали в течение семи дней до начала исследования и признали здоровыми. Мышам вводили однократную в/в инъекцию конъюгата и ежедневно отслеживали у животных потерю массы тела, заболеваемость или смертность, В Таблице 10 показано, что конъюгат huMy9-6-SPDB-1c, содержащий диимин и дисульфид, переносился в дозе менее 300 мкг/кг.В противоположность этому обнаружено, что моноиминные дисульфидные конъюгаты huMy9-6-SPDB-1f и huMy9-6-сульфо-SPDB-1f переносились лучше, причем их максимальная переносимая доза составила >729 мкг/кг и <750 мкг/кг, соответственно.

Таблица 10.

Данные сравнения переносимости для конъюгатов (А) huMy9-6-SPDB-1c, (В) huMy9-6-SPDB-1f, (С) huMy9-6-сульфо-SPDB-1f и (D) huMy9-6-BMPS-1f.

Пример 26

[456] Соединение 33b:

[457] Соединение 33а (20 г, 77 ммоль) добавляли в виде густой суспензии в безводном дихлорметане (100 мл) и охлаждали до 0°С. Добавляли уксусную кислоту (191 мл), что приводило к получению прозрачного раствора, который перемешивали при температуре 0°С до охлаждения. Через капельную воронку медленно добавляли по каплям азотную кислоту (26 мл, 581 ммоль). Ледяную баню удаляли, и полученный раствор продолжали перемешивать при комнатной температуре. Через 3 часа реакционную смесь разбавляли деионизированной водой и экстрагировали дихлорметаном. Органический слой промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над безводным сульфатом магния и концентрировали фильтрат в вакууме. Неочищенный остаток перекристаллизовывали с использованием смеси этилацетата и гексана. Твердое вещество отфильтровывали и промывали гексаном, получая соединение 33b в виде желтого рыхлого твердого вещества (13,8 г, выход=59%). 'Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 7,48-7,43 (м, 6Н), 7,25 (с, 1Н), 5,25 (с, 2Н), 4,02 (с, 3Н), МС (m/z): 326,1 (М+Na)⁺. См. Фигуру 45.

Пример 27

[458] 3,5-бис-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-N-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси) этил) анилин:

[459] Смесь (5-амино-1,3-фенилен)диметанола (11,78 г, 77 ммоль), 2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил-4-метилбензолсульфоната (15,3 г, 48,1 ммоль) и карбоната калия (13,28 г, 96 ммоль) в ДМФ (96 мл) нагревали с обратным холодильником в течение 20 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и разбавляли дихлорметаном. Смесь фильтровали через целит и концентрировали в вакууме. Полученное оранжевое масло растворяли в дихлорметане (240 мл) и добавляли трет-бутилдиметилсилилхлорид (18,09 г, 120 ммоль) и имидазол (9,80 г, 144 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 часов, после чего разбавляли дихлорметаном и фильтровали через целит. Очистка хроматографией на силикагеле (EtOAc/гексан) позволяла получить 3,5-бис-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-N-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)анилин (13 г, 52%). ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 6,52 (с, 1Н), 6,40 (с, 2Н), 4,56 (с, 4Н), 3,60 (т, 2Н, J=5,2 Гц), 3,56 (м, 6Н), 3,46 (м, 2Н), 3,29 (с, 3Н), 3,20 (т, 2Н, J=5,2 Гц), 0.84 (с, 18Н), 0,00 (с, 12Н). МС (m/z): найденное значение 550,1 (М+Na)⁺. См. Фиг.46.

[460] 3,5-бис-(((трет-бутилдиметылсилш)окси)метил)-N-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)-N-(2-метил-2-(метилдисулъфанил)пропил)анилин:

[461] К раствору 3,5-бис-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-N-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)анилина (6,7 г, 12,69 ммоль) в безводном 1,2-дихлорэтане (50 мл) добавляли 2-(метилтио)изобутиральдегид (2,74 мл, 19,04 ммоль), триацетоксиборгидрид натрия (2,8 г, 1 экв.), хлорид цинка (II) (0,865 г, 6,35 ммоль) и сульфат магния (2,292 г, 19,04 ммоль). Смесь перемешивали в течение пяти часов при комнатной температуре. Добавляли триацетоксиборгидрид натрия (2,8 г, 1 экв.). Реакционную смесь продолжали перемешивать при комнатной температуре в течение 20 часов. Полученную смесь фильтровали через целит, промывали дихлорметаном, концентрировали при пониженном давлении, а затем экстрагировали этилацетатом и водой. Органические экстракты промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над сульфатом магния, фильтровали, концентрировали и очищали с помощью Combiflash (EtOAc/гексан), получая 3,5-бис-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-N-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)-N-(2-метил-2-(метилдисульфанил)пропил)анилин (3,5 г, 40%). ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 6,73 (с, 2Н), 6,59 (с, 1Н), 4,56 (с, 4Н), 3,65-3,51 (м, 14Н), 3,30 (с, 3Н), 2,38 (с, 3Н), 1,28 (с, 6Н), 0,84 (с, 18Н), 0,00 (с, 12Н). МС (m/z): найденное значение 684,2 (М+Na)⁺. См. Фиг.46.

[462] (5-((2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)(2-метил-2-(л1етилдисулъфаныл)пропил)амино)-1,3-фенилен)диметанол (1b):

[463] Фторид тетрабутиламмония (1 М в ТГФ) (10,57 мл, 10,57 ммоль) добавляли по каплям к перемешиваемому раствору 3,5-бис-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-N-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)-N-(2-метил-2-(метилдисульфанил)пропил)анилина (3,5 г, 5,29 ммоль) в безводном ТГФ (65 мл) при 0°С на ледяной бане. После добавления смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов. Реакцию останавливали насыщенным раствором хлорида аммония и экстрагировали этилацетатом. Экстракты промывали водой и насыщенным раствором NaCl, высушивали сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Очистка хроматографией на силикагеле (МеОН/ДХМ) позволяла получить (5-((2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)(2-метил-2-(метилдисульфанил)пропил)амино)-1,3-фенилен)диметанол (2 г, 87%). ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 6.76 (с, 2Н), 6,63 (с, 1Н), 4,55 (с, 4Н), 3,65-3,51 (м, 14Н), 3,35 (с, 3Н), 2,44 (с, 3Н), 1,33 (с, 6Н); 13С-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 149,0, 142,35, 114,0, 111,1, 71,98, 70,7, 70,6, 70,5, 67,6, 65,5, 59,75, 59,1, 53,9. 51,9, 26,6, 25,7,20,75; MC (m/z): найденное значение 456,2 (М+Na⁺).См. Фиг.46.

Пример 28

[464] (5-(2-метил-2-(метилдисульфанш)пропилламино)-1,3-фенилен)диметанол:

[465] (5-амино-1,3-фенилен)диметанол (2,5 г, 16,32 ммоль) и 2-(метилдитио)изобутиральдегид (2,347 мл, 16,32 ммоль) перемешивали при комнатной температуре в абсолютном этаноле (82 мл) до полного растворения (3 часа). Смесь охлаждали до 0°С на ледяной бане и добавляли боргидрид натрия (0,741 г, 19,59 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при 0°С, а затем медленно останавливали реакцию холодным 5% раствором HCl. Смесь разбавляли дихлорметаном и доводили рН до рН=8 насыщенным раствором бикарбоната натрия, затем экстрагировали дихлорметаном, а затем промывали насыщенным раствором NaCl. Органические экстракты высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Очистка хроматографией на силикагеле (МеОН/ДХМ) позволяла получить (5-(2-метил-2-(метилдисульфанил)пропиламино)-1,3-фенилен)диметанол (3 г, 65%) в виде белого твердого вещества.

¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 6,62 (с, 1Н), 6,54 (с, 2Н), 4,53 (с, 4Н), 3,13 (с, 2Н), 2,30 (с, 3Н), 1,32 (с, 6Н). См. Фиг.47.

Пример 29

[466] трет-бутил-9-гидрокси-8-метокси-6-оксо-12а,13-дигидро-бН-бензо[5,6][1,4]диазепин[1,2-а]индол-11(12Н)-карбоксилат:

[467] К раствору 9-гидрокси-8-метокси-11,12,12а,13-тетрагидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепин[1,2-а]индол-6-она 3b (0,3 г, 1,012 ммоль) в метаноле (5,06 мл) добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (0,265 г, 1,215 ммоль), триэтиламин (0,212 мл, 1,519 ммоль) и DMAP (6,18 мг, 0,051 ммоль). После 5 часов перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь концентрировали в вакууме. Остаток повторно растворяли в дихлорметане и фильтровали через целит.Очистка хроматографией на силикагеле (20% EtOAc/ДХМ) позволяла получить трет-бутил-9-гидрокси-8-метокси-6-оксо-12а,13-дигидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепин[1,2-а]индол-11(12Н)-карбоксилат (0,21 г, 52%) в виде белого твердого вещества. ¹Н-ЯМР (400 Гц, CDCl₃): δ 8,25 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,44 (с, 1Н), 7,18 (т, J=7,2 Гц, 1Н), 7,11 (д, J=7,2 Гц, 1Н), 6,98 (т, J=7,2 Гц, 1Н), 6,39 (s, 1Н), 4,37 (м, 1Н), 3,75 (с, 3Н), 3,42 (м, 3Н), 2,74 (дд, J=3,6, 16,4 Гц, 1Н), 1,47 (с, 9Н). См. Фиг.48.

Пример 30

[468] Получение и тестирование huMy9-6-31c

[469] В реакционной смеси, содержащей 2,0 мг/мл антитела huMy9-6 и 5 молярных эквивалентов соединения 31 с (предварительно обработанного 5-кратным избытком бисульфита натрия в 90:10 смеси ДМА:вода) в 50 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота)-буфере с рН 8,5 и сорастворителе 10% об/об ДМА (N,N-диметилацетамиде), обеспечивали образование конъюгата в течение 6 часов при 25°С. После реакции конъюгат очищали и заменяли буфер на буфер для состава, содержавший 250 мМ глицина, 10 мМ гистидина, 1% сахарозу, 0,01% Твин-20, 50 мкМ бисульфита натрия, рН 6,2, с помощью обессоливающей колонки NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Диализ осуществляли в этом же буфере в течение 4 часов при комнатной температуре, используя кассеты для диализа Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 20000 MWCO).

[470] Было установлено, что очищенный конъюгат характеризовался в среднем 3,1 молекулами IGN, присоединенными на молекулу антитела (согласно UV-Vis при использовании молярных коэффициентов экстинкции ε_{330 нм}=15,484 см^-1 М^-1, ε_{280 нм}=30,115 см^-1 М^-1 для 1, и ε_{280 нм}=207,000 см^-1 М^-1 для антитела My9-6), содержанием мономера 98% (согласно эксклюзионной хроматографии), содержанием неконъюгированного лекарственного вещества <0,2% (согласно двухколоночной обращенно-фазовой ВЭЖХ) и конечной концентрацией белка 0,4 мг/мл.

[471] Измерения активности конъюгатов huMy9-6 с 31 с in vitro при двух различных нагрузках лекарственного вещества показаны ниже. Оба конъюгата являлись высокоактивными по отношению к антиген-положительным клеткам HL60-QC, причем значения IC₅₀ находились между 1,3-1,8 пМ. Блокирование антигена с использованием 1 мкМ неконъюгированного huMy9-6 значительно снижало активность, демонстрируя антигенную специфичность цитотоксического действия.

Конъюгат huMy9-6-31c IC50 (ПМ) IC₅₀ (ПМ)блокирующего huMy9-6 Окно специфичн ости 3,1 IGN/антитело 1,8 940 522 3,9 IGN/антитело 1,3 790 608

Пример 31

[472] Эффективность различных конъюгатов in vivo на голых мышах, несущих опухоли

[473] В настоящем исследовании изучали противоопухолевую активность нескольких конъюгатов по изобретению на мышах с ослабленным иммунитетом (голых или ТКИН), предпочтительно, на самках голых мышей, несущих различные опухоли. В некоторых случаях, в дополнение или в качестве альтернативы, можно было использовать голых крыс. Конъюгаты, подлежащие тестированию, включали один или более из конъюгатов, описанных здесь. Различные линии опухолевых клеток, которые можно было использовать для инокуляции голых мышей, включали HL60/QC, MOLM-13, NB4, HEL92.1.7, OCI-AML3, KB и/или любые другие линии раковых клеток, признанные в данной области техники адекватной моделью для заболевания (например, рака). Некоторые критерии, которые можно применять для отбора линий опухолевых клеток, подходящих для оценки in vivo, включают: а) экспрессию антигена-мишени на опухолевой клетке, и б) чувствительность опухолевых клеток к неконъюгированному лекарственному веществу in vitro. Например, в качестве одного из руководств по определению типов рака, которые могут являться подходящими для лечения соединениями по изобретению, можно использовать скрининг чувствительности линий клеток in vitro, например, скрининг 60 линий клеток, описанный в Национальном институте рака США (см. Voskoglou-Nomikos et al., 2003, Clinical Cancer Res. 9; 42227-4239, включенную в настоящий документ посредством ссылки). Активност ь различных конъюгатов по отношению к различным линиям опухолевых клеток, выраженную в значениях IC₅₀ (нМ), измеряли соответственно.

[474] Различные линии опухолевых клеток инокулировали в организмы голых или ТКИН-мышей с использованием практически такого же протокола, как описано в Примере 15. Например, приблизительно 1×10⁶-5×10⁷ опухолевых клеток (обычно 1×10⁷) клеток/мышь подкожно инокулировали в объеме приблизительно 0,1-0,2 мл/мышь в область над правым плечом самок бестимусных голых мышей 6-недельного возраста. После достижения опухолью среднего размера ~100 мм³ (как правило, через 6-8 дней после инокуляции опухолевых клеток) мышей делили на группы случайным образом (например, n=5-8 на группу) по объему опухоли. Лечение начинали на следующий день после распределения, группы включали контрольную группу, получавшую соответствующую среду-носитель (200 мкл/инъекцию), или однократное лечение различными дозами (от 5 до 700. мкг/кг) вышеупомянутых конъюгатов лекарственных веществ (доза присоединенного лекарственного вещества 50 мкг/кг соответствовала дозе антитела приблизительно 2 мг/кг). Кроме того, можно было использовать расписания многократных дозировок (например, лечение в день 1, 3, 5 или в день 1, 4, 7).

[475] Измеряли медианный и средний объем опухолей в зависимости от времени, причем данные демонстрировали зависимую от дозы противоопухолевую активность рассматриваемых конъюгатов. Затем рассчитывали минимальную эффективную дозу и сравнивали ее с максимальной переносимой дозой.

Пример 32

[476] Получение huMy9-6-сульфо-SPDB-1d с использованием линкера 4-нитроРy-сульфо-SPDB

[477] Реакционную смесь, содержавшую 6 мг/мл антитела huMy9-6 и 5 молярных эквивалентов высокоактивного линкера N-сукцинимидил-4-(4-нитропиридил-2-дитио)бутаноата (20 мМ рабочий раствор в этаноле), инкубировали в течение 3 ч при 25°С в 50 мМ EPPS-буфере при рН 8. Непрореагировавший линкер удаляли с помощью обессоливающей колонки NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Измеренное на основе концентрации антител и ДТТ-высвобожденной концентрации нитропиридин-2-тиона с помощью спектроскопии в УФ и видимой части спектра (ε_{394 нм}=14205 см^-1 М^-1 для 2-тио-4-нитропиридона) соотношение линкер-антитело (LAR) составило приблизительно 2,3.

[478] HuMy9-6, модифицированное линкером, разбавляли до 2 мг/мл в 50 мМ HEPES - буфере при рН 8,5, 10% объем/объем ДМА, и подвергали взаимодействию с 2 молярными эквивалентами соединения 1d на линкер (рабочий раствор 5 мМ в ДМА, 4,6 эквивалента на антитело) в течение 30 мин при 25°С. Завершение реакции обмена дисульфидных связей определяли, отслеживая увеличение оптической плотности при 394 нм с помощью УФ-спектроскопии.

[479] После реакции конъюгат очищали и заменяли буфер на раствор 250 мМ глицина, 10 мМ гистидина, 1% сахарозы, 0,01% твина-20, 50 мкМ бисульфита натрия при рН 6,2 с помощью обессоливающей колонки (G-25 Sephadex, fine grade, GE Healthcare).

[480] Обнаружено, что очищенный конъюгат характеризовался в среднем 2,1 присоединенными молекулами Id на антитело (согласно спектроскопии в УФ и видимой части спектра с использованием молярных коэффициентов экстинкции ε_{330 нм}=15,484 см^-1 М^-1 и ε_{280 нм}=30,115 см^-1 М^-1 для 1d и ε_{280 нм}=207,000 см^-1 М^-1 для huMy9-6), 98% мономера (согласно эксклюзионной хроматографии), <1% неконъюгированного 1d (согласно экстракции ацетоном/обращенно-фазовой ВЭЖХ), 70% выходом белка и 32% общим выходом 1d. См. Фиг.60.

Настоящее изобретение относится к цитотоксическому соединению формулы (IA) или его фармацевтически приемлемым солям.

В формуле (IA) двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, X отсутствует, a Y является -Н, а когда она является одинарной связью, X является -Н и Y представляет собой -SO₃M; М представляет собой -Н, Na⁺ или K⁺, А и А' оба являются -О-, R₆ является -OR, где R является линейным алкилом, имеющим от 1 до 6 атомов углерода; X' представляет собой -Н, Y' представляет собой -Н, L' представляет -W'-R^x-V-R^y-J, в которой W' и V являются одинаковыми или различными и каждая из них независимо отсутствует или выбрана из -О-, -S-, -CH₂-S-, -N(R^e)-, -N(R^e)-C(=O)- и -SS-; R^x и R^y являются одинаковыми или различными и каждая из них независимо отсутствует или является необязательно замещенным линейным или разветвленным алкилом, имеющим от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенным -SO₃H; R^e выбран из -Н, линейного, разветвленного алкила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k является -Н, линейным, разветвленным алкилом, имеющим от 1 до 6 атомов углерода; n является целым числом от 1 до 3; а J включает реакционноспособную группу, связанную с ней, и выбрана из -SH, -СООН и -СОЕ, где -СОЕ является N-гидроксисукцинимидным сложным эфиром; L'' и L''' представляют собой -Н, и G представляет собой -СН-. Изобретение также относится к конъюгату, содержащему цитотоксическое соединение и антитело, к способам лечения рака у млекопитающего. Технический результат: получены новые соединения, которые могут быть использованы в качестве антипролиферативных агентов. 4 н. и 33 з.п. ф-лы, 60 ил., 10 табл., 32 пр.

1. Цитотоксическое соединение, представленное следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемая соль, где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, X отсутствует, a Y является -Н, а когда она является одинарной связью, X является -Н и Y представляет собой -SO₃M;

М представляет собой -Н, Na⁺ или K⁺,

А и А' оба являются -О-,

R₆ является -OR, где R является линейным алкилом, имеющим от 1 до 6 атомов углерода;

X' представляет собой -Н,

Y' представляет собой -Н,

L' представлена следующей формулой:

-W'-R^x-V-R^y-J,

где:

W' и V являются одинаковыми или различными и каждая из них независимо отсутствует или выбрана из -О-, -S-, -CH₂-S-, -N(R^e)-, -N(R^e)-C(=O)- и -SS-;

R^x и R^y являются одинаковыми или различными и каждая из них независимо отсутствует или является необязательно замещенным линейным или разветвленным алкилом, имеющим от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенным -SO₃H;

R^e выбран из -Н, линейного, разветвленного алкила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k является -Н, линейным или разветвленным алкилом, имеющим от 1 до 6 атомов углерода;

n является целым числом от 1 до 3; а

J включает реакционноспособную группу, связанную с ней, и выбрана из -SH, -СООН и -СОЕ, где -СОЕ является N-гидроксисукцинимидным сложным эфиром;

L'' и L''' представляют собой -Н, и

G представляет собой -СН-,

при условии, что соединение не является любым из следующих соединений:

2. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что R₆ является -ОМе.

3. Соединение по п. 2, отличающееся тем, что:

R^e является линейным или разветвленным алкилом, имеющим от 1 до 6 атомов углерода, или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где

n является целым числом, составляющим 2 или 3; а

R^k является -Н, -Me или -CH₂CH₂-NMe₂.

4. Соединение по п. 2, отличающееся тем, что:

W' является -О-, -N(R^e)- или -N(R^e)-C(=O)-;

R^e является -Н, -Me или -(СН₂-СН₂-O)_n-Ме;

n является целым числом, составляющим 2 или 3;

R^x является линейным или разветвленным алкилом, несущим от 1 до 6 атомов углерода;

V и R^y отсутствуют; а

J является N-гидроксисукцинимидным сложным эфиром.

5. Соединение по п. 1, являющееся:

или

или его фармацевтически приемлемая соль.

6. Соединение по п. 1, являющееся:

или его фармацевтически приемлемая соль.

7. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанное соединение представлено следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

W' отсутствует или выбрана из -О-, -N(R^e)-, -N(R^e)-C(=O)-, -S- и -CH₂-S-;

Z^s является -H или выбрана из любой из следующих формул:

и

где:

q является целым числом от 1 до 5;

D является -Н или -SO₃M;

М является -Н или катионом, таким как Na⁺ или K⁺.

8. Соединение по п. 7, отличающееся тем, что W' является -N(R^e)-.

9. Соединение по п. 8, отличающееся тем, что R^e является -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k является -Н, линейным, разветвленным или циклическим алкилом, имеющим от 1 до 6 атомов углерода.

10. Соединение по п. 9, отличающееся тем, что R^k является -Н или -Me.

11. Соединение по п. 10, отличающееся тем, что R^x является линейным или разветвленным алкилом, имеющим от 1 до 6 атомов углерода.

12. Соединение по п. 10, отличающееся тем, что R^x является -(CH₂)_p-(CR^fR^g)-, где каждая из R^f и R^g независимо выбрана из -Н или линейного или разветвленного алкила, имеющего от 1 до 4 атомов углерода; а р равен 0, 1, 2 или 3.

13. Соединение по п. 12, отличающееся тем, что R^f и R^g являются одинаковыми или различными и выбраны из -Н и -Me; а p равен 1.

14. Конъюгат, содержащий: цитотоксическое соединение и антитело, где цитотоксическое соединение включает связывающую группу, которая ковалентно связывает цитотоксическое соединение с антителом, где указанное цитотоксическое соединение представлено следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, X отсутствует, a Y является -Н, а когда она является одинарной связью, X является -Н и Y представляет собой -OSO₃M;

М представляет собой Н, Na⁺ или K⁺;

А и А' оба являются -О-,

R₆ является -OR, где R является линейным алкилом, имеющим от 1 до 6 атомов углерода;

X' представляет собой -Н,

Y' представляет собой -Н,

L' представлена следующей формулой:

-W'-R^x-V-R^y-J,

где:

W' и V являются одинаковыми или различными и каждая из них независимо отсутствует или выбрана из -О-, -S-, -CH₂-S-, -N(R^e)-, -N(R^e)-C(=O)- и -SS-;

R^x и R^y являются одинаковыми или различными и каждая из них независимо отсутствует или является необязательно замещенным линейным или разветвленным алкилом, имеющим от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенным -SO₃H;

R^e выбран из -Н, линейного, разветвленного алкила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k является -Н, линейным или разветвленным алкилом, имеющим от 1 до 6 атомов углерода;

n является целым числом от 1 до 3; а

J представляет собой -S- или -С(=O)-;

L'' и L''' представляют собой -Н, и

G представляет собой -СН-,

при условии, что соединение не является любым из следующих соединений:

15. Конъюгат по п. 14, отличающийся тем, что R₆ является -ОМе.

16. Конъюгат по п. 15, отличающийся тем, что:

R^e является линейным или разветвленным алкилом, имеющим от 1 до 6 атомов углерода или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где

n является целым числом, составляющим 2 или 3; а

R^k является -Н, -Me или -СН₂СН₂-NMe₂.

17. Конъюгат по п. 15, отличающийся тем, что:

W' является -О-, -N(R^e)- или -N(R^e)-C(=O)-;

R^e является -Н, -Me или -(СН₂-СН₂-O)_n-Ме;

n является целым числом, составляющим 2 или 3;

R^x является линейным или разветвленным алкилом, несущим от 1 до 6 атомов углерода;

V и R^y отсутствуют; а

J является -С(=O)-.

18. Конъюгат по п. 14, являющийся:

или

или его фармацевтически приемлемая соль,

где r является целым числом от 1 до 10.

19. Конъюгат по п. 18, отличающийся тем, что антитело является huMy9-6.

20. Конъюгат по п. 14, являющийся:

или

или его фармацевтически приемлемая соль.

21. Конъюгат по п. 14, отличающийся тем, что указанное соединение представлено следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью,

где:

W' отсутствует или выбрана из -О-, -N(R^e)-, -N(R^e)-C(=O)-, -S-, -CH₂-S- или -CH₂NR^e-;

n является целым числом, составляющим 2 или 3;

Z^s присоединена к СВА и представляет собой:

связь;

или

где:

q является целым числом от 1 до 5; а

М является -Н или катионом, таким как Na⁺ или K⁺.

22. Конъюгат по п. 21, отличающийся тем, что W' является -N(R^e)-.

23. Конъюгат по п. 22, отличающийся тем, что R^e является -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где

R^k является -H или линейным или разветвленным алкилом, имеющим от 1 до 6 атомов углерода.

24. Конъюгат по п. 23, отличающийся тем, что R^k является -Н или -Me.

25. Конъюгат по п. 24, отличающийся тем, что R^x является линейным или разветвленным алкилом, имеющим от 1 до 6 атомов углерода.

26. Конъюгат по п. 24, отличающийся тем, что R^x является -(CH₂)_p-(CR^fR^g)-, где каждая из R^f и R^g независимо выбрана из Н или линейного или разветвленного алкила, имеющего от 1 до 4 атомов углерода; а p равен 0, 1, 2 или 3.

27. Конъюгат по п. 26, отличающийся тем, что R^f и R^g являются одинаковыми или различными, и выбраны из Н и Me; а p равен 1.

28. Конъюгат по п. 14, отличающийся тем, что включает 1-10 цитотоксических соединений, причем каждое цитотоксическое соединение включает связывающую группу, присоединяющую указанное цитотоксическое соединение к антителу, и каждое цитотоксическое соединение в составе конъюгата одинаково.

29. Конъюгат по п. 14, отличающийся тем, что антитело связывается с клетками-мишенями, выбранными из опухолевых клеток, клеток, инфицированных вирусом, клеток, инфицированных микроорганизмами, клеток, инфицированных паразитами, аутоиммунных клеток, активированных клеток, миелоидных клеток, активированных Т-клеток, В-клеток или меланоцитов; клеток, экспрессирующих CD4, CD6, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, ЕрСАМ, CanAg, CALLA или антигены Her-2, антигены Her-3; или клеток, экспрессирующих рецептор инсулиноподобного фактора роста, рецептор эпидермального фактора роста и рецептор фолата.

30. Конъюгат по п. 14, отличающийся тем, что антитело является антителом с модифицированной поверхностью, одноцепочечным антителом с модифицированной поверхностью или фрагментом антитела с модифицированной поверхностью.

31. Конъюгат по п. 14, отличающийся тем, что антитело является моноклональным антителом, одноцепочечным моноклональным антителом или фрагментом моноклонального антитела.

32. Конъюгат по п. 14, отличающийся тем, что антитело является гуманизированным антителом, гуманизированным одноцепочечным антителом или фрагментом гуманизированного антитела.

33. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп. 1-13 или конъюгата по любому из пп. 14-32, где рак выбран из группы, состоящей из лейкоза, лимфомы, плазмаклеточной миеломы, рака шейки матки, немелкоклеточного рака легких, мелкоклеточного рака легких, рака головы и шеи и рака толстой кишки.

34. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества конъюгата, причем конъюгат выбран из:

или его фармацевтически приемлемой соли,

где r является целым числом от 1 до 10, где рак выбран из группы, состоящей из лейкоза, лимфомы, плазмаклеточной миеломы, рака шейки матки, немелкоклеточного рака легких, мелкоклеточного рака легких, рака головы и шеи и рака толстой кишки.

35. Способ по п. 34, где конъюгат представляет собой:

или

или его фармацевтически приемлемую соль.

36. Способ по п. 35, где антитело представляет собой huMy9-6.

37. Способ по п. 36, где рак представляет собой острый миелобластный лейкоз (ОМЛ).