Способ определения адгезивных свойств бактерий Советский патент 1984 года по МПК C12M1/00 

ы

к

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕ ЗИВНЫХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ путем смешивания эритроцитов человека и микроорганизмов с последующими инкубацией, отьшванием неприкрепившихся клеток и определением адгезивуых свойств, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, используют эритроциты хозяина, при этом их . смешивают с микроорганизмами в соотношении 1:10 и инкубирование веjj T при встряхивании.

сь

4 4 Изобретение относится к медицине, преимущественно к Микробиологи и может быть использовано при опре делении болеэнетворности микроорга низмов н механизмов инф экции. Известен способ определения адге зивньт свойств бактерий путем изуче ния адгезии микоплазм на нативных эритроцитах Cl3. Однако этот способ обладает недостаточной точностью и является трудоемЛим при выполнении. Цель изобретения - упрощение и повышение точности способа. Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа определения адгезивных свойств бактерий путем смешивания эритроцитов челове ка и микроорганизмов с последующими инкубацией, отмыванием неприкрепившихся клеток и определением адге зивных свойств используют эритроцит хозяина, при этом их смешивают с микроорганизмами в соотношении 1:10 и инкубирование ведает при v встряхивании.. Способ выполняется следующим об разом. Микроорганизмы предварительно смешивают с эритроцитами хозяийа в 0,5 М растворе трисбуфера, инкубиру ют при 35-37 с во влажной камере в течение 25-30 мин, высушивают, фиксируют, окрашивают и после оценк под световым микроскопом отбирают необходимые штаммы бактерий, которы после отмывания смешивают с зритроцитами в концентрациях соо.хветствен но 1 млрд/мл и 100 млн/мл, затем смео инкубируют при 35-37°С на встряхивателе в течение 25-30 мин и после высушивания, фиксирования и окрашивания производят под световым микроскопом окончательную рдёнку адгезии.. Пример.I этап - предварительный опыт. Предназначен для быстрого определения адгезивных свойств большого числа штаммов бактерий . Буферный раствор. Во всех опытах используют 0,05 М раствор трисбуфер ПIiйгoтoвлeнный на 0,87 М растворе хлористого натрия. . Взвесь бактерий. Односуточные культуры микробов, хорошо растущих на скошенном агаре или какой-либо другой питательной среде, .смывают 2,0 мл буферного раствора рН 7,27,3 при 37°С. Взвесь эритроцитов. Кровь из локтевой вены берут в пробирку с гепарином: одна капля гепарина на 5 мл крови. Эритроциты дважды отмываюТ буферным раствором рН 7,2-7,3 при на центрифуге (300 об/мин Готовят взвесь эритроцитов на указанном буфере концентрацией ° 1 млрд/мл. Постановка опыт. На необезжиренное предметное стекло наносят одну каплю буферного раствора рН 7,27,3 при 37°С, в которую суспендируют по одной петле взвесей бактерий и эритроцитов. На одном предметном стекле можно одновременно ставить до пяти опытов. Предметное стекло помещают во влажную камеру на 30 мин при 37С, затем высушивают на воздухе, фиксируют метанолом 10 мин, окрашивают по Граму. Для получения более контрастных препаратов при работе с грамположительными микробгили окрашивание кристалвиолетом продолжают 45 с, раствор Люголя выдеряшвают 30 с, обесцвечивают спиртом 1 мин и докрашивают фуксином Пфейфеi a 2 мин) с грамотрицательными микробами соответствующее время - 2 и 1 мин, 15 и 30 с. Изучение адгезии ведется под световым микроскопом, а оценка-адгезивных свойств проводится с помощью трех показателей С, Т .и О, высчитываемых на 25 эриг троцитах. С - среднее количество микробов, прикрепившихся к одному эритроциту. Т - наличие направленности (Таксиса ) микробов к эритроцитам О - нет {неприкрепившиеся бактерии более или менее равномерно разбросаны между эритроцитами), 1 - слабый таксис {менее половины неприкрепившихся бактерий располагаются вокруг эритроцитов), 2 -сальный таксис {подавляющее большинство непрякрепившихся бактерий располагаютСй вокруг эритроцитов). О - занятость окружности эритроцита прикрепившимися микробами: О - прикрепления нет или на единичнь1х эритроцитах единичные микробы, 1 - занято до 1/4, 2 - до 1/2, 3 - до 3/4, 4 - более 3/4 окружности большинства эритроцитов.. Для микробов, плохо растущих на твердой питательной среде {например лактобациллы) используют жидкую питательную среду. На предме1;ное стекло наносят каплю буферного раствора который после смешивания с одной петлей микробов в питательной среде и одной петлей взвеси эритроцитов обеспечивает рН 7,1-7,3 {пределы, в которых Эритроциты сохраняют нормальную форму). Iэтап дает предварительное представление об адгезивных свойствах бактерий. IIэтап - основной ЬПыт. Предназначен дляболее точного определения адгезивных свойств бактерий, выяснения влияния свойств клеток микрои макроорганизма на процесс ад1.езии. Взвесь бактерий. Односуточную культуру на плотной или в жидкой питате ль ной среде дважды п омывают раствором 0,05 М трисбуфера рН 7,27,3 при на центрифуге (1500 об/мин). Готовят взвесь микробов концентрацией 1 млрд/мл на указанном буферном растворе.

Взвесь эритроцитов. Готовят аналогично предварительному опыту, только концентрация эритроцитов 100 млн/мл.

Постановка опыта. В пробирку .вносят равные объемы (0,25-0,5 мл) взвесей микробов и эритроцитов, инкубируют при на встряхивателе 30 мин. Затем на тщательно обезжиренном предметном стекле готовят мазок, который обрабатывают аналогично таковому в предварительном опыте. При оценке адгезивных свойств микробов используют показатели С, Т и Oj причем подсчет ведется на 100 эритроцитов, Кроме них определяют показатель К - процентное содержание эритроцитов, имекщих на своей поверхности микробы, по отношению ко всем изученным эритроцитам.

Для изучения влияния микроорганизма на адгезию следует ставить параллельные опыты с эритроцитами различных людей и (или) животных.

II этап дает представление об адгезивных свойствах бактерий, о П.р и м е ч а н 11 е. НАМ - индекс

влиянии на процесс адгезии свойств клеток микро- и макроорганизма.

Способ отличается от аналогов и прототипа простотой и доступностью, возможностью изучения одновременно большого числа штаммов бактерий и клеток от различных людей и животных, получением количественной характеристики адгезии, позволяет одновременно изучить влияние на адгезию свойств клеток микро- и макроорганизма.

Оригинальность способа состоит в выборе модели, где для изучения адгезивных свойств микроорганизма используют эритроциты хозяина носителя данного штамма. Концентрация микроорганизмов и эритроцитов 10:1 в отличие от общепринятой 1000:1, кроме того, не проводят отмывания неприкрепившихся микробов. Отличается и оценка адгез ии в способе. Адгезивность и процент вариации результатов опытов при различных соотношениях эритроцитов и лактоба- цилл приведены в таблице.. Вариация результатов опытов у высокоадЬезивных штаммов при соотношении 1:100 в среднем 10,5%, а при 1:10 - 5,0%, у среднеадгезивных 12,1и 8,0%, а У низко- и неадгезивных - 15,6 и11,6% соответственно. адгезивностимикроорганизма.

1076441

Таким образом, использование пред-упрощает исследования, отпадас г не.яагаемого способа приводит к досто- обходимость использования различных

ве;рном}г увдличенику точности опытовспособов отмывания неприкрепившихся

(f .0,01) в 2 раза.микробных клеток, увеличивается воэможность изучения большого числа

Изменение сортн яиеиия микробов 5штаммов бактерий, сокращается время

и эритроцитов также значительноисследования.