СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕМАТОЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ АВЕРМЕКТИНСОДЕРЖАЩИХ СУБСТАНЦИЙ И ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/15 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа тестирования биоцидной активности противопаразитарных субстанций и препаратов, содержащих в качестве активного вещества авермектины и их производные.

Актуальность разработки экпресс-способов определения нематоцидной активности авермектинов связана с тем, что эти вещества являются основой наиболее востребованных современных противопаразитарных препаратов широкого спектра действия. Поэтому постоянно ведутся работы в направлении создания новых авермектинсодержащих субстанций и препаратов и эти работы предполагают наличие соответствующих относительно точных и быстрых методов выявления нематоцидной активности исследуемых веществ.

Известен способ определения нематоцидной активности авермектинов в системах in vitro с использованием в качестве чувствительного тест-организма нематоды Aphelenchoides bessei (Патент RU 2013053 С1, A01N 63/00, опубл. 30.05.1994). Способ заключается в том, что готовят растворы авермектинов в различных концентрациях, в которые вносят нематоды вида Aphelenchoides bessei (10-20 особей) и культивируют в течение 1-3 ч при 28-36°С, рН 5,5-8,0. В результате под микроскопом подсчитывают общее количество нематод в каждом из разведений авермектинов, вычисляют процент смертности нематод в каждом разведении и находят концентрацию исследуемого образца авермектина, при которой смертность нематод составляет 50% (СК₅₀). Нематоцидную активность определяют путем сравнения СК₅₀ исследуемого образца авермектинов и эталонного образца известной концентрации.

Недостатком данного способа является длительность процедуры определения, низкая точность определения физиологического состояния нематод под микроскопом при подсчете СК₅₀.

Известен также способ определения биоцидной активности различных веществ с помощью олигохет (Потапов Д.С., Стом Д.И., Антонова Е.В. // Бюллетень ВСНЦ СОРАМН. - Иркутск, 1998. - №2 (8). - С. 156-159). В ходе определения олигохеты (Eisenia fetida, Ehchytraeus albidus и Tubifex tubifex) помещают в 30 мл испытуемого раствора, где основным критерием оценки служит выживаемость олигохет через 24 ч. При помещении червей в максимально недействующие концентрации исследуемых веществ их тело непрерывно сокращается и они пытаются выползти из раствора.

Недостатком данного способа является его низкая чувствительность и длительность получения результата в силу того, что олигохеты погибают при продолжительном (24 ч) воздействии высоких концентраций.

Наиболее близким аналогом по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ биотестирования активности препаратов, по оценке поведенческой реакции олигохет, помещенных в раствор изучаемого препарата (Патент RU 2377561 С2, G01N 33/18, A01K 67/033, опубл. 27.03.2011). Препарат смешивают с водой, а затем в полученный раствор помещают олигохеты (Mesenchytraeus bungei, Tubifex tubifex), выдерживают в течение 30 мин и далее определяют активность препарата по поведенческой реакции тест-объектов. Критерием активности препарата является отсутствие сползания олигохет в клубок в присутствии активного вещества в результате конвульсивных сокращений их тел и обездвиживания (минимальная нечувствительная доза - 1 мг/мл воды). Таким образом, для диагностики активности препарата используется конкретная поведенческая реакция сползания олигохет, а не их выживаемость.

Недостатком данного способа является низкая точность анализа из-за отсутствия стандартизованных параметров и режимов осуществления методики. Кроме того, в известном способе не используется опорная концентрация испытуемых веществ, что не позволяет установить конкретные качественные характеристики испытуемого образца на основании получаемых результатов, т.е. отсутствует сравнение биологической активности исследуемого вещества со стандартным образцом и это не дает возможности выражать действие веществ в количественных единицах.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка высокочувствительного и точного экспресс-метода количественной оценки биоцидной активности субстанций и препаратов, содержащих в качестве активного вещества авермектины и их производные, с помощью олигохет вида Tubifex tubifex.

Техническим результатом заявленного изобретения является стандартизация, повышение чувствительности и экспрессности способа биотестирования активности противопаразитарных субстанций и препаратов, содержащих в качестве активного вещества авермектины, с использованием поведенческой реакции олигохет вида Tubifex tubifex, основанной на нейрохимических особенностях метаболизма.

Технический результат изобретения достигается за счет использования механизма действия авермектинов (основной мишенью являются глутаматчувствительные хлорные каналы и рецепторы гамма-аминомасляной кислоты), воздействующих на нейрональную сигнальную систему олигохет вида Tubifex tubifex, вызывая у них паралич и нарушение поведенческой реакции, которая заключается в отсутствии сборки в клубок.

Сущность изобретения заключается в следующем: олигохеты по 15-20 особей помещают в растворы, содержащие различные концентрации (от 0,5 до 50 мкг/мл) авермектинов, выдерживают в течение 1-2 ч в термостате при 27°С-30°С. При этом каждые 15-20 мин определяют активность исследуемых образцов по поведенческой реакции олигохет (сползания в клубок), т.е. по степени паралича.

В результате вычисляют процент паралича олигохет в каждом разведении по формуле:

,

где А - общее количество олигохет,

В - количество олигохет с нарушенной подвижностью.

Биоцидную активность исследуемого вещества определяют путем оценки степени паралича у тест-объектов в испытуемом образце и контроле. В качестве контроля используют реакцию олигохет, помещенных в водопроводную воду.

Для получения стандартизованного тест-объекта олигохеты вида Tubifex tubifex можно культивировать в лабораторных условиях (Богданов Т.О. Выживаемость и плодовитость Tubifex tubifex (Tubiflcidae) при содержании и разведении в лабораторных условиях. // Вестник Челябинского государственного университета №04, Биология, Выпуск 1. - Челябинск, 2008. - С. 105; Воробьев Д.С., Франк Ю.А., Лушников С.В., Залозный Н.А., Носков Ю.А. Использование Limnodrilus hoffmeisteri (Tubificidae, Oligochaeta) в очистке донных отложений от нефти и нефтепродуктов. // Сибирский экологический журнал. - Новосибирск, 2010. - Т. 17, №1. - С. 21-27).

Так как выращенная в лабораторных условиях культура Tubifex tubifex довольно устойчивая, это позволяет длительное время (до 1 месяца) хранить ее в колбах с водой и хранят в холодильнике при температуре 4-7°С, периодически промывая водой.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение биоцидной активности ивермектина.

Готовят рабочий 1% раствор ивермектина в 96%-ном этаноле (изопропиловом спирте) с концентрацией 10000 мкг/мл. Из него на дистиллированной воде приготавливают серию разведений вещества со следующими концентрациями:

№1 - 50 мкг/мл,

№2 - 25 мкг/мл,

№3 - 10 мкг/мл,

№4 - 5 мкг/мл,

№5 - 2,5 мкг/мл,

№6 - 1 мкг/мл,

№7 - 0,5 мкг/мл.

Полученные растворы вносят в лунки на микробиологическом планшете или чашки Петри в количестве 15-20 мл, затем в растворы пинцетом вносят по 15-20 особей олигохет вида Tubifex tubifex и ставят в термостат при 27 -30°С. Контролем служит образец с водопроводной водой без содержания ивермектина.

Через каждые 15-20 мин на протяжении 1 ч подсчитывают общее количество олигохет (А), количество олигохет с нарушенной подвижностью (В) и вычисляют процент паралича тест-объектов. В итоге устанавливают минимальную концентрацию вещества, при котором наблюдается паралич олигохет.

В условиях данного эксперимента наблюдается паралич олигохет в чашках Петри, содержащих раствор ивермектина концентрацией 1 мкг/мл. Естественно, паралич олигохет наблюдается и при более высоких концентрациях, но при концентрации 0,5 мкг/мл достоверного паралича не наблюдается.

Таким образом, на данном примере продемонстрирована возможность количественного определения нематоцидной активности ивермектина. Из полученных данных следует, что ивермектин вызывает паралич нематод при концентрации 1 мкг/мл.

Пример 2. Определение биоцидной активности абамектина.

Все операции осуществляют как в примере 1, но в качестве исследуемого вещества используют 1% раствор абамектина в 96% -ном этаноле (изопропиловом спирте) с концентрацией 10000 мкг/мл.

Показано, что биоцидная активность абамектина практически совпадает с активностью ивермектина и составляет 1 мкг/мл.

Пример 3. Определение биоцидной активности авермектинового комплекса, выделенного экстракцией из мицелиальной биомассы Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ - 56.

Для получения авермектинового комплекса микроорганизм Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ - 56 культивируют в глубинных условиях на качалке с числом оборотов 220 об/мин при температуре 27°С на среде, содержащей в качестве основных ингредиентов картофельный отвар и глюкозу - 3%. Через 36 ч культивирования выросший мицелий используют в качестве вегетативно-посевного материала. Для этого в 500 мл качал очные колбы с 100 мл среды вносят 5 мл инокулята (5% от объема среды) и культивируют в течение 5 суток при 220 об/мин, 27°С, рН 7,0-7,2.

Количество синтезированных авермектинов в биомассе определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) экстракта биомассы и эти данные используют при приготовлении тестируемых растворов авермектинов.

Далее все операции по определению биоцидной активности комплекса авермектинов осуществляют как в примере 1, но в качестве исследуемого вещества используют экстракт биомассы, содержащий комплекс авермектинов, синтезированных микроорганизмом Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ - 56.

Из полученных данных следует, что биоцидная активность авермектинового комплекса S. avermitilis ВНИИСХМ - 56 выявляется при концентрации 5 мкг/мл.

Пример 4. Определение биоцидной активности гемисукцината авермектина В1а.

Все операции осуществляют как в примере 1, но в качестве исследуемого вещества используют 1% раствор гемисукцината авермектина B_1a в 96%-ном этаноле (или в изопропиловом спирте) с концентрацией 10000 мкг/мл.

Биоцидная активность препарата составляет 5 мкг/мл, т.е. в чашках Петри, содержащих растворы гемисукцината авермектина B_1a концентрацией 5 и более мкг/мл, наблюдается паралич олигохет, а в чашках Петри с концентрацией 1,0 и 2,5 мкг/мл паралич тест-объектов отсутствует.

Установлено, что инкубирование олигохет более 2-х ч является не целесообразным, т.к. не приводит к существенным изменениям результатов, но увеличивает время анализа и, следовательно, его себестоимость.

Кроме того, установлено, что культивирование при температуре менее 27°С (24-25°С) влияет на точность результатов анализа, т.к. паралич тест-объектов наступает значительно позже в сравнении с аналогичным инкубированием при 27-30°С. При этом отмечается снижение подвижности олигохет, что в свою очередь понижает точность определения физиологического состояния тест-объектов по поведенческой реакции (сползания в клубок). В то же время культивирование олигохет при температуре выше 30°С (31-33°С) не приводит к существенным изменениям результатов, однако увеличивает время проведения анализ. Следовательно, оптимальный температурный диапазон при постановке метода с использованием олигохет вида Tubifex tubifex составляет 27-30°С.

Таким образом, вышеописанные примеры демонстрируют, что данный метод позволяет проводить экспресс оценку и скрининг противопаразитарной (нематоцидной) активности авермектиновых субстанций и их производных.

Наряду с этим установлены оптимальные условия получения, поддержания и хранения стандартизованного тест-объекта - олигохет вида Tubifex tubifex. В стеклянных емкостях (банки, колбы) при ежесуточной промывке чистой водопроводной водой олигохеты хорошо хранятся в холодильнике при 4-7°С в течение 3-4 недель.

Обобщающие результаты исследования биоцидой активности авермектинов представлены в таблице 1.

Источники информации

1. Патент RU 2013053 С1, 30.05.1994.

2. Потапов Д.С., Стом Д.И., Антонова Е.В. // Бюллетень ВСНЦ СОРАМН. - Иркутск, 1998. - №2 (8). - С. 156-159.

3. Патент RU 2377561 С2, 27.03.2011.

4. Богданов Г.О. Выживаемость и плодовитость Tubifex tubifex (Tubificidae) при содержании и разведении в лабораторных условиях. // Вестник Челябинского государственного университета №04, Биология, Выпуск 1. - Челябинск, 2008. - С. 105.

5. Воробьев Д.С., Франк Ю.А., Лушников С.В., Залозный Н.А., Носков Ю.А. Использование Limnodrilus hoffmeisteri (Tubificidae, Oligochaeta) в очистке донных отложений от нефти и нефтепродуктов. // Сибирский экологический журнал. - Новосибирск, 2010. - Т. 17, №1. - С. 21-27.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу биотестирования активности противопаразитарных субстанций и препаратов, содержащих в качестве активного вещества авермектины и их производные, с помощью олигохет вида Tubifex tubifex. Сущность способа заключается в том, что готовятся разведения авермектинов (0,5 до 50 мкг/мл), в которые вносятся олигохеты по 15-20 особей и инкубируют в течение 1-2 ч при температуре 27-30°С. Далее оценивают биоцидное действие авермектинов по поведенческой реакции олигохет, причем об активности препарата судят по отсутствию сползания тест-объектов в клубок в результате различной степени паралича. Достигаемый технический результат заключается в стандартизации, повышении чувствительности и экспрессности способа биотестирования активности авермектинсодержащих субстанций и препаратов с использованием поведенческой реакции олигохет вида Tubifex tubifex, основанной на их нейрохимических особенностях метаболизма. Преимущества способа заключаются в низкой трудоемкости и стоимости, быстроте анализа, доступности, высокой чувствительности (до 1,0 мкг/мл). 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 пр.

1. Способ определения нематоцидной активности авермектинсодержащих субстанций и препаратов, включающий инкубирование олигохет in vitro в растворах авермектинов и регистрацию их поведенческой реакции, отличающийся тем, что с целью повышения точности анализа и получения возможности количественной оценки биоцидной активности исследуемых веществ олигохеты вида Tubificidal tubifex инкубируют при 27-30°C в термостате в растворах авермектинов разной концентрации, в течение 1-2 ч.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что олигохеты в количестве 15-20 особей инкубируют в 15-20 мл тестируемых растворов, содержащих от 0,5 до 50 мкг/мл авермектинов.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что за нематоцидную активность принимают минимальную концентрацию тестируемых субстанций и препаратов, вызывающую паралич олигохет.