СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕМАТОЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ АВЕРМЕКТИНОВ Российский патент 1994 года по МПК A01N63/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается производства авермектинов, продуктов жизнедеятельности Streptomyces avermitilis, обладающих акарицидным, инсектицидным и нематоцидным действиями.

Известен способ определения нематоцидной активности авермектинов в системах in vivo. Авермектины скармливают мышам с кормом, которых за трое суток до этого заражают нематодами вида Nematospiroides dubuis. На 11-е, 12-е, 13-е сутки после инфицирования проверяют кал животных на наличие или отсутствие яиц нематод. На следующий день после их обнаружения животное умерщвляют и подсчитывают количество живых и мертвых нематод, а также их яиц в проксимальной части тонкой кишки. В качестве контроля используют инфицированных животных, которые не получали авермектинов.

Недостатками известного способа являются его длительность и высокая трудоемкость. Продолжительность одного анализа составляет 12-15 сут.

Известен способ определения нематоцидной активности в системе in vitro, а также модификация известного способа. В основу этого типа методов положено свойство авермектинов парализовывать естественное волнообразное движение нематод Вursaphelenhus lignicolus во время их культивирования в водных растворах.

Недостатком этих методов является высокая трудоемкость. Продолжительность анализа в первом случае составляет 4 дня, а во втором случае - 24 ч.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ, основанный на способности авермектинов (особенно авермектинов серии В₁) парализовывать волнообразные движения свободноживущей сапробиотической нематоды Саеnorhabditis elegans в водных растворах. Техника этого метода сводится к следующим процедурам. Нематоды Саеnorhabditis elegans линии N 2 в возрасте 4-х дней в количестве 10-20 особей помещают в микроячейки, содержащие по 100 μ L испытуемых веществ в разных разведениях, например авермектин В_1а или фильтрат культуральной жидкости Streptomyces avermitilis. Образцы культивируют в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего изучают подвижность нематод в каждом разведении в микроскопе. По соотношению между количеством неподвижных нематод и общим числом проанализированных нематод находят процент парализующего действия испытуемых веществ. Этот показатель с учетом разведения и служит величиной нематоцидной активности авермектинов.

Основным недостатком известного способа является его малая точность, обусловленная рядом причин (выбором тест-объекта, критерием оценки действия авермектинов, условиями проведения культивирования и др. ).

Согласно известного способа критерием оценки воздействия авермектинов на нематоды служит их парализующее действие, т. е. соотношение между числом парализованных нематод к общему числу нематод.

Опыт показывает, что определение указанной величины является условием необходимым, но недостаточным, чтобы в полной мере количественно оценить воздействие авермектинов на нематоды. Было установлено (табл. 1), что после культивирования Саеnorhabditis sp. в течение 1 ч в присутствии различных концентраций ивермектина (препарат фирмы Мерк) наблюдается не два (подвижные и неподвижные нематоды), а по крайней мере три типа воздействия ивермектина на подвижность нематод. Можно наблюдать в микроскопе: активно подвижные нематоды (естественные волнообразные движения); с нарушенной подвижностью полуподвижные нематоды (характерно уменьшение числа волнообразных движений в единицу времени, нарушение в симметрии движений, наличие кругообразных движений вместо волнообразных и др. ); неподвижные нематоды. Согласно известного способа полуподвижные нематоды должны быть причислены к активно подвижным нематодам, хотя воздействие на их организм очевидно, и как показывают наблюдения, полуподвижные нематоды после отмывки от авермектинов не способны к дальнейшему развитию в системах in vitro, в то время как активно подвижные нематоды после их культивирования в растворах авермектинов и отмывания от них способны к развитию в системах in vitro. Отсюда следует, что величина парализующего действия в значительной степени определяется тем, к какому разряду нематод, подвижных или неподвижных, будут причислены полуподвижные нематоды.

Следующей причиной, оказывающей существенное влияние на точность результатов, а именно на их воспроизводимость, является нестандартность условий культивирования нематод в присутствии авермектинов. Согласно известного способа культивирование нематод осуществляется при комнатной температуре без учета значений рН культуральной жидкости и значений температуры окружающей среды.

Выбор нематод рода Саеnorhabditis в качестве тест-объекта для изучения влияния авермектинов также является неудачным с точки зрения воспроизводимости получаемых результатов.

Известно, что жизненный цикл нематод рода Саеnorhabditis характеризуется очень высокими скоростями онтогенеза и составляет 3-6 дней. При этом в популяции можно выделить несколько возрастных групп нематод. В свежеполученной популяции Саеnorhabditis sp. , которая поддерживалась на овсяной кашице в течение 3-4 дней, помимо 20-25% погибших нематод можно выделить по меньшей мере три возрастные группы активно подвижных нематод: старые, молодые и зрелые. Они визуально отличаются друг от друга величиной тела: 1500,500 и 980 мк для старых, молодых и зрелых нематод соответственно. Хранение нематод в водном растворе в холодильнике при 7^оС приводит к существенному изменению жизнеспособного возрастного состава популяции уже в первые сутки хранения по сравнению с исходным составом популяции. Иначе говоря, с возрастной точки зрения популяции нематод рода Саеnorhabditis sp. является динамической популяцией. Эта особенность физиологии нематод данного рода затрудняет получение стандартизованного тест-объекта от партии к партии, даже если предварительно будет проводиться разделение популяции по возрастным группам.

Помимо этого особи, относящиеся к молодым, а также зрелым и старым возрастным группам, по разному чувствительны к авермектинам, в частности к ивермектину. По нашим данным 50% -ная гибель молодых особей наступает при концентрации вещества, равного 0,75, а у зрелых и старых особей этот эффект наступает при 1,25 мкг/мл.

И, наконец, существенным недостатком, влияющим на точность получаемых результатов, является то, что в известном способе не используется опорная концентрация испытуемых веществ, т. е. концентрация, при которой наступает, например, 50% -ная гибель нематод. Применение опорной концентрации в такого типах способах позволяет провести сопоставление данных стандарта и испытуемых веществ, что в свою очередь дает возможность выражать действие веществ в весовых единицах.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Цель достигается тем, что для определения нематоцидной активности авермектинов в качестве тест-объекта используют рисовую нематоду Aphelenchoides bessei. Нематоды в количестве 10-20 особей помещают в микроячейки и культивируют в 100 μ L 0,1 М фосфатного буфера рН 5,5-8,0 в присутствии различных концентраций авермектинов в течение 1-3 ч при 28 ±1^оС. После культивирования определяют в микроскопе общее число нематод A, число активно подвижных нематод В, число полуподвижных нематод С, число неподвижных нематод D. Вычисляют процент смертности нематод по формуле
1 - × 100% в каждом разведении.

Нематоцидную активность определяют путем сравнения СК₅₀(смертельная концентрация) испытуемого образца и стандартного образца известной концентрации.

П р и м е р 1. Определение нематоцидной активности ивермектина. Готовят рабочий раствор ивермектина в 96% -ном этаноле с концентрацией 1000 мкг/мл. Из него приготавливают серию разведений вещества с концентрацией от 0,1 до 10,0 мкг/мл с помощью 0,1 М фосфатного буфера рН 6,8. Разведения вносят с микроячейки на микропланшете в количестве 100 μ L. В каждую микроячейку вносят по 10-20 особей нематод Aphelenchoides bessei. Микропланшетку помещают в термостат на 30^оС. Через 2 ч подсчитывают в микроскопе общее количество нематод в микроячейке A, число активных подвижных нематод В, число полуподвижных нематод. Вычисляют процент смертности нематод в каждом разведении (табл. 1). Находят концентрацию вещества, при котором смертность составляет 50% . В указанных условиях она равна 1 мкг/мл. Следовательно нематоцидная активность ивермектина составляет 1 мкг/мл.

П р и м е р 2. Определение нематоцидной активности ивермектина. Все процедуры проводят как в примере 1, за исключением того, что культивирование нематод Aphelenchoides bessei в присутствии ивермектина проводят в течение 1 ч. Нематоцидная активность составляет 1 мкг/мл.

П р и м е р 3. Определение нематоцидной активности ивермектина. Все процедуры проводят как описано в примере 1, за исключением того, что культивирование нематод Aphelenchoides bessei в присутствии ивермектина проводят в течение 1 ч. Нематоцидная активность составляет 1 мкг/мл. Культивирование менее 1 ч влияет на точность результатов, так как смертность составляет всего 20-30% от той, которая наблюдается при культивировании не менее 1 ч. Культивирование нематод более 3 ч не приводит к значимым изменениям результатов, однако увеличивает время анализа, а следовательно, его себестоимость.

П р и м е р 4. Определение нематоцидной активности ивермектина. Все процедуры проводят так как описано в примере 1, за исключением того, что рН среды культивирования составляет 5,5. Нематоцидная активность ивермектина составляет 1 мкг/мл.

П р и м е р 5. Определение нематоцидной активности ивермектина. Все процедуры проводят как описано в примере 1, за исключением того, что используют среду для культивирования со значением рН на уровне 7,0. Нематоцидная активность составляет 1 мкг/мл.

П р и м е р 6. Определение нематоцидной активности ивермектина. Все процедуры проводят как примере 1, за исключением того, что используют среду для культивирования со значением рН на уровне 8,0. Нематоцидная активность составляет 1 мкг/мл.

Использование буферного раствора со значением рН ниже 5,5 и выше 8,0 влияет на точность получаемых результатов, так как при этом отмечается снижение подвижности нематод этого вида.

П р и м е р 7. Определение нематоцидной активности авермектина В_1а. Готовят рабочий раствор авермектина В_1а в 96% -ном этаноле с концентрацией 1000 мкг/мл. Из него приготавливают серию разведений вещества от 5 до 15 мкг/мл. Далее условия аналогичны примеру 1. Нематоцидная активность составляет 7 мкг/мл.

П р и м е р 8, Определение нематоцидной активности авермектина A_1в. Готовят рабочий раствор авермектина A_1в в 96% -ном этаноле с концентрацией вещества 100 мкг/мл. Из него приготавливают серию разведений вещества от 15 до 25 мкг/мл. Далее условия анализа аналогичны примеру 1. Нематоцидная активность авермектина A_1в составляет 19 мкг/мл.

П р и м е р 9. Определение нематоцидной активности экстрактов мицелиальной биомассы Streptomyces avermitilis BKM AC 1301. Споры штамма Streptomyces avermitilis BKM AC 1301 выращивают на агаризованной 2% -ной глюкозо-картофельной среде в течение 10 сут при 28^оС. Кусочек агаризованной среды 0,5х1,0 со спорами вносят в качалочные колбы емкостью 750 мл, содержащие 50 мл посевной среды следующего состава, мас. % : глюкоза 1; кукурузный экстракт 0,3 (по техническому весу); соевая мука 1,2; аутолизат дрожжей 0,6; кальций углекислый 0,6; вида дистиллированная до 100. Глюкозу стерилизуют отдельно при 0,5 ати 30 мин и вносят в колбы в момент засева среды посевным материалом. Остальные компоненты стерилизуют при 0,8 ати 40 мин. Колбы устанавливают на качалку с числом оборотов 220 в минуту и выращивают инокулят при 28 ±1^оС в течение 24 ч. Затем инокулят в количестве 5% передают в колбы с ферментационной средой следующего состава, мас. % : глюкоза 7; кукурузный экстракт 0,3 (по техническому весу); соевая мука 1,2; аутолизат дрожжей 0,6; вода дистиллированная до 100. Значение рН до стерилизации 6,8-7,2. Стерилизация компонентов раздельная: глюкоза стерилизуется при 0,5 ати 30 мин, а остальные компоненты при 0,8 ати 40 мин. Глюкозу вносят в колбы в момент засева среды инокулятом. Ферментацию проводят в течение 144 ч при 28± 1^оС. Авермектины выделяют из мицелия следующим образом. Вначале отделяют мицелий на центрифуге при 3000 оборотах в минуту в течение 20 мин. К влажному осадку мицелия, полученного из 10 мл культуральной жидкости добавляют 10 мл 96% -ного этанола и проводят экстракцию авермектинов при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 20 мин. В центрифугате после отделения мицелия при 3000 оборотах в минуту в течение 10 мин определяют нематоцидную активность. Для этого готовят серию разведений с помощью 0,1 М фосфатного буфера так, чтобы экстракты были разведены в 40, 50, 60, 70, 80 и 100 раз. В качестве стандарта используют авермектин В_1а, нематоцидная активность которого составляет 7 мкг/мл. Далее условия анализа аналогичны примеру 1. Нематоцидная активность мицелиальных этанольных экстрактов Streptomyces avermitilis BKM AC 1301 составляет 350 мкг/мл.

Таким образом предлагаемый способ позволяет определять нематоцидную активность как очищенных (ивермектин, авермектин В_1а и авермектин A_1в), так и неочищенных (мицелиальные этанольные экстракты) форм авермектинов и выражать нематоцидную активность в весовых единицах.

Использование: микробиологическая промышленность, оценка активности авермектинов. Сущность способа: готовят разведения авермектина, затем в них вносят рисовые нематоды по 10 - 20 особей, культивируют нематоды при 28 - 36 С, рН 5,5 - 8,0, в течение 1 - 3 ч, затем под микроскопом подсчитывают общее количество нематод в каждом из разведений авермектина, количество активно подвижных нематод B, количество нематод с нарушенной подвижностью C и количество неподвижных нематод D, вычисляют процент смертности нематод в каждом разведении по формуле 1 - [B + (C 0,5) + (D 0)] /A 100, находят концентрацию исследуемого образца авермектина, при которой смертность нематод составляет 50% (СК₅₀), и определяют нематоцидную активность путем сравнения СК₅₀ исследуемого образца авермектинов и эталонного образца известной концентрации. 2 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕМАТОЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ АВЕРМЕКТИНОВ, включающий культивирование нематод in vitro в присутствии различных концентраций исследуемого образца авермектинов с последующим подсчетом общего количества и неподвижных нематод и определение нематоцидной активности, отличающийся тем, что из нематод используют рисовую нематоду Aphelenchoides bessei, культивирование осуществляют при 28 - 36^oС, pH среды 5,5 - 8,0 в течение 1 - 3 ч, дополнительно определяют количество нематод с нарушенной подвижностью, вычисляют процент смертности нематод по формуле
1 - × 100% ,
где A - общее количество нематод;
B - количество активно подвижных нематод;
C - количество нематод с нарушенной подвижностью;
D - количество неподвижных нематод,
находят концентрацию исследуемого образца авермектина, при которой смертность нематод составляет 50% /Ск₅₀/, а нематоцидную активность определяют путем сравнения СК₅₀ исследуемого образца и эталонного образца известной концентрации.