СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИВНОСТИ КЛЕТОК КРОВИ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 G01N33/53 G01N33/49 

Изобретение относится к исследованиям в области биологии и медицины, а именно к измерению характеристик клеток крови в организме (лабораторная оценка свойств клеток периферической крови человека и животных с диагностическими и научно-исследовательскими целями).

Известно, что все клетки организма способны к контактному (адгезивному) и дистантному химическому (опосредованному гуморальными факторами) взаимодействию (В.Л. Быков. Цитология и общая гистология. - СПб.: СОТИС, 1998, стр.111). Среди механизмов межклеточного контактного взаимодействия клеток, в частности клеток крови (гемоцитов), имеет место способность этих клеток к адгезии к окружающих их объектам. Адгезивные свойства клеток в организме проявляются контактным межклеточным взаимодействием, а вне организма - прилипанием адгезивных клеток, в том числе лейкоцитов, к стеклу, нейлону и другим объектам. Адгезивность клеток крови отражает в определенной степени их функциональное состояние при различных патологических процессах (лихорадка, воспаление, инфекционный процесс, некроз и др.) (патент RU 2145084, G01N 33/48, G01N 33/49, опубл. 27.01.2000). Специфические адгезивные взаимодействия между клетками обеспечиваются взаимным распознаванием адгезивных рецепторов и соответствующим им лигандов (субстратных адгезионных молекул - САМ), экспрессированных на их поверхности (Быков В.Л. Цитология и общая гистология. - СПб.: СОТИС, 1998, стр.111).

Существующие методы определения адгезивных свойств клеток, основанные на дорогостоящих и достаточно сложных процедурах выделения собственно адгезивных структур определенных видов клеток (САМ), требуют специальной аппаратуры, химреактивов, оборудования и специально подготовленного персонала (патент RU 2145084, G01N 33/48, G01N 33/49, опубл. 27.01.2000).

Известен метод подсчета агломерированных лейкоцитов в мазке крови больных инфарктом миокарда при просмотре препарата по диагонали (М.И. Китаев, В.М. Евстропов, В.Н. Клейменов. Лимфоцитарно-гранулоцитарное взаимодействие в феномене аллергической агломерации лейкоцитов (аллергенолейкергии) у больных инфарктом миокарда / Здравоохранение Киргизии, 1986, №1, стр.43-45).

Наиболее близким по существу предлагаемого изобретения - прототипом - является способ определения адгезивности клеток периферической крови (патент RU 2145084, G01N 33/48, G01N 33/49, опубл. 27.01.2000), включающий регистрацию лейкоцитов с учетом их агрегабильности, подсчет лейкоцитов с учетом их местонахождения в мазке и взаимосвязи с другими клетками.

Недостатком известного способа является произвольное (нестандартизованное) количество клеток, участвующих в данном исследовании, а также вероятность разрушения клеточных агрегатов при осуществлении мазка крови (препарата). При проведении изучения влияния концентрации лейкоцитарных клеток крови доноров на интенсивность их агломерации было установлено, что количество учитываемых агломерированных клеток может варьировать при различных концентрациях клеток, от 58,4 до 38,6, т.е. на 151%. К тому же известно, что содержание лейкоцитов в периферической крови может как повышаться (лейкоцитоз), так и снижаться (лейкопения). Существует лейкоцитоз, вызванный различными физиологическими (прием пищи, тяжелая мышечная работа, боль, эмоции и т.д.) и патологическими воздействиями (воспаление, бактериальные инфекции, отравления и т.д.) (Физиология человека: Учебник. Т.1 / В.М. Покровский, Г.Ф. Коротько, В.И. Кобрин и др.; Под редакцией В.М. Покровского, Г.Ф. Коротько. - М.: Медицина, 1998. стр.292-293), а также лейкопения (при вирусных болезнях, лучевой болезни и т.д.) (О.И. Лаврентьева. Кровь - зеркало здоровья [Электронный ресурс] // Бюллетень медицинских интернет конференций, Издательство Наука и Инновация (Саратов), 2013, т.3, №2, стр.432. Режим доступа: http//elibrary.ra/item.asp?id=18820782).

Задачей данного изобретения является повышение достоверности и эффективности способа, расширение его возможностей.

Сущность изобретения заключается в том, что способ определения адгезивности клеток крови включает отбор проб исследуемой ткани организма, фиксацию и окраску клеток, а также учет адгезивности клеток по их адгезии к стеклу и агрегабильности, месторасположению и составу взаимодействующих клеток, при этом клетки разделяют на мононуклеарные и полинуклеарные, количественно стандартизируют, проводят их совместное инкубирование при оптимальных для их агрегации условиях временного и температурного режимов.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения адгезивности вне организма клеток крови или лимфоидной ткани согласно предлагаемому изобретению совокупность исследуемых клеток организма разделяют на мононуклеарные и полинуклеарные клетки, количественно их стандартизируют и проводят их совместное инкубирование при оптимальных для клеточной агрегации условиях временного и температурного режимов, что дает возможность получить более достоверные данные и расширяет возможности известного способа.

Поставленная цель достигается следующим образом.

Для этого используют фракцию мононуклеарных и фракцию полинуклеарных клеток, выделенных из исследуемой ткани с помощью двухступенчатого градиента плотности фиколл-верографина. Полинуклеары в количестве приблизительно 3×10⁶ кратковременно (30 мин) инкубируют на покровном стекле в среде 199, освобождают прилипшие к стеклу клетки от неприлипших удалением их совместно с питательной средой, добавляют к прилипшим полинуклеарам мононуклеарные клетки в количестве 1×10⁶, инкубируют в течение 45 мин, фиксируют глутаровым альдегидом, этиловым спиртом, промывают в двух сменах дистиллированной воды и окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимза. Под световым микроскопом подсчитывают 200 клеток, регистрируя как свободнолежащие, так и агрегированные клетки: образующие клеточные агрегационные агломераты в количестве трех клеток (показатель А), четырех клеток (показатель Б) и пяти клеток (показатель В) и общий процент клеток, участвующих в образовании агрегатов данных типов (показатель С). При обследовании предлагаемым способом клеток крови доноров нами определено, что процент клеток, образующих трехклеточные агрегационные агломераты (показатель А), составил 30%, четырехклеточные агрегационные агломераты (показатель Б) составил 16%, а процент клеток, образующих пятиклеточные агрегационные агломераты (показатель В), - 5%, общий процент клеток, участвующих в образовании агрегатов данных типов (показатель С), составил 51%.

Пример 1

Забираем для обследования кровь у больного с наличием воспалительного процесса и лихорадки (воспаление легких). Используем фракцию мононуклеарных и фракцию полинуклеарных клеток, выделенных из исследуемой ткани с помощью двухступенчатого градиента плотности фиколл-верографина. Полинуклеары в количестве 3×10⁶ кратковременно (30 мин) инкубируем на покровном стекле в среде 199, освобождаем прилипшие к стеклу клетки от неприлипших удалением их совместно с питательной средой, добавляем к прилипшим полинуклеарам мононуклеарные клетки в количестве 1×10⁶, инкубируем в течение 45 мин, фиксируем глутаровым альдегидом, этиловым спиртом, промываем в двух сменах дистиллированной воды и окрашиваем азур-эозином по Романовскому-Гимза. Под световым микроскопом подсчитываем 200 клеток, регистрируя как свободнолежащие, так и агрегированные клетки: образующие клеточные агрегационные агломераты в количестве трех клеток (показатель А), четырех клеток (показатель Б) и пяти клеток (показатель В) и общий процент клеток, участвующих в образовании агрегатов данных типов (показатель С). При исследовании предлагаемым способом определяем, что увеличено количество клеток трехклеточных агрегационных агломератов (показатель А=34), не изменено количество клеток четырехклеточных агрегационных агломератов (показатель Б=16) и пятиклеточных агрегационных агломератов (показатель В=5). Общий процент клеток, участвующих в образовании агрегатов данных типов (показатель С), составил 55%. Делаем вывод об умеренном увеличении адгезивности клеток крови у этого больного.

Пример 2

Забираем для обследования кровь у онкологического больного раком прямой кишки, стадия II (T3, N0). При исследовании предлагаемым способом определяем, что снижено количество клеток трехклеточных агрегационных агломератов (показатель А=26), отсутствуют клеточные агрегационные агломераты как в количестве четырех клеток (показатель Б=0), так и в количестве пяти клеток (показатель В=0). Общий процент клеток, участвующих в образовании агрегатов данных типов (показатель С), составил 26. Делаем вывод о резком снижении адгезивности клеток крови у этого больного.

Пример 3

Забираем для обследования кровь у больного ревматоидным артритом (серопозитивный, развернутая стадия). При исследовании предлагаемым способом определяем, что не изменено количество клеток трехклеточных агрегационных агломератов (показатель А=30), снижено количество клеток четырехклеточных агрегационных агломератов (показатель Б=12), но увеличен количественный уровень пятиклеточных агрегационных агломератов (показатель В=15). Общий процент клеток, участвующих в образовании агрегатов данных типов (показатель С), составил 57. Делаем вывод об увеличении адгезивности клеток крови у этого больного с аутоиммунной патологией.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять не только изменения адгезивности клеток крови при разных патологических состояниях, но и регистрирует количественные особенности изучаемой цитологической характеристики у клеток различного взаиморасположения при этих состояниях, например при онкологической и аутоиммунной патологии.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике разных патологических состояний человека. Для этого проводится измерение характеристик клеток крови пациента по определению их адгезивности к стеклу. При этом исследуют их агрегабильность и ведут учет по месторасположению и составу взаимодействующих клеток. Далее клетки разделяют на мононуклеарные и полинуклеарные, количественно стандартизируют и проводят их совместное инкубирование при оптимальных условиях. Способ может быть использован для цитологической характеристики клеток при онкологических и аутоиммунных заболеваниях. Изобретение повышает достоверность и эффективность известного метода подсчета агломеризированных лейкоцитов. 3 пр.

Способ определения адгезивности мононуклеарных и полинуклеарных клеток крови, включающий отбор проб крови, выделение и разделение на мононуклеарные и полинуклеарные клетки, количественную стандартизацию полинуклеарных клеток, совместное инкубирование мононуклеарных и полинуклеарных клеток, фиксацию и окраску клеток, а также учет адгезивности клеток по их агрегабельности между собой, по месторасположению и составу взаимодействующих клеток.