ШТАММ БАКТЕРИИ Xanthomonas campestris - ПРОДУЦЕНТ КСАНТАНА Российский патент 2017 года по МПК C12N1/20 C12P19/06 C12R1/64 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине, пищевой, косметической и фармацевтической промышленности.

Ксантан представляет собой экзополисахарид микробного происхождения, полученный при использовании встречающейся в природе бактерии Xanthomonas campestris. Это биополимер, широко используемый в пищевой и фармацевтической отраслях промышленности. Его также используют и во многих других сферах, таких как добыча нефти, чистка линий трубопроводов, добыча нефти вторичными способами, печатание на текстильных материалах и их окрашивание, работа с глазурями, суспензионными взрывчатыми веществами и сфера косметики. Его используют для целей загущения, суспендирования, стабилизации и гелеобразования (RU 2324711, МПК C08L 5/00, опубл. 20.05.2008).

Известен штамм Xanthomonas campestris NRRL В-1459 (ВКПМ В-6720), широко используемый в промышленности в качестве активного продуцента ксантана (RU 2252033, МПК A61K 47/36, C12P 19/06, опубл. 2004; RU 2323005, МПК A61K 47/00, C12P 19/06, опубл. 27.04.2008; RU 2559553, МПК C12N 1/20, C12P 19/06, C12R 1/64, опубл. 10.08.2015).

Известный штамм Xanthomonas campestris NRRL В 1459 (ВКПМ В-6720) согласно паспорту ВКПМ синтезирует ксантан в количестве 6,1 г/л. Недостатком известного штамма является низкая продуктивность.

Технический результат заключается в создании нового мутантного штамма бактерии Xanthomonas campestris, используемого для получения ксантана, обеспечивающего высокий выход полисахарида.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать штамм бактерии Xanthomonas campestris 2017 (ВКПМ В-12968) - продуцент ксантана.

Заявляемый штамм получен на основе известного промышленного штамма бактерии Xanthomonas campestris NRRL В 1459 (ВКПМ В-6720) - продуцента ксантана путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза.

Штамм бактерии Xanthomonas campestris 2017 продуцирует экзополисахарид - ксантан и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером штамм Xanthomonas campestris 2017 ВКПМ В-12968.

Штамм бактерии Xanthomonas campestris 2017 идентифицирован по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам и генетическим характеристикам и имеет следующие признаки.

Культурально-морфологические свойства. Клетки одиночные грамотрицательные подвижные палочки с закругленными концами. Спор не образуют. На агаризованной среде следующего состава (г/л): сахароза - 20,0; дрожжевой экстракт - 10,0; пептон - 10,0; агар - 17,0; вода дистиллированная - 1,0 л, образуют круглые, с ровным краем, однородной маслянистой консистенции, блестящие колонии выпуклой формы желтого цвета.

Физиолого-биохимические свойства. Культура каталазоположительная и оксидазоотрицательная, разжижает желатин, пептонизирует молоко, не восстанавливает нитраты, гидролизует крахмал. Продуцирует кислоту из глюкозы, галактозы, мальтозы, сахарозы, раффинозы. Аэроб. Оптимальная температура роста 28°C. Оптимальное значение рН среды 6,0.

Генетические характеристики. Штамм идентифицирован до вида с помощью анализа 16S РНК. При секвенировании вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, получена собранная нуклеотидная последовательность для штамма. Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank. По данным анализа генов, кодирующих 16S рРНК, построено филогенетическое дерево Xanthomonas campestris 2017 с гомологичными штаммами, представленное на фигуре. По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, штамм наиболее близок к виду Xanthomonas campestris.

Штамм бактерии Xanthomonas campestris 2017 предназначен для получения ксантана путем глубинного культивирования на ферментационных средах.

При глубинном культивировании штамма бактерии Xanthomonas campestris 2017 в динамических условиях на качалке при 200 об/мин и температуре 28°C на среде следующего состава (г/л): сахароза - 20,0, дрожжевой экстракт - 3,0, K₂HPO₄ - 2,0, KH₂PO₄ - 2,0, MgSO₄×7H₂O - 0,1, количество ксантана, образующегося на третьи сутки, составляет 9,5 г/л. На среде с мелассой образуется 12,2 г/л ксантана. На среде с кукурузным крахмалом - 13,2 г/л ксантана.

При глубинном культивировании штамма бактерии Xanthomonas campestris 2017 в динамических условиях на качалке при 200 об/мин и температуре 28°C на среде следующего состава (г/л): сахароза - 20, MgSO₄×7H₂O - 0,2, (NH₄)₂SO₄ - 3,0, Н₃ВО₃ - 0,006, FeCl₃ - 0,0024, KH₂PO₄ - 2,0, CaCO₃ - 0,002, ZnO - 0,006, лимонная кислота - 2,0, количество ксантана, образующегося на третьи сутки, составляет 3,6 г/л. На среде с мелассой образуется 9,5 г/л ксантана. На среде с кукурузным крахмалом - 15,6 г/л ксантана.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм бактерии Xanthomonas campestris 2017 культивируют в течение 72 часов в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 200 об/мин и температуре 28°C в колбах на 250 мл, содержащих 50 мл среды следующего состава (г/л): сахароза - 20,0, дрожжевой экстракт - 3,0, K₂HPO₄ - 2,0, KH₂PO₄ - 2,0, MgSO₄×7H₂O - 0,1, рН среды 6,0. Режим стерилизации 121°C в течение 20 минут. Ферментационную питательную среду засевают посевным материалом культуры в количестве 5%, выращенным при 28°C в течение 48 часов. Полученную культуральную жидкость центрифугируют в течение 30 минут при 8000 об/мин 4°C. Для осаждения ксантана в супернатант добавляют этиловый спирт в соотношении 1:2, затем смесь выдерживают в холодильнике при 4°C в течение 24 часов. Далее осажденный ксантан высушивают при 80°C до постоянной массы. Количество ксантана определяют весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 9,5 г/л.

Пример 2. Штамм бактерии Xanthomonas campestris 2017 культивируют в течение 72 часов в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 200 об/мин и температуре 28°C в колбах на 250 мл, содержащих 50 мл среды следующего состава (г/л): меласса - 45,0, дрожжевой экстракт - 3,0, K₂HPO₄ - 2,0, KH₂PO₄ - 2,0, MgSO₄×7H₂O - 0,1, рН среды 6,0. Режим стерилизации 121°C в течение 20 минут. Ферментационную питательную среду засевают посевным материалом культуры в количестве 5%, выращенным при 28°C в течение 48 часов. Полученную культуральную жидкость центрифугируют в течение 30 минут при 8000 об/мин 4°C. Для осаждения ксантана в супернатант добавляют этиловый спирт в соотношении 1:2, затем смесь выдерживают в холодильнике при 4°C в течение 24 часов. Далее осажденный ксантан высушивают при 80°C до постоянной массы. Количество ксантана определяют весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 12,2 г/л.

Пример 3. Штамм бактерии Xanthomonas campestris 2017 культивируют в течение 72 часов в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 200 об/мин и температуре 28°C в колбах на 250 мл, содержащих 50 мл среды следующего состава (г/л): кукурузный крахмал - 20,0, дрожжевой экстракт - 3,0, K₂HPO₄ - 2,0, KH₂PO₄ - 2,0, MgSO₄×7H₂O - 0,1, рН среды 6,0. Режим стерилизации 121°C в течение 20 минут. Ферментационную питательную среду засевают посевным материалом культуры в количестве 5%, выращенным при 28°C в течение 48 часов. Полученную культуральную жидкость центрифугируют в течение 30 минут при 8000 об/мин 4°C. Для осаждения ксантана в супернатант добавляют этиловый (или изопропиловый) спирт в соотношении 1:2, затем смесь выдерживают в холодильнике при 4°C в течение 24 часов. Далее осажденный ксантан высушивают при 80°C до постоянной массы. Количество ксантана определяют весовым методом. Выход сухого ксантана составил 13,2 г/л.

Пример 4. Штамм бактерии Xanthomonas campestris 2017 культивируют в течение 72 часов в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 200 об/мин и температуре 28°C в колбах на 250 мл, содержащих 50 мл среды следующего состава (г/л): сахароза - 20, MgSO₄×7H₂O - 0,2, (NH₄)₂SO₄ - 3,0, Н₃ВО₃ - 0,006, FeCl₃ - 0,0024, KH₂PO₄ - 2,0, CaCO₃ - 0,002, ZnO - 0,006, лимонная кислота - 2,0, рН среды 6,0. Режим стерилизации 121°C в течение 20 минут. Ферментационную питательную среду засевают посевным материалом культуры в количестве 5%, выращенным при 28°C в течение 48 часов. Полученную культуральную жидкость центрифугируют в течение 30 минут при 8000 об/мин 4°C. Для осаждения ксантана в супернатант добавляют этиловый спирт в соотношении 1:2, затем смесь выдерживают в холодильнике при 4°C в течение 24 часов. Далее осажденный ксантан высушивают при 80°C до постоянной массы. Количество ксантана определяют весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 3,6 г/л.

Пример 5. Штамм бактерии Xanthomonas campestris 2017 культивируют в течение 72 часов в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 200 об/мин и температуре 28°C в колбах на 250 мл, содержащих 50 мл среды следующего состава (г/л): меласса - 45,0, MgSO₄×7H₂O - 0,2, (NH₄)₂SO₄ - 3,0, Н₃ВО₃ - 0,006, FeCl₃ - 0,0024, KH₂PO₄ - 2,0, CaCO₃ - 0,002, ZnO - 0,006, лимонная кислота - 2,0, рН среды 6,0. Режим стерилизации 121°C в течение 20 минут. Ферментационную питательную среду засевают посевным материалом культуры в количестве 5%, выращенным при 28°C в течение 48 часов. Полученную культуральную жидкость центрифугируют в течение 30 минут при 8000 об/мин 4°C. Для осаждения ксантана в супернатант добавляют этиловый спирт в соотношении 1:2, затем смесь выдерживают в холодильнике при 4°C в течение 24 часов. Далее осажденный ксантан высушивают при 80°C до постоянной массы. Количество ксантана определяют весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 9,5 г/л.

Пример 6. Штамм бактерии Xanthomonas campestris 2017 культивируют в течение 72 часов в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 200 об/мин и температуре 28°C в колбах на 250 мл, содержащих 50 мл среды следующего состава (г/л): кукурузный крахмал - 20, MgSO₄×7H₂O - 0,2, (NH₄)₂SO₄ - 3,0, Н₃ВО₃ - 0,006, FeCl₃ - 0,0024, KH₂PO₄ - 2,0, CaCO₃ - 0,002, ZnO - 0,006, лимонная кислота - 2,0, рН среды 6,0. Режим стерилизации 121°C в течение 20 минут. Ферментационную питательную среду засевают посевным материалом культуры в количестве 5%, выращенным при 28°C в течение 48 часов. Полученную культуральную жидкость центрифугируют в течение 30 минут при 8000 об/мин 4°C. Для осаждения ксантана в супернатант добавляют этиловый спирт в соотношении 1:2, затем смесь выдерживают в холодильнике при 4°C в течение 24 часов. Далее осажденный ксантан высушивают при 80°C до постоянной массы. Количество ксантана определяют весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 15,6 г/л.

По сравнению с известным решением предлагаемое обеспечивает высокий выход полисахарида (на среде с мелассой образуется 9,5 г/л ксантана, на среде с кукурузным крахмалом - 15,6 г/л) за счет использования штамма бактерии Xanthomonas campestris 2017 (ВКПМ В-12968)

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Xanthomonas campestris 2017, обладающий способностью продуцировать ксантан, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-12968. Штамм может быть использован в медицине, пищевой, косметической и фармацевтической промышленности. Изобретение позволяет повысить выход ксантана. 1 ил., 6 пр.

Штамм бактерии Xanthomonas campestris ВКПМ В-12968 - продуцент ксантана.