СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КСАНТАНА Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12P19/06 C12R1/64 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно - к биотехнологическому получению экзополисахаридов, и может быть использовано при получении ксантана.

Ксантан представляет собой микробиологический полимер, широко применяемый в пищевой, фармацевтической, косметической промышлености, а так же при добыче нефти.

Известен (RU, патент 2323005, опубл. 2008) способ получения ксантана, включающий культивирование штамма Xanthomonas campestris ВКМ В-611 на питательной среде, содержащей в качестве источника углеродного питания сахарозу, а также минеральные соли и факторы роста, в условиях аэрации и перемешивания причем культивирование ведут в ферментерах без выделения ксантана, но с концентрированием культуральной жидкости с наработанным ксантаном. Используемые ферментеры предварительно последовательно промывают 0,01-0,05%-ным водным раствором β-лактамного антибиотика или 0,01-0,05%-ным водным раствором антибиотика рода тетрациклинов или их смесью при той же концентрации в любом соотношении, водой и стерилизуют.

Недостатком известного способа следует признать использование в качестве источника углеродного питания сахарозы, а также сложность промывки ферментеров.

Известен (US патент 3485719, опубл. 23.12.1969) способ получения ксантанов с использованием бактерий Xanthomonas

campestris. Известный способ предусматривает культивирование бактерий Xanthomonas campestris с введением в состав питательной среды, кроме источника углерода (сахароза), ионов железа и хелатообразующих соединений. Выделение ксантана из культуральной жидкости не производят.

Недостатком указанного способа является значительное загрязнение полученной культуральной жидкости неутилизируемыми бактериями компонентами питательной среды.

Известен (FR, патент 2231748, опубл. 1975) способ получения ксантанов, включающий культивирование штамма Xanthomonas campestris ВКМ В-611 на питательной среде, содержащей в качестве источника углеродного питания метанол, а также минеральные соли.

Недостатком известного способа следует признать не только использование токсичного компонента (метанола), но и малое содержание экзосахаров в конечной культуральной среде.

Наиболее близким аналогом разработанного способа можно признать (SU, патент 929015, опубл. 1982) способ производства ксантанов, включающий культивирование культуры штамма Pseudomonas polysaccharogenes М-30 на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, а также минеральные соли, в условиях аэрации, с последующим выделением ксантана, причем в качестве источника углерода использован метанол.

Недостатком известного способа следует признать применение токсичного источника углерода (метанола), а также слабую эффективность штамма Pseudomonas polysaccharogenes М-30 как продуцента ксантана.

Техническая задача, решаемая посредством разработанного технического решения, состоит в оптимизации технологии получания ксантана.

Технический результат, получаемый при реализации способа, состоит в повышении эффективности получения ксантана при одновременном использовании в качестве источника углерода не токсичной предварительно гидролизованной низкосортной древесины.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ получения ксантана, включающий культивирование культуры бактерий Xanthomonas campestris на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, а также минеральные соли, в условиях аэрации с последующим экстрагированием ксантана из культуральной жидкости, причем в качестве источника углерода в питательной среде используют предварительно гидролизованную низкосортную древесину, при этом на питательной среде осуществляют культивирование штамма Xanthomonas campestris В-2228, а экстракцию проводят действием низших однатомных спиртов, предпочтительно этиловым.

Выращивание штамма Xanthomonas campestris В-2228, полученного из коллекции ВНИИГенетика ВКПМ, в совокупности с использованием в качестве источника углерода предварительно гидролизованной низкосортной древесины (ольха, осина, береза и т.д) позволяет решить поставленную задачу и достичь указанного технического результата - исключить их технологического процесса токсичное вещество и утилизировать низкосортную древесину с одновременным повышением эффективности культивирования,

выраженый повышенным содержанием продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Кроме предварительно гидролизованной низкосортной двевесины в качестве источника углерода могут быть использованы и другие предварительно гидролизованные целлюлозосодержащие субстраты.

Культивирование продуцента ксантиана проводят в присутствии источников калия, фосфора, магния, кальция, органического и неорганического азота.

Гидролиз низкосортной древесины может быть осуществлен путем обработки измельченной низкосортной древесины неорганической кислотой или ферментативным путем. В результате гидролиза получают продукт с содержанием 1,75-1,98 дисахаров и 0,56-0,64 моносахаров, который предназначен для микробиологического синтеза ксантана в качестве источника сахаров.

Поскольку процесс биотехнологического получения ксантана достаточно чувствителен к присутствию посторонней микрофауны желательно проводить процесс в асептическом режиме.

Поскольку в ходе культивирования ксантана расходуются компоненты питательной среды желательно в ходе культивирования культуры бактерий добавлять в ферментер питательную среду.

Культуральную среду с наработанным ксантаном обрабатывают с целью экстракции ксантана низшим одноатомным спиртом, предпочтительно, этиловым.

Спиртовую фракцию отделяют и любым известным образом из нее выделяют ксантан.

Разработаный способ осуществляют следующим образом.

В состав ферментационной среды для культивирования продуцента ксантана входят источник сахаров (упаренный гидролизат

древесного сырья - УГДС), кукурузный экстракт (ростовой фактор), аммоний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый и вода.

Основой источника сахаров является отход - древесная щепа. Размер исходных частиц щепы варьирует в широком пределе и зависит от вида древесины. Гидролиз щепы может быть как кислотным, так и ферментативным. В любом варианте гидролиз проводят известным образом.

Выращивание посевного материала проводят на скошенной агаризованной среде.

В качестве среды для твердофазного культивирования используют агаризованный 2% агара бульон МПА с добавлением 2% стерильной глюкозы.

Полученную среду в асептических условиях разливают в стерильные пробирки с ватными пробками. Укладывают пробирки на валик для получения скошенной твердой среды. После остывания и затвердения агаризованной среды в пробирках пробирки помещают в термостат при температуре 37°C на 5 суток для проращивания.

Через 5 суток отбирают визуально стерильные пробирки со скошенной агаризованной средой и производят в асептических условиях посев культуры продуцента ксантана микробиологической петлей с пробирки с культурой, проверенной на отсутствие контаминантов визуально и микроскопированием, хранящейся в холодильнике не более 20 суток.

Пробирки после посева помещают в термостат при температуре 27-28°C на 24 часа.

Посевная среда для выращивания в колбах имеет следующий состав, г/л:

УГДС (по глюкозе) - 10,0 Кукурузный экстракт - 15,0 Аммоний сернокислый - 1,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,5 Магний сернокислый пятиводный - 0,7 Остальное - водопроводная вода

В асептических условиях посевную среду по 10 мл заливают в пробирки с культурой, полученные ранее и производят смыв культуры с поверхности агаризованной среды стерильной пипеткой. Среду с культурой из пробирок асептически переносят в посевную среду. Перемешивают и разливают по стерильным колбам емкостью 250 мл по 30 мл в каждую колбу. Приготовленные колбы устанавливают на качалке. Включают перемешивание на 380-400 об/мин и устанавливают температуру культивирования 26-28°C. В установленном режиме колбы культивируют в течение 24 часов.

Затем колбы снимают с качалки и в асептических условиях сливают посевной материал из каждой колбы в стерильную колбу с нижним тубусом, шлангом и зажимом на нем. Из этой колбы отбирают пробу усредненного посевного материала из колб и осуществляют проверку посевного материала на отсутствие контаминантов микроскопированием и высевом на твердую питательную среду.

При культивировании продуцента ксантана в биореактор, в котором находится 8 л стерильной УГДС, вносят ранее полученный посевной материал, а также ранее подготовленные стерильные растворы солей и ростового фактора. Включают подачу стерильного воздуха в биореактор. Процесс проводят при термостатировании и перемешивании содержимого биореактора. В процессе культивирования из биореактора периодически отбирают пробу на

отсутствие контаминантов, оптическую плотность и содержание редуцирующих веществ (РВ, по глюкозе). По показаниям контрольного pH-метра корректируют значение pH в начальной ферментационной среде. При соблюдении всех вышеперечисленных условий, в асептических условиях присоединяют к биореактору колбу с 2 л посевного материала и переносят содержимое колбы в биореактор.

Затем осуществляют культивирование продуцента ксантана осуществляют в биореакторе.

В течение всего процесса культивирования из биореактора периодически отбирают пробу культуральной жидкости для контроля на отсутствие контаминантов, определения концентрации биомассы и ксантана и концентрации остаточных РВ.

При необходимости проводят корректировки состава питательной среды.

Окончание процесса культивирования определяется по результатам анализа проб из биореактора на содержание РВ и показаниям датчика измерения парциального давления растворенного кислорода. По окончании процесса культивирования культуральную жидкость сливают из биореактора через нижний штуцер в пластиковые канистры и культуральная жидкость поступает на стадию выделения ксантана.

Культуральную жидкость обрабатывают этиловым спиртом при перемешивании, отделяют спиртовую фракцию, из которой любым известным способом (предпочтительно, выпариванием спирта) выделяют ксантан.

Использование разработанного способа позволяет повысить содержание ксантана в культуральной жидкости на 0,4% при одновременном использовании в качестве источника углерода предварительно гидролизованной низкосортной древесины.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения ксантана. Проводят культивирование культуры бактерий Xanthomonas cаmpestris ВКПМ В-2228 на питательной среде в условиях аэрации. Питательная среда содержит предварительно гидролизованную низкосортную древесину, источники азота, минеральные соли. Выделяют ксантан из культуральной жидкости путем экстракции низшим одноатомным спиртом. Преимуществом способа является повышение эффективности получения ксантана. 6 з.п. ф-лы, 1 пр.

1. Способ получения ксантана, включающий культивирование культуры бактерий Xanthomonas cаmpestris на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, а также минеральные соли, в условиях аэрации, с последующим выделением ксантана из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве источника углерода в питательной среде используют предварительно гидролизованную низкосортную древесину, при этом на питательной среде осуществляют культивирование штамма Xanthomonas campestris ВКПМ B-2228, а выделение ксантана из культуральной жидкости осуществляют путем экстракции его низшим одноатомным спиртом.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят культивирование в присутствии источников калия, фосфора, магния, органического и неорганического азота.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гидролиз низкосортной древесины проводят путем обработки измельченной низкосортной древесины неорганической кислотой.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гидролиз низкосортной древесины осуществляют ферментативным путем.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс проводят в асептическом режиме.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в ходе культивирования культуры бактерий проводят добавление питательной среды.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экстракцию проводят этанолом.