Штамм бактерии Xanthomonas theicola - продуцент ксантана Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 C12P19/06 C12R1/64 

Штамм бактерии Xanthomonas theicola - продуцент ксантана

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в нефтедобывающей, пищевой, косметической, лакокрасочной и фармацевтической промышленности.

Ксантан представляет собой экзополисахарид микробного происхождения, образуемый бактериями рода Xanthomonas. Ксантан - важный промышленный биополимер, который благодаря своим ценным и уникальным свойствам нашел применение в пищевой, нефтяной, фармацевтической, горнодобывающей, текстильной и других отраслях промышленности. Ксантан экологически безопасен, нетоксичен (используется в пищевой промышленности как стабилизатор и загуститель под названием Е 415).

Известен штамм Xanthomonas campestris NRRL В-1459 (ВКПМ В-6720), широко используемый в промышленности в качестве активного продуцента ксантана (RU 2252033, МПК А61K 47/36, С12Р 19/06, опубл. 2004; RU 2323005, МПК А61K 47/00, С12Р 19/06, опубл. 27.04.2008; RU 2559553, МПК C12N 1/20, С12Р 19/06, C12R 1/64, опубл. 10.08.2015).

Известный штамм Xanthomonas campestris NRRL В 1459 (ВКПМ В-6720) согласно паспорту ВКПМ синтезирует ксантан в количестве 6,1 г/л. Недостатком известного штамма является низкая продуктивность.

Известен штамм Xanthomonas campestris 2017 (ВКПМ В-12968), предлагаемый для получения ксантана (RU 2639557, МПК C12N 1/20, С12Р 19/06, C12R 1/64, опубл. 2017). Недостатком известного штамма является низкая продуктивность (9,5 г/л ксантана на среде с сахарозой, 12,2 г/л ксантана на среде с мелассой).

Технический результат заключается в создании нового высокопродуктивного штамма бактерии Xanthomonas theicola, используемого для получения ксантана, обеспечивающего высокий выход полисахарида.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать штамм бактерии Xanthomonas theicola 6.3, который продуцирует экзопоисахард - ксантан. Штамм бактерии Xanthomonas theicola 6.3 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11268.

На чертеже представлено филогенетическое дерево Xanthomonas theicola ВКПМ В-11268 с гомологичными штаммами.

Заявляемый штамм получен селекционным путем из штамма, выделенного из пораженной ткани капусты.

Штамм бактерии Xanthomonas theicola ВКПМ В-11268 идентифицирован по культурально-морфологическим, физиолого-биохимическим свойствам и генетическим характеристикам и имеет следующие признаки.

Культурально-морфологические свойства. Клетки грамотрицательные палочковидные, с закругленными концами, расположенные одиночно и попарно. Спор не образуют.Колонии на 3 сутки культивирования на среде с мелассой - слизистые, гладкие, округлые, выпуклые, желто-коричневые, диаметром 4-6 мм, на среде с глюкозой и сахарозой - слизистые, диаметром 5-8 мм, желтого цвета.

Физиолого-биохимические свойства. Культура каталазоположительная и оксидазоотрицательная, разжижает желатин, пептонизирует молоко, не восстанавливает нитраты, гидролизует крахмал. Продуцирует кислоту из глюкозы, галактозы, мальтозы, сахарозы, раффинозы. Аэроб. Оптимальная температура роста 28°С. Оптимальное значение рН среды 6,8-7,0.

Генетические характеристики. Штамм идентифицирован до вида с помощью анализа 16S РНК. При секвенировании вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, получена собранная нуклеотидная последовательность для штамма. Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank. По данным анализа генов, кодирующих 16S рРНК, построено филогенетическое дерево Xanthomonas theicola ВКПМ В-11268 с гомологичными штаммами, представленное на фиг. 1. По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, штамм наиболее близок к виду Xanthomonas theicola ВКПМ В-11268 (99%).

Штамм бактерии Xanthomonas theicola ВКПМ В-11268 предназначен для получения ксантана путем глубинного культивирования на ферментационных средах различного состава.

При глубинном культивировании штамма бактерии Xanthomonas theicola ВКПМ В-11268 в динамических условиях на качалке при 250 об/мин и температуре 28°С на среде следующего состава (г/л): сахароза - 20,0, дрожжевой экстракт - 5,0, пептон - 10,0, количество ксантана, образующегося на третьи сутки, составляет 21,2 г/л. На среде с мелассой образуется 22,4 г/л ксантана. На среде с крахмалом - 15,7 г/л ксантана.

При глубинном культивировании штамма бактерии Xanthomonas theicola ВКПМ В-11268 в динамических условиях в биореакторе BIOSTAT А plus объемом 1 литр при 300 об/мин и температуре 28°С на среде с мелассой количество ксантана, образующегося на третьи сутки, составляет 27,9 г/л.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм бактерии Xanthomonas theicola ВКПМ В-11268 культивируют в течение 72 ч в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 250 об/мин и температуре 28°С в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл среды следующего состава (г/л): сахароза - 20,0, дрожжевой экстракт - 5,0, пептон - 10, рН среды 6,8-7,2. Режим стерилизации 121°С в течение 20 мин. Ферментационную питательную среду засевают посевным материалом культуры в количестве 10%, выращенным при температуре 28°С в течение 24 ч. Полученную культуральную жидкость центрифугируют в течение 40 мин при 8000 об/мин. Для осаждения ксантана к супернатанту добавляют 96%-ный этиловый спирт в соотношении 1:2, затем смесь выдерживают в холодильнике при температуре 4°С в течение 24 ч. Далее осажденный ксантан высушивают при температуре 80°С до постоянной массы. Количество ксантана определяют весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 21,2 г/л.

Пример 2. Штамм бактерии Xanthomonas theicola ВКПМ В-11268 культивируют в течение 72 ч в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 250 об/мин и температуре 28°С в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл среды следующего состава (г/л): меласса - 45,0, K₂HPO₄ - 3,0, рН среды 6,8-7,2. Режим стерилизации 121°С в течение 20 мин. Ферментационную питательную среду засевают посевным материалом культуры в количестве 10%, выращенным при температуре 28°С в течение 24 ч. Полученную культуральную жидкость центрифугируют в течение 40 мин при 8000 об/мин. Для осаждения ксантана у супернатанту добавляют 96%-ный этиловый спирт в соотношении 1:2, затем смесь выдерживают в холодильнике при температуре 4°С в течение 24 ч. Далее осажденный ксантан высушивают при температуре 80°С до постоянной массы. Количество ксантана определяют весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 22,4 г/л.

Пример 3. Штамм бактерии Xanthomonas theicola ВКПМ В-11268 культивируют в течение 72 ч в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 250 об/мин и температуре 28°С в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл среды следующего состава (г/л): крахмал - 20,0, дрожжевой экстракт - 3,0, (NH₄)₂SO₄ - 2,0, K₂HPO₄ - 1,0, MgSO₄×7H₂O - 1,0, CaCO₃ - 3,0, рН среды 6,8-7,0. Режим стерилизации 121°С в течение 20 мин.

Ферментационную питательную среду засевают посевным материалом культуры в количестве 10%, выращенным при температуре 28°С в течение 24 ч. Полученную культуральную жидкость центрифугируют в течение 40 мин при 8000 об/мин. Для осаждения ксантана к супернатанту добавляют 96%-ный этиловый спирт в соотношении 1:2, затем смесь выдерживают в холодильнике при температуре 4°С в течение 24 ч. Далее осажденный ксантан высушивают при температуре 80°С до постоянной массы. Количество ксантана определяют весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 15,7 г/л.

Пример 4. Штамм бактерии Xanthomonas theicola ВКПМ В-11268 культивируют в течение 72 ч в динамических условиях в биореакторе BIOSTAT A plus объемом 1 л при 300 об/мин и температуре 28°С на среде следующего состава (г/л): меласса - 45,0, K₂HPO₄ - 3,0, рН среды 6,8-7,2. Режим стерилизации 121°С в течение 20 мин. Ферментационную питательную среду засевают посевным материалом культуры в количестве 10%, выращенным при температуре 28°С в течение 24 ч. Полученную культуральную жидкость центрифугируют в течение 40 мин при 8000 об/мин. Для осаждения ксантана к супернатанту добавляют этиловый спирт в соотношении 1:2, затем смесь выдерживают в холодильнике при температуре 4°С в течение 24 ч. Далее осажденный ксантан высушивают при температуре 80°С до постоянной массы. Количество ксантана определяют весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 27,9 г/л.

По сравнению с известным решением заявленное обеспечивает высокий выход полисахарида (на среде с мелассой образуется 27,9 г/л ксантана, на среде с сахарозой образуется 21,2 г/л ксантана, на среде с крахмалом - 15,7 г/л) за счет использования штамма бактерии Xanthomonas theicola ВКПМ В-11268.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм бактерий Xanthomonas theicola 6.3, обладающий способностью продуцировать ксантан, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-11268. Штамм бактерий Xanthomonas theicola ВКПМ В-11268 может быть использован в нефтедобывающей, пищевой, косметической и фармацевтической промышленности. Изобретение позволяет повысить выход ксантана. 4 пр.

Штамм бактерии Xanthomonas theicola ВКПМ В-11268 – продуцент ксантана.