Штамм бактерий Xanthomonas fuscans - продуцент ксантановой камеди Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C12P19/06 C12R1/64 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой, фармацевтической, косметической промышленности, а также при добыче нефти.

Ксантан (ксантановая камедь) - внеклеточный полисахарид, который представляет собой продукт жизнедеятельности бактерий Xanthomonas. Ксантан представляет собой экзополисахарид микробного происхождения. Ксантан - важный промышленный биополимер, который, благодаря своим ценным и уникальным свойствам, нашел применение в пищевой, нефтяной, фармацевтической, горнодобывающей, текстильной и других отраслях промышленности. Ксантан экологически безопасен, нетоксичен (используется в пищевой промышленности как стабилизатор и загуститель под названием Е 415).

Известен штамм бактерий Xanthomonas fuscans, способный расти в среде, содержащей лактозу, и продуцирующий экзоклеточный полисахарид [Konice et al. Folia Microbiol. 22: 12-18 (1977)]. Исследовано получение экзоклеточного полисахарида фитопатогенной бактерии Xanthomonas fuscans с точки зрения его возможного использования при утилизации промышленных отходов, содержащих лактозу.

Известен штамм Xanthomonas campestris X59-1232, депонированный 4 декабря 1991 г.в Американской коллекции, под номером 55258, используемый в качестве активного продуцента ксантановой камеди [заявка US5279961, МПК: C12N 1/21, C12N 15/63, C12N15/74, опубл. 18.01.1994 г.].

Известен штамм Xanthomonas campestris NRRL В-1459 (ВКПМ В-6720), широко используемый в промышленности в качестве активного продуцента ксантана (RU 2252033, МПК: А61K 47/36, С12Р 19/06, опубл. 20.05.2005; RU 2323005, МПК: А61K 47/00, С12Р 19/06, опубл. 27.04.2008; RU 2559553, МПК: C12N 1/20, С12Р 19/06, C12R 1/64, опубл. 10.08.2015).

Известный штамм Xanthomonas campestris NRRL В 1459 (ВКПМ В-6720) согласно паспорту ВКПМ синтезирует ксантан в количестве 6,1 г/л. Недостатком известного штамма является низкая продуктивность.

Известен штамм Xanthomonas campestris 2017 (ВКПМ В-12968), предлагаемый для получения ксантана (RU 2639557, МПК: C12N 1/20, С12Р 19/06, C12R 1/64, опубл. 21.12.2017). Недостатком известного штамма является низкая продуктивность (9,5 г/л ксантана на среде с сахарозой, 12,2 г/л ксантана на среде с мелассой).

Известен штамм Xanthomonas theicola (ВКПМ В-11268), предлагаемый для получения ксантана (RU 2714638, МПК C12N 1/20, С12Р 19/06, C12R 1/64, опубл. 18.02.2020). Недостатком известного штамма является невысокая продуктивность на некоторых средах: выход сухого ксантана на среде с сахарозой составляет 21,2 г/л.; на среде с мелассой - 27,9 г/л; на среде с крахмалом- 15,7 г/л.

Технический результат заключается в создании нового высокопродуктивного штамма бактерии Xanthomonas fuscans, используемого для получения ксантана, обеспечивающего высокий выход полисахарида, в частности, на среде с мелассой и на среде с ферментативным гидролизатом казеина.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать штамм бактерии Xanthomonas fuscans GBigcsan-615, который продуцирует экзополисахард - ксантан. Штамм бактерии Xanthomonas fuscans GBigcsan-615 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-13738.

Штамм выделен в естественных условиях в Московской области из пораженного колоса пшеницы, проявленного в виде черного пигмента на верхних частях колосовых чешуек, сплошного пятна и широких штрихов, выращен на плотной питательной среде и многократно модифицирован селекционным путем.

Материалы, поясняющие сущность изобретения:

на фиг. 1 представлена фотография штамма бактерии Xanthomonas fuscans GBigcsan-615 ВКПМ В-13738;

на фиг. 2 представлено филогенетическое дерево Xanthomonas fuscans GBigcsan-615 ВКПМ В-13738;

на фиг. 3 представлена таблица сравнения продуктивности заявленного штамма со штаммами из коллекции ВКПМ.

Штамм бактерии Xanthomonas fuscans GBigcsan-615 ВКПМ В-13738 идентифицирован по культурально-морфологическим, физиолого-биохимическим свойствам и генетическим характеристикам и имеет следующие признаки.

Культурально-морфологические свойства. Клетки одиночные грамотрицательные подвижные палочки с закругленными концами. Спор не образуют.На агаризованной среде следующего состава (г/л): сахароза - 20,0; дрожжевой экстракт - 10,0; пептон - 10,0; агар - 17,0; вода дистиллированная - 1,0 л, образуют круглые, с ровным краем, однородной маслянистой консистенции, блестящие колонии выпуклой формы желтого цвета. Фотография штамма бактерии Xanthomonas fuscans GBigcsan-615 ВКПМ В-13738 представлена на фиг. 1

Физиолого-биохимические свойства. Грамотрицательный аэроб. Не восстанавливает нитраты. Культура оксидазоотрицательная и каталазоположительная. Разжижает желатин, пептонизирует молоко, гиролизирует крахмал. Продуцирует кислоту из глюкозы, галактозы, мальтозы, сахарозы и раффинозы. Оптимальная температура роста 28°С. Оптимальное значение рН среды 6,5-7,5.

Генетические характеристики. Штамм идентифицирован до вида с помощью анализа 16S РНК. При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена собранная нуклеотидная последовательность для штамма. Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank. По данным анализа было построено филогенетическое дерево Xanthomonas fuscans GBigcsan-615 ВКПМ В-13738 с гомологичными штаммами, представленное на фиг. 2. Анализ филогенетического родства, построенный с использованием типовых штаммов близкородственных бактерий, показал, что наиболее близким к исследуемому штамму являются виды Xanthomonas fuscans (99%).

Штамм бактерии Xanthomonas fuscans GBigcsan-615 ВКПМ В-13738 предназначен для получения ксантана путем глубинного культивирования на ферментационных средах различного состава.

В результате биосинтеза из данного штамма получается ксантановая камедь определенного молекулярного веса, позволяющая удерживать заданные значения вязкости в широком диапазоне концентраций и температур. Продуцируемая ксантановая камедь по своим свойствам походит для использования в различных областях, в частности, в нефтяной промышленности для приготовления буровых растворов.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм бактерий Xanthomonas fuscans GBigcsan-615 ВКПМ В-13738 культивируют в течение 72 часов в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 200 об/мин и температуре 28°C в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл среды следующего состава (г/л): сахароза - 20,0, дрожжевой экстракт - 3,0, ферментативный гидролизат казеина - 10,0, K₂HPO₄ - 2,0, KH₂PO₄ - 2,0, MgSO₄×7H₂O - 0,1, рН среды 6,8. Режим стерилизации 121°C в течение 20 минут.Ферментационную питательную среду засевают посевным материалом культуры в количестве 5%, выращенным при 28°C в течение 48 часов. Полученную культуральную жидкость фильтруют с помощью ультрафильтрационного модуля УФМ-0,2 Далее отделенный ксантан высушивают при 80°C до постоянной массы. Количество ксантана определяют весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 29,5 г/л.

Пример 2. Штамм бактерий Xanthomonas fuscans GBigcsan-615 ВКПМ В-13738 культивируют в течение 72 часов в динамических условиях на ферментере БИОР-75 при 200 об/мин и температуре 28°C, содержащем 50 л среды следующего состава (г/л): меласса - 45,0, дрожжевой экстракт - 3,0, ферментативный гидролизат казеина - 10,0, K₂HPO₄ - 2,0, KH₂PO₄ - 2,0, MgSO₄×7H₂O - 0,1, рН среды 6,0. Режим стерилизации 121°C в течение 20 минут. Ферментационную питательную среду засевают посевным материалом культуры в количестве 5%, выращенным при 28°C в течение 48 часов. Полученную культуральную жидкость фильтруют с помощью ультрафильтрационного модуля УФМ-0,2. Далее осажденный ксантан высушивают при 80°C до постоянной массы. Количество ксантана определяют весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 24,2 г/л.

Пример 3. Штамм бактерий Xanthomonas fuscans GBigcsan-615 ВКПМ В-13738 культивируют в течение 72 часов в динамических условиях на шейкере-инкубаторе при 200 об/мин и 28°C в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл среды следующего состава (г/л): кукурузный крахмал - 20,0, дрожжевой экстракт - 3,0, ферментативный гидролизат казеина - 10,0, K₂HPO₄ - 2,0, KH₂PO4 - 2,0, MgSO₄×7H₂O - 0,1, рН среды 6,7. Режим стерилизации 121°C в течение 20 минут.Ферментационную питательную среду засевают посевным материалом культуры в количестве 5%, выращенным при 28°C в течение 48 часов. Полученную культуральную жидкость фильтруют с помощью ультрафильтрационного модуля УФМ-0,2. Далее отфильтрованный ксантан высушивают при 80°C до постоянной массы. Количество ксантана определяют весовым методом. Выход сухого ксантана составил 18,2 г/л.

Пример 4. Штамм бактерий Xanthomonas fuscans GBigcsan-615 ВКПМ В-13738 культивируют в течение 72 часов в динамических условиях на шуттель-аппарате в качалочных колбах при 200 об/мин и температуре 28°C, содержащих 100 мл среды следующего состава (г/л): сахароза - 20, MgSO₄×7H₂O - 0,2, (NH₄)₂SO₄ - 3,0, Н₃ ВО₃ - 0,006, FeCl₃ - 0,0024, KH₂PO₄ - 2,0, CaCO₃ - 0,002, ZnO - 0,006, лимонная кислота - 2,0, рН среды 6,7. Режим стерилизации 121°C в течение 20 минут.Ферментационную питательную среду засевают посевным материалом культуры в количестве 5%, выращенным при 28°C в течение 48 часов. Полученную культуральную жидкость центрифугируют в течение 30 минут при 8000 об/мин 4°C. Для осаждения ксантана в супернатант добавляют этиловый спирт в соотношении 1:2, затем смесь выдерживают в холодильнике при 4°C в течение 24 часов. Далее осажденный ксантан высушивают при 80°C до постоянной массы. Количество ксантана определяют весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 12,6 г/л.

Сравнение продуктивности заявленного штамма с продуктивностью штаммов из коллекции ВКПМ (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов) представлено в таблице на фиг. 3. Составы указанных в таблице питательных сред представлены ниже.

Среда 233 (г/л): картофельный отвар - 300, глюкоза 20,0, агар - 20,0 и вода водопроводная - 1,0 л.

Среда 533 (г/л): мальтэкстракт - 3,0, дрожжевой экстракт - 3,0, бактопептон - 5,0, глюкоза 10,0, агар - 20, вода водопроводная - 1,0 л.

Среда DMEM/F12 (г/л): смесь неорганических солей, аминокислот, витаминов и глюкозы.

Среда С** (г/л): кукурузный крахмал - 20,0, дрожжевой экстракт - 3,0, ферментативный гидролизат казеина - 10,0, K₂HPO₄ - 2,0, KH₂PO₄ - 2,0, MgSO₄×7H₂O - 0,1.

По сравнению с известными решениями предлагаемое изобретение обеспечивает более высокий выход полисахарида. В частности, на среде с мелассой образуется 29,5 г/л ксантана, на среде с ферментативным гидролизатом казеина - 24,2 г/л ксантана.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой, фармацевтической, косметической промышленности, а также при добыче нефти. Штамм бактерий Xanthomonas fuscans GBigcsan-615 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-13738. Штамм бактерий Xanthomonas fuscans ВКПМ В-13738 обладает способностью продуцировать ксантановую камедь. Изобретение позволяет повысить выход ксантана. 3 ил., 4 пр.

Штамм бактерий Xanthomonas fuscans ВКПМ В-13738 - продуцент ксантановой камеди.