Штамм Cohnella sp. 56 ВКМ B-3672D для деструкции ксантана Российский патент 2023 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, в частности к производству ферментов, и касается нового штамма бактерий, используемого для синтеза ксантанолитических ферментов. Штамм может быть использован в качестве промышленного штамма-продуцента ксантанолитических ферментов, которые могут найти применение в области нефтедобычи, пищевой и фармакологической промышленности.

Ксантан является внеклеточным гетерополисахаридом, который продуцируют бактерии Xanthamonas campestris. Основная цепь ксантана состоит из связанных β-1,4-глюкозидной связью остатков глюкозы, боковые группы состоят из трех остатков: α-D-манноза (2→1)-β-D-глюкуроновая кислота (4→1)-β-D-манноза у каждого второго остатка глюкозы в положении C3 [Janson, P, Kenne, L, Lindberg, B. (1975) Structure of extracellular polysaccharide from Xanthamonas campestris, Carbohydr. Res., 45, 275-282].

Основной объем ксантановой камеди применяется в промышленной добыче нефти, где она используется при бурении вертикальных и боковых скважин, а также в процессах интенсификации добычи нефти и природного газа при использовании технологии гидроразрыва пласта. Важно, что после завершения операции гидроразрыва пласта вязкость раствора ксантана должна быть уменьшена, т.е. осуществлена деградация ксантана. Заявители обнаружили, что такое снижение вязкости возможно при использовании ферментов, продуцируемых Cohnella sp. 56 [Santos, V. E., Casas, J. A., and Go, E. (2000) Xanthan gum: production, recovery, and properties, Biotechnol Adv., 18(7), 549-579, Benny, I. S., Gunasekar, V., and Ponnusami, V. (2014) Review on Application of Xanthan Gum in Drug Delivery, International Journal of PharmTech Research, 6, 1322-1326].

В настоящее время известны бактериальные штаммы, которые способны к деградации ксантана.

В патенте US4996153 зарегистрирован консорциум бактерий NRRL B-18445, который в ходе культивирования в течение 96 часов продуцировал культуральную жидкость с общей ксантанолитической активностью 195 ед/мг по ксантану, которая снижала вязкость среды. Однако для деградации ксантана в изобретении US4996153 использовался консорциум нетипированных бактериальных штаммов, что является существенным недостатком изобретения, поскольку специфичность фермента/ферментов, приводящих к деградации ксантана была не определена.

В патенте EP0975708 описан консорциум бактерий ATCC No. 55941, который имел в своем составе две бактерии, идентифицированные как Citrobacter freundi и Enterococcus faecalis. В ходе культивирования идентифицированных бактерий на средах с содержанием ксантана в течение 48 часов, консорциум продуцировал культуральную жидкость с ксантаназной активностью 10,4 ед/мг и снижал при этом вязкость среды. Однако общая ксантанолитическая активность консорциума была относительно низкой.

В патенте US4410625 указана бактерия NRRL B-4529 Bacillus sp. Штамм данной бактерии в ходе культивирования на среде (г/л): ксантан - 2; (NH₄)₂SO₄ - 0,5; триптон - 1,8; K₂HPO₄ - 0,7; KH₂PO₄ - 1,5; MgSO₄ - 0,4; MnSO₄ - 0,02; NaCl - 40; в течение 96 часов продуцировал культуральную жидкость с общей ксантанолитичекой активностью 20 ед/мл и также снижал вязкость среды. Ксантанолитические активности в культуральных жидкостях штамма Bacillus sp. и заявляемого штамма Cohnella sp. 56 являются сопоставимыми. Однако сравнение молекулярно-генетических характеристик (16S рРНК) позволило подтвердить, что это разные штаммы бактерий (SEQ ID NO 1). Стоит отметить, что культивирование штамма Cohnella sp. 56 проводилось в обедненной среде с ксантаном, как единственным источником углерода (без триптона).

Технической задачей изобретения является расширение спектра штаммов микроорганизмов, способных к деструкции ксантановой камеди.

Поставленная задача достигается идентификацией бактериального штамма Cohnella sp. 56, способного продуцировать культуральную жидкость за 96 часов при 32 С и 150 об/мин культивирования с ксантаназной активностью 20 ед/мл (320 ед/мг белка), а также использовать ксантан как единственный источник углерода.

Заявляемый штамм выделен из раствора ксантана на пищевом производстве в г. Санкт-Петербург и депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ B-3672D.

Штамм Cohnella sp. 56 характеризуется следующими признаками:

Колонии выпуклые с ровными краями, желатинообразные, белесоватого цвета на среде LB (Lysogeny broth, состав г/л: агар - 15, триптон - 1, натрия хлорид - 1, дрожжевой экстракт - 0.5).

Микроскопические особенности: при световом микроскопическом исследовании клетки имеют вид грам-переменных палочек, агрегированных в цепочки.

Клетки представляют собой палочки, грам-переменные, подвижные, способные образовывать эллипсоидальные эндоспоры.

Физиолого-биохимические:

Клетки факультативно анаэробные, мезофильные. Растут при температуре 5-40°C (оптимум 30°C). Диапазон pH для роста составляет 5-11 (оптимальный pH 6-8).

Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии, хранение ампул 4 - 6 С.

В качестве молекулярно-генетической характеристики штамма Cohnella sp. 56 проведено генотипирование штамма (определение участка 16S рРНК). Идентичность секвенированного участка 16S рРНК длиной 1456 п.о. (SEQ ID NO 1) с штаммом Cohnella plantaginis strain YN-83 (GenBank: NR_132614.1) составила 97,33%, с штаммом Cohnella ginsengisoli strain GR21-5 (GenBank: NR_115998.1) составила 97,12% и с штаммом Cohnella rhizosphaerae strain 18JY42-3 (GenBank: MH497628.1) составила 97,17%, что не позволяет однозначно идентифицировать видовую принадлежность, но позволяет однозначно провести родовую идентификацию штамма.

Изобретение проиллюстрировано следующими примерами:

Пример 1. Способность заявляемого штамма к использованию ксантана в качестве единственного источника углерода.

Клетки штамма Cohnella sp. 56 инкубировали при 30оС на твердой среде следующего состава: агар - 20, ксантан - 5; CaCl₂ - 0,05; K₂HPO₄ - 0,8; KH₂PO₄ - 0,6; NaCl - 0,5; MgSO₄*7H₂O - 0,15; (NH₄)₂SO₄- 0,6 (pH 7,0); FeSO₄*7H₂O - 0,002; MnCl₂ - 0,001. Образование колоний наблюдали через 48 часов.

В используемой среде единственным источником углерода являлся ксантан.

Пример 2. Определение ксантанолитической способности штамма Cohnella sp. 56

Для получения культуральной жидкости готовили жидкую среду следующего состава (г/л): ксантан - 5; CaCl₂ - 0,05; K₂HPO₄ - 0,8; KH₂PO₄ - 0,6; NaCl - 0,5; MgSO₄*7H₂O - 0,15; (NH₄)₂SO₄- 0,6 (pH 7,0); FeSO₄*7H₂O - 0,002; MnCl₂ - 0,001. Среду разливали по 5 мл в 50 мл пробирки и стерилизовали. Затем жидкую среду засевали бактериями штамма Cohnella sp. 56, среду в одной из пробирок не засевали и оставляли в качестве контроля. После 96 часов культивирования при 30°С и 150 об/мин была изучена активность культуральной жидкости по отношению к ксантану. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при 50°С и рН 7,2 высвобождает 1 мкмоль восстанавливающих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы, которые определяются методом Шомоди-Нельсона [А.П. Синицын, А.В. Гусаков, И.М. Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учеб. пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995, с. 144-156]. Ферментативная активность в конечной точке культивирования после 96 ч составила 20 ед/мл культуральной жидкости (320 ед/мг белка).

Была измерена конечная вязкость культуральных жидкостей и контрольной жидкой среды на визкозиметрах Оствальда и ротационном вискозиметре. После 96 часов культивирования при 30°С и 150 об/мин вязкость культуральных жидкостей составила 1,56 сП, вязкость контрольного раствора - 310 сП.

Таким образом, показано, что штамм Cohnella sp. 56 ВКМ B-3672D при культивировании в течение 96 часов способен продуцировать культуральную жидкость, обладающую активностью 20 ед/мл по отношению к ксантану; в ходе культивирования вязкость жидкой питательной среды, содержащей ксантан в качестве единственного источника углерода, уменьшилась в 200 раз по сравнению с контрольным раствором.

Важно, что заявляемый штамм может использовать ксантан как единственный источник углерода при росте на твердых и жидких средах, т.е. может быть использован напрямую при деградации ксантана, без добавок иных сахаров или олигосахаридов.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><!DOCTYPE ST26SequenceListing

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN"

"ST26SequenceListing_V1_3.dtd"><ST26SequenceListing

originalFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3" fileName="16 S

ribosomal DNA cohnella sp 56.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-01-09">

<ApplicationIdentification> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022133188/20(072284)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-12-16</FilingDate> </ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Денисенко Ю.А.</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Yury A. Denisenko</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм Cohnella sp. 56 ВКМ B-3672D

для деструкции ксантана</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity> <SequenceData

sequenceIDNumber="1"> <INSDSeq>

<INSDSeq_length>1456</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1456</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Cohnella sp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcaagtcgagcggatcttgtttgggagctkgctcyygracttggttagcggc

ggacgggtgagtaacacgtaggcaacctgcccttcagacygggataacattcggaaacgartgctaagac

cggataggcagcgaggtcgcatgaccttgctgagaaacacggagcaatctgtggctggaggatgggcctg

cggcgcattagctagttggtggggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtasccgacctgagagggtga

acggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatg

ggcgcaagcctgatggagcaacgccgcgtgagtgaggaaggctttcgggtcgtaaagctctgttgccagg

gaagaataaggatgtgttaactgcacattcgatgacggtacctgagaagaaagccccggctaactacgtg

ccagcagccgcggtaatacgtagggggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcg

gtcttttaagtctggtgtctaagtgcggggctcamccccgtgatgcactggaaactgggagacttgagtg

cagaagaggagagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggmga

aggcggctctctggactgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccct

ggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaggtgttgggggggtccacccctcggtgccgaagttaacac

attaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaa

gcagtggagtatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatccctctgaccg

gtrcagagatgtacctttccttcgggacagaggagacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgt

gagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttggatttagttgccagcacttcaggtgggcact

ctagatcgactgccggtgacaaaccggaggaaggcggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacc

tgggctacacacgtactacaatggccggtacaacgggctgcgaaggagcgatccggagccaatcctacca

aagccggtctcagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagtcggaattgctagtaatcgcgga

tcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttacaac

acccgaagccggtggggtaacccgcaagggagccagccgtcgaaggtggggtagatgattggggtgaagt

cgta</INSDSeq_sequence> </INSDSeq>

</SequenceData></ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, в частности к производству ферментов, и касается нового штамма бактерий, используемого для синтеза ксантанолитических ферментов. Штамм Cohnella sp. 56 ВКМ B-3672D может использовать ксантан как единственный источник углерода при росте на твердых и жидких средах, т.е. может быть использован напрямую для деградации ксантана, без добавок иных сахаров или олигосахаридов. Изобретение позволяет расширить спектр штаммов микроорганизмов, способных к деструкции ксантановой камеди. 2 пр.

Штамм-продуцент ксантанолитических ферментов Cohnella sp. 56 ВКМ B-3672D, способный к деструкции ксантановой камеди.