ЛЕЧЕНИЕ РАКА ПРИ ПОМОЩИ НАПРАВЛЕННЫХ НА МИШЕНЬ АНТИТЕЛ IN VIVO Российский патент 2018 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61P35/00 C12N5/18 

Во всем мире рак является существенной проблемой, связанной со здоровьем, и все еще остается в числе главных причин смерти. Раковые клетки в значительной степени биологически отличаются от незлокачественных клеток того же происхождения. Эти отличия являются результатом генетических изменений, приобретенных во время развития рака, а также, в числе прочего, приводят к образованию качественно или количественно измененных молекулярных структур в раковых клетках. В частности, такого рода структурами, связанными с раком, являются генетические продукты, экспрессия которых вызывается или увеличивается во время злокачественной трансформации.

Иммунная система обладает способностью распознавать и уничтожать клетки с помощью двух отдельных механизмов: врожденного и приобретенного иммунитета. Компоненты врожденного иммунитета включают макрофаги, натуральные клетки-киллеры (NK), моноциты и гранулоциты. Эти клетки опознают характерные участки молекулы, принимающие участие в трансформации клеток, и высвобождают различные цитокины и медиаторы воспаления. Врожденный ответ не обладает способностью запоминать чужеродные антигены, эта характерная особенность присуща приобретенному иммунному ответу. Этот последний компонент иммунной системы также отличается специфичностью по отношению к чужеродным антигенам, которая обеспечивается наличием рецепторов на лимфоцитах. Антигенпрезентирующие клетки (АРС) также играют роль в адаптивном ответе - они поглощают чужеродные антигены и представляют их лимфоцитам в случае главного комплекса гистосовместимости (МНС). Клетки CD4+T несут рецепторы, распознающие антигены в случае МНС II класса, которые затем разрешают им высвобождать цитокины и дополнительно активировать CD8+ лимфоциты (цитотоксические Т лимфоциты; CTL) или B-клетки. CTL являются частью клеточно-опосредованного иммунитета и способны уничтожать клетки, презентированные в случае молекул МНС II класса, путем апоптоза или клеточного лизиса, опосредованного перфорином. Является общепризнанным, что иммунитет, опосредованный T-клетками, играет жизненно важную роль в противоопухолевом ответе. B-клетки участвуют в высвобождении иммуноглобулинов и, по существу, являются частью гуморальной иммунной системы.

При правильном нацеливании и усилении иммунные функции можно использовать в терапевтических целях для контроля и даже уничтожения злокачественных патологических изменений. Генетические и эпигенетические изменения, связанные с канцерогенезом, порождают антигены, которые распознаются иммунной системой аналогично микробным антигенам.

Антитела успешно введены в клинику для использования при лечении рака и представляют собой наиболее обещающие терапевтические средства в онкологии в течение последнего десятилетия. Основанные на антителах методы лечения рака обладают возможностью более высокой специфичности и профилем более низких побочных действий по сравнению с традиционными лекарственными средствами. Причиной является точное распознавание нормальных и неопластических клеток антителами и факт, что механизм их действия основывается на менее токсичных иммунологических противоопухолевых механизмах, таких как активация комплемента и пополнение (рекрутинг) цитотоксических иммунных клеток.

Клаудины представляют собой интегральные мембранные белки, расположенные в плотных контактах эпителия и эндотелия. Известно, что клаудины имеют четыре трансмембранных сегмента с двумя внеклеточными петлями, при этом N- и C-концы располагаются в цитоплазме. Семейство трансмембранных белков клаудинов (CLDN) играет решающую роль в сохранении эпителиальных и эндотелиальных плотных контактов и, кроме того, может играть роль в поддержании цитоскелета и сигнальной системы клетки.

Мы обнаружили, что CLDN6 экспрессируется в тканях при различных видах рака, в то время как экспрессия в нормальных тканях ограничивается плацентой. Такие виды рака включают рак яичника, в частности аденокарциному яичника и тератокарциному яичника, рак легкого, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточную карциному легких и аденокарциному, рак желудка, рак молочной железы, рак печени, рак поджелудочной железы, рак кожи, в частности базальноклеточную карциному и плоскоклеточную карциному, злокачественную меланому, рак головы и шеи, в частности злокачественную плеоморфную аденому, саркому, в частности синовиальную саркому и карциносаркому, рак желчных протоков, рак мочевого пузыря, в частности переходно-клеточную карциному и папиллярную карциному, рак почки, в частности почечно-клеточную карциному, включая светлоклеточный рак почки и папиллярный рак почки, рак толстой кишки, рак тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциному тонкой кишки и аденокарциному подвздошной кишки, тестикулярную эмбриональную карциному, плацентарную хориокарциному, рак шейки матки, рак яичка, в частности тестикулярную семиному, тестикулярную тератому и эмбриональный рак яичка, и рак матки, и их метастатические формы.

Кроме того, мы получили антитела, способные специфически связываться с CLDN6 на поверхности интактных клеток, экспрессирующих CLDN6. Не наблюдалось специфического связывания с клетками, экспрессирующими клаудины, отличные от CLDN6, в частности CLDN3, CLDN4 и CLDN9, или в отношении этих антител проводилось исследование клеток, не экспрессирующих какие-либо из этих CLDN белков.

В данной работе мы расширили исследования и продемонстрировали, что связывания антитела с CLDN6 на поверхности опухолевых клеток достаточно для обеспечения значительного ингибирования роста опухоли. Оценка in vivo роста опухолевых клеток, трансфицированных CLDN6 и нетрансфицированных ксенотрансплантатов показала специфическое ингибирование опухолевого роста CLDN6-трансфицированных клеток, опосредованное антителом, связанным с CLDN6. Кроме того, было продемонстрировано, что связывание антитела с CLDN6 достаточно при ингибировании роста in vivo опухолевых клеток, эндогенно экспрессирующих CLDN6. Это дает экспериментальное доказательство того, что связывание антитела с CLDN6 является эффективным при ингибировании роста опухоли, и, что CLDN6 представляет собой привлекательную мишень для терапевтических антител, разработанных с целью ингибирования роста опухоли путем нацеливания на CLDN6.

Кроме того, было показано, что связывание антитела с CLDN6 является эффективным при ингибировании in vivo роста клеточной линии герминогенной опухоли, положительной в отношении человеческого CLDN6, что демонстрирует возможность применения антител, связывающихся с CLDN6, в качестве селективных терапевтических средств для нацеливания и уничтожения герминогенных опухолей, таких как опухоль половых клеток яичка.

Таким образом, мы представили первое прямое доказательство того, что связывание антитела с CLDN6 на поверхности опухолевых клеток in vivo приводит к ослаблению клеточного роста, и продемонстрировали, что специфическое связывание с CLDN6 дает в результате (представляет собой) терапевтические вмешательство, ослабляющее рост опухоли. Более того, мы представляем доказательство, что связывание антитела с CLDN6 на поверхности опухолевых клеток in vivo приводит к продлению выживаемости и увеличению продолжительности жизни пациента с опухолью.

Таким образом, изобретение имеет отношение к лечению и/или предотвращению опухолевых заболеваний, связанных с клетками, экспрессирующими CLDN6, в частности рака и метастазов рака, с помощью антител, связывающихся с CLDN6. Настоящая заявка показывает, что связывания антител с CLDN6 на поверхности опухолевых клеток достаточно для ингибирования роста опухоли, повышения выживаемости и увеличения продолжительности жизни пациентов с опухолью. Более того, связывание антител с CLDN6 является эффективным при ингибировании роста CLDN6-положительных герминогенных опухолей, таких как тератокарцинома или эмбриональный рак, в частности эмбрионально-клеточная опухоль яичка.

Раскрытие изобретения

В одном аспекте изобретение имеет отношение к антителу, ингибирующему рост опухоли in vivo, при этом клетки опухоли экспрессируют клаудин 6 (CLDN6), а антитело является способным связываться с CLDN6. В одном варианте осуществления антитело ингибирует рост опухоли посредством связывания с CLDN6. В одном варианте осуществления антитело является специфическим к CLDN6. В одном варианте осуществления антитело является моноклональным, химерным, человеческим или гуманизированным антителом, или является фрагментом антитела или синтетическим антителом. Опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из рака яичника, в частности аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легкого, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточной карциномы легких и аденокарциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в частности злокачественной плеоморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, в частности переходно-клеточной карциномы и папиллярной карциномы, рака почки, в частности почечно-клеточной карциномы, включая светлоклеточный рак почки и папиллярный рак почки, рака толстой кишки, рака тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциномы тонкой кишки и аденокарциномы подвздошной кишки, тестикулярной эмбриональной карциномы, плацентарной хориокарциномы, рака шейки матки, рака яичка, в частности тестикулярной семиномы, тестикулярной тератомы и эмбрионального рака яичка, рака матки, и их метастатических форм. Опухоль может быть герминогенной опухолью, такой как тератокарцинома или эмбриональная карцинома. Герминогенная опухоль может быть эмбрионально-клеточной опухолью яичка.

В дополнительном аспекте изобретение имеет отношение к антителу, выбранному из группы, состоящей из: (i) антитела, выработанного или полученного от клона, депонированного под инвентарным номером DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A), DSM ACC3058 (GT512muMAB 21A) или DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2); (ii) антитела, представляющего собой химерную или гуманизированную форму антитела по пункту (i); (iii) антитела, обладающего специфичностью антитела по пункту (i) и (iv) антитела, содержащего антигенсвязывающий участок антитела по пункту (i). Антигенсвязывающий участок или антигенсвязывающий сайт антитела по пункту (i) может содержать вариабельный участок антитела по пункту (i).

Антитело в соответствии с любым из вышеприведенных аспектов может прикрепляться, по меньшей мере, к одной терапевтической эффекторной частице (фрагменту, молекуле), такой как радиоизотопная метка, цитотоксин или цитотоксический фермент.

В дополнительном аспекте изобретение имеет отношение к гибридоме, способной продуцировать антитело в соответствии с любым из вышеуказанных аспектов.

В дополнительном аспекте изобретение имеет отношение к гибридоме, депонированной под инвентарным номером DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A), DSM ACC3058 (GT512muMAB 27A) или DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2).

В дополнительном аспекте изобретение имеет отношение к фармацевтической композиции, содержащей антитело, соответствующее любому из вышеупомянутых аспектов. Фармацевтическая композиция может иметь форму терапевтической или профилактической противоопухолевой вакцины. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция предназначается для лечения или предотвращения опухолевого заболевания.

В дополнительном аспекте изобретение имеет отношение к способу лечения пациента, имеющего опухолевое заболевание или имеющего риск развития опухолевого заболевания, при котором клетки опухоли экспрессируют клаудин 6 (CLDN6), при этом способ включает введение антитела, способного связываться с CLDN6. В одном варианте осуществления антитело при введениии пациенту ингибирует рост опухоли у пациента посредством связывания с CLDN6. В одном варианте осуществления антитело присоединяется, по меньшей мере, к одной терапевтической эффекторной частице (фрагменту, молекуле), такой как радиоизотопная метка, цитотоксин или цитотоксический фермент. Антитело может быть специфическим к CLDN6. Антитело может быть моноклональным, химерным, человеческим или гуманизированным антителом, или фрагментом антитела или синтетическим антителом. В одном варианте осуществления способ включает введение фармацевтической композиции в соответствии с любым из вышеприведенных аспектов.

В любом из вышеприведенных аспектов опухолевое заболевание может быть выбрано из группы, состоящей из рака яичника, в частности аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легкого, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточной карциномы легких и аденокарциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в частности злокачественной плеоморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, в частности переходно-клеточной карциномы и папиллярной карциномы, рака почки, в частности почечно-клеточной карциномы, включая светлоклеточный рак почки и папиллярный рак почки, рака толстой кишки, рака тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциномы тонкой кишки и аденокарциномы подвздошной кишки, тестикулярной эмбриональной карциномы, плацентарной хориокарциномы, рака шейки матки, рака яичка, в частности тестикулярной семиномы, тестикулярной тератомы, эмбрионального рака яичка, рака матки и их метастатических форм.

В любом из вышеприведенных аспектов опухолевое заболевание может быть герминогенным опухолевым заболеванием, таким как тератокарцинома или эмбриональная карцинома. Герминогенное опухолевое заболевание может быть эмбрионально-клеточной опухолью яичка.

В любом из вышеприведенных аспектов CLDN6 может содержать аминокислотную последовательность, кодированную нуклеиновой кислотой, которая содержит нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1 списка последовательностей или вариантом указанной нуклеотидной последовательности и/или может содержать аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2 списка последовательностей или вариантом указанной нуклеотидной последовательности.

Описанное здесь антитело является способным к связыванию с CLDN6 и предпочтительно является способным к связыванию с CLDN6, связанным с поверхностью клетки, экспрессирующей CLDN6. Предпочтительно, антитело является неспособным к связыванию с CLDN3, в частности при связывании с поверхностью клетки, на которой экспрессируется CLDN3, и/или является неспособным к связыванию с CLDN4, в частности при связывании с поверхностью клетки, на которой экспрессируется CLDN4. Предпочтительно, антитело является неспособным к связыванию с CLDN9, в частности при связывании с поверхностью клетки, на которой экспрессируется CLDN9. Наиболее предпочтительно, антитело является практически неспособным к связыванию с белком CLDN, отличным от CLDN6, в частности при связывании с поверхностью клетки, на которой экспрессируется указанный белок CLDN, и является специфическим в отношении CLDN6. Предпочтительно, указанная клетка, экспрессирующая указанный белок CLDN, является интактной клеткой, в частности непермеабилизированной клеткой (клеткой с ненарушенной проницаемостью мембраны), и указанный белок CLDN, связанный с поверхностью клетки, имеет нативную, т.е. неденатурированную конформацию. Предпочтительно, антитело является способным связываться с одним или более эпитопами CLDN6 в их нативной конформации.

В отдельных предпочтительных вариантах осуществления антитело, описанное здесь, связывается с нативными эпитопами CLDN6, присутствующими на поверхности живых клеток, такими как эпитопы SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления антитело является специфическим к опухолевым клеткам, экспрессирующим CLDN6, и не связывается с опухолевыми клетками, не экспрессирующими CLDN6. Предпочтительно, антитело, описанное здесь, специфически связывается с CLDN6.

В одном варианте осуществления антитело, описанное здесь, является способным к связыванию с эпитопом, расположенным во внеклеточной части CLDN6, при этом указанная внеклеточная часть CLDN6 предпочтительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, более предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. Предпочтительно, антитело является способным к связыванию с эпитопом, расположенным в пределах аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.

В одном варианте осуществления антитело получают способом, включающим стадию иммунизации животного пептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, более предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или иммунологически эквивалентным пептидом, или нуклеиновой кислотой или клеткой-хозяином, экспресирующей указанный пептид.

В различных вариантах осуществления CLDN6, с которым способно связываться антитело, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Особенно предпочтительно, когда антитело является способным связываться с CLDN6, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и способным связываться с CLDN6, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

В предпочтительных вариантах осуществления антитело, описанное здесь, обладает одним или более видами активности: (i) способностью уничтожать клетку, экспрессирующую CLDN6; (ii) способностью ингибировать пролиферацию клетки, экспрессирующей CLDN6; (iii) способностью ингибировать колониеобразование клетки, экспрессирующей CLDN6; и (iv) способностью ингибировать метастазирование клетки, экспрессирующей CLDN6. Уничтожение клеток, ингибирование пролиферации клеток и/или ингибирование колониеобразования клеток может использоваться в терапевтических целях для ингибирования роста опухоли, что включает остановку и/или предотвращение роста опухоли, замедление роста опухоли и/или уменьшение размера существующей опухоли, и, следовательно может использоваться в терапевтических целях для лечения или предотвращения рака, метастазов рака и/или метастатического распространения раковых клеток.

Предпочтительно описанное здесь антитело содействует уничтожению клеток, вызывая лизис, опосредованный комплементзависимой цитотоксичностью (CDC), лизис, опосредованный антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичностью (ADCC), апоптоз, гомотипическую адгезию и/или фагоцитоз, предпочтительно, вызывая CDC-опосредованный лизис и/или ADCC-опосредованный лизис.

Предпочтительно ADCC-опосредованный лизис клеток происходит в присутствии эффекторных клеток, которые в отдельных вариантах осуществления выбирают из группы, состоящей из моноцитов, мононуклеарных клеток, NK-клеток и полиморфно-ядерных нейтрофилов (PMN), а фагоцитоз осуществляется макрофагами.

Активность, связанную с ингибированием или уменьшением пролиферации клеток, экспрессирующих CLDN6, предпочтительно раковых клеток, можно измерить in vitro путем определения пролиферации CLDN6-экспрессирующих клеток с помощью метода, использующего бромдезоксиуридин (5-бром-2-дезоксиуридин, BrdU). BrdU представляет собой синтетический нуклеозид, являющийся аналогом тимидина, который может включаться во вновь синтезированную ДНК воспроизводящихся путем клеточного деления клеток (во время S-фазы клеточного цикла), замещая тимидин во время репликации ДНК. Обнаружение включенного химического вещества, например, с помощью антител, специфических к BrdU, укажет на клетки, которые активно воспроизводили свою ДНК.

Активность, связанную с ингибированием или уменьшением колониеобразования клеток, экспрессирующих CLDN6, предпочтительно раковых клеток, можно измерить in vitro с помощью исследования колониеобразования. Оценка способности образования колоний представляет собой микробиологическую методику для изучения эффективности воздействия отдельных веществ на выживание и пролиферацию клеток. Эта методика часто используется в лабораториях, изучающих рак, для определения действия лекарственных препаратов или облучения на пролиферирующие опухолевые клетки. Эксперимент включает три основных этапа: (i) обработку образца клеток, в частности раковых клеток; (ii) высевание клеток в сосуд для культивирования; и (iii) этап роста клеток. Полученные колонии фиксируют, окрашивают и подсчитывают. Колониеобразование имеет большое значение для образования метастазов, если отдельные опухолевые клетки проникают в органы. Ингибирующая активность антител показывает их возможность подавлять образование метастазов. Антитела, продемонстрировавшие активность, связанную с ингибированием или уменьшением колониеобразования, при исследовании методом колониеобразования, являются в частности пригодными для лечения или предотвращения метастазов и метастатического распространения раковых клеток, в частности упомянутых в описании видов рака.

В предпочтительных вариантах осуществления описанное здесь антитело проявляет одну или более иммунных эффекторных функций в отношении клеток, несущих CLDN6 в нативной конформации, при этом одну или более иммунные эффекторные функции предпочтительно выбирают из группы, состоящей из комплементзависимой цитотоксичности (CDC), антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC), индукции апоптоза и ингибирования пролиферации, предпочтительно эффекторными функциями являются ADCC и/или CDC.

Предпочтительно ингибирование роста опухоли или иммунные эффекторные функции, проявляемые описанным здесь антителом, вызываются связыванием указанного антитела с CLDN6, предпочтительно с эпитопом, расположенным на внеклеточном участке CLDN6, причем указанный внеклеточный участок CLDN6 предпочтительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, более предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

Согласно изобретению клетка, экспрессирующая CLDN6, предпочтительно характеризуется соединением CLDN6 с клеточной поверхностью. Клетка, экспрессирующая CLDN6, или клетка, отличающаяся связыванием CLDN6 с клеточной поверхностью или несущая CLDN6 в нативной конформации, предпочтительно является опухолевой клеткой, такой как раковая клетка, предпочтительно клеткой, описанной здесь злокачественной опухоли.

Антитело, описанное здесь, может быть присоединено к одной или более терапевтическим эффекторным частицам (фрагментам молекулам), например, радиоизотопным меткам, цитотоксинам, терапевтическим ферментам, агентам, вызывающим апоптоз, и тому подобному, для того, чтобы обеспечить прицельную цитотоксичность, т.е. уничтожение опухолевых клеток.

В одном варианте осуществления описанное здесь антитело (i) связывается с клетками, экспрессирующими CLDN6, и (ii) не связывается с клетками, неэкспрессирующими CLDN6 6. Антитело, описанное здесь, предпочтительно (i) опосредует уничтожение и/или ингибирует пролиферацию клеток, экспрессирующих CLDN6, и (ii) не опосредует уничтожение и/или не ингибирует пролиферацию клеток, неэкспрессирующих CLDN6.

В одном варианте осуществления описанные здесь антитела могут характеризоваться одним или более из следующих свойств:

a) специфичностью к CLDN6;

b) родством связывания с CLDN6 около 100 нМ или менее, предпочтительно около 5-10 нМ или менее и более предпочтительно около 1-3 нМ или менее;

c) способностью уничтожать опухолевые клетки, экспрессирующие CLDN6;

d) способностью останавливать или задерживать пролиферацию опухолевых клеток, экспрессирующих CLDN6;

e) способностью повышать выживаемость субъекта, у которого имеются опухолевые клетки, экспрессирующие CLDN6.

В одном варианте осуществления описанное здесь антитело уменьшает рост опухолевых клеток и/или вызывает гибель опухолевых клеток и, таким образом, оказывает на опухоль ингибирующее или разрушающее действие.

Предпочтительное антитело, описанное здесь, является антителом, выработанным клеткой гибридомой или полученным от клетки гибридомы, находящейся на хранении в DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Германия) и имеющей одно из следующих обозначений и инвентарных номеров:

1. GT512muMAB 36A, инвентарный номер DSM ACC3059, зарегистрировано 13 апреля 2010;

2. GT512muMAB 27A, инвентарный номер DSM ACC3058, зарегистрировано 13 апреля 2010; или

3. GT512muMAB 5F2D2, инвентарный номер DSM ACC3057, зарегистрировано 13 апреля 2010.

Антитела изобретения обозначаются в описании путем отсылки к обозначению антитела и/или путем отсылки к клону, продуцирующему антитело, например, muMAB 36A.

Кроме того, предпочтительными антителами являются антитела, имеющие специфичность антител, выработанных гибридомой или полученных от описанной выше гибридомы, и в частности, антитела, содержащие антигенсвязывающий участок или антигенсвязывающий центр, в частности вариабельный участок, идентичный или высокогомологичный участку антитела, выработанного или полученного от вышеописанной гибридомы. Предусматривается, что предпочтительными антителами являются антитела, имеющие CDR участки или идентичные или высокогомологичные участкам антител, продуцированных или полученных от описанной выше гибридомы. Под "высокогомологичным" имеется в виду, что может быть сделано от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, например от 1 до 3, или 1 или 2 замены. Особенно предпочтительными являются химерные и гуманизированные формы антител, продуцированные или полученные от вышеуказанных гибридом.

Настоящее изобретение также имеет отношение к клетке, такой как клетка гибридомы, продуцирующая антитело, как описано здесь.

Предпочтительными клетками гибридомы являются те, которые находятся на хранении в DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Германия) и имеют одно из следующих обозначений и инвентарных номеров:

1. GT512muMAB 36A, инвентарный номер ACC3059, зарегистрирована 13 апреля 2010;

2. GT512muMAB 27A, инвентарный номер ACC3058, зарегистрирована 13 апреля 2010; или

3. GT512muMAB 5F2D2, инвентарный номер ACC3057, зарегистрирована 13 апреля 2010.

Настоящее изобретение также имеет отношение к нуклеиновым кислотам, содержащим гены или нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или их участки, например цепь антитела, как описано здесь. Нуклеиновые кислоты могут входить в состав вектора, например плазмиды, космиды, вируса, бактериофага или другого используемого вектора, например, принятого в генной инженерии. Кроме того, вектор может содержать гены, например маркерные гены, дающие возможность отобрать вектор в подходящей клетке-хозяине и в подходящих условиях. Кроме того, вектор может содержать контрольные элементы экспрессии, обеспечивающие надлежащую экспрессию закодированных участков в подходящих хозяевах. Такие контрольные элементы известны специалисту и могут включать промотор, сплайс-кассету и инициаторный кодон трансляции.

Предпочтительно нуклеиновая кислота изобретения функционально прикрепляется к элементам, контролирующим экспрессию, обеспечивая экспрессию в эукариотических и прокариотических клетках. Контролирующие элементы, обеспечивающие экспрессию в эукариотических и прокариотических клетках, хорошо известны специалистам в данной области техники.

Способы конструирования нуклеотидных молекул, конструирования векторов, содержащих молекулы нуклеиновой кислоты, введения векторов в соответствующие выбранные клетки-хозяева или индуцирования (вызывания) или достижения экспрессии молекул нуклеиновой кислоты хорошо известны в данной области техники.

Дополнительный аспект настоящего изобретения имеет отношение к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту или вектор, раскрытые здесь.

В одном аспекте изобретение предоставляет композиции, например, фармацевтические и диагностические композиции/наборы, содержащие антитело или комбинацию антител изобретения, описанных здесь. Фармацевтическая композиция изобретения может содержать фармацевтически приемлемый носитель и может необязательно содержать один или более адьювантов, стабилизирующих веществ и т.д. В отдельном варианте осуществления композиция включает комбинацию антител, которые связываются с разными эпитопами или которые обладают разными функциональными характеристиками, например, вызывают CDC и/или ADCC.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция настоящего изобретения является терапевтической или профилактической противоопухолевой вакциной.

В одном аспекте изобретение предоставляет терапевтические и профилактические способы лечения пациента, имеющего опухолевое заболевание или подвергающегося риску развития опухолевого заболевания. В одном аспекте изобретение предоставляет способы ингибирования роста опухоли. В одном аспекте изобретение предоставляет способы вызывания гибели опухолевой клетки. Эти аспекты могут включать введение описанных здесь антител или композиций пациенту.

Настоящее изобретение также включает одновременное или последовательное введение двух или более анти-CLDN6 антител, при этом предпочтительно, по меньшей мере, одно из указанных антител представляет собой химерное анти-CLDN6 антитело и, по меньшей мере, еще одно антитело представляет собой человеческое анти-CLDN6 антитело, антитела связываются с одними и теми же или разными эпитопами CLDN6. Предпочтительно, химерное CLDN6-антитело изобретения вводят сначала, а затем вводят человеческое анти-CLDN6 антитело, причем человеческое анти-CLDN6 антитело предпочтительно вводится в течение продолжительного периода времени, т.е. в качестве поддерживающей терапии.

Антитело или композиция, описанная здесь, может быть использована в целом ряде способов ингибирования роста опухолевых клеток, экспрессирующих CLDN6, и/или селективного уничтожения опухолевых клеток, экспрессирующих CLDN6, и следовательно ингибирования роста опухоли посредством контактирования клеток с эффективным количеством антитела или композиции, так что рост клетки ингибируется и/или клетка уничтожается. В одном варианте осуществления способ включает уничтожение опухолевых клеток, экспрессирующих CLDN6, необязательно в присутствии эффекторных клеток, например, с помощью CDC, апоптоза, ADCC, фагоцитоза или с помощью комбинации двух или более из этих механизмов.

Антитело или композиция, описанная здесь, может использоваться для лечения и/или предотвращения опухолевых заболеваний, вовлекающих клетки, экспрессирующие CLDN6, путем введения антител или композиции пациентам, страдающим от подобных заболеваний или подвергающимся риску развития таких заболеваний.

Изобретение включает профилактическое и/или терапевтическое лечение опухолевых болезней, т.е. для лечения пациента, имеющего опухолевое заболевание или подвергающегося риску развития опухолевого заболевания. В одном аспекте изобретение предоставляет способы ингибирования роста опухоли, включающие введение одного или более антител и композиций, описанных здесь.

Предпочтительно антитела и композиции, описанные здесь, вводятся таким способом, что терапевтически активная субстанция, в частности антитело, не доставляется или практически не доставляется в ткань или орган, в котором клетки экспрессируют CLDN6, в то время как ткань или орган свободны от опухоли, например в ткань плаценты или плаценту. Для этого средства и композиции, описанные здесь, вводятся местно.

В одном аспекте изобретение предоставляет описанное здесь антитело для применения в описанных здесь способах лечения. В одном варианте осуществления изобретение предоставляет описанную здесь фармацевтическую композицию для применения в описанных здесь способах лечения.

Описанные здесь способы лечения могут комбинироваться с хирургическим удалением и/или облучением и/или общепринятой химиотерапией.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут понятны из следующего подробного описания и пунктов формулы изобретения.

Подробное описание изобретения

На всем протяжении этого подробного описания и последующих пунктов формулы изобретения, если контекст не требует иного, следует понимать, что слово "содержать" и его варианты, такие как "содержит" и "содержащий", предполагает включение определенного члена, целого числа или стадии или группы членов, целых чисел или стадий, а не исключение любого другого члена, целого числа или стадии или группы членов, целых чисел или стадий, хотя в некоторых вариантах осуществления подобный другой член, целое число или стадия или группа членов, целых чисел или стадий могут исключаться, т.е. объект заключается во включении определенного члена, целого числа или стадии или группы членов, целых чисел или стадий. Термины "а" и "an" и "the" и подобные ссылки, использованные в контексте описания изобретения (особенно в контексте формулы изобретения) следует истолковывать как включающие и единственное и множественное число, если в описании не указано иначе или иное явно не продиктовано контекстом. Перечисление пределов значений в описании служит только как способ сокращения упоминания в отдельности каждого отдельного значения, попадающего в предел. Если не указано иное, каждое индивидуальное значение включается в подробное описание, как если бы оно было отдельно перечислено в описании. Все описанные здесь методы могут осуществляться в любом подходящем порядке, если в описании не указано иначе или иным образом явно не противоречит контексту. Использование всех без исключения примеров или характерных выражений (например, "такой как"), предоставленных в описании, имеет целью только лучше иллюстрировать изобретение и не ограничивает рамки изобретения, заявленные в иной форме. Формулировки подробного описания не должны быть истолкованы, как означающие какой-либо незаявленный элемент, существенный для осуществления изобретения на практике.

Клаудины представляют собой белки, являющиеся наиболее важными компонентами плотных контактов, где они создают трансклеточный барьер, контролирующий поток молекул в межклеточном пространстве между клетками эпителия. Клаудины являются трансмембранными белками, пересекающими мембрану 4 раза, при этом и N-конец и C-конец располагаются в цитоплазме. Первая внеклеточная петля состоит в среднем из 53 аминокислот и вторая петля примерно из 24 аминокислот. CLDN6 и CLDN9 являются наиболее сходными членами семейства CLDN.

Термин "CLDN" при использовании в описании означает клаудин и включает CLDN6, CLDN9, CLDN4 и CLDN3. Предпочтительно CLDN является человеческим CLDN.

Термин "CLDN6" предпочтительно имеет отношение к человеческому CLDN6 и, в частности, к белку, содержащему (i) аминокислотную последовательность, кодированную нуклеиновой кислотой, которая содержит нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1 списка последовательностей или вариант указанной нуклеотидной последовательности, и/или (ii) аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 6 списка последовательностей или вариант указанной аминокислотной последовательности. Первая внеклеточная петля CLDN6 предпочтительно содержит аминокислоты с 28 по 80, более предпочтительно аминокислоты с 28 по 76 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2, или аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6, например, аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3. Вторая внеклеточная петля CLDN6 предпочтительно содержит аминокислоты с 138 по 160, предпочтительно аминокислоты с 141 по 159, более предпочтительно аминокислоты с 145 по 157 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2, или аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6, такой как аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID NO: 5. Указанные первая и вторая внеклеточные петли предпочтительно образуют внеклеточный участок CLDN6.

Термин "CLDN9" предпочтительно имеет отношение к человеческому CLDN9 и, в частности, к белку, содержащему аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 7 списка последовательностей или вариант указанной аминокислотной последовательности. Первая внеклеточная петля CLDN9 предпочтительно содержит аминокислоты с 28 по 76 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7. Вторая внеклеточная петля CLDN9 предпочтительно содержит аминокислоты с 141 по 159 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7. Указанные первая и вторая внеклеточные петли предпочтительно образуют внеклеточный участок CLDN9.

Термин "CLDN4" предпочтительно имеет отношение к человеческому CLDN4 и, в частности, к белку, содержащему аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 8 списка последовательностей или вариант указанной аминокислотной последовательности. Первая внеклеточная петля CLDN4 предпочтительно содержит аминокислоты с 28 по 76 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8. Вторая внеклеточная петля CLDN4 предпочтительно содержит аминокислоты с 141 по 159 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8. Указанные первая и вторая внеклеточные петли предпочтительно образуют внеклеточный участок CLDN4.

Термин "CLDN3" предпочтительно имеет отношение к человеческому CLDN3 и, в частности, к белку, содержащему аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 9 списка последовательностей или вариант указанной аминокислотной последовательности. Первая внеклеточная петля CLDN3 предпочтительно содержит аминокислоты с 27 по 75 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9. Вторая внеклеточная петля CLDN4 предпочтительно содержит аминокислоты с 140 по 158 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9. Указанные первая и вторая внеклеточные петли предпочтительно образуют внеклеточный участок CLDN3.

Описанные выше последовательности CLDN включают любые варианты указанных последовательностей, в частности мутанты, сплайс-варианты, конформации, изоформы, аллельные варианты, видовые варианты и видовые гомологи, в частности присутствующие в природе. Аллельный вариант имеет отношение к изменению в нормальной последовательности гена, значение которого часто непонятно. Полное генетическое секвенирование часто определяет многочисленные аллельные варианты для данного гена. Видовой гомолог представляет собой нуклеотидную или аминокислотную последовательность с другим видовым происхождением по сравнению с происхождением данной нуклеотидной или аминокислотной последовательности. Термин "CLDN" включает (i) CLDN сплайс-варианты, (ii) CLDN-посттрансляционно модифицированные варианты, в частности включая варианты с разным гликозилированием, например статусом N-гликозилирования, (iii) CLDN конформационные варианты, (iv) варианты CLDN, связанного с раком, и CLDN, несвязанного с раком. Предпочтительно CLDN находится в нативной конформации.

Термин "часть" относится к участку. В отношении отдельной структуры, например, аминокислотной последовательности или белка, термин их "часть" может обозначать непрерывный или прерывистый участок указанной структуры. Предпочтительно часть аминокислотной последовательности содержит, по меньшей мере, 1%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, предпочтительно, по меньшей мере, 40%, предпочтительно, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 80% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 90% аминокислот указанной аминокислотной последовательности. Предпочтительно, если часть является прерывистым участком, указанный прерывистый участок состоит из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более частей структуры, причем каждая часть является непрерывным элементом структуры. Например, прерывистый участок аминокислотной последовательности может состоять из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более, предпочтительно не более чем 4, частей указанной аминокислотной последовательности, при этом каждая часть предпочтительно содержит, по меньшей мере, 5 непрерывных аминокислот, по меньшей мере, 10 непрерывных аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере, 20 непрерывных аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере, 30 непрерывных аминокислот аминокислотной последовательности.

Термины "часть" и "фрагмент" используются здесь взаимозаменяемым образом и относятся к непрерывному элементу. Например, часть структуры, такая как аминокислотная последовательность или белок относится к непрерывному элементу указанной структуры. Участок, часть или фрагмент структуры предпочтительно заключает в себе одно или более функциональных свойств указанной структуры. Например, участок, часть или фрагмент эпитопа или пептида предпочтительно является иммунологически эквивалентным (равнозначным) эпитопу или пептиду, из которого он получен.

Термин "внеклеточный участок CLDN" в контексте настоящего изобретения относится к части CLDN, обращенной к внеклеточному пространству клетки и предпочтительно являющейся доступной с наружной части указанной клетки, например, для антител, располагающихся снаружи клетки. Предпочтительно термин относится к одной или более внеклеточным петлям или их части или любой другой внеклеточной части CLDN, которая предпочтительно является специфической для указанного CLDN. Предпочтительно указанная часть содержит, по меньшей мере 5, по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, или по меньшей мере 50 аминокислот или более.

Согласно изобретению экспрессированный клеткой CLDN предпочтительно является связанным с поверхностью указанной клетки. Термин "CLDN, связанный с поверхностью клетки" означает, что CLDN связывается с и располагается на плазматической мембране указанной клетки, при этом, по меньшей мере, часть CLDN, предпочтительно внеклеточный участок, обращен к внеклеточному пространству указанной клетки и является доступным с наружной части указанной клетки, например, для антител, располагающихся снаружи клетки. Соединение может быть прямым или непрямым (опосредованным). Например, соединение может совершаться одним или более трансмембранными доменами, одним или более липидными якорями и/или путем взаимодействия с любым другим белком, липидом, сахаридом или другой структурой, находящейся на внешней стороне плазматической мембраны клетки. Например, CLDN, связанный с поверхностью клетки, может быть трансмембранным белком, т.е. интегральным мембранным белком, имеющим внеклеточный участок, или может быть белком, связанным с поверхностью клетки, посредством взаимодействия с другим белком, который является трансмембранным белком.

CLDN6 является соединенным с поверхностью клетки, если он располагается на поверхности указанной клетки и является доступным для связывания CLDN6-специфическими антителами, добавленными к клетке. Следует понимать, что в случае, когда CLDN6 экспрессируется клетками, CLDN6, соединенный с поверхностью указанных клеток, может являться только частью экспрессированного CLDN6.

Термин "клетка, несущая CLDN" предпочтительно означает, что указанная клетка несет CLDN на своей поверхности, т.е. что CLDN соединяется с поверхностью указанной клетки.

Термин "клеточная поверхность" или "поверхность клетки" используется в соответствии с его обычным значением в данной области и соответственно включает внешнюю поверхность клетки, доступную для связывания с белками и другими молекулами.

Выражение "CLDN, экспрессированный на поверхности клетки" означает, что CLDN, экспрессированный клеткой, связан с поверхностью указанной клетки.

Согласно изобретению CLDN6 является незначительно экспрессированным в клетке и является незначительно соединенным с клеточной поверхностью, если уровень экспрессии и соединения является более низким по сравнению с экспрессией и соединением в клетках плаценты или в ткани плаценты. Предпочтительно уровень экспрессии и соединения составляет меньше чем 10%, предпочтительно меньше чем 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% или 0,05% экспрессии и соединения в клетках плаценты или в ткани плаценты или даже ниже. Предпочтительно, CLDN6 является незначительно экспрессированным в клетке и является незначительно соединенным с клеточной поверхностью, если уровень экспрессии и соединения превышает уровень экспрессии и соединения в неканцерогенной, доброкачественной ткани, отличной от ткани плаценты, не более чем в 2 раза, предпочтительно 1,5 раза и предпочтительно не превышает уровень экспрессии и соединения в указанной неканцерогенной, доброкачественной ткани. Предпочтительно CLDN6 является незначительно экспрессированным в клетке и является незначительно соединенным с клеточной поверхностью, если уровень экспрессии и соединения является уровнем, ниже предела обнаружения, и/или если уровень экспрессии и соединения является слишком низким для осуществления связывания CLDN6-специфическими антителами, добавленными к клеткам.

Согласно изобретению CLDN6 экспрессируется в клетке и соединяется с клеточной поверхностью, если уровень экспрессии и соединения превышает уровень экспрессии и соединения в неканцерогенной, доброкачественной ткани иной, чем ткань плаценты, предпочтительно более чем в 2 раза, предпочтительно в 10 раз, 100 раз, 1000 раз или 10000 раз. Предпочтительно CLDN6 экспрессируется в клетке и соединяется с клеточной поверхностью, если уровень экспрессии и соединения находится выше предела обнаружения и/или если уровень экспрессии и соединения является достаточно высоким для осуществления связывания CLDN6-специфическими антителами, добавленными к клеткам. Предпочтительно CLDN6, экспрессированный в клетке, экспрессируется или выставляется на поверхности указанной клетки.

Термин "плот" относится к микродоменам мембраны, богатым сфинголипидом и холестерином, располагающимся в пространстве внешнего «листка» (слоя) плазматической мембраны клетки. Способность некоторых белков соединяться внутри таких доменов и их способность образовывать "агрегаты" или "фокальные агрегаты" может влиять на функцию белков. Например, перемещение молекул CLDN6 в такие структуры после связывания антителами настоящего изобретения, создает высокую плотность комплексов CLDN6-антиген-антитело в плазматических мембранах. Такая высокая плотность комплексов CLDN6-антиген-антитело может дать толчок эффективной активации системы комплемента во время CDC.

Термин "антитело" относится к гликопротеину, содержащему, по меньшей мере, две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, взаимно соединенные дисульфидными связями, и включает любую молекулу, содержащую антигенсвязывающий участок. Термин "антитело" включает моноклональные антитела и их фрагменты или производные, включая, без ограничения, человеческие моноклональные антитела, гуманизированные моноклональные антитела, химерные моноклональные антитела, одноцепочечные антитела, например, scFv’s и антигенсвязывающие фрагменты антител, такие как Fab и Fab¹ фрагменты, а также включает все рекомбинантные формы антител, например, антитела, экспрессированные в прокариотах, негликозилированные антитела и любые антигенсвязывающие фрагменты антител и производные, как описывается здесь. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (обозначается в описании VH) и константной области тяжелой цепи. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (обозначается в описании VL) и константной области легкой цепи. Области VH и VL можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности (сверхизменчивости), называемые гипервариабельными участками (CDR), чередующиеся с участками, являющимися более консервативными, называемыми каркасными участками (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, располагающихся от аминоконца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепи содержат домен связывания, взаимодействующий с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканью-«хозяином» или факторами, включая разные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.

Термин "гуманизированное антитело" относится к молекуле, имеющей участок связывания антигена, полученный в основном от иммуноглобулина вида животного, не являющегося человеком, при этом остальная структура иммуноглобулиновой молекулы основывается на структуре и/или последовательности человеческого иммуноглобулина. Участок связывания антигена может содержать или полные вариабельные домены, присоединенные к константным доменам, или только гипервариабельные участки (CDR), присоединенные к подходящим каркасным участкам в вариабельных доменах. Участки связывания антигена могут быть дикого типа или модифицированными одной или более аминокислотными заменами, например, модифицированными, чтобы быть больше похожим на человеческий иммуноглобулин. Некоторые формы гуманизированных антител сохраняют все CDR-последовательности (например, гуманизированное мышиное антитело, содержащее все шесть CDR от мышиного антитела). Другие формы имеют один или более CDR, измененных относительно первоначального антитела.

Термин "химерное антитело" относится к антителам, в которых одна часть каждой из аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепей является гомологичной соответствующим последовательностям в антителе, полученном от конкретного вида или принадлежащего к определенному классу, тогда как остальной сегмент цепи является гомологичным соответствующим последовательностям другого вида. Обычно вариабельный участок и легкой и тяжелой цепей копирует вариабельные участки антител, полученных от одного вида млекопитающих, тогда как константные части являются гомологичными последовательностям антител, полученных от другого вида. Одним очевидным преимуществом таких химерных форм является то, что вариабельный участок можно легко получить от известных в настоящее время источников, используя легкодоступные B-клетки или гибридомы от организмов-хозяев, не являющихся человеком, в комбинации с константными областями, полученными, например, из препаратов клеток человека. Притом, что вариабельная область имеет преимущество легкости получения, а источник не оказывает действия на специфичность, константная область, будучи человеческой, менее вероятно вызовет иммунный ответ у субъекта-человека при введении антител, чем вызвала бы константная область из источника, не являющегося человеком. Однако определение не ограничивается этим отдельным примером.

Термин "антигенсвязывающий участок" антитела (или просто "участок связывания") относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с антигеном. Показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченные термином "антигенсвязывающий участок" антитела, включают: (i) Fab фрагменты, одновалентные фрагменты, состоящие из VL, VH, CL и СН доменов; (ii) F(ab’)2 фрагменты, двухвалентные фрагменты, содержащие два Fab-фрагмента, соединенные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd фрагменты, состоящие из VH и CH доменов; (iv) Fv фрагменты, состоящие из VL и VH доменов одноцепочечных антител; (v) dAb фрагменты (Ward et al, (1989) Nature 341: 544-546), состоящие из VH домена; (vi) изолированные гипервариабельные участки (CDR); и (vii) комбинации двух или более изолированных CDR, которые необязательно могут соединяться синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена Fv фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, их можно соединить, используя рекомбинантные методы, с помощью синтетических линкеров, что дает им возможность представлять собой единую белковую цепь, в которой VL и VH области располагаются парами, чтобы образовать одновалентные молекулы (известные как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также включаются в термин "антигенсвязывающий участок" антитела. Дополнительным примером являются доменсвязывающие гибридные иммуноглобулины, содержащие (i) полипептидный домен связывания, который присоединяется к шарнирной области иммуноглобулина, (ii) константную область CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина, присоединенную к шарнирной области и (iii) константную область CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, присоединенную к константной области CH2. Связывающий домен полипептида может быть вариабельной областью тяжелой цепи или вариабельной областью легкой цепи. Доменсвязывающие иммуноглобулиновые гибридные белки дополнительно раскрываются в США 2003/0118592 и США 2003/0133939. Эти фрагменты антител получают с помощью обычных методов, известных специалистам в данной области техники, при этом фрагменты подвергаются скринингу в отношении пригодности, так же, как и интактные антитела.

Антитела, описанные здесь, используются для пассивной противоопухолевой иммунотерапии и могут быть присоединены или не присоединены к терапевтическим эффекторным частицам, например, радиоизотопным меткам, химиотерапевтическим средствам, таким как цисплатин, метотрексат, адриамицин и тому подобному, пригодному для лечения рака, цитотоксинам, терапевтическим ферментам, средствам, вызывающим апоптоз, и тому подобному для того, чтобы обеспечить целенаправленную цитотоксичность, т.е., уничтожение опухолевых клеток.

Предпочтительно антитела, описанные здесь, опосредуют уничтожение клеток, вызывая лизис, опосредованный комплементзависимой цитотоксичностью (CDC), лизис, опосредованный антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичностью (ADCC), апоптоз, гомотипическую адгезию и/или фагоцитоз, предпочтительно, вызывая CDC-опосредованный лизис и/или ADCC-опосредованный лизис. Предпочтительно, описанные здесь антитела взаимодействуют с компонентами иммунной системы, предпочтительно вследствие ADCC или CDC. Однако, антитела изобретения также могут оказывать действие просто путем связывания с опухолевыми антигенами на поверхности клетки, таким образом, препятствуя пролиферации клеток, например.

ADCC представляет собой способность эффекторных клеток (в частности лимфоцитов) убивать клетки, при этом для функционирования лимфоцитов необходимо, чтобы клетка-мишень была помечена антителом.

Предпочтительно ADCC наблюдается, когда антитела связываются с антигенами на опухолевых клетках, а Fc-домены антител связывают Fc-рецепторы (FcR) на поверхности иммунных эффекторных клеток. Было установлено несколько семейств Fc-рецепторов, при этом характерно, что специфические популяции клеток экспрессируют определенные Fc-рецепторы. ADCC можно рассматривать как механизм прямого индуцирования разрушения (различной степени) опухоли, который приводит к презентации антигена и индукции T-клеточных ответов, направленных на опухоль. Предпочтительно индукция ADCC in vivo приводит к T-клеточному ответу, направленному на опухолевые клетки, и ответу антител хозяина.

Другим способом уничтожения клеток, который может опосредоваться антителами, является CDC. Самым эффективным изотипом для активации комплемента является IgM. Также очень эффективными при направлении CDC через классический путь активации комплемента являются IgG1 и IgG3. Предпочтительно, образование комплексов антиген-антитело в этом каскаде приводит к раскрытию многочисленных мест связывания C1q в непосредственной близости на CH2-доменах участвующих молекул антител, например, молекул IgG (C1q является одним из трех субкомпонентов комплемента С1). Предпочтительно эти раскрытые места связывания C1q превращают взаимодействие C1q-IgG до этого с низким сродством в сродство с высокой авидностью, что запускает каскад событий, вовлекающих ряд других белков комплемента, и приводит к протеолитическому высвобождению хемотаксических/активирующих агентов эффекторных клеток C3a и C5a. Предпочтительно каскад комплемента оканчивается образованием мембрано-атакующего комплекса, который создает поры в клеточной мембране, что способствуют свободному прохождению воды и растворенных веществ в клетки и из клеток и может приводить к апоптозу.

Термин "антитело" включает "биспецифические молекулы", т.е. молекулы, имеющие две разные специфичности связывания. Например, молекула может связываться или взаимодействовать с (a) клеточной поверхностью антигена и (b) Fc-рецептором на поверхности эффекторной клетки. Термин "антитело" также включает "мультиспецифические молекулы" или "гетероспецифические молекулы", т.е. молекулы, имеющие более чем две различные специфичности связывания. Например, молекула может связываться или взаимодействовать с (a) клеточной поверхностью антигена, (b) Fc-рецептором на поверхности эффекторной клетки и (c), по меньшей мере, одним другим компонентом. Соответственно, изобретение включает, но не ограничивается этим, биспецифические, триспецифические, тетраспецифические и другие мультиспецифические молекулы, направленные на CLDN6 и другие мишени, такие как Fc-рецепторы на эффекторных клетках. Термин "антитело" также включает "биспецифические антитела", также включающие диабоди (диатела, diabodies). Диабоди представляют собой двухвалентные, биспецифические антитела, в которых VH и VL домены экспрессированы на одной полипептидной цепи, имеющие линкер, который является слишком коротким, чтобы позволить образовывать пары между двумя доменами на одной и той же цепи, тем самым вынуждая домены образовывать пары с комплементарными доменами другой цепи и создавая два сайта связывания антигена (см., например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).

Термин "антитело" также включает "гетероантитела", относящийся к двум или более антителам, их производным или антигенсвязывающим участкам, связанным вместе, по меньшей мере, два из которых имеют различные специфичности. Эти различные специфичности включают специфичность связывания к Fc-рецептору на эффекторной клетке и специфичность к антигену или эпитопу на клетке-мишени, например, опухолевой клетке.

"Клетка-мишень" означает любую нежелательную клетку у субъекта (например, человека или животного), на которую может быть нацелено антитело изобретения. В предпочтительных вариантах осуществления клетка-мишень является клеткой, экспрессирующей CLDN6. В большинстве случаев клетки, экспрессирующие CLDN6, включают опухолевые клетки.

При использовании в описании термин "эффекторная клетка" относится к иммунной клетке, которая вовлекается в эффекторную фазу иммунного ответа, в отличие от фазы распознавания и фазы активации иммунного ответа. Примеры иммунных клеток включают клетки миелоидного и лимфоидного происхождения, например лимфоциты (например, B-клетки и T-клетки, включая цитолитические T-клетки (цитотоксические T-лимфоциты, CTL), клетки-киллеры, натуральные клетки-киллеры, макрофаги, моноциты, эозинофилы, нейтрофилы, полиморфноядерные клетки, мастоциты и базофилы. Некоторые эффекторные клетки экспрессируют специфические Fc-рецепторы и выполняют специфические иммунные функции. В предпочтительных вариантах осуществления эффекторная клетка способна индуцировать антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC), например, нейтрофил, способный индуцировать ADCC. Например моноциты, макрофаги, экспрессирующие FcR, участвуют в специфическом уничтожении клеток-мишеней и презентировании антигенов другим компонентам иммунной системы или связываются с клетками, которые представляют антигены. В других вариантах осуществления эффекторная клетка может фагоцитировать антиген-мишень, клетку-мишень или микроорганизм. Экспрессия отдельного FcR на эффекторной клетке может регулироваться гуморальными факторами, такими как цитокины. Например, было обнаружено, что экспрессия Fc-гаммаRI повышается под воздействием интерферона гамма (IFN-γ). Эта усиленная экспрессия увеличивает цитотоксическую активность Fc-гаммаRI-несущих клеток против мишеней. Эффекторная клетка может фагоцитировать или лизировать антиген-мишень или клетку-мишень.

Антитела, описанные здесь, могут быть человеческими антителами. Термин "человеческое антитело", при использовании в описании, включает антитела, имеющие вариабельную и константную области, полученные от иммуноглобулиновых последовательностей человеческих зародышевых линий (germline). Человеческие антитела изобретения могут включать аминокислотные остатки, некодированные иммуноглобулиновыми последовательностями человеческих зародышевых линий (например, мутации, введенные с помощью случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или с помощью соматической мутации in vivo).

Антитела, описанные здесь, могут быть моноклональными антителами. Термин "моноклональное антитело" при использовании в описании относится к препарату антител с единообразным молекулярным составом. Моноклональное антитело проявляет одну специфичность связывания и сродство к отдельному эпитопу. В одном варианте осуществления моноклональные антитела вырабатываются с помощью гибридомы, которая включает B-клетку, полученную от животного, не являющегося человеком, например, мыши, соединенную с иммортализованной клеткой.

Антитела, описанные здесь, могут быть рекомбинантными антителами. Термин "рекомбинантные антитела" при использовании в описании включает все антитела, которые получаются, экспрессируются, создаются или выделяются с помощью рекомбинантных способов, например (a) антитела, выделенные из животного (например, мыши), являющегося трансгенным или трансхромосомным в отношении генов иммуноглобулинов, или гибридомы, полученной из них, (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для того, чтобы она экспрессировала антитела, например, из трансфектомы, (c) антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки рекомбинантных антител, и (d) антитела полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые затрагивают сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов с другими ДНК-последовательностями.

Термин "трансфектома" при использовании в описании включает рекомбинантные эукариотические клетки-хозяева, экспрессирующие антитело, такие как клетки CHO, клетки NS/0, клетки HEK293, клетки HEK293T, растительные клетки или клетки грибов, включая клетки дрожжей.

При использовании в описании "гетерологичное антитело" определяется с точки зрения трансгенного организма, продуцирующего такое антитело. Этот термин относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность или кодированному нуклеотидной последовательностью, соответствующей последовательности, обнаруженной в организме, не содержащем трансгенный организм, и как правило, полученному от вида иного, чем трансгенный организм.

При использовании в описании "гетерогибридное антитело" относится к антителу, имеющему легкую и тяжелую цепи от разных организмов. Например, антитело, имеющее человеческую тяжелую цепь, соединенную с мышиной легкой цепью, является гетерогибридным антителом.

Изобретение включает все антитела и производные антител, описанные здесь, которые для целей изобретения охватываются термином "антитело". Термин "производные антител" относится к любой модифицированной форме антитела, например конъюгату антитела и другого агента или антитела или фрагмента антитела.

Описанные здесь антитела предпочтительно являются изолированными. "Изолированное антитело" при использовании в описании относится к антителу, которое в основном свободно от других антител, имеющих другие антигенные специфичности (например, изолированное антитело, которое специфично связывается с CLDN6, является в основном свободным от антител, специфично связывающих антигены, отличные от CLDN6). Однако, изолированное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом человеческого CLDN6, может иметь перекрестную реактивность к другим родственным антигенам, например, от других видов (например, видовыми гомологами CLDN6). Более того, изолированное антитело может быть в основном свободно от другого клеточного материала и/или химических веществ. В одном варианте осуществления изобретения комбинация "изолированных" моноклональных антител имеет отношение к антителам, имеющим разные специфичности и объединенным в четко определенную композицию.

Согласно настоящему изобретению антитело является способным связываться с предопределенной мишенью, если оно имеет значительное сродство с указанной предопределенной мишенью и связывается с указанной предопределенной мишенью в стандартных методах исследования. "Сродство" или "сродство связывания" часто оценивается равновесной константой диссоциации (K_D). Предпочтительно термин "значительное сродство" относится к связыванию с предопределенной мишенью с константой диссоциации (K_D) 10^-5 М или ниже, 10^-6 М или ниже, 10^-7 М или ниже, 10^-8 М или ниже, 10^-9 М или ниже, 10^-10 М или ниже, 10^-11 М или ниже или 10^-12 М или ниже.

Антитело не является способным (значительно) связываться с мишенью, если оно не обладает значительным сродством к указанной мишени и не связывается значительно с указанной мишенью в стандартных методах. Предпочтительно антитело не является способным (значительно) связываться с мишенью, если его связывание с указанной мишенью не обнаруживается с помощью проточной цитометрии (с помощью FACS анализа), посредством которой определяют связывание указанного антитела с указанной мишенью, экспрессированной на поверхности интактных клеток. Предпочтительно, антитело необнаружимо связывается с указанной мишенью, если присутствует в концентрации до 2, предпочтительно 10, более предпочтительно 20, в частности 50 или 100 мкг/мл или выше. Предпочтительно антитело не имеет значительного сродства к мишени, если оно связывается с указанной мишенью с K_D, которая является, по меньшей мере, в 10 раз, 100 раз, 10³ раз, 10⁴ раз, 10⁵ раз или 10⁶ раз выше, чем K_D связывания с предопределенной мишенью, с которой способно связываться антитело. Например, если K_D связывания антитела с мишенью, с которой способно связываться антитело, составляет 10^-7 М, тогда K_D связывания с мишенью, к которой антитело не имеет значительного сродства, составляло бы, по меньшей мере, 10^-6 М, 10^-5 М, 10^-4 М, 10^-3 М, 10^-2 М или 10^-1 М.

Предпочтительно, антитело согласно настоящему изобретению способно к специфическому связыванию с заранее выбранной мишенью, в частности CLDN6.

Антитело является специфическим для предопределенной мишени, если оно способно связываться с указанной предопределенной мишенью, тогда как оно не способно связываться с другими мишенями, т.е. обладает незначительным сродством к другим мишеням и незначительно связывается с другими мишенями при стандартных методах анализа. Согласно изобретению антитело является специфическим к CLDN6, если оно способно связываться с CLDN6, но практически неспособно связываться с другими мишенями, в частности белками клаудинами, отличными от CLDN6, такими как CLDN9, CLDN4, CLDN3 и CLDN1. Предпочтительно антитело является специфическим к CLDN6, если сродство и связывание с белком клаудином, отличным от CLDN6, таким как CLDN9, CLDN4, CLDN3 и CLDN1, не превышает значительно сродство к или связывание с белками, неродственными клаудину, такими как бычий сывороточный альбумин (BSA), казеин, человеческий сывороточный альбумин (HSA) или трансмембранные белки, не являющиеся клаудинами, такие как молекулы МНС или рецептор трансферрина или любой другой специфический полипептид. Предпочтительно антитело является специфическим для предопределенной мишени, если оно связывается с указанной мишенью с K_D, являющейся, по меньшей мере, в 10 раз, 100 раз, 10³ раз, 10⁴ раз, 10⁵ раз или 10⁶ раз ниже, чем K_D связывания с мишенью, не являющейся специфической. Например, если K_D связывания антитела с мишенью, являющейся специфической, составляет 10^-7 М, тогда K_D связывания с мишенью, не являющейся специфической, должно быть, по меньшей мере, 10^-6 М, 10^-5 М, 10^-4 М, 10^-3 М, 10^-2 М или 10^-1 М.

Связывание антитела с мишенью можно определить экспериментально, используя любой подходящий метод, см., например, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Jam’s Immunology, W.H. Freeman и Company New York, N Y (1992), и описанные здесь методы. Сродство можно легко определить с помощью обычных методов, таких как равновесный диализ; с помощью прибора BIAcore 2000, используя общие методы, предложенные производителем; с помощью радиоиммунологического анализа с использованием меченого радиоактивным изотопом целевого антигена или другими методами, известными специалистам. Данные по сродству можно проанализировать, например, с помощью метода Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). Измеренное сродство отдельного взаимодействия антитело-антиген может варьировать, если измерение проводилось при разных условиях, например, концентрации соли, pH. Таким образом, измерения сродства и других параметров связывания антигена, например, K_D, IC50, предпочтительно проводятся с помощью стандартизированных растворов антитела и антигена и стандартизированного буфера.

При использовании в описании "изотип" относится к классу антител (например, IgM или IgG1), которые кодируются генами константной области тяжелой цепи. Антитела согласно изобретению включают поликлональные и моноклональные антитела и включают IgG2a (например, IgG2a, κ, λ), IgG2b (например, IgG2b, κ, λ), IgG3 (например, IgG3, κ, λ) и IgM антитела. Тем не менее, другие изотипы антител также рассматриваются изобретением, включая IgG1, IgA1, IgA2, секреторные IgA, IgD и IgE антитела.

При использовании в описании "переключение изотипа" относится к явлению, посредством которого класс или изотип антитела изменяется от одного класса Ig на один из других классов Ig.

Термин "природный" при использовании в описании применительно к объекту относится к тому обстоятельству, что объект может быть найден в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из природного источника, и которая не была намеренно модифицирована человеком в лаборатории, является природной.

Термин "перегруппированная" при использовании в описании относится к конфигурации тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулинового локуса, в котором V сегмент располагается непосредственно рядом с D-J или J сегментом в конформации, кодирующей фактически полный VH или VL домен, соответственно. Перегруппированный генный локус иммуноглобулина (антитела) может быть установлен путем сравнения с зародышевой ДНК; перегруппированный локус будет иметь, по меньшей мере, один рекомбинированный семичленный/девятичленный гомологичный элемент.

Термин "неперегруппированная" или "зародышевая конфигурация" при использовании в описании в отношении V сегмента относится к конфигурации, в которой V сегмент является нерекомбинированным для того, чтобы быть непосредственно рядом с D или J сегментом.

Согласно изобретению антитела можно получить от разных видов животных, включая, но не ограничиваясь этим, мышь, крысу, кролика, морскую свинку и человека. Антитела также включают химерные молекулы, в которых константная область, полученная от одного вида, предпочтительно человека, объединена с участком связывания антигена, полученным от другого вида. Более того, антитела включают гуманизированные молекулы, в которых антигенсвязывающие участки, полученные от вида, не являющегося человеком, объединяются с константным и каркасным участками человеческого происхождения.

Антитела можно получить с помощью ряда методов, включая обычную методику получения моноклональных антител, например, методом гибридизации стандартных соматических клеток Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Несмотря на то, что методы гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе можно использовать другие методы получения моноклональных антител, например, путем вирусной или онкогенной трансформации B-лимфоцитов, или метод фагового дисплея с использованием библиотек генов антител.

Предпочтительной животной системой для получения гибридомы, секретирующей моноклональные антитела, является мышиная система. Получение гибридомы в мыши является общепринятым методом. Протоколы иммунизации и методики выделения иммунизированных спленоцитов для слияния хорошо известны в данной области техники. Сливающиеся клетки (например, клетки миеломы мышей) и процедуры слияния также хорошо известны.

Другими предпочтительными животными системами для получения гибридом, секретирующих моноклональные антитела, являются крысы или кролики (например, система, описанная в Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), смотри также Rossi et al., Am. J. Clin. 35 Pathol. 124: 295 (2005)).

В другом предпочтительном варианте осуществления человеческие моноклональные антитела, направленные к CLDN6, можно получить с помощью трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части человеческой иммунной системы, а не мышиной системы. Эти трансгенные или трансхромосомные мыши включают мышей, известных как мыши HuMAb и мыши KM, соответственно, и вместе упоминаются в описании как "трансгенные мыши". Получение человеческих антител в таких трансгенных мышах можно осуществить, как подробно описано для CD20 в WO 2004035607.

Другой стратегией получения моноклональных антител является прямое выделение генов, кодирующих антитела, из лимфоцитов, продуцирующих антитела, например, см. Babcock et el, 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antiboies of defined strategy. Подробности разработки рекомбинантных антител смотри также в Welschof и Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 и Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.

Для получения антител к CLDN6, мышей можно иммунизировать конъюгированными с носителем пептидами, полученными из CLDN6-последовательности, препаратом, обогащенным рекомбинантно экспрессированным CLDN6-антигеном или его фрагментами и/или клетками, экспрессирующими CLDN6 или его фрагменты, как описано. Альтернативно, мышей можно иммунизировать ДНК, кодирующей человеческий полноразмерный CLDN6 или его фрагменты. В том случае, когда иммунизация с использованием очищенного или обогащенного препарата антигена CLDN6 не приводит к образованию антител, мышей также можно иммунизировать клетками, экспрессирующими CLDN6, например, клеточной линией, чтобы содействовать иммунному ответу.

Иммунный ответ можно контролировать на протяжении выполнения протокола иммунизации, отбирая образцы плазмы и сыворотки из хвостовой вены или ретроорбитально. Мыши с достаточным титром анти-CLDN6 иммуноглобулина могут использоваться для слияния. Мышей можно подвергнуть стимуляции внутрибрюшинно и внутривенно клетками, экспрессирующими CLDN6, и за 3-5 дней до забоя и удаления селезенки для того, чтобы увеличить скорость секретирования специфических антител гибридомами.

Для получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к CLDN6, из лимфатических узлов или селезенки, полученных от иммунизированных мышей, могут быть выделены клетки и слиты с подходящей иммортализованной клеточной линией, например, линией клеток миеломы мыши. Затем можно отобрать полученные гибридомы по выработке антигенспецифических антител. В таком случае с помощью метода ELISA можно отобрать отдельные лунки с гибридомами, секретирующими антитела. С помощью иммунофлуоресценции и FACS-анализа с использованием клеток, экспрессирующих CLDN6, можно установить антитела со специфичностью к CLDN6. Гибридомы, секретирующие антитела, можно вновь высеять, провести отбор и положительные по анти-CLDN6 моноклональным антителам можно субклонировать с помощью серийного разведения. Затем стабильные субклоны культивируют in vitro в среде для культуры ткани, чтобы получить и охарактеризовать антитела.

Антитела изобретения также можно получить в клетках-хозяевах, таких как, трансфектомы, используя, например, комбинацию методов рекомбинантных ДНК и методов трансфекции генов, хорошо известных в данной области техники (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Например, в одном варианте осуществления представляющие интерес гены(ген), например, гены антител, могут быть лигированы в вектор экспрессии, такой как эукариотическая экспрессирующая плазмида, например, используемая системой экспрессии гена GS, раскрытой в WO 87/04462, WO 89/01036 и EP 338841, или другие системы экспрессии, хорошо известные в данной области. Очищенная плазмида с клонированными генами антитела может быть введена в эукариотическую клетку-хозяина, такую как CHO клетки (клетки яичников китайского хомячка), NS/0 клетки, HEK293T клетки или HEK293 клетки или альтернативно другие эукариотические клетки, подобные клеткам растений, грибов или дрожжей. Используемым методом для введения этих генов могут быть методы, описанные в данной области техники, такие как электропорация, липофектин, липофектамин или другие. После введения этих генов антител в клетки-хозяева, клетки, экспрессирующие антитело могут быть опознаны и отобраны. Эти клетки представляют собой трансфектомы, которые затем можно амплифицировать и масштабировать для выработки антител. Рекомбинантные антитела могут быть изолированы и очищены из этих культуральных супернатантов и/или клеток.

Альтернативно, клонированные гены антитела могут быть экспрессированы в других системах экспрессии, включая прокариотические клетки, такие как микроорганизмы, например, Е.coli. Более того, антитела могут продуцироваться в трансгенных организмах, не являющихся человеком, и присутствовать, например, в молоке овец и кроликов или в яйцах кур, или в трансгенных растениях; см., например, Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; и Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.

Мышиные моноклональные антитела могут использоваться как терапевтические антитела для людей, в том случае, когда к ним прикрепляется токсин, или когда их метят радиоактивными изотопами. При повторном применении немеченые мышиные антитела являются высоко иммуногенными для человека, что приводит к уменьшению терапевтического эффекта. Основная иммуногенность опосредуется константными областями тяжелой цепи. Иммуногенность мышиных антител у человека можно уменьшить или полностью ее избежать, если соответствующие антитела сделать химерными или гуманизированными. Химерные антитела являются антителами, разные части которых происходят от разных видов животных, например, антитела имеют вариабельную область, полученную от мышиного антитела, и константную область человеческого иммуноглобулина. Химеризация антител достигается соединением вариабельных областей тяжелой и легкой цепей мышиных антител с человеческой константной областью тяжелой и легкой цепи (например, как описано Kraus et al., в Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). В предпочтительном варианте осуществления химерные антитела получают соединением человеческой константной области каппа-легкой цепи с мышиной вариабельной областью легкой цепи. В другом предпочтительном варианте осуществления химерные антитела получают соединением человеческой константной области лямбда-легкой цепи с вариабельной областью легкой цепи мыши. Предпочтительными константными областями тяжелой цепи для получения химерных антител являются IgG1, IgG3 и IgG4. Другими предпочтительными константными областями тяжелой цепи для получения химерных антител являются IgG2, IgA, IgD и IgM.

Антитела взаимодействуют с целевыми антигенами преимущественно через аминокислотные остатки, расположенные в шести гипервариабельных участках (CDR) тяжелой и легкой цепи. По этой причине аминокислотные последовательности в CDR являются более разными между отдельными антителами, чем последовательности вне CDR. Поскольку CDR-последовательности отвечают за большинство взаимодействий антитело-антиген, является возможной экспрессия рекомбинантных антител, подражающих свойствам специфических природных антител, путем конструирования векторов экспрессии, которые включают CDR-последовательности от специфических природных антител, пересаженные на каркасные последовательности от другого антитела с другими свойствами (см., например, Riechmann, L, et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et ai. (1986) Nature 321: 522-525; и Queen, С et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029-10033). Такие каркасные последовательности можно получить из публичных баз данных ДНК, которые включают зародышевые последовательности генов антител. Эти зародышевые последовательности будут отличаться от зрелых последовательностей генов антител, так как они не включают полностью собранные изменчивые гены, которые формируются при V (D) J соединении во время созревания B-клетки. Зародышевые генные последовательности также будут отличаться от последовательностей высокоаффинного антитела из вторичного репертуара отдельной равномерной вариабельной областью. Например, соматические мутации являются относительно редкими в аминоконцевой части каркасного участка 1 и в карбоксиконцевой части каркасного участка 4. Более того, многие соматические мутации значительно не изменяют связывающие свойства антитела. По этой причине, необходимо получить полную последовательность ДНК отдельного антитела, для того чтобы заново создать (восстановить) интактное рекомбинантное антитело, имеющее свойства, сходные со свойствами первичного антитела (см. WO 99/45962). Для этой цели, как правило, достаточно частичных последовательностей тяжелой и легкой цепи, соединяющих CDR участки. Частичная последовательность используется, чтобы определить какие зародышевые вариабельные и соединяющие генные сегменты способствуют рекомбинированию изменчивых генов антитела. Затем используется зародышевая последовательность, чтобы заполнить недостающие части вариабельных участков. Лидерные последовательности тяжелой и легкой цепи расщепляются во время созревания белка и не вносят вклад в свойства антитела. Чтобы добавить отсутствующие последовательности, клонированные кДНК-последовательности можно соединить с синтетическими олигонуклеотидами с помощью лигирования или ПЦР-амплификации. Альтернативно, полная вариабельная область может быть синтезирована как набор коротких перекрывающихся олигонуклеитидов и объединена с помощью ПЦР-амплификации, чтобы создать клон с полностью синтетической вариабельной областью. Этот процесс имеет определенные преимущества, такие как элиминация, или включение, или отдельные сайты рестрикции, или оптимизация отдельных кодонов.

Нуклеотидные последовательности транскриптов тяжелой и легкой цепи из гибридом используются для составления перекрывающего набора синтетических олигонуклеотидов, чтобы создать синтетические V-последовательности с возможностью кодирования тех же самых аминокислот, как в природной последовательности. Последовательности синтетической тяжелой и каппа-цепи могут трояко отличаться от природных последовательностей: нити повторных нуклеиновых оснований прерываются, чтобы облегчить синтез олигонуклеотидов и ПЦР амплификацию; оптимальные сайты инициации трансляции включаются согласно правилам Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. 5 Chem. 266: 19867-19870); и сайты HindIII создаются выше сайтов инициации трансляции.

Что касается вариабельных областей и тяжелой и легкой цепей, оптимизированные кодирующие и соответствующие некодирующие участки последовательностей разделяются на 30-50 нуклеотидов приблизительно в срединной точке соответствующего некодирующего олигонуклеотида. Таким образом, для каждой цепи олигонуклеотиды могут быть собраны в перекрывающиеся двунитевые наборы, которые охватывают сегменты из 150-400 нуклеотидов. Эти пулы (кластеры, группы) затем используются как матрицы для получения продуктов ПЦР-амплификации из 150-400 нуклеотидов. Как правило, одна вариабельная область олигонуклеотидного набора будет разделяться на два пула, которые отдельно амплифицируются, чтобы выработать два перекрывающихся ПЦР-продукта. Затем эти перекрывающиеся продукты затем объединяют с помощью ПЦР-амплификации, чтобы создать полную вариабельную область. Также может быть желательно включение перекрывающегося фрагмента вариабельной области тяжелой или легкой цепи в ПЦР-амплификацию для создания фрагментов, которые можно легко клонировать в конструкты векторов экспрессии.

Затем реконструированные химерную и гуманизированную вариабельные области тяжелой и легкой цепи объединяют с клонированными последовательностями промоторного участка, лидерного участка, участка инициации трансляции, константной области, 3’ нетранслируемого участка, участка полиаденилирования и участка терминации транскрипции, чтобы образовать конструкты вектора экспрессии. Конструкты экспрессии тяжелой и легкой цепи могут быть объединены в один вектор, котрансфицированы, последовательно трансфицированы или отдельно трансфицированы в клетки-хозяева, которые затем сливаются с образованием клетки-хозяина, экспрессирующей обе цепи. Описаны плазмиды, использующиеся в создании векторов экспрессии для человеческого IgGκ. Плазмиды могут быть созданы так, что ПЦР-амплифицированные кДНК-последовательности V тяжелой и V каппа легкой цепи могут использоваться для реконструирования минигенов полной тяжелой и легкой цепи. Эти плазмиды могут использоваться для экспрессии полностью человеческого или химерного IgG1, каппа или IgG4, каппа антител. Могут быть созданы подобные плазмиды для экспрессии других изотипов тяжелой цепи или для экспрессии антител, содержащих лямбда-легкие цепи.

Таким образом, в другом аспекте изобретения структурные признаки анти-CLDN6 антител изобретения используются для создания структурно-родственных гуманизированных анти-CLDN6 антител, которые сохраняют, по меньшей мере, одно функциональное свойство антител изобретения, например, связывание с CLDN6. Конкретнее, один или более CDR-участков мышиного моноклонального антитела может быть рекомбинантно объединено с известными человеческими каркасными участками и CDR для создания дополнительных рекомбинантно-сконструированных гуманизированных анти-CLDN6 антител изобретения.

Способность антитела связываться с CLDN6 можно определить с помощью стандартных методов анализа, таких как методы, представленные в примерах (например, ELISA, вестерн-блоттинг, иммунофлуоресценция и проточная цитометрия).

Термин "эпитоп" относится к антигенной детерминанте в молекуле, т.е. части в молекуле, которая распознается иммунной системой, например, которая распознается антителом. Например, эпитопы являются отдельными, трехмерными участками на антигене, которые распознаются иммунной системой. В контексте настоящего изобретения эпитоп предпочтительно происходит от белка CLDN. Обычно эпитопы состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что связывание с первым, но не со вторым, утрачивается в присутствии денатуриующих растворителей. Эпитоп белка, такого как CLDN, предпочтительно содержит непрерывную или прерывистую часть указанного белка и составляет предпочтительно от 5 до 100, предпочтительно от 5 до 50, более предпочтительно от 8 до 30, наиболее предпочтительно от 10 до 25 аминокислот в длину, например, эпитоп может иметь предпочтительно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот в длину.

Термин "прерывистый эпитоп" при использовании в описании означает конформационный эпитоп на белковом антигене, который образуется, по меньшей мере, из двух отдельных областей в первичной последовательности белка.

Согласно изобретению термин "связывание" предпочтительно имеет отношение к специфическому связыванию. "Специфическое связывание" означает, что агент, такой как антитело, сильнее связывается с мишенью, например эпитопом, для которой оно является специфическим, по сравнению со связыванием с другой мишенью. Агент связывается сильнее с первой мишенью по сравнению со второй мишенью, если он связывается с первой мишенью с константой диссоциации (K_D), меньшей, чем константа диссоциации для второй мишени. Предпочтительно константа диссоциации (K_D) для мишени, с которой агент связывается специфически, является в 10² раз, 10³ раз, 10⁴ раз, 10⁵ раз, 10⁶ раз, 10⁷ раз, 10⁸ раз, 10⁹ раз или 10¹⁰ раз более низкой, чем константа диссоциации (K_D) для мишени, с которой агент не связывается специфически.

Термин "нуклеиновая кислота" при использовании в описании включает дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Нуклеиновые кислоты согласно изобретению включают геномную ДНК, кДНК, мРНК, рекомбинантно-полученные и химически-синтезированные молекулы. Согласно изобретению нуклеиновая кислота может представлять собой одноцепочечную или двухцепочечную и линейную или ковалентно-замкнутую кругообразную молекулу.

Нуклеиновые кислоты, описанные согласно изобретению, предпочтительно являются изолированными. Термин "изолированная нуклеиновая кислота" означает согласно изобретению, что нуклеиновая кислота была (i) амплифицирована in vitro, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), (ii) получена рекомбинантно путем клонирования, (iii) очищена, например, с помощью расщепления и гель-электрофоретического фракционирования или (iv) синтезирована, например, с помощью химического синтеза. Изолированная нуклеиновая кислота является нуклеиновой кислотой, которая является доступной для манипуляций с помощью технологии рекомбинантных ДНК.

Нуклеиновые кислоты согласно изобретению присутствуют отдельно или в комбинации с другими нуклеиновыми кислотами, которые могут быть гомологичными или гетерологичными. В предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются функционально связанными с последовательностями, контролирующими экспрессию, которые могут быть гомологичными или гетерологичными в отношении указанной нуклеиновой кислоты, при этом термин "гомологичные" означает, что нуклеиновая кислота также является функционально связанной с последовательностью, контролирующей экспрессию, естественным образом, а термин "гетерологичные" означает, что нуклеиновая кислота не является функционально связанной с последовательностью, контролирующей экспрессию, в естественных условиях.

Нуклеиновая кислота, такая как нуклеиновая кислота, экспрессирующая РНК и/или белок или пептид, и последовательность, контролирующая экспрессию, являются "функционально" связанными друг с другом, если они ковалентно связаны друг с другом таким образом, что экспрессия или транскрипция указанной нуклеиновой кислоты находится под контролем или под влиянием указанной последовательности, контролирующей экспрессию. Если нуклеиновая кислота должна транслироваться в функциональный белок, тогда, при наличии последовательности, контролирующей экспрессию, связанной с кодирующей последовательностью, индукция указанной последовательности, контролирующей экспрессию, вызывает транскрипцию указанной нуклеиновой кислоты, без вызывания сдвига рамки в кодирующей последовательности или указанная кодирующая последовательность является неспособной транслироваться в желательный белок или пептид.

Термин "последовательность, контролирующая экспрессию" включает согласно изобретению промоторы, участки связывания рибосом, энхансеры и другие контрольные элементы, регулирующие транскрипцию гена или трансляцию мРНК. В отдельных вариантах осуществления изобретения последовательности, контролирующие экспрессию, могут регулироваться. Точная структура последовательности, контролирующей экспрессию, может варьировать в зависимости от вида или клеточного типа, но, как правило, содержит 5’-нетранскибируемую и 5’- и 3’-нетранслируемые последовательности, которые вовлечены в инициацию транскрипции и трансляцию, соответственно, такие как ТАТА-бокс, кэппинг-последовательность, CAAT последовательность и т.п. Конкретнее, 5’-нетранскибируемые последовательности, контролирующие экспрессию, содержат промоторную область, включающую промоторную последовательность для транскрипционного контроля функционально связанной нуклеиновой кислоты. Последовательности, контролирующие экспрессию, также могут содержать энхансерные последовательности или активирующие последовательности.

Согласно изобретению термин "промотор" или "промоторная область" имеет отношение к нуклеотидной последовательности, которая располагается выше (upstream) (5’) относительно экспрессированной нуклеотидной последовательности и контролирует экспрессию последовательности, обеспечивая распознавание и сайт связывания для РНК-полимеразы. "Промоторная область" может включать дополнительные сайт распознавания и связывания для дополнительных факторов, вовлекаемых в регуляцию транскрипции гена. Промотор может контролировать транскрипцию прокариотического или эукариотического гена. Кроме того, промотор может быть "индуцибельным" и может инициировать транскрипцию в ответ на индуцирующий агент или может быть "конститутивным", если транскрипция не контролируется индуцирующим агентом. Ген, находящийся под контролем индуцибельного промотора, не экспрессируется или экспрессируется только в небольшой степени, если отсутствует индуцирующий агент. В присутствии индуцирующего агента включается ген или увеличивается уровень транскрипции. В общем, это опосредуется связыванием специфического фактора транскрипции.

Промоторы, являющиеся предпочтительными согласно изобретению, включают промоторы для SP6, Т3 и Т7 полимеразы, человеческий U6 РНК промотор, CMV-промотор и их искусственные гибридные промоторы (например, CMV), где часть или части соединяются с частью или частями промоторов генов других клеточных белков, например, таких как человеческий GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа), и включая или не включая дополнительный интрон(ы).

Согласно изобретению термин "экспрессия" используется в его наиболее общем значении и включает выработку РНК или РНК и белка/пептида. Он также включает частичную экспрессию нуклеиновых кислот. Более того, экспрессия может осуществляться временно или стабильно. Согласно изобретению термин экспрессия также включает "измененную экспрессию" или "аномальную экспрессию".

"Измененная экспрессия" или "аномальная экспрессия" означает согласно изобретению, что экспрессия является измененной, предпочтительно повышенной, по сравнению с эталонной, предпочтительно по сравнению с состоянием в неонкогенной нормальной клетке или у здорового индивидуума. Увеличение экспрессии относится к увеличению, по меньшей мере, на 10%, в частности, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 50% или, по меньшей мере, на 100%. В одном варианте осуществления экспрессия обнаруживается только в затронутой болезнью ткани, в то время как экспрессия в здоровой ткани подавляется.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеотидная молекула согласно изобретению присутствует в векторе, в соответствующих случаях с промотором, который контролирует экспрессию нуклеиновой кислоты. Термин "вектор" используется здесь в его самом общем значении и включает любой промежуточный переносчик нуклеиновой кислоты, который дает возможность указанной нуклеиновой кислоте, например, быть внесенной в прокариотические и/или эукариотические клетки и, при необходимости, интегрироваться в геном. Векторы этого сорта предпочтительно являются реплицируемыми и/или экспрессируются в клетках. Векторы включают плазмиды, фагмиды, бактериофаги или вирусные геномы. Термин "плазмида" при использовании в описании, в общем, имеет отношение к конструкту экстрахромосомного генетического материала, обычно дуплекса кольцевой ДНК, который может реплицироваться независимо от хромосомной ДНК.

В качестве вектора для экспрессии антитела может использоваться или тип вектора, в котором тяжелая цепь антитела и легкая цепь присутствуют в разных векторах, или тип вектора, в котором тяжелая цепь и легкая цепь присутствуют в одном и том же векторе.

Предложенную в описании идею в отношении нуклеотидной и аминокислотной последовательностей, например, указанных в списке последовательностей, следует также относить к модификациям (т.е. вариантам) указанных специфических последовательностей, дающим в результате последовательности, которые являются функционально эквивалентными указанным специфическим последовательностям, например, аминокислотные последовательности, проявляющие свойства, идентичные или подобные свойствам специфических аминокислотных последовательностей, и нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, проявляющие свойства, идентичные или подобные свойствам аминокислотных последовательностей, кодированных специфическими нуклеотидными последовательностями.

Подобным образом, приведенную здесь идею в отношении специфических антител или гибридом, продуцирующих специфические антитела, следует понимать как относящуюся также к антителу, характеризующемуся аминокислотной последовательностью и/или нуклеотидной последовательностью, которая является модифицированной по сравнению с аминокислотной последовательностью и/или нуклеотидной последовательностью специфических антител, но является функционально эквивалентной. Одним важным свойством является сохранение связывания антитела с его мишенью или осуществления эффекторных функций антитела. Предпочтительно последовательность, модифицированная относительно специфической последовательности, когда она заменяет специфическую последовательность в антителе, сохраняет связывание указанного антитела с мишенью и предпочтительно функции указанного антитела, как описано здесь, например, CDC-опосредованный лизис или ADCC-опосредованный лизис.

В частности, специалистам ясно, что последовательности CDR, гипервариабельные и вариабельные области могут быть модифицированы без потери способности связываться с мишенью. Например, CDR-участки будут или идентичными или высокогомологичными областям антител, перечисленных здесь. Под "высокогомологичной" подразумевается, что в CDR может быть сделано от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, например от 1 до 3 или 1 или 2 замены. В дополнение к этому гипервариабельные и вариабельные участки могут быть модифицированы таким образом, чтобы они показывали значительную гомологию с участками антител, специально раскрытых здесь.

Следует понимать, что описанные здесь специфические нуклеиновые кислоты также включают нуклеиновые кислоты, модифицированные ради оптимизации частоты использования кодона в отдельной клетке-хозяине или организме. Различия в частоте использования кодона между организмами могут приводить к ряду проблем, касающихся гетерологичной генной экспрессии. Оптимизация кодона изменением одного или более нуклеотидов первоначальной последовательности может дать в результате оптимизацию экспрессии нуклеиновой кислоты, в частности оптимизацию эффективности трансляции в гомологичном или гетерологичном хозяине, в котором должна экспрессироваться указанная нуклеиновая кислота. Например, если надлежит использовать нуклеиновые кислоты, полученные от человека и кодирующие константные области и/или каркасные участки антител согласно настоящему изобретению, например, для получения химерных или гуманизированных антител, может быть предпочтительно модифицировать указанные нуклеиновые кислоты ради оптимизации частоты использования кодона, в частности, если указанные нуклеиновые кислоты, необязательно соединенные с гетерологичными нуклеиновыми кислотами, такими как нуклеиновые кислоты, полученные из других организмов, как описано здесь, должны экспрессироваться в клетках организма, отличного от человека, такого как мышь или хомяк. Например, нуклеотидные последовательности, кодирующие константные области легкой и тяжелой цепей человека, могут быть модифицированы так, чтобы включать одну или более, предпочтительно, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 и предпочтительно до 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 или 100 или более замен нуклеотидов, приводящих к оптимальной частоте использования кодона. Такие замены нуклеотидов предпочтительно имеют отношение к заменам нуклеотидов, не приводящим к изменению кодированной аминокислотной последовательности, или имеют отношение к соответствующим заменам в соответствующих положениях в других нуклеотидных последовательностях, кодирующих константные области легкой и тяжелой цепей человека, соответственно.

Предпочтительно степень идентичности между специфической нуклеотидной последовательностью и нуклеотидной последовательностью, которая является модифицированной по отношению к или которая является вариантом указанной специфической нуклеотидной последовательности, составляет, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере, 75%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90% или наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. В отношении CLDN6-нуклеотидных вариантов, степень идентичности предпочтительно составляет, по меньшей мере, около 300, по меньшей мере, около 400, по меньшей мере, около 450, по меньшей мере, около 500, по меньшей мере, около 550, по меньшей мере, около 600 или, по меньшей мере, около 630 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления степень идентичности дается для полной длины эталонной нуклеотидной последовательности, например, нуклеотидных последовательностей, приведенных в перечне последовательностей. Предпочтительно две последовательности являются способными гибридизоваться и образовывать стабильный дуплекс друг с другом, когда гибридизацию предпочтительно проводят при условиях, которые обеспечивают специфическую гибридизацию между полинуклеотидами (строгие условия). Строгие условия описываются, например, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 или Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York и касаются, например, гибридизации при 65°C в буфере для гибридизации (3,5×SSC, 0,02% фиколла, 0,02% поливинилпирролидона, 0,02% бычьего сывороточного альбумина, 2,5 мМ NaH₂PO₄ (pH 7), 0,5% SDS, 2 мМ EDTA). SSC представляет собой 0,15М хлорид натрия/0,15М цитрат натрия, pH 7. После гибридизации мембрану, на которую была перенесена ДНК, промывают, например, в 2×SSC при комнатной температуре, а затем в 0,1-0,5×SSC/0,1×SDS при температурах до 68°C.

Термин "вариант" согласно изобретению также включает мутанты, сплайс-варианты, конформации, изоформы, аллельные варианты, видовые варианты и видовые гомологи, в частности те, которые присутствуют от природы. Аллельный вариант имеет отношение к изменению в нормальной последовательности гена, значение которой часто является неясным. Полное генетическое секвенирование часто устанавливает многочисленные аллельные варианты для данного гена. Видовой гомолог является нуклеиновой кислотой или аминокислотной последовательностью происходящей от других видов, чем данная нуклеотидная или аминокислотная последовательность.

В отношении молекул нуклеиновой кислоты термин "вариант" включает вырожденные последовательности нуклеиновой кислоты, при этом вырожденная нуклеиновая кислота согласно изобретению является нуклеиновой кислотой, которая отличается от исходной нуклеиновой кислоты последовательностью кодона вследствие вырожденности генетического кода.

Кроме того, "вариант" специфической последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению включает последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие одну или несколько, например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 6 и предпочтительно до 3, до 4, до 5, до 6, до 10, до 15 или до 20 замен, делений и/или добавлений нуклеотидов.

Для целей настоящего изобретения "варианты" аминокислотной последовательности включают варианты аминокислотных вставок, варианты аминокислотных добавок, варианты аминокислотных делеций и/или варианты аминокислотных замен.

В случае вариантов аминокислотной последовательности, имеющих вставку, один или более остатков аминокислоты вставляются в определенное место аминокислотной последовательности, хотя также возможна случайная вставка с использованием соответствующего скрининга полученного продукта.

Варианты аминокислотных делеций характеризуются удалением одной или более аминокислот из последовательности.

Варианты аминокислотных замен характеризуются, по меньшей мере, удалением одного остатка в последовательности и вставкой другого остатка на его место. Предпочтение отдается модификациям, находящимся в положениях аминокислотной последовательности, которые не являются консервативными между гомологичными белками или пептидами, и/или заменам аминокислот на другие аминокислоты, имеющие сходные свойства.

Предпочтительно аминокислотные изменения в белковых вариантах являются консервативными аминокислотными изменениями, т.е. заменами так же заряженных или незаряженных аминокислот.

Предпочтительно степень сходства, предпочтительно идентичности между специфической аминокислотной последовательностью и аминокислотной последовательностью, которая является модифицированной по отношении к или которая является вариантом указанной специфической аминокислотной последовательности, например, между аминокислотными последовательностями, показывающими существенную гомологию, будет составлять, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере, 80%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90% или наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. В отношении полипептидных вариантов CLDN6, степень сходства или идентичность предоставляется предпочтительно для участка, по меньшей мере, примерно из 100, по меньшей мере, около 120, по меньшей мере, около 140, по меньшей мере, около 160, по меньшей мере, около 180, по меньшей мере, около 200 или, по меньшей мере, примерно из 210 аминокислот. В предпочтительных вариантах осуществления степень сходства или идентичность предоставляется для полной длины эталонной аминокислотной последовательности, например, аминокислотных последовательностей, приведенных в списке последовательностей.

"Сходство последовательности" указывает процент аминокислот, которые или являются идентичными или которые представляют консервативные аминокислотные замены. "Идентичность последовательности" между двумя полипептидными или нуклеотидными последовательностями указывает процент аминокислот или нуклеотидов, являющихся идентичными между последовательностями.

Термин "процент идентичности" обозначает процент нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются идентичными между двумя последовательностями, которые сравниваются; полученный после выполнения лучшего выравнивания, этот процент является чисто статистическим, а различия между двумя последовательностями распределяются случайно и на протяжении их полной длины. Сравнение последовательности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями обычно осуществляется путем сравнения этих последовательностей после их оптимального выравнивания, указанное сравнение проводится посредством сегмента или "окна сравнения" для того, чтобы установить и сравнить локальные области сходства последовательности. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, кроме способа вручную, посредством алгоритма локальной гомологии Smith и Waterman, 1981, Ads Арр. Math. 2, 482, посредством алгоритма локальной гомологии Neddleman и Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, посредством метода поиска сходства Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, или посредством компьютерных программ с применением этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST Р, BLAST N и TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

Процент идентичности вычисляется путем определения числа идентичных положений между двумя последовательностями при сравнении, делением этого числа на число сравниваемых положений и умножением полученного результата на 100 для получения процента идентичности между этими двумя последовательностями.

"Консервативные замены" могут быть сделаны, например, на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или алифатической природы вовлеченных остатков. Например, (a) неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; (b) полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; (c) положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и (d) отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Как правило, замены могут быть сделаны в группах (a)-(d). Кроме того, глицин и пролин могут быть замещены друг другом, исходя из их способности разрывать α-спирали. Некоторые предпочтительные замены могут быть сделаны среди следующих групп: (i) S и Т; (ii) Р и G; и (iii) А, V, L и I. Если имеется известный генетический код, с помощью технологии рекомбинантных и синтетических ДНК квалифицированный ученый легко может создать ДНК, кодирующие консервативные аминокислотные варианты.

Изобретение включает производные нуклеотидных последовательностей, аминокислотных последовательностей, пептидов или белков, в частности антитела, описанные здесь.

Термин "производное" включает какое-либо химическое получение производных (дериватизацию) нуклеиновой кислоты за счет нуклеотидного основания, сахара или фосфата. Термин "производное" также включает нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, не встречающиеся в природе. Предпочтительно, дериватизация нуклеиновой кислоты повышает ее устойчивость.

Согласно изобретению "производные" белков и пептидов являются модифицированными формами белков и пептидов. Такие модификации включают любые химические модификации и единичные или множественные замены, делеций и/или добавления любых молекул, связанных с белком или пептидом, таких как углеводы, липиды и/или белки или пептиды. Термин "производное" также распространяется на все функциональные химические эквиваленты указанных белков и пептидов. Предпочтительно, модифицированный пептид обладает повышенной устойчивостью и/или повышенной иммуногенностью.

Согласно изобретению вариант, производное, модифицированная форма, фрагмент, часть или участок нуклеотидной последовательности, аминокислотная последовательность, пептид или белок предпочтительно обладают функциональным свойством нуклеотидной последовательности, аминокислотной последовательности, пептида или белка, соответственно, из которого он был получен. Такие функциональные свойства включают взаимодействие с пептидами или белками, такими как антитела или мишени антител, в частности CLDN6, селективное связывание нуклеиновых кислот и ферментативную активность. В одном варианте осуществления вариант, производное, модифицированная форма, фрагмент, часть или участок нуклеотидной последовательности, аминокислотная последовательность, пептид или белок являются иммунологически эквивалентными нуклеотидной последовательности, аминокислотной последовательности, пептиду или белку, соответственно, из которого он был получен. В одном варианте осуществления функциональное свойство представляет собой иммунологическое свойство.

Согласно изобретению клетка предпочтительно является интактной клеткой, т.е. клеткой с интактной мембраной, не высвобождающей свои нормальные внутриклеточные компоненты, такие как ферменты, органеллы, или генетический материал. Интактная клетка предпочтительно является жизнеспособной клеткой, т.е. живой клеткой, способной выполнять свои обычные метаболические функции. Предпочтительно, клетка является человеческой клеткой.

"Клетка" может быть "клеткой-хозяином", что при использовании в описании подразумевает клетку, в которую может быть введена рекомбинантная нуклеиновая кислота.

Термин "трансгенное животное" относится к животному, имеющему геном, содержащий один или более трансгенов, предпочтительно трансгенов тяжелой и/или легкой цепи, или трансхромосом (или интегрированных или неинтегрированных в природную геномную ДНК животного), предпочтительно способных экспрессировать трансгены. Например, трансгенная мышь может иметь трансген человеческой легкой цепи, и или трансген человеческой тяжелой цепи, или трансхромосому человеческой тяжелой цепи, так что мышь продуцирует человеческие анти-CLDN6 антитела, когда она иммунизирована CLDN6-антигеном и/или клетками, экспрессирующими CLDN6. Трансген человеческой тяжелой цепи может быть интегрирован в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенной мыши, например, HuMAb мыши, например HCo7 или HCo12 мыши, или трансген человеческой тяжелой цепи может быть сохранен экстрахромосомно, как в случае трансхромосомных (например, KM) мышей, как описано в WO 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши могут быть способны продуцировать множество изотипов человеческих моноклональных антител к CLDN6 (например, IgG, IgA и/или IgE) при проведении V-D-J рекомбинации и переключения изотипа.

Согласно изобретению термин "терапевтический эффекторный фрагмент" означает любую молекулу, которая может оказывать терапевтическое действие. Согласно изобретению терапевтическая эффекторная молекула предпочтительно селективно направляется к клетке (нацеливается на клетку), экспрессирующую CLDN6, и включает противоопухолевые препараты, радиоизотопы, токсины, цитостатические или цитолитические лекарственные средства и т.д. Противоопухолевые препараты включают, например, аминоглутетимид, азатиоприн, блеомицина сульфат, бусульфан, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, циклоспорин, цитарабидин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубин, доксорубицин, таксол, этопозид, фторурацил, интерферон-α, ломустин, меркаптопурин, метотрексат, митотан, прокарбазин HCl, тиогуанин, винбластин сульфат и винкристин сульфат. Другие противоопухолевые препараты описаны, например, в Goodman and Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8th Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc., в частности в Главе 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner). Токсины могут быть белками, такими как антивирусный белок фитолакки, холерный токсин, коклюшный токсин, рицин, гелонин, абрин, дифтерийный экзотоксин или экзотоксин синегнойной палочки (Pseudomonas). Токсичными радикалами также могут быть испускающие высокую энергию радионуклиды, такие как кобальт-60.

"Уменьшить" или "ингибировать" при использовании в описании означает способность вызывать полное уменьшение, предпочтительно на 5% или больше, 10% или больше, 20% или больше, более предпочтительно 50% или больше и наиболее предпочтительно на 75% или больше в уровне, например, в уровне пролиферации клеток. Термин "ингибировать" или подобные фразы включают полное или практически полное ингибирование, т.е. уменьшение до нуля или практически до нуля.

Такие термины, как "увеличение" или "усиление", предпочтительно относятся к увеличению или усилению, по меньшей мере, примерно на 10%, предпочтительно, по меньшей мере, на 20%, предпочтительно, по меньшей мере, на 30%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 40%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 50%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, на 80% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 100%.

Термин "иммунологически эквивалентный" означает, что иммунологически эквивалентная молекула, например, иммунологически эквивалентная аминокислотная последовательность, проявляет одинаковые или в основном одинаковые иммунологические свойства и/или оказывает одинаковые или в основном одинаковые иммунологические действия, например, в отношении типа иммунологического действия, такого как вызывание гуморального и/или клеточного иммунного ответа, силы и/или продолжительности вызванной иммунной реакции или специфичности иммунной реакции. В контексте настоящего изобретения термин "иммунологически эквивалентный" предпочтительно используется в отношении иммунологических действий или свойств пептида или пептидного варианта, использованного для иммунизации. Конкретным иммунологическим свойством является способность связываться с антителами и, если потребуется, вызывать иммунный ответ, предпочтительно путем стимулирования выработки антител. Например, аминокислотная последовательность является иммунологически эквивалентной эталонной аминокислотной последовательности, если указанная аминокислотная последовательность при встрече с иммунной системой субъекта вызывает иммунную реакцию, предпочтительно выработку антител, обладающих специфичностью вступления в реакцию с эталонной аминокислотной последовательностью, такой как эталонная аминокислотная последовательность, образующая часть CLDN6.

Термин "иммунные эффекторные функции" в контексте настоящего изобретения включает любые функции, опосредованные компонентами иммунной системы, приводящие к ингибированию роста опухоли и/или ингибированию развития опухоли, включая ингибирование распространения опухоли и метастазирования. Предпочтительно иммунные эффекторные функции приводят к уничтожению опухолевых клеток. Предпочтительно иммунные эффекторные функции в контексте настоящего изобретения являются антителоопосредованными эффекторными функциями. Такие функции включают комплементзависимую цитотоксичность (CDC), антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC), индукцию апоптоза в клетках, несущих ассоциированный с опухолью антиген, например, путем соединения антитела с поверхностью антигена, и/или ингибирование пролиферации клеток, несущих ассоциированный с опухолью антиген, предпочтительно ADCC и/или CDC. Таким образом, антитела, способные опосредовать один или более иммунных эффекторных функций предпочтительно являются способными опосредовать уничтожение клеток, вызывая CDC-опосредованный лизис, ADCC-опосредованный лизис, апоптоз, гомотопическую адгезию и/или фагоцитоз, предпочтительно вызывая CDC-опосредованный лизис и/или ADCC-опосредованный лизис. Кроме того, антитела могут оказывать действие просто путем связывания с опухоль-ассоциированными антигенами на поверхности опухолевой клетки. Например, антитела могут блокировать функцию антигена, ассоциированного с опухолью, или вызывать апоптоз только путем связывания с опухоль-ассоциированным антигеном на поверхности опухолевой клетки.

Антитела, композиции и способы, описанные здесь, могут использоваться для лечения субъекта с опухолевым заболеванием, например, заболеванием, характеризующимся наличием опухолевых клеток, экспрессирующих CLDN6. Примеры опухолей, которые можно лечить и/или предотвратить, включают все раковые заболевания и опухоли, при которых экспрессируется CLDN6, включая описанные здесь.

Антитела, композиции и способы, описанные здесь, также могут использоваться для иммунизации или вакцинации с целью предотвращения болезни, описанной здесь.

Согласно изобретению термин "болезнь" относится к любому патологическому состоянию, включая рак, в частности, описанные здесь формы рака.

"Болезни, затрагивающие клетки, экспрессирующие CLDN6" означает согласно изобретению, что экспрессия CLDN6 в клетках пораженной ткани или органа предпочтительно является увеличенной по сравнению с состоянием в здоровой ткани или органе. Увеличение относится к увеличению, по меньшей мере, на 10%, в частности по меньшей мере, 20%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 200%, по меньшей мере 500%, по меньшей мере 1000%, по меньшей мере на 10000% или даже более. В одном варианте осуществления экспрессия обнаруживается только в пораженной ткани, тогда как экспрессия в здоровой ткани подавляется. Согласно изобретению болезни, связанные с клетками, экспрессирующими CLDN6, включают опухолевые заболевания, такие как раковые заболевания. Более того, согласно изобретению опухолевые заболевания, такие как раковые заболевания, предпочтительно являются теми болезнями, при которых опухолевые клетки или раковые клетки экспрессируют CLDN6.

Согласно изобретению термин "опухоль" или "опухолевое заболевание" относится к увеличению в объеме или патологическому изменению, образованному вследствие аномального роста клеток (называемых неопластическими клетками или опухолевыми клетками). Под "опухолевой клеткой" подразумевается ненормальная клетка, которая размножается путем быстрой неконтролируемой клеточной пролиферации и продолжает расти после поступления сигнала, вызывающего остановку нового роста. У опухолей наблюдается частичное или полное отсутствие структурной организации и функциональной согласованности с нормальной тканью и в большинстве случаев образуется отдельная масса ткани, которая может являться доброкачественной, предзлокачественной или злокачественной.

Доброкачественная опухоль - это опухоль, не имеющая всех трех признаков злокачественной опухоли. Таким образом, по определению, доброкачественная опухоль не растет неограниченным, агрессивным образом, не вторгается в окружающие ткани и не распространяется на несмежные ткани (не метастазирует). Обычные примеры доброкачественных опухолей включают родинки и маточные фиброиды.

Термин "доброкачественное" предполагает умеренное и непрогрессирующее заболевание, и в самом деле многие виды доброкачественных опухолей являются безопасными для здоровья. Однако, некоторые новообразования, которые определяются как "доброкачественные опухоли" вследствие отсутствия инвазивных свойств рака, тем не менее, могут оказывать негативное воздействие на здоровье. Примеры включают опухоли, которые оказывают "масс-эффект" (сдавливание жизненно важных органов, таких как кровеносные сосуды), или "функциональные" опухоли эндокринных тканей, которые при этом могут сверхпродуцировать (перевырабатывать) некоторые гормоны (примеры включают аденому щитовидной железы, адренокортикальную аденому и аденому гипофиза).

Как правило, доброкачественные опухоли окружены наружной поверхностью, которая препятствует их озлокачествлению. В некоторых случаях определенные "доброкачественные" опухоли могут впоследствии дать начало злокачественным опухолям, что является результатом дополнительных генетических изменений в субпопуляции неопластических клеток опухоли. Известным примером этого феномена является тубулярная аденома, обычный тип полипа кишечника, который является основным предшественником рака толстого кишечника. Клетки тубулярной аденомы, подобно большей части опухолей, которые развиваются в рак, показывают определенные нарушения созревания клеток и в совокупности появление признака, известного под названием дисплазия. Эти клеточные аномалии не встречаются в доброкачественных опухолях, которые редко или никогда не превращаются в раковые, но наблюдаются при других предраковых патологических изменениях ткани (без образования дискретных масс), таких как предраковые патологические изменения шейки матки. Некоторые специалисты предпочитают относиться к диспластическим опухолям как к "пред-злокачественным", а термин "доброкачественные" оставляют для опухолей, которые редко или никогда не дают начало раку.

Новообразование - это ненормальная масса ткани, являющаяся результатом неоплазии. Неоплазия (новообразование по-гречески) - ненормальная пролиферация клеток. При этом рост клеток превышает пределы нормального роста и является несогласованным с ростом окружающих нормальных тканей. Избыточный рост продолжается даже после прекращения поступления сигнала (стимула роста). Это обычно приводит к образованию узла или опухоли. Новообразования могут быть доброкачественными, предзлокачественными или злокачественными.

"Рост опухоли" или "опухолевый рост" согласно изобретению имеет отношение к стремлению опухоли увеличить свой размер и/или к стремлению опухолевых клеток к пролиферации.

Предпочтительно "опухолевое заболевание" согласно изобретению является раковым заболеванием, т.е. злокачественным заболеванием, а опухолевая клетка является раковой клеткой. Предпочтительно "опухолевое заболевание" характеризуется наличием клеток, экспрессирующих CLDN6, а опухолевая клетка экспрессирует CLDN6.

Рак (медицинский термин - злокачественное новообразование) представляет собой класс болезней, в котором группа клеток проявляет неконтролируемый рост (превышение нормальных границ), инвазию (вторжение в окружающие ткани и их разрушение) и иногда метастазирование (распространение к другим местоположениям в организме через лимфу или кровь). Эти три злокачественных свойства раков отличают их от доброкачественных опухолей, которые являются самоограничивающими, не вторгаются в соседние ткани и не метастазируют. При большей части раков образуется опухоль, но при некоторых не образуется, например, при лейкозе.

Клетка, экспрессирующая CLDN6, предпочтительно является опухолевой клеткой или раковой клеткой, предпочтительно клеткой опухолей и видов рака, описанных здесь. Предпочтительно такая клетка является иной, чем клетка плаценты.

Раки классифицируют по типу клеток, которые внешне имеют сходство с опухолевыми и, следовательно, по типу ткани, которая предположительно дает начало (является источником) опухоли. Это - гистологи и локализация, соответственно.

Термин "рак" согласно изобретению включает лейкоз, семиному, меланому, тератому, лимфому, нейробластому, глиому, рак прямой кишки, рак эндометрия, рак почки, рак надпочечника, рак щитовидной железы, рак кожи, рак головного мозга, рак шейки матки, рак желудочно-кишечного тракта, рак печени, рак толстой кишки, рак желудка, рак кишечника, рак головы и шеи, рак лимфатического узла, рак пищевода, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак уха, носа и горла (отоларингологический (ENT) рак), рак молочной железы, рак простаты, рак матки, рак яичника, рак легкого и их метастазы. Примерами являются карцинома легкого, карцинома молочной железы, карцинома простаты, карцинома толстого кишечника, почечно-клеточная карцинома, карцинома шейки матки или метастазы типов рака или опухолей, описанных выше. Термин рак согласно изобретению также включает метастазы рака.

Предпочтительно раковые болезни или виды рака согласно изобретению выбирают из группы, состоящей из карциномы яичника, в частности аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легких, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточный рак легкого и аденокарциному, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базально-клеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в частности злокачественной плеоморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчного протока, рака мочевого пузыря, в частности переходно-клеточной карциномы и папиллярного рака, рака почки, в частности почечноклеточного рака, включая светлоклеточный рак почки и папиллярную карциному почки, рака толстой кишки, рака тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциномы тонкой кишки и аденокарциномы подвздошной кишки, эмбриональной карциномы яичка, плацентарной хориокарциномы, рака шейки матки, рака яичка, в частности семиномы яичка, тератомы яичка и эмбрионального рака яичка, рака матки и их метастатических форм.

Особенно предпочтительные опухолевые заболевания или формы рака согласно изобретению выбирают из группы, состоящей из рака яичника, рака легкого, метастатического рака яичника и метастатического рака легкого. Предпочтительно, рак яичника является карциномой яичника или аденокарциномой яичника. Предпочтительно, рак легкого является карциномой или аденокарциномой и предпочтительно является бронхиолярным раком, таким как бронхиолярная карцинома или бронхиолярная аденокарцинома. В одном варианте осуществления опухолевая клетка является клеткой такого вида рака. Метастатические формы рака яичника включают метастатическую карциному яичника и метастатическую аденокарциному яичника, а метастатические формы рака легкого включают метастатическую карциному легкого, метастатическую аденокарциному легкого, метастатическую бронхиолярную карциному и метастатическую бронхиолярную аденокарциному.

Основными видами рака легкого являются мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC). Существует три основных подтипа немелкоклеточного рака легкого: плоскоклеточный рак легкого, аденокарцинома и крупноклеточный рак легкого. Аденокарциномы составляют приблизительно 10% раков легкого. Обычно этот вид рака наблюдается на периферии легких, в противоположность мелкоклеточному раку легкого и плоскоклеточному раку легкого, которые имеют тенденцию располагаться более центрально.

Рак кожи является злокачественным образованием на коже. Самыми распространенными видами рака кожи являются базальноклеточный рак, плоскоклеточная карцинома и меланома. Вызывающим опасения типом рака кожи является злокачественная меланома. Она связана с неконтролируемым ростом пигментных клеток-меланоцитов.

Согласно изобретению "карцинома" представляет собой злокачественную опухоль, происходящую из эпителиальных клеток. Эта группа представляет наиболее распространенные формы рака, включая обычные формы рака молочной железы, простаты, легких и толстого кишечника.

"Бронхиолярная карцинома" представляет собой карциному легкого и, как считается, возникает в эпителии терминальных бронхиол, где неопластическая ткань тянется по ходу альвеолярных стенок и растет в небольших количествах внутри альвеолы. Муцин может быть виден в некоторых клетках и в веществе в альвеоле, куда также включаются голые клетки.

"Аденокарцинома" представляет собой рак, возникающий в железистой ткани. Эта ткань к тому же является частью большой группы тканей, известных как эпителиальная ткань. Эпителиальная ткань включает кожу, железы и целый ряд других тканей, выстилающих полости и органы тела. С точки зрения эмбриологии эпителий происходит из эктодермы, эндодермы и мезодермы. Чтобы относиться к аденокарциноме, клетки необязательно должны быть частью железы, если только они обладают секреторными свойствами. Эта форма карциномы может возникать у некоторых высших животных, включая людей. Хорошо дифференцированные аденокарциномы имеют тенденцию походить на железистую ткань, из которой они происходят, в то время как плохо дифференцированные не похожи на эту ткань. С помощью окрашивания клеток из биопсийного материала патолог определяет, является ли опухоль аденокарциномой или другим типом рака. Аденокарциномы могут возникать во многих тканях организма вследствие повсеместного распространения желез в организме. Наряду с тем, что каждая железа не может секретировать одно и то же вещество, когда у клетки существует внешнесекреторная функция, она считается железистой, и поэтому ее злокачественная форма называется аденокарциномой. Злокачественные аденокарциномы вторгаются в другие ткани и дают метастазы, также проникающие в другие ткани. Аденокарцинома яичника является наиболее распространенным типом карциномы яичника. Сюда включаются серозные и слизитые аденокарциномы, светлоклеточная аденокарцинома и эндометриоидная аденокарцинома.

"Цистаденокарцинома" представляет собой злокачественную форму поверхностной эпителиально-стромальной опухоли, типа карциномы яичника.

Как полагают, поверхностные эпителиально-стромальные опухоли являются классом новообразований, происходящих из поверхностного эпителия яичника (измененного peritoneum (брюшина)) или из эктопического эндометрия или ткани фаллопиевой (маточной) трубы. Эта группа опухолей составляет большую часть всех опухолей яичника.

"Хориокарцинома" является злокачественным трофобластическим и быстро развивающимся раком, обычно плаценты. Она характеризуется ранним распространением в легкие с током крови.

Почечно-клеточная карцинома, известная также как почечно-клеточный рак или почечно-клеточная аденокарцинома, является раком почки, происходящим из выстилки проксимальных извитых канальцев, очень маленьких трубочек в почке, которые фильтруют кровь и удаляют продукты жизнедеятельности. Почечно-клеточная карцинома является вне всяких сомнений наиболее распространенным типом рака почки у взрослых и наиболее летальным из всех урогенитальных опухолей. Отдельными подтипами почечно-клеточной карциномы являются светлоклеточный рак почки и папиллярный рак почки. Светлоклеточный рак почки является наиболее распространенной формой почечно-клеточной карциномы. Под микроскопом клетки светлоклеточного рака кажутся очень бледными или светлыми. Папиллярный рак почки является вторым наиболее распространенным подтипом. При некоторых, если не при большинстве, из этих форм рака образуются небольшие пальцеподобные выросты (называемые сосочками, папилломами).

Саркома является злокачественной опухолью, происходящей из соединительной ткани или мезенхимальных клеток. Это является отличием от карцином, имеющих эпителиальное происхождение. Синовиальная саркома является редкой формой рака, обычно встречающейся около суставов рук и ног. Она является одним из видов сарком мягких тканей.

Герминогенная опухоль является новообразованием, происходящим из эмбриональных клеток. Герминогенные опухоли могут быть раковыми и нераковыми опухолями. Обычно эмбриональные клетки встречаются внутри гонад (яичника и яичка). Герминогенные опухоли, возникающие снаружи гонад (например, на голове, во рту, на шее, почечной лоханке; в зародышах, у младенцев и маленьких детей чаще всего обнаруживаются на средней линии тела, в частности на кончике копчика), могут быть врожденными пороками развития, возникающими вследствие ошибок во время развития эмбриона.

Двумя основными классами герминогенных опухолей являются семиномы и несеминомы, при этом несеминомы включают тератокарциному, эмбриональную карциному, опухоли желточного мешка, хориокарциному и дифференцированную тератому. Большинство клеточных линий от несемином равноценны эмбриональным карциномам, то есть они почти полностью состоят из стволовых клеток, которые не дифференцируются при исходных условиях, хотя некоторые могут реагировать на индуцирующие факторы дифференцировки, такие как ретиноевая кислота.

Тератокарцинома относится к герминогенной (эмбрионально-клеточным) опухоли, которая является смесью тератомы с эмбриональной карциномой или с хориокарциномой или с обеими. Эта разновидность смешенной герминогенной опухоли может называться просто тератомой с элементами эмбриональной карциномы или хориокарциномы или просто без учета компонента тератомы, принимая во внимание только ее злокачественный компонент, эмбриональной карциномой и/или хориокарциномой.

Лимфома и лейкоз являются злокачественными опухолями, происходящими от гемопоэтических (кровообразующих) клеток.

Бластная опухоль или бластома представляет собой опухоль (обычно злокачественную) которая напоминает незрелую или эмбриональную ткань. Многие из этих опухолей наиболее распространены у детей.

Под "метастазированием" имеется в виду распространение раковых клеток из первоначального местоположения в другую часть организма. Образование метастаза является очень сложным процессом и зависит от отделения злокачественных клеток от первичной опухоли, инвазии внеклеточного матрикса, проницаемости эндотелиальных базальных мембран для проникновения в полость тела и сосудов, а затем, после транспортировки кровотоком, инфильтрации органов-мишеней. Наконец, рост новой опухоли, т.е. вторичной опухоли или метастатической опухоли, в месте-мишени зависит от ангиогенеза. Метастазы опухоли могут возникать даже после удаления первичной опухоли, так как опухолевые клетки или компоненты могут остаться и развить метастатический потенциал. В одном варианте осуществления термин "метастаз" согласно изобретению имеет отношение к "отдаленному метастазу", т.е. метастазу, удаленному от первичной опухоли и системы региональных лимфатических узлов.

Клетки вторичной или метастатической опухоли являются такими же, как в первоначальной опухоли. Это означает, например, что если карцинома яичника метастазирует в печень, вторичная опухоль состоит из аномальных клеток яичника, а не из аномальных клеток печени. Опухоль в печени потом называют метастатической карциномой яичника, а не раком печени.

При раке яичника метастазирование может происходить следующими способами: путем прямого контакта или распространения (рак может вторгаться в близлежащую ткань или органы, расположенные рядом или вокруг яичника, такие как фаллопиевы трубы, матка, мочевой пузырь, прямая кишка и т.д.), путем диссеминации или распространения в брюшную полость, что является наиболее частым путем распространения рака яичника. Раковые клетки разрывают поверхность массы яичника и образуют "вкрапления" в других структурах в брюшной полости, таких как печень, желудок, толстый кишечник или диафрагма; путем отрыва от массы яичника, вторжения в лимфатические сосуды и последующего перемещения к другим областям организма или отдаленным органам, таким как легкие или печень; путем отрыва от массы яичника, вторжения в кровеносную систему и перемещения к другим областям организма или отдаленным органам.

Согласно изобретению метастатический рак яичника включает рак в фаллопиевых трубах, рак в органах брюшной полости, такой как рак в кишечнике, рак в матке, рак в мочевом пузыре, рак в толстой кишке, рак в печени, рак в желудке, рак в диафрагме, рак в легких, рак в выстилке брюшной полости или таза (peritoneum) и рак в мозге. Подобным образом, метастатический рак легкого относится к раку, который распространился из легких в отдаленные места и/или несколько мест в организме и включает рак в печени, рак в надпочечных железах, рак в костях и рак в мозге.

В том случае, когда человек вновь испытывает состояние, которому он подвергался в прошлом, наблюдается или происходит рецидив или повторное проявление болезни. Например, в том случае, когда пациент страдал от опухолевого заболевания, получил успешное лечение указанной болезни, и у него вновь развилась эта болезнь, указанная вновь развившаяся болезнь может считаться рецидивом или повторным проявлением болезни. Однако согласно изобретению рецидив или повторное проявление опухолевого заболевания не обязательно может наблюдаться в месте первичного опухолевого заболевания. Таким образом, например, если пациент страдал от рака яичника и получил успешное лечение, рецидив или повторное проявление рака яичника или появление опухоли может наблюдаться в месте, отличном от яичника. Рецидив или повторное появление опухоли также включает ситуации, при которых опухоль появляется в месте, отличном от местоположения первичной опухоли, так же как и на месте первичной опухоли. Предпочтительно, первоначальная опухоль, в отношении которой пациент получал лечение, является первичной опухолью, а опухоль в месте, отличном от местоположения первичной опухоли, является вторичной или метастатической опухолью.

Под термином "лечить" имеется в виду введение субъекту соединения или композиции, описанных здесь, для того, чтобы предотвратить или устранить опухоль или уменьшить размер опухоли или количество опухолей у субъекта; остановить или замедлить рост опухоли у субъекта; ингибировать или замедлить развитие новой опухоли или опухолевых метастазов у субъекта; уменьшить частоту и тяжесть симптомов и/или рецидивов у субъекта, имеющего в настоящее время или ранее имевшего раковое заболевание; и/или удлинить, т.е. увеличить продолжительность жизни субъекта.

В частности, термин "лечение болезни" включает исцеление, сокращение продолжительности, улучшение, предотвращение, замедление или подавление прогрессирования или ухудшения или предотвращение или задержку начала заболевания или его симптомов.

Под "имеющим риск" подразумевается субъект, т.е. пациент, имеющий более высокий, чем обычно, шанс развития болезни, в частности рака, по сравнению с основной популяцией. В дополнение к этому, субъект, имевший или в настоящее время имеющий болезнь, в частности рак, является субъектом с повышенным риском развития болезни, так как болезнь у субъекта может продолжать развиваться. У субъектов, имеющих рак в настоящее время или имевших рак, также имеется повышенный риск образования метастазов рака.

Термин "иммунотерапия" имеет отношение к лечению, затрагивающему специфическую иммунную реакцию. В контексте настоящего изобретения такие термины как "предохранить (защитить)", "предотвратить", "профилактический", "превентивный" или "предохранительный" имеют отношение к предотвращению или лечению или одновременно к тому и другому возникновения и/или распространения опухоли у индивидуума и, в частности, к снижению до минимума возможности, что у субъекта разовьется опухоль, или к задержке развития опухоли. Например, человек, имеющий риск развития опухоли, как описано выше, может быть кандидатом для лечения с целью предотвращения развития опухоли.

Профилактическое введение иммунотерапии, например профилактические введение композиции изобретения, предпочтительно предохраняет реципиента от развития опухолевого роста. Терапевтическое введение иммунотерапии, например терапевтическое введение композиции изобретения, может привести к подавлению прогрессии/роста опухоли. Сюда включается уменьшение скорости прогрессии/роста опухоли, в частности прерывание прогрессии опухоли, что предпочтительно ведет к устранению опухоли.

Термин "in vivo" имеет отношение к ситуации у субъекта.

Термины "субъект", "индивидуум" или "пациент" используются взаимозаменяемым образом и относятся к позвоночным, предпочтительно млекопитающим. Например, млекопитающие в контексте настоящего изобретения являются людьми, приматами, не являющимися людьми, домашними животными, такими как кошки, собаки, овцы, крупный рогатый скот, козы, свиньи, лошади и т.д., лабораторными животными, такими как мыши, крысы, кролики, морские свинки и т.д., а также плененными животными, например, животными в зоопарке. Термин "животное" при использовании в описании также включает людей. Термин "субъект" также может включать пациента, т.е. животного, предпочтительно человека, имеющего заболевание, предпочтительно заболевание, связанное с экспрессией CLDN6, предпочтительно опухолевое заболевание, такое как рак.

В качестве части композиции для иммунизации или вакцинации одно или более средств, описанных здесь, предпочтительно вводятся вместе с одним или более адьювантами с целью вызвать иммунный ответ или для увеличения иммунного ответа. Термин "адьювант" относится к соединениям, удлиняющим или усиливающим или ускоряющим иммунный ответ. Композиция настоящего изобретения предпочтительно оказывает свое влияние без добавления адьювантов. Тем не менее, композиция настоящей заявки может содержать любой известный адьювант. Адьюванты включают разнородную группу соединений, таких как масляные эмульсии (например, адьюванты Фрейнда), минеральные соединения (такие, как квасцы), бактериальные продукты (такие, как токсин Bordeiella pertussis), липосомы и иммуностимулирующие комплексы. Примерами адьювантов являются монофосфорил-липид-А (MPL SmithKline Beecham), сапонины, такие как QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 и QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), неполные адьюванты Фрейнда, полные адьюванты Фрейнда, витамин E, монтанид, квасцы, CpG олигонуклеотиды (Kxieg et al., 1995, Nature 374: 546-549) и различные эмульсии вода-в-масле, которые получают из поддающихся биологическому разложению масел, таких как сквален и/или токоферол.

Согласно изобретению "образец" может быть любым образцом, пригодным согласно настоящему изобретению, в частности биологическим образцом, например образцом ткани, включая жидкости организма, и/или клеточным образцом, и может быть получен обычным способом, например путем биопсии ткани, включая пункционную биопсию, и путем взятия крови, бронхиального аспирата, слюны, мочи, кала или других жидкостей организма. Согласно изобретению термин "образец" также включает обработанные образцы, такие как фракции или изоляты биологических образцов, например нуклеиновые кислоты и изоляты пептидов/белков.

Кроме того, могут быть введены другие вещества, стимулирующие иммунный ответ пациента. Например, при вакцинации возможно использование цитокинов вследствие их регуляторных свойств в отношении лимфоцитов. Такие цитокины включают, например, интерлейкин-12 (IL-12), который, как было показано, увеличивает защитное действие вакцин (Hall (1995) Science 268: 1432-1434), GM-CSF и IL-18.

Существует целый ряд соединений, усиливающих иммунный ответ, которые, следовательно, могут использоваться при вакцинации. Указанные соединения включают ко-стимулирующие (совместно стимулирующие) молекулы, предоставленные в форме белков или нуклеиновых кислот, таких как B7-1 и B7-2 (CD80 и CD86, соответственно).

Терапевтически активные соединения изобретения могут вводиться любым общепринятым способом, включая инъекцию или вливание (инфузию). Введение может осуществляться, например, перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно подкожно или чрескожно. Предпочтительно, антитела вводятся в терапевтических целях с помощью легочного аэрозоля.

В дополнительном варианте осуществления антитела изобретения могут быть созданы таким образом, чтобы предотвратить или уменьшить их транспорт (перенос) через плаценту. Это может быть сделано с помощью известных в данной области техники методов, например, с помощью пегилирования антитела или с помощью F(ab)2’ фрагментов. Можно дополнительно сослаться на "Cunningham-Rundles С, Zhuo Z, Griffith В, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J. Immunol. Methods, 152: 177-190; и на "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 279-283.

Композиции изобретения вводятся в эффективных количествах. "Эффективное количество" относится к количеству, с помощью которого достигается желательная реакция или желательный эффект в отдельности или совместно с дополнительными дозами. В случае лечения конкретной болезни или конкретного состояния желательная реакция предпочтительно имеет отношение к ингибированию течения болезни. Это включает замедление прогрессирования болезни и, в частности, прерывание или реверсию (обратное развитие) прогрессирования болезни. Желательной реакцией при лечении болезни или состояния также может быть задержка начала или предотвращение начала указанной болезни или указанного состояния.

Эффективное количество композиции изобретения будет зависеть от состояния, которое следует лечить, серьезности заболевания, индивидуальных характеристик пациента, включая возраст, физиологическое состояние, размер и вес, продолжительность лечения, тип сопутствующего лечения (если имеется), конкретный способ введения и подобные факторы. Соответственно вводимые дозировки композиций изобретения могут варьировать в зависимости от подобных характеристик. В том случае, когда при использовании первоначальной дозы ответная реакция у пациента является недостаточной, могут использоваться более высокие дозы (или практически более высокие дозы, которые могут достигаться при помощи другого, более локализованного способа введения).

Фармацевтические композиции изобретения предпочтительно являются стерильными и содержат эффективное количество терапевтически активного вещества для того, чтобы вызвать желательную реакцию или желательный эффект.

Фармацевтические композиции изобретения обычно вводятся в фармацевтически совместимых количествах и в фармацевтически совместимом препарате. Термин "фармацевтически совместимый" имеет отношение к нетоксичному материалу, который не взаимодействует с активным компонентом фармацевтической композиции. Препараты такого рода обычно могут содержать соли, буферные вещества, консерванты, носители, дополнительные вещества, усиливающие иммунитет, такие как адьюванты, например CpG олигонуклеотиды, цитокины, хемокины, сапонин, GM-CSF и/или РНК и, если необходимо, другие терапевтически активные соединения. При использовании в медицинских целях соли должны быть фармацевтически совместимыми. Тем не менее, соли, не являющиеся фармацевтически совместимыми, могут использоваться для получения фармацевтически совместимых солей и включаются в изобретение. Фармакологически и фармацевтически совместимые соли такого рода включают, неограничивающим образом, соли, полученные из следующих кислот: хлористоводородной, бромистоводородной, серной, азотной, фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, лимонной, муравьиной, малоновой, янтарной и тому подобных кислот. Фармацевтически совместимые соли также можно получить в виде солей щелочных и щелочноземельных металлов, таких как соли натрия, калия или кальция.

Фармацевтическая композиция изобретения может содержать фармацевтически совместимый носитель. Термин "носитель" относится к органическому или неорганическому компоненту, естественной или синтетической природы, с которым объединяется активный компонент с целью облегчения применения. Согласно изобретению термин "фармацевтически совместимый носитель" включает один или более совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, пригодных для введения пациенту. Компоненты фармацевтической композиции изобретения обычно являются такими, что не происходит взаимодействия, существенно уменьшающего желательную терапевтическую эффективность.

Фармацевтические композиции изобретения могут содержать подходящие буферные вещества в виде солей таких кислот, как уксусная кислота, лимонная кислота, борная кислота и фосфорная кислота.

Фармацевтические композиции, при необходимости, также могут содержать подходящие консерванты, такие как бензалконий хлорид, хлорбутанол, парабен и тимеросал.

Фармацевтические композиции обычно предоставляются в стандартной лекарственной форме и могут быть приготовлены с помощью известных методов. Фармацевтические композиции изобретения могут иметь форму капсул, таблеток, таблеток для рассасывания, растворов, суспензий, сиропов, эликсиров или, например, иметь форму эмульсии.

Композиции, пригодные для парентерального введения, обычно содержат стерильный водный или безводный препарат активного соединения, который предпочтительно является изотоничным по отношению к крови реципиента. Примерами совместимых носителей и растворителей являются раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. В дополнение к этому в качестве раствора или среды для суспензии часто используют стерильные жирные масла.

Настоящее изобретение подробно описывается с помощью чертежей и примеров, представленных далее, которые используются только с целью иллюстрации и не являются ограничивающими. Благодаря описанию и примерам, дополнительные варианты осуществления, которые также включаются в изобретение, являются доступными для квалифицированного специалиста.

Описание чертежей

Фиг. 1. Специфичность связывания анти-CLDN6 мышиных моноклональных антител muMAB 5F2D2, 27A и 36A.

Антитела MuMAB 5F2D2, 27A и 36A сильно связываются с клетками, экспрессирующими CLDN6, и в то же время не связываются с клетками, экспресирующими CLDN3 или CLDN4.

Фиг. 2. Титрование связывания muMAB 5F2D2 с клетками HEK293T, транзиентно трансфицированными CLDN6, 3, 4 или 9 соответственно.

MuMAB 5F2D2 показывают сильное связывание с человеческим CLDN6 и очень слабое связывание с человеческим CLDN9. Эти антитела не взаимодействуют с человеческим CLDN3 или 4.

Фиг. 3. Титрование связывания muMAB 27A с клетками HEK293T, транзиентно трансфицированными CLDN6, 3, 4 или 9 соответственно.

MuMAB 27A показывают сильное связывание с человеческим CLDN6 и очень слабое связывание с человеческим CLDN9. Эти антитела не взаимодействуют с человеческим CLDN3 или 4.

Фиг. 4. Титрование связывания muMAB 36A с клетками HEK293T, транзиентно трансфицированными CLDN6, 3,4 или 9 соответственно.

MuMAB 36A показывают сильное связывание с человеческим CLDN6 и практически отсутствие связывания с человеческим CLDN9. Эти антитела не взаимодействуют с человеческим CLDN3 или 4.

Фиг. 5. Относительное сродство анти-CLDN6 мышиных моноклональных антител muMAB 5F2D2, 27A и 36A.

MuMAB 5F2D2 и 27A демонстрируют значение EC50 350-450 нг/мл, причем насыщение связывания достигается при низких концентрациях, тогда как muMAB 36A не показывают насыщения связывания даже при самой высокой концентрации.

Фиг. 6. Активность, связанная с комплементзависимой цитотоксичностью (CDC), анти-CLDN6 мышиных моноклональных антител muMAB 5F2D2.

MuMAB 5F2D2 проявляют дозозависимую CDC-активность.

Фиг. 7. Активность, связанная с комплементзависимой цитотоксичностью (CDC), анти-CLDN6 мышиных моноклональных антител muMAB 27A и 36A.

MuMAB 27A проявляют дозозависимую CDC-активность, тогда как muMAB 36A не способны индуцировать CDC in vitro.

Фиг. 8. Индукция антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) химерным анти-CLDN6 антителом chimAB 5F2D2 на NEC8 и NEC8 LVTS2 54 (CLDN6 нокаутные), эндогенно экспрессирующих CLDN6.

Химерное анти-CLDN6 антитело chimAB 5F2D2 вызывает ADCC на клетках NEC 8 вместе с эффекторными клетками двух разных доноров дозозависимым образом. Способность chimAB 5F2D2 индуцировать ADCC на клетках NEC8 LVTS2 54 (CLDN6 нокаутные) является сильно сниженной.

Фиг. 9. Терапевтический эффект раннего лечения антителами muMAB 5F2D2 на модели ксенотрансплантата.

MuMAB 5F2D2 показывает специфическое и сильное ингибирование роста опухоли у мышей с привитыми клетками HEK293, стабильно экспрессирующими человеческий CLDN6.

Фиг. 10. Терапевтический эффект раннего лечения антителами muMAB 5F2D2 на модели ксенотрансплантата.

Объем опухолей значительно уменьшался на 28 день (и в дальнейшем) после лечения muMAB 5F2D2, что было показано в тесте Крускала-Уоллиса.

Фиг. 11. Терапевтический эффект раннего лечения антителами muMAB 5F2D2 на модели ксенотрансплантата.

У мышей, которых лечили моноклональными мышиными анти-CLDN6 антителами muMAB 5F2D2, наблюдалось более длительное выживание по сравнению с контрольными группами (PBS).

Фиг. 12. Терапевтический эффект раннего лечения антителами muMAB 27A на модели ксенотрансплантата.

MuMAB 27A показывают специфическое и сильное ингибирование роста опухоли у мышей с привитыми клетками HEK293, стабильно экспрессирующими человеческий CLDN6.

Фиг. 13. Терапевтический эффект раннего лечения антителами muMAB 36A на модели ксенотрансплантата.

MuMAB 36A показывают специфическое и сильное ингибирование роста опухоли у мышей с привитыми клетками HEK293, стабильно экспрессирующими человеческий CLDN6.

Фиг. 14. Терапевтический эффект раннего лечения антителами muMAB 27A и 36A на модели ксенотрансплантата.

У мышей, которых лечили моноклональными мышиными анти-CLDN6 антителами muMAB 27A и 36A, наблюдалось увеличение продолжительности жизни.

Фиг. 15. Иммуноблот-анализ экспрессии человеческого CLDN3, 4, 6 и 9 в клетках NEC8.

Линия клеток опухоли половых клеток яичка NEC8 показывает экспрессию только CLDN6 (A), но не CLDN3, 4 или 9 соответственно (B).

Фиг. 16. Исследование экспрессии CLDN6 на поверхности клеток NEC8 с помощью проточной цитометрии.

CLDN6 экспрессируется на клетках NEC 8.

Фиг. 17. Терапевтический эффект раннего лечения антителами muMAB 5F2D2 на модели ксенотрансплантата у мышей с привитыми опухолевыми клетками NEC8.

По сравнению с контрольной группой антитела muMAB 5F2D2 показали специфическое и сильное ингибирование роста опухоли у мышей с привитыми клетками NEC8, эндогенно экспрессирующими человеческий CLDN6.

Фиг. 18. Терапевтический эффект раннего лечения антителами muMAB 5F2D2 на модели ксенотрансплантата у мышей с привитыми опухолевыми клетками NEC8.

Тест Крускала-Уоллиса показал, что объем опухолей уменьшался на 21 и 42 день после лечения muMAB 5F2D2.

Примеры

Использованные здесь процедуры и методы описываются и осуществляются известным способом, как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Все методы, включая использование наборов и реагентов, осуществляются в соответствии с инструкциями производителя, если специально не указано иное.

Пример 1. Материалы и методы

A. Получение мышиных антител к CLDN6

a. Получение векторов экспрессии, кодирующих полноразмерный CLDN6 и фрагменты CLDN6

Искусственная кодон-оптимизированная последовательность ДНК (SEQ ID NO: 10), кодирующая полноразмерный CLDN6 (SEQ ID NO: 2) была получена с помощью химического синтеза (GENEART AG, Германия) и клонирована в вектор pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen, США), давая вектор р3953. Вставка стоп-кодона давала возможность экспрессии белка CLDN6 без соединения с вектором, кодирующим myc-Ris tag. Экспрессию CLDN6 проверили с помощью вестерн-блоттинга, проточной цитометриии и иммунофлуоресцентного анализа с использованием коммерчески доступных анти-CLDN6 антител (ARP, 01-8865; R&D Systems, МАВ3656).

Кроме того, была получена кодон-оптимизированная последовательность ДНК (SEQ ID NO: 11), кодирующая предполагаемый внеклеточный фрагмент домена 2 (ЕС2) CLDN6 (SEQ ID NO: 5), объединенная с N-концевой лидерной последовательностью сигнального пептида Ig каппа, а потом 4 дополнительными аминокислотами, чтобы сформировать соответствующий сайт расщепления сигнальной пептидазы (SEQ ID NO: 12), и клонирована в pcDNA3.1/myc-His вектор, давая вектор р3974. До иммунизации экспрессия фрагмента ЕС2 была подтверждена с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии на транзиентно трансфицированных и фиксированных параформальдегидом (PFA) клетках CHO-K1 с помощью коммерчески доступных анти-myc антител (Cell Signaling, MAB 2276).

b. Получение клеточных линий, стабильно экспрессирующих CLDN6

Клеточные линии HEK293 и P3X63Ag8U.1, стабильно экспрессирующие CLDN6, были получены с помощью стандартных методов с использованием вектора р3953.

c. Иммунизация.

MuMAB 5F2D2: Мышей Balb/c иммунизировали 25 мкг плазмидной ДНК р3974 вместе с 4 мкл PEI-маннозы (PEI-Man; in vivo-jetPEI™-Man от компании PolyPlus Transfection) (150 мМ PEI-Man в H₂O с 5% глюкозы) путем внутрибрюшинной инъекции в 0, 16 и 36 дни. В день 48 и день 62 мышей иммунизировали путем внутрибрюшинной инъекции миеломными клетками P3X63Ag8U.1, трансфицированными вектором p3953 для стабильной экспрессии CLDN6. Клетки, введенные на 62 день, до инъекции облучали 3000 рад.

MuMAB 27A: Мышей Balb/c иммунизировали с помощью внутрибрюшинной инъекции 2×10⁷ P3X63Ag8U.1 клеток миеломы, трансфицированных вектором р3953 для устойчивой экспрессии CLDN6, на день 0 и день 13. Мышам, у которых развилась опухоль, вторично привили с помощью внутрибрюшинной инъекции 2×10⁷ HEK293 клеток, стабильно трансфицированных вектором p3953 на день 21. Через три дня мышей забили, и подготовили спленоциты. 5×10⁷ спленоцитов трансплантировали другим мышам Balb/c с помощью внутривенной инъекции. В 35, 49, 67 и 104 дни привитых мышей иммунизировали с помощью внутрибрюшинной инъекции 2×10⁷ P3X63Ag8U.1 клетками миеломы, стабильно трансфицированными вектором p3953 вместе с очищенными при помощи ВЭЖХ модифицированными фосфотиоатом CpG олигодезоксинуклеотидами (PTO-CpG-ODN) (50 мкг; 5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT; Eurofins MWG Operon, Германия). Перед введением клетки обработали митомицином С (5 мг/мл, Sigma-Aldrich, М4287).

Мышей MuMAB 36A:C57BL/6 иммунизировали 25 мкг p3974 плазмидной ДНК вместе с 4 мкл PEI-маннозы (PEI-Man; in vivo-jetPEI™-Man от компании PolyPlus Transfection) (150 мМ PEI-Man в H₂O с 5% глюкозы) с помощью внутрибрюшинной инъекции на 0, 16 и 36 дни. В 55, 69 и 85 дни мышей иммунизировали внутрибрюшинной инъекцией 2×107 P3X63Ag8U.1 миеломных клеток, трансфицированных вектором р3953, для стабильной экспрессии CLDN6. На 85 день клетки вводили вместе с очищенными при помощи ВЭЖХ PTO-CpG-ODN (50 мкг в PBS; 5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT; Eurofins MWG Operon, Германия).

Наличие антител против CLDN6 в сыворотке мышей контролировали с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии между днями 20 и 70, используя CHO-K1 клетки, ко-трансфицированные нуклеиновыми кислотами, кодирующими CLDN6 и GFP. Для этого через 24 часа после трансфекции PFA-фиксированные или нефиксированные клетки инкубировали с сывороткой от иммунизированных мышей при разведении 1:100 в течение 45 минут при комнатной температуре (RT). Клетки промыли, инкубировали с мечеными Alexa555 антимышиными Ig антителами (Molecular Probes) и исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии.

Для получения моноклональных антител мышей с обнаруженными анти-CLDN6 иммунными ответами стимулировали за четыре дня до спленэктомии с помощью внутрибрюшинной инъекции 2×10⁷ клеток HEK293, стабильно трансфицированных вектором p3953.

d. Получение гибридом, продуцирующих мышиные моноклональные антитела к CLDN6

Спленоциты (6×10⁷), выделенные из иммунизированной мыши, были соединены с клетками (3×10⁷)миеломы мышей P3X63Ag8.653 (АТСС, CRL 1580) с помощью PEG 1500 (Roche, CRL 10783641001). Клетки высевали в количестве приблизительно 5×10⁴ клеток на лунку в титрационные микропланшеты с плоским дном и культивировали примерно в течение двух недель в селективной среде RPMI, содержащей 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки, 1% гибридомы и дополнения для клонирования (cloning supplement) (HFCS, Roche, CRL 11363735), 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия, 4,5% глюкозы, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 × пенициллин/стрептомицин и 1×HAT добавки (Invitrogen, CRL 21060). Через 10-14 дней отдельные лунки отобрали с помощью проточной цитометриии на aHTH-CLDN6 моноклональные антитела. Секретирующие антитела гибридомы были субклонированы методом серийных разведений и снова протестированы на анти-CLDN6 моноклональные антитела. Стабильные субклоны культивировали в среде для культуры ткани, чтобы получить небольшие количества антител для характеристики. От каждой гибридомы был выбран, по меньшей мере, один клон, который сохранил реакционную способность материнских клеток (проверенную с помощью проточной цитометрии). Для каждого клона были созданы банки из девяти ампул, которые хранили в жидком азоте.

B. Проточная цитометрия

Для тестирования связывания моноклональных антител с CLDN6 и другими клаудинами клетки HEK293T были транзиентно трансфицированы соответствующей кодирующей клаудин плазмидой, при этом экспрессию анализировали с помощью проточной цитометрии. Чтобы различить трансфицированные и нетрансфицированные клетки, клетки HEK293T были котрансфицированы флуоресцентным маркером в качестве репортера. Через 24 часа после трансфекции клетки собирали с помощью 0,05% трипсин/EDTA, промывали буфером FACS (PBS, содержащий 2% FCS и 0,1% азида натрия) и ресуспендировали в FACS-буфере в концентрации 2×10⁶ клеток/мл. 100 мкл клеточной суспензии инкубировали с соответствующими антителами в указанных концентрациях в течение 30 минут при 4°C. Антитела, обладающие перекрестной реакционной способностью, использовали для детекции экспрессии CLDN6 и CLDN9. Коммерчески доступные мышиные анти-клаудиновые антитела анти-CLDN3 (R&D, CRL МАВ3656), анти-CLDN3 (R&D, MAB4620) и анти-CLDN4 (R&D, MAB4219) служили в качестве положительного контроля, тогда как мышиные IgG2a (Sigma, CRL М8894) служили в качестве изотипического контроля. Клетки трижды промывали FACS-буфером и инкубировали с аллофикоцианин(APC)-конъюгированными анти-мышь IgG1+2a+2b+3a специфическими вторичными антителами (Dianova, 115-135-164) в течение 30 минут при 4°С. Клетки дважды промывали и ресуспендировали в FACS-буфере. Связывание анализировали при помощи проточной цитометрии с использованием BD FACSArray. Экспрессию флуоресцентного маркера наносили на график по оси абсцисс против связывания антитела по оси ординат.

Связывание моноклональных антител с линиями клеток, эндогенно экспрессирующими CLDN6, исследовали аналогичным способом.

C. Иммуноблот-анализ

Клетки NEC8 исследовали в отношении экспрессии CLDN6, 3, 4 и 9 с помощью иммуноблот-анализа. В качестве положительного контроля клетки HEK293T были транзиентно трансфицированы или CLDN6, 3, 4, 9 или мок-плазмидой (имитация плазмиды) в качестве отрицательного контроля. Клетки собирали в буфер Лэммли, лизировали и подвергали SDS-PAGE. Гель пропускали и окрашивали анти-CLDN6 (Invitrogen, 34-1700), анти-CLDN4 (Invitrogen, 32-9400), анти-CDLN6 (ARP, 01-8865) или анти-CLDN9 (Santa Cruz, sc-17672) антителами, соответственно. После инкубации с пероксидазой, меченой вторичными антителами, блот обрабатывали реагентом ECL и визуализировали, используя прибор LAS-3000 (Fuji).

D. Исследование CDC

Комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) определяли, измеряя содержание внутриклеточной АТФ в нелизированных клетках после добавления человеческого комплемента к клеткам-мишеням, инкубированным с анти-CLDN6 антителами. Для измерения АТФ использовали люминесцентную реакцию люциферазы, как очень чувствительный аналитический метод.

Клетки CHO-K1, стабильно трансфицированные CLDN6 (CHO-K1-CLDN6), собирали с помощью 0,05% трипсин/EDTA, дважды промывали средой Х-Vivo 15 (Lonza, BE04-418Q) и ресуспендировали в концентрации 1×10⁷ клеток/мл в среде X-Vivo 15. 250 мкл клеточной суспензии переносили в 0,4 см кювету для электропорации и смешивали с 7 мкг in vitro транскрибированной РНК, кодирующей люциферазу (luciferase ГУТ RNA). Клетки электропорировали при 200 В и 300 мкФ при помощи Gene Pulser Xcell (Bio Rad). После электропорации клетки ресуспендировали в 2,4 мл теплой среды D-MEM/F12 (1:1) с GlutaMax-I (Invitrogen, 31331-093), содержащей 10% (об./об.) FCS, 1% (об./об.) пенициллина/стрептомицина и 1,5 мг/мл G418. Высевали 50 мкл клеточной суспензии на лунку в прозрачный 96-луночный PP-планшет и инкубировали при 37°C и 7,5% CO₂. Через 24 часа после электропорации к клеткам добавляли 50 мкл моноклональных мышиных анти-CLDN6 антител в 60% RPMI (содержащей 20 мМ HEPES) и 40% человеческой сыворотки (смесь сывороток, полученная от шести здоровых доноров) при определенных концентрациях. 10 мкл 8% (об./об.) Тритона X-100 в PBS на лунку добавили к контролям общего лизиса, тогда как к контролям максимума жизнеспособных клеток и к текущим образцам добавили 10 мл PBS на лунку. После инкубации в течение 80 минут при 37°C и 5% CO₂ добавили 50 мкл люцифериновой смеси (3,84 мг/мл D-люциферина, 0,64 U/мл АТФазы и 160 мМ HEPES в ddH₂O) на лунку. Планшет инкубировали в темноте в течение 45 мин при комнатной температуре. Люминесценцию измеряли с помощью люминометра (Infinite М200, TEC AN). Результаты даны в виде интегрированных численных относительных световых единиц (RLU).

Специфический лизис вычисляли следующим образом:

Специфический лизис [%] = 100 - [(образец - общий лизис)/(максимум жизнеспособных клеток - общий лизис)×100]

максимум жизнеспособных клеток: 10 мкл PBS, без антител

общий лизис: 10 мкл 8% (об./об.) Тритон X-100 в PBS, без антител.

E. Исследование ADCC

Химерные моноклональные анти-CLDN6 антитела были исследованы в отношении их способности индуцировать антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) по сравнению с NEC8-клетками, эндогенно экспрессирующими CLDN6, и клетками NEC8 с нокаутным CLDN6 (NEC8 LVTS2 54) с помощью метода анализа на основе люциферазы.

NEC8 или NEC8 LVTS2 54 клетки-мишени собрали при помощи 0,05% Трипсин/EDTA, дважды промыли средой Х-Vivo 15, и 2,5×10⁶ клеток электропорировали, смешивая с 7 мкг in vitro транскрибированной РНК, кодирующей люциферазу (luciferase ГУТ RNA) (200 В, 400 мкФ) при помощи Gene Pulser Xcell (Bio Rad). После электропорации клетки суспендировали в 2,4 мл предварительно подогретой RPMI, содержащей 10% FCS. Высевали 50 мкл клеточной суспензии (5×10⁴ клеток) на лунку в прозрачный 96-луночный PP-планшет и инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 6 час. Мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMCs) собирали из крови здоровых доноров с использованием Ficoll (Ficoll-Paque ТМ Plus, GE Healthcare, 17-1440-03). PBMCs суспендировали в X-Vivo 15 (Lonza, BE04-418Q) с добавлением 5% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки и инкубировали при 37°C и 5% CO₂. После инкубации в течение 2-4 час супернатант был обогащен натуральными киллерами (NK). 25 мкл антител, разведенных в PBS, в указанных концентрациях добавили к клеткам NEC8. Обогащенные NK клетки добавляли в соотношении 20:1 (эффекторные к клеткам-мишеням) и образцы инкубировали в течение 24 час при 37°C и 5% CO₂. Лизис клеток определяли, измеряя содержание внутриклеточной АТФ с помощью люциферазы, как описано в "CDC".

F. Исследование раннего лечения

Для исследования раннего лечения антителами 5×10⁶ HEK293-CLDN6 клеток (клетки HEK293, стабильно экспрессирующие CLDN6) в 200 мкл PBS подкожно инокулировали в бок бестимусных мышей Nude-Foxn1^nu. Мок-клетки HEK293 использовали в качестве отрицательных контролей. Каждая экспериментальная группа состояла из самок мышей 6-8 недельного возраста. В случае, когда мышам прививали клетки HEK293-CLDN6 или - мок-клетки соответственно, в контрольные группы с физиологическим раствором входило 10 мышей.) Через три дня после инокуляции в течение 46 дней применяли 200 мкг очищенных мышиных моноклональных антител muMAB 5F2D2, 27A и 36A, два раза в неделю с помощью чередующихся внутривенных и внутрибрюшинных инъекций. Экспериментальные группы, обработанные PBS, служили отрицательными контролями. Объем опухоли (TV=(длина×ширина²)/2) измеряли два раза в неделю. TV выражался в мм³, что давало возможность построить кривые роста опухоли в зависимости от времени. Когда опухоль достигала объема больше чем 1500 мм, мышей забивали.

Пример 2. Связывание полученных согласно изобретению антител с клаудинами

Связывание мышиных моноклональных антител muMAB 5F2D2, 27A и 36A с человеческим CLDN6, 3, 4 и 9 исследовали с помощью проточной цитометрии, используя клетки HEK293T, транзиентно экспрессирующие соответствующий человеческий клаудин. HEK293T были ко-трансфицированы флуоресцентным маркером, чтобы различить нетрансфицированные (популяция Q3) и трансфицированные (популяция Q4) клетки. Использовали концентрацию антител, при которой наблюдалось насыщение связывания с CLDN6 (25 мкг/мл). Экспрессию человеческого CLDN6, 3, 4 и 9 подтверждали при помощи коммерчески доступных моноклональных антител к человеческому Клаудину-6 (R&D Systems, МАВ3656), человеческому Клаудину-3 (R&D Systems, МАВ4620) и человеческому Клаудину-4 (R&D Systems, МАВ 4219).

Антитела MuMAB 5F2D2, 27A и 36A показали сильное связывание с клетками, экспрессирующими CLDN6, в то время как они не связывались с клетками, экспрессирующими CLDN3 или CLDN4; см. фиг. 1.

Антитела MuMAB 5F2D2, 27A и 36A инкубировали в разных концентрациях (0,01; 0,1; 1; 10; 100; 1000; 10000 и 25000 нг/мл) с клетками HEK293T, транзиентно экспрессирующими человеческий CLDN6, CLDN3, CLDN4 или CLDN9. Связывание определяли с помощью проточной цитометрии, см. фиг. 2, 3 и 4. На оси у представлен процент клеток, связанных антителами (популяция Q2), а ось x показывает использованную концентрацию антител.

Наблюдалось сильное связывание MuMAB 5F2D2 с человеческим CLDN6 и слабое связывание с человеческим CLDN9. Антитела MuMAB 27A показали сильное связывание с человеческим CLDN6 и очень слабое связывание с человеческим CLDN9. MuMAB 36A показали сильное связывание с человеческим CLDN6 и практически отсутствие связывания с человеческим CLDN9. Ни одно из антител не взаимодействовало с человеческим CLDN3 или 4.

Для определения относительного сродства исследовали связывание анти-CLDN6 антител с человеческим CLDN6, стабильно экспрессированным на поверхности клеток HEK293, с помощью проточной цитометрии. В эксперименте по насыщению связывания концентрацию антител наносили на график в зависимости от сигналов FACS (средняя величина интенсивности флуоресценции); см. фиг. 5. EC50 (концентрацию антител, при которой связывается половина мест связывания при равновесии) вычисляли с помощью нелинейной регрессии. Результаты показывают, что антитела имеют характерные профили связывания. MuMAB 5F2D2 и 27A показали низкие значения EC50 (EC50 350-450 нг/мл), причем насыщение связывания достигалось при низких концентрациях, тогда как muMAB 36A не показали насыщения связывания даже при самой высокой концентрации.

Пример 3. Эффекторные функции антител, полученных согласно изобретению

CDC-активность анти-CLDN6 антител исследовали с помощью люцифераза-зависимого метода анализа с целью обнаружения эндогенной АТФ в нелизированных клетках. Для этой цели клетки CHO-K1, стабильно экспрессирующие человеческий CLDN6, обработали разными концентрациями MuMAB 5F2D2, 27A или 36A или анти-CLDN6 (R&D Systems, МАВ3656) в качестве внутреннего контроля.

Была показана дозозависимая CDC-активность MuMAB 5F2D2; см. фиг. 6. MuMAB 27A показали дозозависимую CDC-активность, тогда как muMAB 36A были не способны индуцировать CDC in vitro; см. фиг. 7.

Способность химерного анти-CLDN6 антитела chimAB 5F2D2 индуцировать антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) определяли на клетках NEC8, эндогенно экспрессирующих CLDN6, и клетках NEC8 LVTS2 54 (нокаутный CLDN6); см. фиг. 8. Химерное анти-CLDN6 антитело chimAB 5F2D2 и положительный контроль (герцептин) вызывали ADCC на клетках NEC8 с эффекторными клетками двух разных доноров дозозависимым образом. Способность вызывать ADCC на клетках NEC8 LVTS2 54 (CLDN6 нокаутный) была сильно уменьшена у chimAB 5F2D2 по сравнению с родительской линией клеток NEC8, что доказывает специфичность к мишени chimAB 5F2D2.

Пример 4. Терапевтическая эффективность антител, полученных согласно изобретению

Терапевтический эффект раннего лечения muMAB 5F2D2 тестировали на модели ксенотрансплантата, при этом стабильно трансфицированные HEK293-CLDN6 и HEK293-мок ксенотрансплантаты были привиты бестимусным мышам Nnde-Foxn1^nu.

MuMAB 5F2D2 продемонстрировали специфическое и сильное ингибирование роста опухоли на мышах с привитыми клетками HEK293, стабильно экспрессирующими человеческий CLDN6; см. фиг. 9. MuMAB 5F2D2 не оказали воздействия на рост опухоли у мышей с привитыми контрольными мок-клетками. Отдельные контрольные группы мышей получили PBS (как разбавитель), при этом объем инъекций был равен объему применяемых антител.

В дополнение к этому тест Крускала-Уоллиса показал, что объемы опухолей были значительно уменьшены на 28 день (и в дальнейшем) после лечения muMAB 5F2D2; см. фиг. 10. Кроме того, у мышей, которых лечили моноклональными мышиными анти-CLDN6 антителами muMAB 5F2D2, отмечалось увеличение продолжительности жизни по сравнению с контрольными группами (PBS). Антитело-зависимый эффект не наблюдался у мышей, которым были привиты мок-клетки HEK293 в качестве контроля; см. фиг. 11.

Подобным образом, тестирование раннего лечения с помощью muMAB 27A и muMAB 36A на модели ксенотрансплантатов показало специфическое и сильное ингибирование роста опухоли у мышей с привитыми клетками HEK293, стабильно экспрессирующими человеческий CLDN6; см. фиг. 12 и 13. Кроме того, muMAB 27A и 36A оказались эффективными для увеличения продолжительности жизни мышей с ксенотрансплантатами; см. фиг. 14.

Пример 5. CLDN6 в качестве мишени в герминогенных опухолях

Экспрессию CLDN3, 4, 6 и 9 исследовали с помощью иммуноблот-анализа в клетках NEC8. Линия клеток опухоли половых клеток яичка NEC8 показала экспрессию только CLDN6 (A), но не показала экспрессию CLDN3, 4 или 9, соответственно (B); см. фиг. 15. Специфичность использованных анти-CLDN3, 4 и 9 антител была проверена с помощью вестерн-блоттинга с использованием клеток HEK293T, транзиентно трансфицированных векторами экспрессии, кодирующими соответствующий человеческий клаудин.

Экспрессию CLDN6 на поверхности клеток NEC8 исследовали с помощью проточной цитометрии. Коммерчески доступное анти-CLDN6 антитело (R&D Systems, МАВ3656) обнаруживало экспрессию CLDN6 на клетках NEC8; см. фиг. 16. В качестве изотипического контроля использовали мышиный IgG2b (Sigma, CRL М8894).

Был изучен терапевтический эффект раннего лечения muMAB 5F2D2 на модели ксенотрансплантатов у мышей с привитой линией опухолевых клеток NEC8. По сравнению с PBS-контрольной группой muMAB 5F2D2 показали специфическое и сильное ингибирование роста опухоли на мышах с привитыми клетками NEC8, эндогенно экспрессирующими человеческий CLDN6; см. фиг. 17. Тест Крускала-Уоллиса показал, что объемы опухолей были уменьшены на 21 и 42 день после лечения muMAB 5F2D2; см. фиг. 18.

Изобретение относится к области биохимии. Заявлено антитело, связывающееся с клаудином 6 (CLDN6) и ингибирующее рост опухоли in vivo. Антитело может применяться, в том числе в составе фармацевтической композиции, в способе лечения опухолевого заболевания, связанного с клетками, экспрессирующими CLDN6. Также изобретение относится к гибридомам, продуцирующим антитела к CLDN6, депонированным под инвентарными номерами DSM АСС3059 (GT512muMAB 36А), DSM АСС3058 (GT512muMAB 27А), DSM АСС3057 (GT512muMAB 5F2D2). Изобретение позволяет эффективно ингибировать рост CLDN6-положительных герминогенных опухолей, повысить выживаемость и увеличить продолжительность жизни пациентов с опухолью. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 18 ил., 5 пр.

1. Антитело против клаудина 6 (CLDN6), которое ингибирует рост опухоли in vivo связыванием эпитопа, расположенного во внеклеточной части клаудина 6 (CLDN6), где указанная внеклеточная часть CLDN6 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, выбранное из группы, состоящей из:

(i) антитела, выработанного или полученного от клона, депонированного под номером DSM АСС3059 (GT512muMAB 36А), DSM АСС3058 (GT512muMAB 27А) или DSM АСС3057 (GT512muMAB 5F2D2),

(ii) антитела, которое представляет собой химерную или гуманизированную форму антитела по пункту (i).

2. Антитело по п.1, связанное с по меньшей мере одной терапевтической эффекторной частицей, при этом терапевтическая эффекторная частица предпочтительно является радиоизотопной меткой, цитотоксином или цитотоксическим ферментом.

3. Антитело по п.1, в котором CLDN6 включает аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, включающей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или вариант указанной нуклеотидной последовательности.

4. Гибридома, которая продуцирует антитело против клаудина 6 (CLDN6), которое ингибирует рост опухоли in vivo связыванием клаудина 6 (CLDN6), депонированная под номером DSM АСС3059 (GT512muMAB 36А), DSM АСС3058 (GT512muMAB 27А) или DSM АСС3057 (GT512muMAB 5F2D2).

5. Фармацевтическая композиция для применения при лечении или профилактике опухолевого заболевания, содержащая антитело по любому из пп. 1-3 в эффективном количестве, предпочтительно имеющая форму терапевтической или профилактической противоопухолевой вакцины.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, в которой опухолевое заболевание выбирают из группы, состоящей из рака яичника, в частности аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легкого, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточной карциномы легких и аденокарциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в частности злокачественной плеоморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, в частности переходно-клеточной карциномы и папиллярной карциномы, рака почки, в частности почечно-клеточной карциномы, включая светлоклеточный рак почки и папиллярный рак почки, рака толстой кишки, рака тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциномы тонкой кишки и аденокарциномы подвздошной кишки, тестикулярной эмбриональной карциномы, плацентарной хориокарциномы, рака шейки матки, рака яичка, в частности тестикулярной семиномы, тестикулярной тератомы и эмбрионального рака яичка, рака матки, эмбрионально-клеточной опухоли, в частности тератокарциномы или эмбриональной карциномы, предпочтительно эмбрионально-клеточной опухоли яичка, и их метастатических форм.

7. Фармацевтическая композиция по п.5, в которой CLDN6 включает аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, включающей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или вариант указанной нуклеотидной последовательности.

8. Фармацевтическая композиция по п.5, в которой CLDN6 включает аминокислотную последовательность по SEQ ID NO: 2 или вариант указанной аминокислотой последовательности.

9. Способ лечения пациента, имеющего опухолевое заболевание или подвергающегося риску развития опухолевого заболевания, при котором клетки опухоли экспрессируют клаудин 6 (CLDN6), который включает введение антитела по любому из пп.1-3.

10. Способ по п.9, в котором антитело при введении пациенту ингибирует рост опухоли у пациента посредством связывания с CLDN6.

11. Способ по п.9 в котором антитело связано с по меньшей мере одной терапевтической эффекторной частицей (фрагментом, молекулой), при этом терапевтическая эффекторная частица предпочтительно является радиоизотопной меткой, цитотоксином или цитотоксическим ферментом.

12. Способ по п.9, в котором антитело является специфическим к CLDN6.

13. Способ по п.9, в котором антитело является моноклональным, химерным, человеческим или гуманизированным антителом, или является фрагментом антитела или синтетическим антителом.

14. Способ по п.9, который включает введение фармацевтической композиции по п.5.

15. Способ по любому из пп.9-14, в котором CLDN6 включает аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, включающей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или вариант указанной нуклеотидной последовательности.

16. Способ по любому из пп.9-14, в котором CLDN6 содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2 списка последовательностей или вариантом указанной аминокислотной последовательности.

17. Способ по любому из пп.9-14, в котором опухолевое заболевание выбирают из группы, состоящей из рака яичника, в частности аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легкого, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточной карциномы легких и аденокарциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в частности злокачественной плеоморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, в частности переходно-клеточной карциномы и папиллярной карциномы, рака почки, в частности почечно-клеточной карциномы, включая светлоклеточный рак почки и папиллярный рак почки, рака толстой кишки, рака тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциномы тонкой кишки и аденокарциномы подвздошной кишки, тестикулярной эмбриональной карциномы, плацентарной хориокарциномы, рака шейки матки, рака яичка, в частности тестикулярной семиномы, тестикулярной тератомы и эмбрионального рака яичка, рака матки, эмбрионально-клеточной опухоли, в частности тератокарциномы или эмбриональной карциномы, предпочтительно эмбрионально-клеточной опухоли яичка, и их метастатических форм.