КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКИХ ОБСТРУКТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ, СОДЕРЖАЩАЯ МОНОАЦЕТИЛДИГЛИЦЕРОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ АКТИВНОГО ИНГРЕДИЕНТА Российский патент 2018 года по МПК A61K31/22 A61P11/06 

Область техники, к которой относится данное изобретение

Данное изобретение относится к фармацевтической композиции для предотвращения или лечения хронического обструктивного заболевания легких и к функциональному продукту лечебного питания для предотвращения или ослабления хронического обструктивного заболевания легких, содержащим в качестве активного ингредиента моноацетилдиацилглицерин или его фармацевтически приемлемую соль.

Уровень техники

Хроническое обструктивное заболевание легких (англ. COPD, русск. ХОЗЛ) характеризуется сужением дыхательных путей вследствие патологической воспалительной реакции в легких. Известно, что хроническое обструктивное заболевание легких вызывается главным образом вдыханием вредных частиц или газов, в частности одной из основных причин этого заболевания является табакокурение. В последнее время в Корее среди лиц старше сорока лет хроническое обструктивное заболевание легких встречается все чаще с каждым годом. Также в целом во всем мире хроническое обструктивное заболевание легких является единственным, заболеваемость и распространенность которого растут; ожидается, что в 2020 г. оно станет третьей ведущей причиной смерти на планете. Табакокурение играет роль мощного раздражителя, который в легочной ткани усиливает образование различных провоспалительных факторов, факторов роста, окислителей и хемотаксических факторов, активирует участвующие в воспалительной реакции сигнальные системы, тем самым способствуя миграции многочисленных клеток воспаления, включая нейтрофилы и макрофаги, и таким образом усугубляя процесс воспаления в легких. Активирующиеся вследствие вдыхания табачного дыма протеазы, например металлопротеиназы, и клетки воспаления разрушают интерстициальную ткань легких. Это приводит к патологическим изменениям легочной ткани; так, стенки воздухоносных путей утолщаются и развивается фиброз, что ухудшает функционирование легких. В свете сказанного выше при разработке различных агентов для предотвращения и лечения хронического обструктивного заболевания легких основное внимание было сосредоточено на ослаблении воспаления в легких как на основной причине заболевания. В том числе весьма привлекательным методом лечения хронического обструктивного заболевания легких, как и астмы, представляется применение стероидных препаратов и антибиотиков для ослабления воспаления. Однако использование стероидных препаратов и антибиотиков ограничено тем, что они могут вызывать множество побочных эффектов из-за иммунологической супрессии и толерантности и поэтому не годятся для страдающих хроническим обструктивным заболеванием легких, нуждающихся в длительном лечении.

Из оленьих рогов были выделены вещества, обозначаемые ЕС-18, которые представляют собой моноацетилглицеридные соединения. Известно, что они влияют на гемопоэз. Установлено, что ЕС-18 повышает выживаемость подопытных животных с экспериментальным сепсисом при перевязке и проколе слепой кишки и не обладает токсичностью при проверке по стандарту надлежащей лабораторной практики (GLP). Однако действие моноацетилдиацилглицеринов, включая ЕС-18, при хроническом обструктивном заболевании легких не известно и не описано. Поэтому авторы изобретения предприняли значительные усилия с целью разработки агента для лечения хронического обструктивного заболевания легких на основе природного материала или нового соединения. В результате этой работы, составившей это изобретение, было обнаружено, что моноацетилдиацилглицерины подавляют секрецию лиганда 1 хемокинов семейства СХС (CXCL-1), альфа-фактора некроза опухолей (TNF-α) или провоспалительного белка 2 макрофагов (MIP-2) и подавляют проникновение клеток воспаления в бронхи; таким образом, эти вещества можно эффективно использовать для предотвращения или лечения хронического обструктивного заболевания легких.

Раскрытие изобретения

Задачи изобретения

Цель изобретения - предложить фармацевтическую композицию для предотвращения или лечения хронического обструктивного заболевания легких и функциональный продукт лечебного питания для предотвращения или ослабления хронического обструктивного заболевания легких, содержащие в качестве активного ингредиента моноацетилдиацилглицерин, представленный формулой 1

где R1 и R2 независимо друг от друга представляют остаток жирной кислоты из 14-22 атомов углерода.

Другая цель данного изобретения - предложить способ предотвращения или лечения хронического обструктивного заболевания легких, включающий введение фармацевтической композиции по изобретению индивиду, страдающему хроническим обструктивным заболеванием легких или подверженному риску его развития.

Техническое решение поставленных задач

Для достижения указанных выше целей в одном из аспектов изобретения предлагается фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения хронического обструктивного заболевания легких, содержащая в качестве активного ингредиента моноацетилдиацилглицерин, представленный формулой 1, или его фармацевтически приемлемую соль,

где R1 и R2 независимо друг от друга представляют жирнокислотную группу из 14-22 атомов углерода. В настоящем документе термин «жирнокислотная группа» означает карбоксильную группу жирной кислоты без ОН-группы.

Говоря конкретно, фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения хронического обструктивного заболевания легких по изобретению включает моноацетилдиацилглицерин, представленный формулой 1. По изобретению термин «моноацетилдиацилглицерин» означает производное глицерина, в котором имеются одна ацетильная группа и две ацильных группы и которое можно назвать моноацетилдиацилглицерином (MADG).

В моноацетилдиацилглицерине, представленном формулой 1, R1 и R2 независимо друг от друга представляют остаток жирной кислоты из 14-22 атомов углерода. Предпочтительно примеры R1 и R2, не имеющие ограничительного характера, включают пальмитоил, олеоил, линолеоил, линоленоил, стеароил, миристоил, арахидоноил и др. Предпочтительные комбинации R1 и R2 (R1/R2) включают олеоил/пальмитоил, пальмитоил/олеоил, пальмитоил/линолеоил, пальмитоил/линоленоил, пальмитоил/арахидоноил, пальмитоил/стеароил, пальмитоил/пальмитоил, олеоил/стеароил, линолеоил/пальмитоил, линолеоил/стеароил, стеароил/линолеоил, стеароил/олеоил, миристоил/линолеоил, миристоил/олеоил и др. В отношении оптической активности моноацетилдиацилглицерин, представленный формулой 1, может быть (R)-формой, (S)-формой или рацемической смесью.

В одном из воплощений изобретения моноацетилдиацилглицерин является соединением, описываемым формулой 2.

Формула 2:

Соединение, представленное формулой 2, - это 1-пальмитоил-2-линолеоил-3-ацетилглицерин, который в настоящем документе иногда называется "ЕС-18". В соединении, представленном формулой 2, R1 и R2 представляют пальмитоил и линолеоил соответственно.

Моноацетилдиацилглицерины можно выделить из природного источника - рогов оленей или же их можно получить синтетическими методами, известными в органической химии (см. патент Кореи №10-0789323). Конкретно, проделывается следующее. Материал оленьих рогов экстрагируют гексаном, затем остаток экстрагируют хлороформом и полученный экстракт перегоняют при пониженном давлении. Количество используемых для экстракции растворителей - гексана и хлороформа - берется таким, чтобы экстрагируемый материал был полностью погружен в растворитель, но не более. Как правило, на 1 кг оленьих рогов берут примерно по 4-5 литров гексана и хлороформа (сказанное здесь относительно вида и количества растворителей не имеет ограничительного характера). Полученный этим способом экстракт далее фракционируют и очищают путем хроматографии на колонках с силикагелем и тонкослойной хроматографии, в результате чего выделяют моноацетилдиацилглицерин по данному изобретению. Для элюирования при хроматографической очистке можно использовать хлороформ/метиловый спирт, гексан/этилацетат, гексан/этилацетат/уксусную кислоту или подобные системы (не ограничиваясь перечисленным здесь).

Способ химического синтеза для получения моноацетилдиацилглицеринов, используемых по данному изобретению, описан в патенте Кореи №10-0789323. Конкретно, этот способ синтеза желаемого моноацетилдиацилглицерина включает следующие процессы: (а) присоединение защитной группы в положении 3 1-R1-глицерина, в результате чего получается 1-R1-3-защитная группа-глицерин; (b) введение группы R2 в положение 2 соединения 1-R1-3-защитная группа-глицерин, в результате чего получается 1-R1-2-R2-3-защитная группа-глицерин; и (с) одновременное осуществление депротекции и ацетилирования соединения 1-R1-2-R2-3-защитная группа-глицерин (I). При необходимости ацетилированное соединение можно очистить. Другой способ состоит в том, что моноацетилдиацилглицерины можно получить путем кислотного разложения (ацетолиза) фосфатидилхолина; сказанное здесь не имеет ограничительного характера. В объем изобретения входят также стереоизомеры соединений, представленных формулой (I).

Согласно изобретению было обнаружено, что моноацетилдиацилглицерины могут сокращать секрецию интерлейкина-4 (IL-4), CXCL-1, TNF-α или MIP-2; это указывает на то, что их можно эффективно использовать для предотвращения или лечения хронического обструктивного заболевания легких. В настоящем документе термин «хроническое обструктивное заболевание легких» относится к заболеванию дыхательных путей, при котором патологическая воспалительная реакция в легких вызвана вдыханием вредных частиц или газов, и сокращение потока воздуха прогрессирует, ухудшая функционирование легких и обусловливая затрудненность дыхания. Основные симптомы хронического обструктивного заболевания легких включают одышку, хронический кашель и хроническое образование мокроты; соответственно, для лечения хронического обструктивного заболевания легких обычно применяются средства, расширяющие бронхи (бронходилататоры), например бета-агонисты адренорецепторов, антихолинергические агенты или метилксантины, или ингалируемые кортикостероидные препараты. По данному изобретению хроническое обструктивное заболевание легких является (не ограничиваясь перечисленным здесь) предпочтительно хроническим бронхитом или эмфиземой. В настоящем документе термин «хронический бронхит» относится к заболеванию, продолжающемуся два года или дольше, при котором кашель с образованием мокроты имеет место по три месяца в году. Считается, что хронический бронхит обусловлен поражением бронхов из-за таких раздражителей, как табакокурение, вдыхание загрязненного воздуха, воздействие вредных факторов, связанных с профессиональной деятельностью и др., причем основные симптомы включают хронический кашель, образование мокроты и затрудненность дыхания при физическом усилии. Кроме того, возможны резкие обострения заболевания, что характерно для хронического обструктивного заболевания легких, во время которых затрудненность дыхания быстро усугубляется за период от нескольких часов до нескольких суток, и количество мокроты возрастает или ее характер изменяется от слизистого на гнойный, цвет становится темно-желтым или синеватым, а консистенция густой, так что она с трудом откашливается. В настоящем документе термин «эмфизема» относится к постоянной аномальной увеличенности и деструкции вместилищ воздуха в дистальной области концевых бронхиол с разрушением альвеол. Известно, что причиной эмфиземы является вдыхание вредных частиц и газов и что наиболее клинически значимым фактором риска развития эмфиземы служит табакокурение. Основные симптомы эмфиземы включают хронический кашель и образование мокроты, затрудненность дыхания и др. В настоящем документе термин «предотвращение/профилактика» относится к мероприятиям, подавляющим или задерживающим развитие хронического обструктивного заболевания легких путем введения композиции по данному изобретению, а термин «лечение» относится ко всем мероприятиям, которые ослабляют или положительным образом изменяют проявление симптомов хронического обструктивного заболевания легких путем введения композиции по данному изобретению.

Цитокины, например IL-4, тесно связаны не только с воспалением бронхов, но и с гиперреактивностью воздухоносных путей, которая является главным фактором риска развития хронического обструктивного заболевания легких (Chest 2004, 126 (6), 1832-9). Таким образом, подавление экспрессии IL-4 может ослабить воспаление в бронхах и уменьшить гиперреактивность воздухоносных путей, а тем самым подавить прогрессирование хронического обструктивного заболевания легких. Известно, что цитокины, например альфа-фактор некроза опухолей (TNF-α) и хемокины подсемейства СХС, например MIP-2, участвуют в обеспечении перемещения нейтрофилов из легочных кровеносных сосудов в альвеолы. Указанные цитокины или хемокины связаны с воспалительной реакцией, и в случае хронического обструктивного заболевания легких количество нейтрофилов возрастает и происходит секреция этих цитокинов или хемокинов. Таким образом, происходит процесс воспаления в воздухоносных путях; их мышечная стенка утолщается, секреция слизи усиливается, и в результате происходит обструкция бронхов. При обструкции бронхов альвеолы увеличиваются, способность к обмену кислорода на диоксид углерода нарушается и возрастает частота дыхательной недостаточности. В частности, обнаружено, что у индивидов с хроническим обструктивным заболеванием легких экспрессия указанных цитокинов и хемокинов усилена; это свидетельствует об участии этих цитокинов и хемокинов в механизме хронического обструктивного заболевания легких. Таким образом, симптомы хронического обструктивного заболевания легких могут быть ослаблены путем подавления секреции белка, выбираемого из группы, состоящей из IL-4, CXCL-1, TNF-α и MIP-2.

В примерах изобретения i) определяли ингибирующую активность моноацетилдиацилглицеринов в отношении индуцированной форболмиристатацетатом (РМА) экспрессии IL-4 в клетках Т-клеточной лимфомы мышей (EL-4), и было обнаружено, что ряд моноацетилдиацилглицеринов, в том числе ЕС-18, обладают значительной ингибирующей активностью (пример 2); и ii) определяли уровни экспрессии (содержание в жидкости, получаемой при бронхоальвеолярном лаваже) CXCL-1, TNF-α и MIP-2, у животных с экспериментальной астмой, и было показано, что у особей с индуцированным хроническим обструктивным заболеванием легких уровень экспрессии CXCL-1, TNF-α и MIP-2 значительно выше, чем у контрольных животных, в то время как в группе особей, которым вводили моноацетилдиацилглицерин ЕС-18, количество этих факторов была гораздо ниже (пример 6). Эти результаты позволяют полагать, что моноацетилдиацилглицерины эффективны для лечения хронического обструктивного заболевания легких.

Кроме того, в данном изобретении обнаружено, что моноацетилдиацилглицерины могут сокращать количество клеток воспаления вокруг бронхов или клеток CD4+ и нейтрофилов (клеток Gr-1+). Известно, что клетки CD4+ усиливают иммунную защиту, а когда этих клеток избыточно много, возможно развитите аутоиммунного процесса. Известно, что у людей с хроническим обструктивном заболевании легких количество клеток CD4+выше, чем у здоровых (Proceedings of the American Thoracic Society, Vol. 4, No. 7 (2007), pp. 512-521.). Количество нейтрофилов (клеток Gr-1⁺) при хроническом обструктивном заболевании легких также увеличивается (Eur Respir J 2011; 38: 285-294; Nikota et al. Respiratory Research 2011, 12:39). Симптомы хронического обструктивного заболевания легких можно купировать путем уменьшения количества клеток CD4⁺и нейтрофилов (клеток Gr-1⁺).

В примерах данного изобретения клетки воспаления в легочной ткани определяли путем окрашивания трипановым синим, а клетки CD4⁺и нейтрофилы (клетки Gr-1⁺⁾ - путем иммунофлуоресцентного окрашивания и проточной цитометрии. В результате было отмечено, что i) у животных с индуцированным обструктивным заболеванием легких количество клеток воспаления значительно повышено, тогда как в тех группах особей, которым вводили моноацетилдиацилглицерин ЕС-18, оно понижено (пример 4); и ii) у животных с индуцированным обструктивным заболеванием легких количество клеток CD4+ и нейтрофилов (клеток Gr-1+) увеличено, в то время как в группах особей, которым вводили моноацетилдиацилглицерин ЕС-18, оно значительно ниже (пример 5). Эти результаты тоже свидетельствуют, что моноацетилдиацилглицерины эффективны для лечения хронического обструктивного заболевания легких.

В состав фармацевтической композиции по изобретению, содержащей моноацетилдиацилглицерины, могут также входить обычно используемые фармацевтически приемлемые носители, разбавители или иные эксципиенты. Количество моноацетилдиацилглицеринов в фармацевтической композиции по данному изобретению может варьировать в широких пределах без каких-либо специфических ограничений; конкретно, содержание моноацетилдиацилглицеринов в фармацевтической композиции по данному изобретению составляет от 0,0001% до 100,0% (масса/масса), предпочтительно от 0,001 до 50% (масса/масса), более предпочтительно от 0,01 до 20% (масса/масса) относительно общего количества композиции.

Фармацевтическая композиция по изобретению может быть представлена различными лекарственными формами для перорального и не перорального введения, например лекарственными формами, выбираемыми из группы, состоящей из таблеток, болюсов, порошков, гранул, капсул (например, мягких или жестких желатиновых капсул), эмульсий, суспензий, сиропов, эмульгируемых концентратов, стерилизованных водных растворов, неводных растворов, лиофилизованных препаратов, суппозиториев и др. При составлении композиции по изобретению могут использоваться обычно применяемые разбавители или иные эксципиенты, например наполнители, объемообразующие агенты, связующие вещества, увлажняющие агенты, дезинтегрирующие агенты и поверхностно-активные вещества. Твердые препараты для перорального применения по изобретению включают таблетки, болюсы, порошки, гранулы, капсулы и проч.; эти твердые препараты могут быть получены путем смешивания одного или более активных компонентов и по меньшей мере одного из таких эксципиентов, как крахмал, карбонат кальция, сахароза, лактоза, желатин и др. Помимо указанных эксципиентов, можно использовать агенты, улучшающие скольжение, например стеарат магния и тальк. Жидкие препараты по изобретению для перорального применения включают эмульсии, суспензии, сиропы и проч.; они могут также содержать обычно используемые разбавители, например воду или жидкий парафин или различные агенты - увлажняющие, подслащивающие, ароматизирующие и консервирующие. Препараты для не перорального применения включают стерилизованные водные растворы, неводные растворы, лиофилизованные препараты, суппозитории и проч.; растворители для таких растворов включают пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла (например, оливковое масло) и эфиры для инъекций с помощью шприца, например этилолеат. Материалы для основы суппозиториев включают витепсол, макрогол, твин (Tween-61), масло какао, лаурин и глицериножелатин.

Композиция по изобретению вводится в организм в фармацевтически эффективном количестве. Термин «фармацевтически эффективное количество» в настоящем документе употребляется применительно к такому количеству композиции, которое достаточно для достижения желаемого результата при лечебных мероприятиях. Фармацевтически эффективное количество определяется соответственно типу, возрасту и полу индивида, характеру заболевания и степени его тяжести, активности взятого препарата, чувствительности к нему данного индивида, времени, продолжительности и пути введения, скорости выведения из организма и другим критериям, известным в области медицины. Композиция по изобретению может вводиться в организм в отдельности или же одновременно либо последовательно с другими лекарственными средствами; введение может быть однократным или многократным. В свете всех указанных выше факторов важно дозировать количество композиции так, чтобы достигался максимально возможный лечебный эффект при минимальных побочных явлениях или их отсутствии; дозировку композиции по данному изобретению вполне может определить специалист в данной области техники. Предпочтительное количество композиции по изобретению может варьировать соответственно состоянию индивида, его массе тела, степени тяжести заболевания, характеру препарата, пути и продолжительности введения. Нужное суммарное количество композиции, вводимое за сутки, определяет врач, специализирующийся в соответствующей области медицины; обычно оно составляет от 0,001 мг/кг массы тела до 1000 мг/кг, предпочтительно от 0,05 мг/кг до 200 мг/кг, более предпочтительно от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг и вводится в один прием или в несколько приемов на протяжении суток. Композицию по изобретению можно вводить любому индивиду, которому требуется подавление ракового заболевания крови или метастазирования рака. Например, композицию по изобретению моно вводить не только людям, но и животным (в частности, млекопитающим), например обезьянам, собакам, кошкам, кроликам, морским свинкам, крысам, мышам, коровам, овцам, свиньям, козам и др. Композицию по изобретению можно вводить в организм различными обычно применяемыми для введения лекарственных средств способами, например перорально или ректально, внутривенно, внутримышечно, подкожно или интрацеребрально.

В другом аспекте изобретения предлагается функциональный продукт лечебного питания для предотвращения или ослабления хронического обструктивного заболевания легких, включающий в качестве активного компонента моноацетилдиацилглицерины, описываемые формулой 1

где R1 и R2 независимо друг от друга представляют (не ограничиваясь указанным здесь) жирнокислотную группу из 14-22 атомов углерода.

Подробнее, моноацетилдиацилглицерины по изобретению можно включать в состав функциональных продуктов лечебного питания для предотвращения или ослабления хронического обструктивного заболевания легких. Эти соединения и заболевание подробно описаны ранее. Термин «улучшение» означает любое изменение, ослабляющее симптомы или положительным образом влияющее на проявления заболевания у индивида, у которого имеется или подозревается хроническое обструктивное заболевание легких.

В состав функционального продукта лечебного питания композиция по изобретению включается в отдельности или вместе с другим активным компонентом. Количество соединений по изобретению в функциональном продукте лечебного питания определяют соответственно предполагаемому применению этого продукта. Как правило, при изготовлении функционального продукта (в том числе напитка) лечебного питания композиция по данному изобретению включается в его состав в количестве менее чем 15 массовых долей, предпочтительно менее 10 массовых долей. В случае продолжительного использования функционального продукта лечебного питания с целью поддержания здоровья индивида количество композиции в нем может быть уменьшено. Однако, поскольку активный компонент продукта не вызывает никаких негативных эффектов, количество композиции в продукте может быть больше указанного выше. Функциональный продукт лечебного питания, включающий композицию по изобретению, может представлять собой любой обычный пищевой продукт или напиток. Конкретные примеры включают мясные продукты, колбасные изделия, хлеб, шоколад, конфеты, чипсы и подобные продукты, печенье, пиццу, лапшу быстрого приготовления, макаронные изделия, жевательную резинку, мороженое, молочные продукты, супы, прохладительные безалкогольные напитки, чай, алкогольные напитки, витаминные комплексные препараты и др. При необходимости пищевой продукт по изобретению включает также корм для животных.

В том случае, когда функциональный продукт лечебного питания является напитком, он может включать обычно используемые в напитках подсластители, ароматизирующие агенты, природные углеводы и др. Примеры природных углеводов включают моносахариды, например глюкозу и фруктозу, дисахариды, например мальтозу и сахарозу, полисахариды, например декстрин и циклодекстрин, сахарные спирты, например ксилит, сорбит и эритрит. Предпочтительное количество природных углеводов в напитке по изобретению составляет от 0,01 г до 0,04 г, более предпочтительно от 0,02 до 0,03 г на 100 мл. Примеры подсластителей включают природные агенты, например тауматин и экстракт стевии, и искусственные вещества, например сахарин и аспартам. Функциональный продукт лечебного питания по изобретению может также включать различные питательные добавки, витамины, электролиты, ароматизирующие агенты, красители, пектиновые кислоты и их соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, защитные коллоиды, загустители, агенты для подведения рН, стабилизирующие агенты, консерванты, глицерин, спирт, соки и др.

В другом аспекте изобретения предлагается способ для предотвращения или лечения хронического обструктивного заболевания легких, включающий этап введения фармацевтической композиции по данному изобретению индивиду, у которого имеется или подозревается хроническое обструктивное заболевание легких. Понятие «индивид, у которого имеется или подозревается хроническое обструктивное заболевание легких» включает не только животных и людей, страдающих хроническим обструктивным заболеванием легких, но и тех, у которых возможно его развитие. Индивидов, у которых имеется или подозревается хроническое обструктивное заболевание легких, можно эффективно лечить путем введения фармацевтической композиции по данному изобретению. Термин «введение» означает, что фармацевтическая композиция по изобретению каким-либо образом попадает в организм индивида, у которого имеется или подозревается хроническое обструктивное заболевание легких. Путь введения может быть любым - пероральным или не пероральным.

Способ лечения хронического обструктивного заболевания легких по изобретению включает этап введения в организм фармацевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей моноацетилдиацилглицерины, описываемые формулой I, или их фармацевтически приемлемые соли. Сколько нужно вводить препарата суммарно за сутки, определяет врач, исходя из разумных медицинских соображений. Соединение по изобретению вводят один или несколько раз в сутки в количестве, как правило, от 0,001 мг/кг массы тела пациента до около 1000 мг/кг, предпочтительно от около 0,05 мг/кг до около 200 мг/кг, более предпочтительно от около 0,1 мг/кг до около 100 мг/кг. Впрочем, конкретное терапевтически эффективное количество моноацетилдиацилглицеринов для данного индивида варьирует в зависимости от различных факторов, в том числе характера и степени тяжести заболевания, характера и выраженности желаемого эффекта, состава композиции, в том числе от присутствия в ней других активных агентов, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и питания индивида, времени и пути введения препарата, скорости выведения композиции из организма, продолжительности лечения, других препаратов, используемых в сочетании или одновременно с данным в ходе лечения, и различных других факторов, известных в области медицины.

Полезный эффект изобретения

Моноацетилдиацилглицерины по изобретению подавляют экспрессию интерлейкина-4 в клетках Т-клеточной лимфомы мышей (клетках EL-4) и проникновение клеток воспаления в бронхи в экспериментах на животных моделях. Кроме того, соединения по изобретению существенно снижают уровень экспрессии CXCL-1, TNF-α или MIP-2, не обладая побочными эффектами, свойственными существующими на сегодняшний день агентами для лечения хронического обструктивного заболевания легких, не токсичны и оказывают выраженное терапевтическое действие. Таким образом, эти соединения можно с успехом использовать для предотвращения или лечения хронического обструктивного заболевания легких и облегчения состояния больного.

Осуществление изобретения

Ниже данное изобретение описывается в дальнейших подробностях с помощью примеров. Следует принять во внимание, что эти примеры служат сугубо иллюстративной цели и не должны ограничивать объем изобретения.

Препаративный пример 1. Получение стандартного сигаретного экстракта

Препаративный пример 1-1. Материалы для эксперимента

Использовали стандартные сигареты СМ7 (60 штук, по стандарту международной организации Coresta, производство Heinr Borgwaldt, Германия), изопропанол, этиловый спирт (Merck, Германия), н-гептадекан (Sigma-Aldrich, США). Эксперимент выполняли в лабораторных условиях с помощью автоматизированной курительной машины (стандарт ISO 3308, модель RM20, Heinr Borgwaldt).

Препаративный пример 1-2. Сбор сигаретного дыма

Сбор конденсата дыма от прокуривания стандартных сигарет СМ7 (Coresta Monitoring Cigarette 7, Heinr Borgwaldt, Германия) проводили в камере для прокуривания при температуре 22±2°С и относительной влажности 60±5% по стандарту ISO 3402, используя автоматизированную курительную машину RM20 (Heinr Borgwaldt, Германия) согласно стандарту ISO 3308 при следующих условиях: объем дыма 35,0±0,3 мл; продолжительность цикла прокуривания 60±0,5 секунд; время прокуривания 2,00±0,02 секунды; длина фильтра +3 мм (ободковая бумага +3 мм). Кроме того, конденсат дыма собирали на 92-миллиметровый кембриджский фильтр (стандартный, ISO 3308, 2000),

Препаративный пример 1-3. Экстракция конденсата сигаретного дыма

Кембриджский фильтр, содержащий собранный конденсат сигаретного дыма, снимали с держателя и помещали в колбы Эрленмейера объемом 100 мл; в каждую колбу прибавляли 50 мл растворителя для экстракции (изопропанола) и хорошо встряхивали. Затем содержимое колб оставляли при комнатной температуре на 8 часов или дольше, чтобы прошла экстракция. Полученный экстракт фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Объединяли концентраты из трех колб в измерительном сосуде для сцинтилляционного счетчика и полностью концентрировали, используя газообразный азот.

Препаративный пример 1-4. Расчет содержания влажного конденсата (ТРМ).

Содержание влажного конденсата в главной струе дыма рассчитывали, используя уравнение 1

где ТРМ - количество влажного конденсата (мг на одну сигарету); W_FHA - масса держателя фильтра после прокуривания; W_FHB - масса держателя фильтра до прокуривания; N - число количество сигарет (штук), прокуренных на одну ловушку для дыма.

Пример 1. Определение цитотоксичности моноацетилдиацилглицеринов с использованием клеток EL-4

Клетки Т-клеточной лимфомы мышей (клетки EL-4) суспендировали в среде RPMI (Gibco), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, в концентрации 5×10⁴ клеток/мл; по 100 мкл этой клеточной суспензии высевали в лунки 96-луночного планшета и культивировали в течение 12 часов. Затем культуру клеток обрабатывали моноацетилдиацилглицеринами (MADG), взятыми в концентрациях, представленных в приведенной ниже таблице 1, после чего культивировали в течение еще 24 часов. После этого, следуя инструкциям к набору для подсчета клеток ССК-8 (Dojino), в лунки планшета прибавляли по 10 мкл раствора ССК-8, давали реакции протекать в течение от 30 минут до 4 часов и измеряли поглощение (OD) на длине волны 570 нм. Жизнеспособность клеток рассчитывали с помощью приведенного ниже уравнения 1; полученные результаты представлены в таблице 1. В уравнении 1 группа «отрицательный контроль» - это культура клеток, обработанная 0,2%-ным диметилсульфоксидом (DMSO). В таблице 1 используются следующие сокращения: PLAG - 1-пальмитоил-2-линолеоил-3-ацетилглицерин; POAG - 1-пальмитоил-2-олеоил-3-ацетилглицерин; PSAG - 1-пальмитоил-2-стеароил-3-ацетилглицерин; PPAG - 1-пальмитоил-2-пальмитоил-3-ацетилглицерин; OPAG - 1-олеоил-2-пальмитоил-3-ацетилглицерин; OSAG - 1-олеоил-2-стеароил-3-ацетилглицерин; LPAG - 1-линоеоил-2-пальмитоил-3-ацетилглицерин; и LSAG - 1-линоеоил -2-стеароил-3-ацетилглицерин.

Уравнение 1

Жизнеспособность клеток (%) = [(Значение OD при 570 нм для группы с обработкой МАБС) / (Значение OD при 570 нм для группы «отрицательный контроль»)] × 100

Как представлено в приведенной выше таблице 1, определяли жизнеспособность клеток EL-4 при различных концентрациях моноацетилдиацилглицеринов (MADG), и было показано, что агент ЕС-18 не проявляет цитотоксичности при концентрации 200 мкг/мл или менее, а другие испытанные соединения не проявляли цитотоксичности при концентрации 20 мкг/мл или менее.

Пример 2. Подавление экспрессии мРНК в клетках EL-4 под действием моноацетилдиацилглицеринов

На основании результатов, описанных в примере 1, каждый из испытываемых моноацетилдиацилглицеринов добавляли к клеткам EL-4 в концентрации 20 мкг/мл и определяли его влияние на индуцированную форболмиристатацетатом (РМА) экспрессию мРНК интерлейкина-4 (IL-4) в клетках EL-4. А именно, уровень экспрессии мРНК IL-4, индуцированной РМА (1 нг/мл), определяли с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (rtPCR) и количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qPCR). Клетки EL-4 высевали на 6-луночный планшет в концентрации 1×10⁶ клеток на лунку и культивировали в течение 12 часов; затем клетки обрабатывали тем или иным из испытываемых моноацетилдиацилглицеринов в концентрации 20 мкг/мл в течение 1 часа и РМА в концентрации 1 нг/мл, после чего культивировали в течение 12 часов. Из клеток выделяли суммарную РНК с помощью тризола (Trizol В, Invitrogen, США) и определяли ее количество. Затем по суммарной РНК синтезировали кДНК, используя набор Omniscript RT (Qiagen, GmbH, Хилден, Германия). Синтезированную кДНК в качестве матрицы смешивали с праймерами для IL-4 и GAPDH, представленными в приведенной ниже таблице 2, и проводили полимеразную цепную реакцию, используя готовую реакционную смесь для ПЦР PCR Master Mix (Bioneer, Корея), при следующих условиях: денатурация при температуре 94°С в течение 5 минут, затем 30 циклов, каждый из которых включает 30 секунд при 95°С 45 секунд при 60°С и 45 секунд при 72°С; затем инактивация фермента при 72°С в течение 10 минут. Результаты определения степени подавления экспрессии мРНК IL-4 в клетках EL-4, как описано выше, представлены в таблице 3, приведенной ниже. Обозначения образцов в таблице 3 те же, что и в таблице 1.

Как представлено в приведенной выше таблице 3, уровень экспрессии IL-4 в группе с обработкой РМА повышен, а моноацетилдиацилглицерины подавляют экспрессию IL-4 на 20-50% по сравнению с группой, в которой была обработка РМА (100%).

Пример 3. Модель хронического обструктивного заболевания у мышей и введение испытываемого агента

Для создания модели хронического обструктивного заболевания легких самкам мышей линии BALB/c возрастом 8 недель раз в неделю на протяжении трех недель делали анестезию 7%-ным хлоралгидратом, после чего интратрахеально ингалировали по 100 мл смеси LPS + CS, содержавшей 100 мкг/мл липополисахарида (LPS) и 4 мг/мл экстракта конденсата дыма от прокуривания стандартных сигарет (CS). Говоря конкретно, делали следующее. Пока животное было неактивно после указанной анестезии, ему ингалировали интратрахеально 100 мкл смеси LPS + CS: через нос 50 мкл и через рот (при этом передние зубы фиксировали резинками) 50 мкл. Агент ЕС-18 растворяли в 0,5%-ной карбоксиметилцеллюлозе натрия (CMC) в концентрации 30 мг/мл либо 60 мг/мл и вводили мышам перорально за 1 час до интратрахеальной ингаляции 100 мкл смеси PS + CS. В этом эксперименте брали следующие группы мышей: (i) особи, не подвергавшиеся никакой обработке (интактные - «нормальный контроль», NC); (ii) контрольные особи, которым делали обработку LPS + CS («индуцированное обструктивное заболевание легких», COPD-контроль); (iii) подопытные мыши, которым вводили перорально ЕС-18 в дозе 30 мк/кг массы тела за 1 час до обработки смесью LPS + CS (ЕС-18-30); и (iv) подопытные мыши, которым вводили перорально ЕС-18 в дозе 60 мк/кг массы тела за 1 час до обработки смесью LPS + CS (ЕС-18-60). По завершении эксперимента во всех группах у каждой особи брали кровь, жидкость, получаемую при бронхоальвеолярном лаваже и легочную ткань.

Пример 4. Получение жидкости путем бронхоальвеолярного лаважа и подсчет клеток

После забора крови мышей вскрывали. Для выделения клеток из жидкости, получаемой при бронхоальвеолярном лаваже (BALF), животному вводили в трахею шприц, содержащий 1 мл среды DMEM без фетальной телячьей сыворотки (FBS), фиксировали его и делали три промывания. Полученные в результате клетки обрабатывали лизирующим раствором АСК при температуре 37°С в течение 5 минут, чтобы произошел лизис эритроцитов. Затем клетки промывали средой DMEM, не содержащей FBS, и окрашивали 0,04%-ным трипановым синим, после чего подсчитывали общее число клеток. Результаты представлены в таблице 4 ниже.

Важнейшим признаком обструктивного заболевания легких является воспаление в легочной ткани. Как видно из таблицы 4, приведенной выше, среди клеток воспаления наблюдалось увеличение количества нейтрофилов. В группе мышей с индуцированным обструктивным заболеванием легких (COPD) отмечалось увеличенное количество клеток воспаления в жидкости, полученной путем бронхоальвеолярного лаважа, по сравнению с группой «нормальный контроль» (NC), причем среди клеток воспаления было значительно увеличено количество нейтрофилов. Однако в той группе мышей, которым вводили препарат по данному изобретению (ЕС-18) в дозе 30 мг/кг массы тела, общее число клеток воспаления было меньше на 15,1% и существенного изменения в количестве нейтрофилов не отмечалось. А в той группе мышей, которым вводили препарат по данному изобретению (ЕС-18) в дозе 60 мг/кг массы тела, общее число клеток воспаления было меньше на 44,8% (Р<0,05) и количество нейтрофилов тоже было меньше на 42% (Р<0,05).

Пример 5. Определение количества клеток CD4+ и нейтрофилов Склеток Gr-1+) путем проточной цитометрии

Выделенные клетки, полученные путем бронхоальвеолярного лаважа, разводили до концентрации 5×10⁵ и проводили иммунофлуоресцентное окрашивание при температуре 4°С; для этого к клеткам прибавляли антитела против CD4, конъюгированные с фикоэритрином (PE-anti-CD4, 553047, BD Pharmingen) и антитела против Gr-1, конъюгированные с фикоэритрином (PE-anti-Gr-1, 553128, BD Pharmingen) и инкубировали на льду в течение 30 минут. После инкубации клетки промывали три раза или больше физиологическим раствором, забуференным фосфатом (PBS) и определяли относительное количество клеток CD4⁺ и нейтрофилов Gr-1⁺ на проточном цитометре с программой Cell Quest (643274, BD Biosciences). Затем, исходя из данных об общем количестве клеток, определяли абсолютное количество клеток в каждом образце.

Как видно из таблицы 5, приведенной выше, количество клеток CD4⁺ и нейтрофилов Gr-1⁺ в группе мышей с индуцированным обструктивным заболеванием легких (СОРD) значительно больше, чем в группе «нормальный контроль» (NC). А в группе, в которой животные получали ЕС-18 в дозе 30 мг/кг массы тела, количество клеток CD4⁺ было на 39,6% меньше и число нейтрофилов Gr-1⁺ было на 40,9% (Р<0,05) меньше, чем у особей с индуцированным хроническим обструктивным заболеванием легких; в группе, в которой животные получали ЕС-18 в дозе 60 мг/кг массы тела, количество клеток CD4⁺ было меньше на 70,0% и число нейтрофилов Gr-1⁺ было меньше на 62,7% (Р<0,05).

Пример 6. Определение уровней экспрессии (содержания в жидкости, полученной путем бронхоальвеолярного лаважа) CXCL-1, TNF-α и MIP-2 методом твердофазного иммуноферментного анализа

Содержание CXCL-1, TNF-α и MIP-2 в жидкости, полученной путем бронхоальвеолярного лаважа, у мышей определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Антитела, специфичные к CXCL-1, TNF-α либо MIP-2, разводили буферным раствором для покрывания планшета (291195, R&D System), вносили в лунки микропланшета и инкубировали в течение ночи при температуре 4°С. Каждую лунку промывали три раза буферным раствором для промывания и вносили в нее 100 мкл сыворотки, разбавленной в 10 раз. Планшет оставляли при комнатной температуре на 1 час, после чего два раза промывали буферным раствором для промывания и в каждую лунку вносили 100 мкл пероксидазы хрена, конъюгированной с авидином (HRP, DY998, R&D System), оставляли при комнатной температуре на 1 час, после чего промывали. В лунки добавляли по 100 мкл тетраметилбензидина (ТМВ) в качестве субстрата пероксидазы и оставляли в темном помещении на 30 минут, после чего добавляли 50 мкл раствора для остановки реакции. Измеряли поглощение на длине волны 450 нм при помощи планшетного ELISA-ридера (Emax, Molecular Devices), и рассчитывали подавление (в процентах) экспрессии. Полученные результаты представлены в таблице 6 ниже.

Как видно из таблицы 6, приведенной выше, содержание CXCL-1 в жидкости, полученной путем бронхоальвеолярного лаважа, у мышей с индуцированным обструктивным заболеванием легких (группа COPD) значительно выше, чем в группе «нормальный контроль» (NC). А в группе, в которой животные получали ЕС-18 в дозе 30 мг/кг массы тела, уровень экспрессии (содержание в жидкости, полученной путем броноальвеолярного лаважа) CXCL-1 был на 15,4% меньше, чем у особей с индуцированным хроническим обструктивным заболеванием легких; в группе, в которой животные получали ЕС-18 в дозе 60 мг/кг массы тела, уровень экспрессии (содержание в жидкости, полученной путем броноальвеолярного лаважа) CXCL-1 был на 54,3% (Р<0,01) меньше, чем у особей с индуцированным хроническим обструктивным заболеванием легких.

Также, как видно из таблицы 7, приведенной выше, содержание TNF-α в жидкости, полученной путем бронхоальвеолярного лаважа, у мышей с индуцированным обструктивным заболеванием легких (группа COPD) значительно выше, чем в группе «нормальный контроль» (NC). А в группе, в которой животные получали ЕС-18 в дозе 30 мг/кг массы тела, уровень экспрессии (содержание в жидкости, полученной путем броноальвеолярного лаважа) TNF-α был на 36,0% меньше, чем у особей с индуцированным хроническим обструктивным заболеванием легких; в группе, в которой животные получали ЕС-18 в дозе 60 мг/кг массы тела, уровень экспрессии (содержание в жидкости, полученной путем броноальвеолярного лаважа) TNF-α был на 61,8% (Р<0,05) меньше, чем у особей с индуцированным хроническим обструктивным заболеванием легких.

Также, как видно из таблицы 8, приведенной выше, содержание MIP-2 в жидкости, полученной путем бронхоальвеолярного лаважа, у мышей с индуцированным обструктивным заболеванием легких (группа COPD) значительно выше, чем в группе «нормальный контроль» (NC). А в группе, в которой животные получали ЕС-18 в дозе 30 мг/кг массы тела, уровень экспрессии (содержание в жидкости, полученной путем броноальвеолярного лаважа) MIP-2 был на 40,6% меньше, чем у особей с индуцированным хроническим обструктивным заболеванием легких; в группе, в которой животные получали ЕС-18 в дозе 60 мг/кг массы тела, уровень экспрессии (содержание в жидкости, полученной путем броноальвеолярного лаважа) MIP-2 был на 63,8% (Р<0,05) меньше, чем у особей с индуцированным хроническим обструктивным заболеванием легких.

Хотя изобретение описано в настоящем документе на примере конкретных иллюстративных воплощений, специалистам в данной области техники, к которым обращено это изобретение, понятно, что оно может быть воплощено и в других конкретных вариантах без отклонения от технической сущности или существенных признаков изобретения. Таким образом, описанные выше воплощения изобретения следует рассматривать как во всех отношениях иллюстративные и не имеющие ограничительного характера. Также объем изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, а не подробным описанием, и следует принять во внимание, что все модификации или варианты, проистекающие из смыслового содержания и объема изобретения, и эквивалентные им утверждения входят в объем данного изобретения.

Изобретение относится к фармацевтической композиции для предотвращения или лечения хронического обструктивного заболевания легких, содержащей в качестве активного ингредиента моноацетилдиацилглицерин. Соединения по данному изобретению снижают уровень экспрессии CXCL-1, TNF-α или MIP-2 и, таким образом, не имеют побочных эффектов, свойственных используемым в настоящее время терапевтическим агентам для лечения хронического обструктивного заболевания легких, не токсичны и отличаются превосходным терапевтическим действием, так что могут быть полезны в качестве композиции для предотвращения, лечения и снижения степени тяжести хронического обструктивного заболевания легких. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 6 пр., 8 табл.

1. Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения хронического обструктивного заболевания легких, содержащая в качестве активного ингредиента моноацетилдиацилглицерин, описываемый формулой 1

где R1 и R2 независимо друг от друга представляют жирнокислотную группу из 14-20 атомов углерода.

2. Композиция по п. 1, в которой R1 и R2 независимо друг от друга выбирают из группы, состоящей из пальмитоила, олеоила, линолеоила, линоленоила, стеароила, миристоила и арахидоноила.

3. Композиция по п. 1, в которой R1 и R2 (R1/R2) выбирают из группы, состоящей из олеоила/пальмитоила, пальмитоила/олеоила, пальмитоила/линолеоила, пальмитоила/линоленоила, пальмитоила/арахидоноила, пальмитоила/стеароила, пальмитоила/пальмитоила, олеоила/стеароила, линолеоила/пальмитоила, линолеоила/стеароила, стеароила/линолеоила, стеароила/олеоила, миристоила/линолеоила, миристоила/олеоила.

4. Композиция по п. 1, в которой моноацетилдиацилглицерин является соединением, описываемым формулой 2

5. Композиция по п. 1, в которой моноацетилдиацилглицерин, описываемый формулой 1, является природным веществом, выделенным из оленьих рогов.

6. Композиция по п. 1, в которой хроническое обструктивное заболевание легких является хроническим бронхитом или эмфиземой.

7. Композиция по п. 1, в которой моноацетилдиацилглицерин ослабляет секрецию одного или более белков, выбираемых из группы, состоящей из интерлейкина-4 (IL-4), лиганда 1 хемокинов семейства СХС (CXCL-1), альфа-фактора некроза опухолей (TNF-α) и провоспалительного белка 2 макрофагов (MIP-2).

8. Композиция по п. 1, в которой моноацетилдиацилглицерин уменьшает количество клеток воспаления вокруг бронхов или сосудов или количество клеток CD4+ и нейтрофилов Gr-1+.

9. Композиция по п. 1, в которой моноацетилдиацилглицерин, описываемый формулой 1, содержится в количестве от 0,001% до 50% от общей массы композиции,

где R1 и R2 независимо друг от друга представляют жирнокислотную группу из 14-20 атомов углерода.

10. Способ предотвращения или лечения хронического обструктивного заболевания легких, включающий введение пациенту, не являющемуся человеком, композиции по любому из пп. 1-9.