Инактивированная бивалентная гидроокись алюминиевая вакцина против кампилобактериоза собак Российский патент 2018 года по МПК A61K39/02 A61P43/00 

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии, ветеринарии, микробиологии и может быть использовано в биотехнологии при производстве инактивированной вакцины против кампилобактериоза домашних животных.

Известно применение гидроокиси алюминия в качестве адъюванта и формалина в качестве инактиватора и при производстве ГОА - (гидроокись алюминевой формол-вакцины) против возбудителя Campylobacter fetus subspecies fetus «Современные проблемы профилактики и терапии заразных болезней сельскохозяйственных животных и птиц», Огородникова, Гришина. Горовенко, Кисилёва, Иванова. Опыт сравнительного изучения иммуногенности противокампилобактериозных вакцин на морских свинках, Ленинград, 1984, МСХ СССР ЛВИ (Ленинградский ветеринарный институт), сборник научных трудов, стр. 58-59. Данная вакцина выбрана в качестве прототитпа.

Применение формалина для инактивации является то, что он убивает микробную клетку не разрушая ее, сохраняя антигены на поверхности оболочки. Усиливается антигенность и иммуногенность.

Недостатком известного (гидроокись алюминиевая-формолвакцина) является недостаточная антигенная активность препарата, повышенная реактогенность инактиватора(формалина), используемого при производстве вакцины. Кроме того, формалин требует защиты дыхательных путей и кожных покровов специалиста при работе с ним.

Техническим результатом изобретения является создание инактивированной вакцины против кампилобактериоза собак с использованием ГОА (гидроокись алюминия) 2% гидроокиси алюминия на фосфатно-буферном растворе.

Технический результат достигается тем, что она дополнительно содержит формалинизированные антигены из штаммов Campylobacter: fetus subspecies fetus и jejuni subspecies jejuni при концентрации смеси антигенов 2 млрд микробных клеток в 1 мл вакцины при соотношении 1,5:0,5 (полторы части штамма Campylobacter fetus subspecies fetus и 0,5 части Campylobacter jejuni subspecies jejuni).

Технологический процесс включает стадии выделения и накопления возбудителей Campylobacter fetus subspecies fetus и Campylobacter jejuni subspecies jejuni соединения накопленной культуры с инактивирующим агентом в оптимальном соотношении и внесения получившейся биомассы.

Концентрацию микробных клеток определяют при помощи стандарта мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича), выделяют, поддерживают и культивируют на среде ПЖА (полужидкий агар) в микроаэробных условиях в термостате 37°C в течение 2 суток. После проверяют принадлежность возбудителей по их культурально-морфологическим и биохимическим свойствам.

Накопление колоний возбудителей осуществляется путем пересева с ПЖА (полужидкий агар) на плотную среду по рецепту проблемной бруцеллезной лаборатории СПбГАВМ (Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины).

Фасуют по колбам-матрам и простерилизовывают в автоклаве при 115° 30 минут. РН - 7,2-7,3, возбудители кампилобактериоза на указанной среде культивируют в микроаэробных условях в термостате при 37-38°C в течение 2 суток. Смыв бакмассы со среды проводится стерильно 0,9% раствором натрия хлорида с добавлением 0,3% формалина в стерильные флаконы по 100 мл.

На инактивацию биомассы с формалином ставят в термостат. Инактивация проходит в бескислородных условиях при 37°C в течение 2 суток.

Контроль инактивации осуществляется путем посева полученной инактивированной биомассы на ПЖА, а также микроскопии инактивированных клеток.

После контроля на инактивацию биомассу центрифугируют при 3000 оборотов в мин в течение 30 минут. Сливают надосадочную жидкость и разводят стерильным 0,9% раствором хлорида натрия.

Образец бивалентной вакцины производят следующим образом:

1. В 100 мл инактивированной бакмассы вносится 2% суспензия гидроокиси алюминия AL(OH) в количестве 11 мл, доведя концентрацию действующего вещества до 0,2% относительно общей массы препарата ГОА (гидроокись алюминиевая - вакцина).

2. Перемешивают и ставят в термостат на 24-48 часов при 37°C.

3. Перемешивают полученную эмульсию при 14 тысяч оборотах в минуту в течение 5 минут.

В дальнейшем опытный образец вакцины прошел контроль на стабильность, безвредность, реактогенность, иммуногенность и антигенную активность. Испытания проводились на лабораторных животных (морские свинки 350-400 г. По результатам серологического исследования не имеющие антител к возбудителю кампилобактериоза), поделенных на группы по 10 голов: 3 опытные и 4 контрольная.

Иммуногенность вакцины оценивалась путем заражения подопытных животных культурой возбудителя. Для определения заражающей дозы проведено пассажирование патогенного штамма Campylobacter fetus subspecies fetus на 3-x беременных морских свинках. Выделенная культура 2 пассажа в концентрации 20 тыс. микробных клеток использована в качестве зараженной дозы. Заражение вакцинированных морских свинок проводилось подкожно в дозе 1 мл через 30 дней после вакцинации. Через 30 дней после заражения морские свинки опытных и контрольных групп убиты для бактериологического исследования органов и тканей на кампилобактериоз.

Результаты исследований представлены в таблице 1 на 40 морских свинках и свидетельствуют о высокой защитной эффективности бивалентной противокампилобактериозной ГОА (гидроокись алюминия) - формол-вакцины на морских свинках, привитых более высокими дозами, защитная эффективность составила 80-90%, в это же время в контрольной группе (не вакцинированной) установлено 100% заражение.

Длительность прививочного иммунитета испытанной вакцины достигает 150 дней (срок наблюдения). Стабильность вакцины более 8 месяцев (срок наблюдения).

Для определения безвредности (безопасности) вакцины осуществлялся ежедневный контроль состояния подопытных животных. Все животные из групп 1-3 активно принимали корм и воду, клинических признаков заболеваемости не выявлено, животные активны, аборты у беременных свинок отсутствовали. Признаков токсичности, аллергенности, мутагенности препарата не выявлено. Таким образом, установлена безвредность этой вакцины.

При контроле реактогенности бивалентной вакцины у морских свинок местные и побочные действия не выявлены.

Антигенная активность вакцины устанавливалась путем определения титров антител в сыворотке животных через 3-6 недель после вакцинации.

Антигенная активность инактивированной бивалентной ГОА (гидроокись алюминия) - вакцины против кампилобактериоза устанавливалась определением и титров антител в сыворотке крови животных в реакции РА через 3-6 недель после вакцинации. Через 3 недели титр антител в первых группах с антигеном Campylobacter fetus subspecies fetus составлял 1:100-1:200. С антигеном Campylobacter jejuni subspecies jejuni составлял 1:50-1:100. Через 6 недель титры антител в сыворотке крови с антигеном Campylobacter fetus subspecies fetus были 1:200-1:400 во всех группах. С антигеном Campylobacter jejuni subspecies jejuni титры антител соответствовали 1:100-1:200 во всех 3 группах. В контрольной группе, которая не прививалась вакциной, с антигенами Campylobacter была отрицательной. Таким образом, испытуемая серия бивалентной инактивированной ГОА-вакцины против кампилобактериоза собак в остром опыте на морских свинках показала 80-90%-ную эффективность в группах животных, привитых дозами 4 и 5 миллиардов микробных клеток при 100% заражении в контроле. Иммуногенность вакцины была испытана на 500 собаках различных пород с лечебной и профилактической целью. Разработан способ применения вакцины в зависимости от живого веса 0,1 мл на кг подкожно через день 3^х кратно, повторная ревакцинация проводится через 3 месяца. После применения вакцины в течение года отсутствовало бесплодие у самок, у самцов исчезали орхиты после 3^х кратных введений вакцины. У собак с симптомами артритов и положительно реагирующих на кампилобактериоз сокращался послеоперационный период реабилитации.

Вакцина может применяться в ветеринарии для лечения и профилактики домашних и сельскохозяйственных животных.

Результаты применения бивалентной ГОА инактивированной вакцины против кампилобактериоза собак представлены в таблице 3. Из таблицы следует, что вакцина обладает высокой защитной эффективностью против кампилобактериоза собак.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и может быть использовано для профилактики и лечения кампилобактериоза собак. Бивалентная вакцина против кампилобактериоза собак содержит формализированный антиген из штамма Campylobacter fetus subspecies fetus и адьюванта 2% гидроокиси алюминия на фосфатно-буферном растворе, а также формалинизированный антиген из штамма Campylobacter jejuni sudspecies jejuni с концентрацией смеси антигенов 2 млрд микробных клеток в 1 мл вакцины при соотношении 1,5:0,5 (полторы части штамма Campylobacter fetus subspecies fetus и 0,5 части штамма Campylobacter jejuni subspecies jeuni). Использование изобретения позволяет расширить арсенал средств для лечения и профилактики кампилобактериоза. 3 табл.

Бивалентная вакцина против кампилобактериоза собак, содержащая формализированный антиген из штамма Campylobacter fetus subspecies fetus и адъювант 2% гидроокиси алюминия на фосфатно-буферном растворе гидроокиси алюминия, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит формализированный антиген из штамма Campylobacter jejuni subspecies jejuni с концентрацией смеси антигенов 2 млрд микробных клеток в 1 мл вакцины при соотношении 1,5:0,5 (полторы части штамма Campylobacter fetus subspecies fetus и 0,5 части штамма Campylobacter jejuni subspecies jejuni).