СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДЕЛИ ОЖИРЕНИЯ ЖИВОТНОГО Российский патент 2018 года по МПК A01K67/02 A01K49/00 C12N1/20 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данная заявка относится к биотехнологии, особенно применительно к способам создания животных моделей ожирения и применению таких животных моделей ожирения для скрининга микроорганизмов, соединений, композиций, лекарственных средств, еды, составов или рецептов, лекарственных препаратов, пищевых добавок, продуктов для ухода за здоровьем или напитков на их роль в вызывании, предотвращении или лечении ожирения.

Предшествующий уровень техники

Если в данном документе особым образом не указано иное, материалы, описанные в этом разделе, не являются предшествующим уровнем техники по отношению к формуле изобретения этой заявки, и не подразумевается, что они являются предшествующим уровнем техники из-за включения в этот раздел.

Большое количество симбиотических микробов живут внутри человеческого тела, их состояние и функция эквивалентны важному органу, приобретенному после рождения, при этом они играют незаменимую роль для человеческого здоровья. Внутри всего человеческого тела эукариотические клетки составляют только 10% от общего количества клеток; тогда как прокариотические клетки составляют оставшиеся 90%, поэтому нобелевский лауреат Ледерберг предположил, что человеческое тело является "суперорганизмом", состоящим как из эукариотических клеток, так и из эндокомменсальных симбиотических прокариотических клеток. Эндокомменсальные симбиотические микробы превышают 1000 видов, вес 1-2 кг и количество в диапазоне 10¹⁴, более чем в 10 раз большее, чем количество клеток человеческого тела, и количество кодирующих генов по меньшей мере в 100 раз больше, чем количество человеческих генов.

Хорошо известно, что ожирение стало в возрастающей степени острой проблемой общественного здоровья в современном обществе, однако до настоящего времени механизм остается непонятным в отношении того, как кишечная флора участвует в начале и развитии ожирения, резистентности к инсулину и других метаболических заболеваниях. Более того, не очевидно то, является ли кишечная флора причиной или эффектом метаболических заболеваний; какие типы бактерий могут приводить к возникновению метаболических заболеваний и какие типы бактерий способны улучшать симптомы ожирения, резистентности к инсулину и других метаболических заболеваний.

Краткая сущность изобретения

Следующее краткое изложение является только иллюстративным и не подразумевается, что оно является каким-либо образом ограничивающим. В добавление к иллюстративным объектам, вариантам осуществления и свойствам, описанным выше, дополнительные объекты, варианты осуществления и свойства станут очевидными со ссылками на чертежи и следующее подробное описание.

Один из объектов данной заявки относится к способам создания животной модели ожирения. В одном варианте осуществления способ содержит инокулирование животных с эндотоксин (LPS)-продуцирующей бактерией c питанием с высоким содержанием жира для продуцирования гнотобиологической животной модели ожирения. После того, как микроорганизм, такой как продуцирующая эндотоксин бактерия или композиция, содержащая эндотоксин-продуцирующую бактерию, инокулированы в аксенических животных, вскармливаемых с питанием с высоким содержанием жира, микроорганизм колонизируется в кишечнике аксенических животных. Животные могут проявлять ожирение, инсулиновую резистентность, хроническое воспаление или другие симптомы метаболического нарушения, нарушения иммунной системы или другие системные нарушения.

Другой объект заявки относится к способам скрининга микроорганизма или композиции микроорганизмов, которые вызывают ожирение.

Другой объект заявки относится к способам скрининга терапевтических мишеней для лечения метаболических нарушений, таких как ожирение.

Другой объект заявки относится к способам скрининга или оценки микроорганизмов, еды, рецептов, составов, композиций, соединений, лекарственных средств, пищевых добавок, продуктов по уходу за здоровьем, напитков или других средств, которые могут быть применены для предотвращения или лечения метаболических заболеваний, таких как ожирение.

Краткое описание чертежей

Вышеприведенные и другие свойства этого открытия станут более понятными из следующего описания и прилагаемой формулы изобретения в сочетании с прилагаемыми чертежами. Принимая во внимание то, что эти чертежи отображают только некоторые варианты осуществления, воплощенные в соответствии с открытием и, следовательно, не должны рассматриваться как ограничивающие объем, открытие будет описано с дополнительной определенностью и подробностями посредством прилагаемых чертежей, в которых:

Фиг. 1 иллюстрирует колонизацию изолятов B29 в кишечнике аксенических мышей, вскармливаемых с питанием с высоким содержанием жира посредством сравнения уровней популяции Enterobacter sp. B29 в ассоциированной с Enterobacter гнотобиологической модели ожирения мышей с уровнями у контрольных мышей.

Фиг. 2 иллюстрирует эффекты B29 на симптомы ожирения и резистентность к инсулину аксенических мышей, вскармливаемых с питанием с высоким содержанием жира; фиг. 2a демонстрирует массу тела ассоциированной с Enterobacter гнотобиологической модели ожирения и контролях; фиг. 2b демонстрирует массу эпидидимального, мезентериального, подкожного ингвинального и ретроперитонеального скопления жировой ткани в ассоциированной с Enterobacter гнотобиологической модели ожирения и контролях; фиг. 2c демонстрирует абдоминальные фотографии в ассоциированной с Enterobacter гнотобиологической модели ожирения и контролях; фиг. 2d демонстрирует оральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT) и площадь под кривой (AUC) у мышей с ассоциированной с Enterobacter гнотобиологической моделью ожирения и контролей; и фиг. 2e демонстрирует сывороточные уровни через 2 часа после загрузки инсулина в ассоциированной с Enterobacter гнотобиологической модели ожирения и контролях; и

Фиг. 3 иллюстрирует эффект B29 на уровень воспаления аксенических мышей, вскармливаемых с питанием с высоким содержанием жира; фиг. 3a демонстрирует сывороточные LBP уровни у ассоциированной с Enterobacter гнотобиологический модели ожирения и контролей; фиг. 3b демонстрирует сывороточные SAA уровни в ассоциированной с Enterobacter гнотобиологической модели ожирения и контролях; фиг. 3c демонстрирует сывороточный адипонектин, скорректированный по уровням массы тела в ассоциированной с Enterobacter гнотобиологической модели ожирения и контролях; фиг. 3d демонстрирует анализ с количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) экспрессии Tnfα, Il1β, Il6, Mcp1, Ikk ε и Tlr4 в печени в ассоциированной с Enterobacter гнотобиологической модели ожирения и контролях; фиг. 3e демонстрирует анализ с количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) экспрессии Tnfα, Il1β, Il6, Mcp1, Ikk ε и Tlr4 в эпидидимальном скоплении жировой ткани в ассоциированной с Enterobacter гнотобиологической модели ожирения и контролях; и фиг. 3f демонстрирует анализ с количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) экспрессии Tnfα, Il1β, Il6, Mcp1, Ikk ε и Tlr4 в подвздошной кишке в ассоциированной с Enterobacter гнотобиологической модели ожирения и контролях.

Подробное описание изобретения

В следующем подробном описании осуществлена ссылка на прилагаемые чертежи, которые формируют его часть. В чертежах схожие символы, как правило, идентифицируют схожие компоненты, если контекст не указывает однозначно на обратное. Не подразумевается, что иллюстративные варианты осуществления, описанные в подробном описании, чертежах и формуле изобретения, являются ограничивающими. Могут быть использованы другие варианты осуществления, и могут быть внесены другие изменения, без выхода за рамки основной идеи и объема объекта патентования, представленного в данном документе. Нетрудно понять, что объекты данного открытия, как в целом описано в данном документе и проиллюстрировано на чертежах, могут быть упорядочены, заменены, комбинированы, разделены и сконструированы в виде широкого разнообразия различных конфигураций, все из которых однозначно предусмотрены данным документом.

Заявка в целом среди прочего относится к новым способам создания животных моделей ожирения, новым способам скрининга микроорганизма или композиции микроорганизмов, которые могут вызвать ожирение, новым способами скрининга терапевтических мишеней для лечения метаболических нарушений и новым способам для скрининга или оценки микроорганизмов, соединений, композиций, еды, рецептов, составов, лекарственных средств, пищевых добавок, продуктов для ухода за здоровьем, напитков и других средств для предотвращения и лечения метаболических заболеваний.

В одном примере данная заявка относится к способу предоставления животной модели ожирения, в которой аксенических животных инокулируют с микроорганизмом, при этом вскармливая их питанием с высоким содержанием жира. Микроорганизм может являться единичным микроорганизмом или комбинацией микроорганизмов. Питание с высоким содержанием жира может содержать по меньшей мере 5% жира. Микроорганизм или комбинация могут колонизировать кишечник аксенических животных внутри и формировать основу популяции кишечной микробиоты для получения в результате животных моделей. Животная модель может проявлять симптомы по меньшей мере одного метаболического нарушения или нарушения иммунной системы.

Симптомы метаболических или нарушений иммунной системы могут являться метаболическим синдромом или нарушениями иммунной системы, включая без ограничения ожирение, инсулиновую резистентность, хроническое воспаление или неалкогольную жировую дистрофию печени.

Аксеническое животное может являться млекопитающим или немлекопитающим. Примером млекопитающих могут быть мышь, крыса, морская свинка, свинья, кролик или обезьяна.

Количество жира в питании с высоким содержанием жира может составлять по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20% или по меньшей мере 25%.

Микроорганизм может являться бактерией, такой как продуцирующая эндотоксин бактерия. Продуцирующая эндотоксин бактерия относится к бактерии, способной к продуцированию веществ(а), которые(ое) обладают(ет) эндотоксинной активностью. Примеры продуцирующей эндотоксин бактерии могут включать, без ограничения, штамм B29 Enterobacter cloacae, Enterobacter cloacae, Enterobacter, энтеробактерии, γ-Proteobacteria, Proteobacteria или грамотрицательные бактерии. Микроорганизм может быть в композиции, содержащей множество штаммов продуцирующих эндотоксин бактерий или содержащей штаммы продуцирующих эндотоксин и не продуцирующих эндотоксин бактерий. В одном примере, микроорганизм может содержать ген синтеза эндотоксина, последовательность которого по меньшей мере на 15%, 20%, 30%, 50%, 75% или 95% подобна последовательности штамма B29 Enterobacter cloacae.

Модель ожирения животного, представленная выше, может включать кишечную бактерию, имеющую ген 16S рРНК, последовательность которого по меньшей мере на 15%, 20%, 30%, 50%, 75% или 95% подобна SEQ ID NO.1.

Способ инокулирования, как отмечено выше, может являться любым способом инокулирования или введения в биологической, медицинской или фармацевтической областях. Пример способов инокулирования может включать гаваж, диетические добавки, добавку к питьевой воде и намазываемое или топическое применение на кожу и мех. После инокулирования инокулированные микроорганизмы, такие как бактерии, могут колонизировать кишечник животного или могут быть детектированы в экскрементах животного. В одном примере, инокулированные бактерии могут быть постоянно детектированы в экскрементах животного. Животные могут проявлять среди прочего сопутствующие метаболические синдромы, прирост массы, повышенное содержание жира, липидов крови, инсулиновую резистентность, резистентность к сывороточному липополисахарид-связывающему белку или лептиновую резистентность, повышенный сывороточный уровень воспаления или повышенные уровни экспрессии воспалительного фактора.

Другой объект данной заявки относится к способам скрининга вызывающего ожирение микроорганизма или их комбинации. В одном примере бактерия позитивного контроля, которая способна к колонизированию кишечника аксенического животного, инокулирована животному, которое подвергается кормлению с питанием с высоким содержанием жира. Полученное в результате животное может проявлять по меньшей мере один тип метаболических или нарушений иммунной системы. Указанную бактерию позитивного контроля сравнивают с тестируемым микроорганизмом или их комбинацией. Если тестируемый микроорганизм или его комбинация проявляет эффект, подобный позитивному контролю, это указывает на то, что тестируемый микроорганизм или его комбинация может вызывать ожирение.

Другой объект данной заявки относится к способам скрининга микроорганизма или его комбинации, которая имеет предупредительный или терапевтический эффект на симптом метаболического нарушения или нарушения иммунной системы. В одном примере в способе применяют животную модель, которая проявляет по меньшей мере один симптом метаболических или нарушений иммунной системы. После введения тестируемого микроорганизма или его комбинации, если животное проявляет улучшение по меньшей мере одного симптома метаболических или нарушений иммунной системы, это указывает на то, что указанный микроорганизм или его комбинация обладает предупредительным или терапевтическим эффектом на симптом метаболических или нарушений иммунной системы. В одном примере, улучшение по меньшей мере одного симптома метаболических или нарушений иммунной системы может включать облегчение симптома ожирения, инсулиновой резистентности или хронического воспаления. Например, после введения тестируемого микроорганизма или его комбинации, если животное проявляет одно или более из потери массы, сниженного содержания жира, понижения липидов крови, улучшенной инсулиновой резистентности, сниженного уровня сывороточного липополисахарид-связывающего белка, пониженной лептиновой резистентности, пониженного сывороточного уровня воспаления или пониженных уровней экспрессии воспалительного фактора, это указывает на то, что тестируемый микроорганизм или его комбинация могут обладать предупредительным или терапевтическим эффектом на симптом метаболического нарушения или нарушения иммунной системы.

Тестируемый микроорганизм может являться любым микроорганизмом. В одном примере тестируемый микроорганизм может включать молочнокислые бактерии, Bifidobacteria, продуцирующие бутират бактерии, грамположительные кокки или пробиотики.

Другой объект данной заявки относится к способам скрининга материала, который может обладать предупредительным или терапевтическим эффектом на симптом метаболических или нарушений иммунной системы. В одном примере в способе применяют животную модель, проявляющуюся в одном симптоме метаболических или нарушений иммунной системы. После введения материала, если животное проявляет улучшение по меньшей мере одного симптома метаболических нарушений или нарушений иммунной системы, это указывает на то, что материал может обладать предупредительным или терапевтическим эффектом на симптом метаболических нарушений или нарушений иммунной системы. Например, улучшение может включать потерю массы, пониженную инсулиновую резистентность или сниженное хроническое воспаление. В одном примере после введения материала, если гнотобиологическая модель ожирения животного проявляет одно или более из потери массы, сниженного содержания жира, понижения липидов крови, улучшенной инсулиновой резистентности, сниженного уровня сывороточного липополисахарид-связывающего белка, пониженной лептиновой резитентности, пониженного сывороточного уровня воспаления или пониженных уровней экспрессии воспалительного фактора, это указывает на то, что материал может обладать предупредительным или терапевтическим эффектом на симптом метаболического нарушения или нарушения иммунной системы.

Вышеупомянутый материал может являться съедобным. Например, материал может включать, без ограничения, еду, рецептуры, составы, соединения, композиции, лекарственные средства, пищевые добавки, продукт для ухода за здоровьем или напиток.

Следующие примеры предназначены для иллюстрации осуществления и свойства показательного способа применения. Не подразумевается, что эти примеры ограничивают объем заявки.

ПРИМЕР 1. Материалы и животные модели

Самцов мышей C57BL/6J (аксенические) применяли в качестве животного. Enterobacter cloacae B29 применяли в качестве иллюстративного инокуляционного микроорганизма. Указанная Enterobacter cloacae B29 относится к превосходному штамму, выделенному из экскрементов пациента-добровольца с болезненным ожирением. Анализ последовательности гена 16s РНК и биохимические испытания идентифицировали бактерии как Enterobacter cloacae.

24 здоровых самца мышей C57BL/6J (аксенические) приобретали у Research Diets, Inc. (New Brunswick, NJ) и подвергали кормлению или нормальной пищевой диете (NCD, содержание жира 4,62%, 3,45 килокалорий/грамм), или питанию с высоким содержанием жира (HFD, содержание жира 34,9%, 5,21 килокалорий/грамм).

Способ на мышах: мышей содержали с 12-часовым световым циклом (освещение начинали с 6:30 утра) при 22±3°C. Стерильных мышей возрастом шесть-десять недель случайно распределяли в четыре группы (6 на группу), и они получали следующее лечение: (1) группа NCD+LB: эту группу инокулировали через гаваж с 0,1 мл стерильной среды LB и подвергали кормлению с NCD; (2) группа NCD+B29: группу инокулировали через гаваж с суспензией B29 (10² клеток) в 0,1 мл стерильной среды LB и подвергали кормлению с NCD; (3) группа HFD+LB: эту группу инокулировали через гаваж с 0,1 мл стерильной среды LB и подвергали кормлению с HFD; и (4) группа HFD+B29: эту группу инокулировали через гаваж с суспензией B29 (10² клетки) в 0,1 мл стерильной среды LB и подвергали кормлению с HFD. Эксперимент продолжался 16 недель. Мышей выращивали в клетках из 3 или 4 в гнотобиологических изоляторах и массу тела каждой мыши измеряли каждую неделю. Каждая группа животных располагалась в их отдельных изоляторах, их подвергали кормлению со стерильным питанием и стерильной водой вплоть до эвтаназии и выполняли наблюдение за бактериальным заражением периодическим бактериологическим исследованием гнотобиологических изоляторов.

Во время эксперимента наблюдали за массой тела, массой скопления жировой ткани, чувствительностью к инсулину и уровнями воспаления у мышей.

ПРИМЕР 2

Выделение и характеризация Enterobacter cloacae B29

Анализ страдающей ожирением популяции выявил, что большинство страдающих болезненным ожирением пациентов страдает от тяжелого нарушения баланса в микробиоте кишечника. Например, было обнаружено, что 35% от общего количества бактерий кишечника представляют собой Enterobacter (анализировано посредством библиотеки генов 16S рРНК, у страдающего от болезненного ожирения добровольца (возраст 26 лет, мужчина, этническая принадлежность - хань, масса тела 174,9 кг, BMI 58,78 кг/м²)). В то же время, физическое обследование продемонстрировало, что доброволец страдает от острого метаболического синдрома. Доброволец подвергался 23 неделям соблюдения диеты (композиция: цельные злаки, средство традиционной китайской медицины и пребиотики), при этом он потерял 30,1 кг после 9 недель, 51,4 кг из 174,8 кг после 23 недель и демонстрировал улучшение всех показателей метаболического синдрома. Анализ популяции бактерий кишечника выявил, что популяция Enterobacter снижалась до 1,8% после 9 недель питания и становилась необнаруживаемой в конце 23-недельного исследования. Штаммы Enterobacter выделяли из экскрементов добровольца посредством схемы "направляемое последовательностью выделение" с использованием среды LB (Лурия-Бертани, состав приведен ниже) при 37°C, получали наиболее обильные изоляты и называли их B29. Выполняли анализ полноразмерного секвенирования на 16S рРНК B29, и было обнаружено, что B29 является на 99% гомологичным Enterobacter cloacae (GenBank номер доступа AB244457). Биохимический тест с грамотрицательной GN картой VITEK 2, bioMerieux, Marcy l'Étoile, France, также указывал на то, что B29 с вероятностью 98% принадлежит к Enterobacter cloacae (Таблица 1).

Липополисахарид (LPS) выделяли из B29 с применением набора для выделения LPS iNtRON Biotecnology Co., Seoul, Korea, и уровень активности эндотоксина измеряли применением набора для испытания активности эндотоксина LAL (ACC, USA). Результат продемонстрировал, что активность эндотоксина B29 составляет 4,45×10⁶ ЕЭ мг-1 LPS, что сопоставимо с E. coli штамма 055:B5.

Для того чтобы выполнить специфическое к Enterobacter cloacae B29 детектирование, штамм B29, который является устойчивым к 500 мкг/мл рифампицина выделяли с применением способа скрининга устойчивых к рифампицину штаммов. Этот штамм инокулировали в среду LB и встряхивали в течение 12 часов при 37°C, и полученную в результате культуру бактерий применяли для конструирования животной модели.

Формула для среды LB (Лурия-Бертани) была следующей: триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 10 г/л, Ph 7,4. Твердая LB среда: добавляли 15 грамм агарозы в 1 л жидкой среды LB, растворяли при нагревании и среду разливали на чашки перед охлаждением.

Таблица 1
Биохимическая характеризация Enterobacter cloacae B29 с системой VITEK 2 ID-GN Лунка Аббревиатура Испытание Результат 2 APPA Ala-Phe-Pro-Ариламидаза - 3 ADO Адонит + 4 PyrA L-Пиролидонил-ариламидаза - 5 lARL L-Арабит - 7 dCEL D-Целлобиоза + 9 BGAL β-d-Галактозидаза + 10 H2S Выработка H2S - 11 BNAG β-Ν-ацетил-глюкозаминидаза + 12 AGLTp Глутамилариламидаза pNA - 13 dGLU D-Глюкоза + 14 GGT γ-Глутамилтрансфераза - 15 OFF Ферментация глюкозы + 17 BGLU β-Глюкозидаза (-) 18 dMAL D-Мальтоза + 19 dMAN D-Маннит + 20 dMNE D-Манноза + 21 BXYL β-Ксилозидаза + 22 BAlap β-Аланин ариламидаза pNA - 23 ProA L- Пролин-ариламидаза + 26 LIP Липаза - 27 PLE Палатиноза + 29 TyrA Тирозин-ариламидаза + 31 URE Уреаза - 32 dSOR D-Сорбит + 33 SAC Сахароза + 34 dTAG D-Тагатоза - 35 dTRE D-Трегалоза + 36 CIT Соль лимонной кислоты (натрий) + 37 MNT Соли малоновой кислоты + 39 5KG 5-Кето-глюкозид - 40 lLATk Алканизация L-лактата + 41 AGLU α-Глюкоза (-) 42 SUCT Алканизация сукцината + 43 NAGA N-Ацетил-β-d-галактоза аммиаклиаза + 44 AGAL α- Галактоза глюкозидный фермент + 45 PHOS Фосфатаза - 46 GlyA Глицинариламидаза + 47 ODC Метиндекарбоксилаза + 48 LDC Лизин-декарбоксилаза - 53 lHISa Усвоение гистидина - 56 CMT Кумарат - 57 BGUR β- Глюкуронидаза - 58 0129R O/129 устойчивость + 59 GGAA Glu-Gly-Arg-Ариламидаза - 61 lMLTa Усвоение L- малата - 62 ELLM ELLMAN - 64 lLATa Усвоение L-лактата -

ПРИМЕР 3

Стабильная колонизация B29 в кишечнике аксенической мыши

Во время эксперимента свежие экскременты образцы отбирали каждые две недели, незамедлительно взвешивали и разбавляли 1:10 в стерильном 0,01М PBS. Буфер PBS был приготовлен в соответствии со следующей формулой: 135 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1,5 мМ KH₂PO₄ и 8 мМ K₂HPO₄, pH 7,2. Отбирали 100 мкл суспензии и разливали ее на LB чашки, культивировали при 37°C в течение 16 часов перед подсчетом колоний. Результаты продемонстрировали, что в течение периода эксперимента (недели 0-16) все модельные мыши (т.е. HDF+B29) и мыши NCD+B29 вырабатывали экскременты, которые содержали Enterobacter cloacae B29 с концентрацией 10¹⁰-10¹² бактерий на грамм влажных экскрементов. Этот результат продемонстрировал, что Enterobacter cloacae B29 может стабильно колонизировать кишечник аксенических мышей после только одного инокулирования (фиг. 1).

ПРИМЕР 4

Штамм B29 индуцирует ожирение и резистентность к инсулину в мышах, подвергаемых кормлению с питанием с высоким содержанием жира.

Во время эксперимента массу тела каждой мыши точно измеряли с электронными весами (d=0,01) раз в неделю. В неделю 16 мышей орально вводили глюкозу (2 г/кг массы тела) после 5 часов голодания. Непосредственно перед введением глюкозы (0 минут) и через 15, 30, 60 и 120 минут после введения глюкозы отбирали кровь из хвостовой вены и незамедлительно измеряли уровни глюкозы в крови измерителем глюкозы в крови от Roche. Эти экспериментальные точки применяли для расчета теста устойчивости глюкозы в крови. Через 120 минут после введения глюкозы 50 мкл крови отбирали из ретроорбитальной вены, оставляли при комнатной температуре в течение одного часа; собирали сыворотку центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут; и измеряли уровни инсулина в крови посредством ELISA (Mercodia, Уппсала, Швеция). Эта экспериментальная точка представляет уровень инсулина через два часа после питания. В конце недели 16 мышей вскрывали, следуя следующим процедурам. Сначала делали изображения вскрытой брюшной полости с масштабной линейкой в качестве маркера на двух показательных мышах из каждой группы; впоследствии эпидидимальные жировые скопления, мезентериальные жировые скопления, паховые подкожные жировые скопления и периренальные жировые скопления мыши из каждой группы собирали и точно взвешивали. Выполняли статистические анализы и результаты выражали как среднее ±S.E.M, используя однофакторный дисперсионный анализ (post Hoc) в качестве анализа статистической достоверности (критерий множественного сравнения Turkey, SPSS 17.0). Результаты показаны на фиг. 2.

Результаты продемонстрировали, что модельные мыши, которых подвергали кормлению с питанием с высоким содержанием жира и которые получали инокулирование Enterobacter cloacae B29, проявляли значительно более высокую массу тела, чем другие три контрольные группы. В конце 16 недели, модельные мыши демонстрировали фенотип с очень заметным ожирением. В добавление, результаты из эпидидимальных жировых скоплений, мезентериальных жировых скоплений, паховых подкожных жировых скоплений и периренальных жировых скоплений демонстрировали, что модельные мыши, получающие питание с высоким содержанием жира и инокулирование Enterobacter cloacae B29, имели очень значимые увеличения массы в основных жировых скоплениях тела мышей. Изображения абдоминальной диссекции демонстрировали, что масса тела группы модельных мышей и абдоминальные накопления жира были заметно больше, чем у других групп. В заключение, глюкозная устойчивость модельной группы мышей была явно значительно ниже, чем у других групп, тогда как уровни инсулина после двух часов после питания были значительно более высокими в модельной группе по сравнению с другой контрольной группой.

ПРИМЕР 4

Эффекты Enterobacter cloacae B29 на уровень воспаления у мышей, подвергаемых кормлению с питанием с высоким содержанием жира

Для того чтобы продемонстрировать эффекты Enterobacter cloacae B29 на уровень воспаления у мышей, подвергаемых кормлению с питанием с высоким содержанием жира, измеряли концентрации сывороточного липополисахарид-связывающего белка (LBP), сывороточного амилоидного белка A (SAA) и адипонектина. Уровни экспрессии гена воспалительных факторов в печени, эпидидимальные скопления жира и ткани тощей кишки также количественно определяли. Результаты показаны на фиг. 3.

Уровень LBP в модели ожирения мышей (HFD+B29) был значительно более высоким, чем уровень у других групп, несмотря на то, что количества B29 в кишечнике мышей, подвергаемых кормлению с нормальным питанием, сильно превышали все другие группы. Так как B29 являлась только LPS-продуцирующей бактерией, значительное возрастание уровня эндотоксина в сыворотках модельных мышей могло происходить только от B29. Значительное возрастание уровня эндотоксина в сыворотке будет приводить в результате к системному воспалению, что в свою очередь приводит к резистентности к инсулину и другим симптомам метаболического нарушения. Модель ожирения мышей продемонстрировала значительное возрастание уровня SAA и значительное снижение уровня адипонектина, что подтверждает значительное возрастание системного воспаления. Результат уровней экспрессии генов воспалительных факторов в печени, эпидидимальных скоплениях жира и ткани тощей кишки продемонстрировал, что модель ожирения мышей имела наивысший уровень экспрессии Tnfα, IL-1β, IL-6, ΙΚΚ-ε и TLR4.

Таким образом, в модели ожирения мышей, которая создана на основе этого применения, сывороточный уровень LBP и сывороточный уровень SAA возрастали значительно по сравнению с тремя контрольными группами, уровень адипонектина понижался значительно по сравнению с тремя контрольными группами и локальные тканевые уровни экспрессии провоспалительных генов повышались значительно по сравнению с тремя контрольными группами.

В применяемом в данном документе значении формы единственного числа включают формы множественного числа, если контекст не указывает однозначно на обратное. Если однозначно не указано обратное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют те же значения, как обычно понимает специалист в данной области. Ничего в данном открытии не должно рассматриваться как допущение того, что варианты осуществления, описанные в этом открытии, не имеют право иметь приоритет такого открытия на основании предшествующего открытия. В применяемом в данном документе значении термин "содержащий" означает "включающий, но неограниченный".

В добавление, когда свойства или объекты открытия описаны посредством групп Маркуша, специалист в данной области распознает, что открытие также тем самым описано посредством любого индивидуального члена или подгрупп членов групп Маркуша.

Как поймет специалист в данной области для любой и всех целей, такой как посредством предоставления письменного описания, все диапазоны, раскрытые в данном документе, также охватывают любой и все возможные поддиапазоны и комбинации их поддиапазонов. Любой приведенный диапазон может быть легко распознан как достаточное описание и позволение того, чтобы тот же диапазон был разделен на по меньшей мере одинаковые половины, трети, четверти, пятые части, десятые части и т.д. В качестве неграничивающего примера каждый диапазон, рассматриваемый в данном документе, может легко быть разделен на меньшую треть, среднюю и большую треть и т.д. Как поймет специалист в данной области все формулировки, такие как "вплоть до", "по меньшей мере" и подобные, включают приведенное количество и относятся к диапазонам, которые могут быть впоследствии разделены на поддиапазоны, как рассмотрено выше. В заключение, как поймет специалист в данной области, диапазон содержит каждый отдельный член. Таким образом, например, группа, имеющая 1-3 клетки, относится к группам, имеющим 1, 2 или 3 клетки. Подобным образом, группа, имеющая 1-5 клеток, относится к группам, имеющим 1, 2, 3, 4 или 5 клеток и так далее.

В вышеприведенном следует принимать во внимание, что различные варианты осуществления данного открытия были описаны в данном документе в целях иллюстрации и что различные модификации могут быть осуществлены без выхода за рамки объема и основной идеи данного открытия. Соответственно, подразумевается, что различные варианты осуществления, раскрытые в данном документе, не являются ограничивающими, при этом рамки объема и основной идеи указаны посредством последующей формулы изобретения.

Изобретение относится к способу получения модели ожирения животного. Способ предусматривает инокулирование аксенического животного бактерией Enterobacter cloacae, имеющей ген 16S рРНК, для получения инокулированного животного, где последовательность гена 16S рРНК представляет собой SEQ ID NO.1; и кормление инокулированного животного кормом, имеющим 34,9% содержания жира, в течение по крайней мере четырех недель для получения модели ожирения животного. Полученная способом модель ожирения может быть использована для скрининга микроорганизмов, соединений, композиций, лекарственных средств, еды, составов или рецептов, лекарственных препаратов, пищевых добавок, продуктов для ухода за здоровьем или напитков на их роль в вызывании, предотвращении или лечении ожирения. 7 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 5 пр.

1. Способ получения модели ожирения животного, содержащий

инокулирование аксенического животного бактерией Enterobacter cloacae, имеющей ген 16S рРНК, для получения инокулированного животного, где последовательность гена 16S рРНК представляет собой SEQ ID NO.1; и

кормление инокулированного животного кормом, имеющим 34,9% содержания жира, в течение по крайней мере четырех недель для получения модели ожирения животного.

2. Способ по п.1, в котором модель ожирения животного проявляет метаболический синдром.

3. Способ по п.2, в котором метаболический синдром включает ожирение, инсулиновую резистентность, хроническое воспаление или их комбинацию.

4. Способ по п.1, в котором модель ожирения животного, не являющаяся человеком, является мышью, крысой, кроликом, обезьяной, свиньей или морской свинкой.

5. Способ по п.1, в котором инокулирование аксенического животного включает внутрижелудочное введение, местное введение, оральное введение или их комбинацию.

6. Способ по п.1, в котором инокулирование аксенического животного включает инокулирование аксенического животного по меньшей мере с 10² клеток бактерий.

7. Способ по п.1, в котором в корме содержится по меньшей мере 4,5 ккал на грамм.

8. Способ по п.1, в котором Enterobacter cloacae способна к колонизированию кишечника аксенического животного.