АВТОМАТ И АВТОМАТИЗИРОВАННЫЙ СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Российский патент 2018 года по МПК C12M1/02 C12M1/36 C12M3/00 C12N5/71 

Изобретение относится к автомату для культивирования клеток, в частности для культивирования стволовых клеток (например, типа CD34+), а также к способу культивирования клеток с использованием данного автомата.

Среди сфер применения клеточной культуры, клеточная терапия менее всего развита в плане внедрения новых технологий. Таким образом, необходимо создать технологию, которая позволит производить клетки в достаточном количестве и в оптимальных условиях с целью использования таких клеток в лечебных целях.

Некоторые способы клеточной терапии требуют культивирования или размножения стволовых клеток перед их введением в организм пациента, так как отобранного количества иногда оказывается недостаточно для обеспечения лечебного эффекта. Важное значение имеет сохранение лечебных свойств клеток в процессе их культивирования. Известные в данной области техники решения, предлагаемые для выращивания стволовых клеток ex vivo, являются кустарными, эмпирическими и неэффективными.

Кроме того, существующий способ не позволяет производить стволовые клетки в объеме, достаточном для терапевтического применения. Следовательно, существует потребность в разработке технологии типа биореактора, который был бы компактным и позволял культивировать клетки в больших количествах.

Ранее уже предлагалось использовать биологические реакторы для культивирования стволовых клеток. Тем не менее, фаза усиления по-прежнему выполняется вручную, а условия окружающей среды для культивирования клеток (температура, СО₂ и т.д.) не могут точно контролироваться.

В качестве примера известны мембранные биологические реакторы, биологические реакторы с системой полых волокон, биологические реакторы с кипящим слоем и микробиореакторы, работающие по принципу непрерывной перфузии пуповинной крови, культуральной среды и факторов роста (см. заявку WO 00/73411).

Заявка US А1-2008/0118977 описывает протокол лечения, позволяющий восстановить сердце пациента после инфаркта. Восстановление осуществляется путем введения в область сердца пациента специфических стволовых клеток (CD34+), выделенных из образца крови, размноженных ex vivo и очищенных после культивирования.

Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы представить технологию, способную обеспечить культивирование, размножение или выращивание таких клеток, а также определенным образом улучшить условия стандартизации, мониторинга и контроля операций, которые в условиях описанного выше способа в основном выполняются вручную.

С этой целью изобретение предлагает автомат для культивирования клеток, содержащий:

резервуары с культуральной средой, факторами роста и культивируемыми клетками,

инкубатор с термостатической камерой, в котором расположен сосуд с клеточной культурой или для выращивания клеток, и

компьютерную систему управления со средствами для ввода и записи данных, предназначенную для контроля условий культивирования в камере и управления распределительными клапанами для распределения текучих сред в определенной последовательности. Отличительной особенностью автомата является наличие опорного средства для взбалтывания емкости для культивирования или выращивания клеток, которое управляется посредством компьютерной системы и размещено в камере, и тем, что емкость представляет собой мешочек с по меньшей мере одним входным отверстием, через которое он соединяется с вышеупомянутыми резервуарами, и выходным отверстием, соединенным со средствами для хранения и извлечения клеток после культивирования. Средства для хранения и резервуары расположены вне камеры и соединены с отверстиями мешочка для выращивания клеток с помощью трубопроводов. Трубопроводы и мешочек для культивирования клеток образуют предварительно собранный модуль, трубопроводы проведены через элемент стенки камеры таким образом, чтобы обеспечить перенос культуральной среды, факторов роста и культивируемых клеток в мешочек и извлечение содержимого в средства для хранения, при закрытой камере.

Согласно изобретению, автомат сочетает в себе главным образом функцию по автоматизации этапов протокола культивирования и управлению условиями окружающей среды (контроль температуры, уровня СО₂ и т.д.) для культивирования клеток в инкубаторе с целью достижения оптимального размножения клеток. В его функцию также входит обеспечение подачи в расположенный в инкубаторе мешочек для выращивания клеток (объем которого может быть относительно большой) культуральной среды, факторов роста и культивируемых клеток с помощью управляемых средств (клапанов и насосов). Кроме того, автомат обеспечивает взбалтывание мешочка для выращивания клеток, а также перенос клеток после культивирования из мешочка для выращивания клеток в средства для хранения.

В соответствии с изобретением автомат может быть использован для производства из клеток, забранных у пациента, большого количества клеток, таких как стволовые клетки. Объем мешочка, в котором происходит культивирование клеток, может быть более 100 мл, 200 мл, 300 мл, 500 мл, около 650 мл или более (1 л, 2 л, 3 л и т.д.). Культивирование стволовых клеток в таком мешочке позволяет производить клетки в количестве, достаточном для проведения клеточной терапии у пациента, например, при перенесенном инфаркте, в соответствии с биологическим протоколом, описанным в заявке US-A1-2008/0118977.

Стенки мешочка для выращивания клеток предпочтительно гибкие и изготовлены из водонепроницаемого и газопроницаемого материала. Мешочек хорошо пропускает кислород и углекислый газ, за счет этого содержимое мешочка хорошо вентилируется без необходимости открытия, что исключает риск заражения. В конкретном варианте реализации мешочек имеет следующие характеристики проницаемости (ежедневно, при 37°С): О₂ (газ) ≈418, СО₂ (газ) ≈966, N₂ (газ) ≈157 и Н₂О (жидкость) ≈0,05.

Мешочек для выращивания клеток предпочтительно имеет слабое сродство с химическими и биологическими продуктами, особенно с культивируемыми клетками, и не впитывает такие продукты. Мешочек может быть изготовлен, например, из тонкой пленки из сополимера FEP (фтор этилен пропилен). Мешочек может иметь различные соединительные порты (изменяемые места стыков), например фитинги «елочка» из FEP. Они подсоединяются к мешочку для снижения риска заражения.

Автомат предназначен для культивирования клеток и включает в себя все средства и ресурсы для проведения культивирования, при этом оператору не требуется регулировать клапаны, заменять мешочки или резервуары и т.д. Культивирование клеток выполняется в соответствии с определенным биологическим протоколом, который полностью управляется компьютерной системой, позволяющей контролировать клапаны, средство взбалтывания, а также регулировать условия окружающей среды в камере инкубатора. С целью регистрации в компьютерной системе оператор может вводить идентификационные данные пациента, данные о взятых клетках, типе и происхождении различных резервуаров или мешочков, чтобы все эти данные были зарегистрированы в компьютерной системе. Таким образом, изобретение позволяет вести биологические протоколы с очень хорошей воспроизводимостью и обеспечивать мониторинг и четкий контроль используемых протоколов и способов.

Контроль и отслеживаемость этапов биологического протокола могут быть обеспечены с помощью компьютерной системы и соответствующего интерфейса «человек-машина» (IHM), что позволяет, например:

- разработать автоматизированный способ культивирования клеток с неизменными параметрами протокола культивирования,

- обеспечить безопасность путем ограничения доступа к компьютерной системе путем идентификации пользователя и установки пароля (в соответствии с нормами и правилами 21 CFR Часть 11 FDA),

- записывать события и различные этапы этого процесса, и

- публиковать отчеты (включая результаты анализа взятия (проб) и последующего анализа характеристик трансплантата, например).

Мешочек для выращивания клеток размещен в камере и имеет по меньшей мере два отверстия, соединенные с трубопроводами, которые проведены через элемент стенки инкубатора и подсоединены к резервуарам и средствам хранения, подключенным вне камеры. Мешочек для выращивания клеток и трубопроводы образуют предварительно собранный модуль одноразового использования, который оператор может легко установить и заменить. По меньшей мере одна часть содержимого резервуаров, расположенных вне камеры, должна быть перенесена в мешочек для выращивания клеток, расположенный в камере. После культивирования клеток содержимое мешочка должно поступить в средства для хранения, расположенные вне камеры. Все эти операции по распределению жидкости выполняются при закрытой камере инкубатора с помощью трубопроводов, проходящих через элемент стенки инкубатора. Это позволяет поддерживать оптимальные условия окружающей среды в камере в течение всего периода ведения биологического протокола и сократить риск заражения культуральной среды клеток.

Предпочтительно, мешочек для выращивания клеток оснащен отверстием для забора проб, к которому подсоединен трубопровод, ведущий к средствам для забора проб, расположенным вне камеры. Этот трубопровод проведен через вышеупомянутый элемент стенки камеры и является неотъемлемой частью предварительно собранного модуля. Таким образом, мешочек для выращивания клеток имеет три отверстия, выполняющие различные функции (подача, сбор и взятие проб) и подсоединенные к различным трубопроводам.

В конкретном варианте реализации настоящего изобретения, инкубатор содержит шкаф с проемом и плотно закрываемой дверцей, при этом средства для прохождения вышеуказанных трубопроводов установлены на наружной кромке указанного проема и имеют параллельные канавки для проведения трубопроводов. В закрытом положении дверца покрывает эти канавки. Когда дверца открыта, оператор может легко присоединять (и отсоединять) трубопроводы, перемещая их перпендикулярно продольным осям канавок, что облегчает установку расходных материалов.

Резервуары с факторами роста и культивируемыми клетками предпочтительно выполнены в форме мешочков, расположенных над входным отверстием мешочка для выращивания клеток таким образом, чтобы содержимое каждого мешочка с культуральной средой и культивируемыми клетками могло перетекать под действием силы тяжести в мешочек для выращивания клеток. Это позволяет обеспечивать целостность клеток и факторов роста во время их переноса в мешочек для выращивания клеток. Использование насоса или любого механического средства для переноса клеток и факторов роста по трубопроводам может привести к их повреждению.

Средства для хранения могут иметь один или два мешочка, которые расположены под выходным отверстием мешочка для выращивания клеток, таким образом, чтобы после культивирования, содержимое мешочка для выращивания клеток могло перетекать под действием силы тяжести в мешочек или мешочки средств для хранения. Это также позволяет обеспечивать целостность клеток во время сбора по завершении культивирования клеток.

Автомат может быть оснащен перистальтическим насосом для промывки резервуаров системы управления подачи в культуральную среду мешочка для выращивания клеток и резервуаров с факторами роста и культивируемыми клетками. Преимущество перистальтического насоса состоит в том, что он не соприкасается с культуральной средой, это позволяет избежать любого риска заражения этой среды.

Автомат может дополнительно включать в себя два мешочка, образующих воздухоуловитель, один из которых соединен с резервуарами с факторами роста и культивируемыми клетками, а другой с мешочком для выращивания клеток. Мешочки выполнены с возможностью сбора и хранения воздуха, содержащегося в трубопроводах, мешочке для выращивания клеток и/или резервуарах.

Предпочтительно трубопроводы изготовлены из гибких трубок, по меньшей мере некоторые из которых, проведены через клапаны, которые в закрытом положении пережимают трубки. Например, каждая трубка легко вставляется в канавку клапана оператором, например, путем перемещения в положение, по существу перпендикулярное продольной оси трубки.

Опорное средство для взбалтывания может быть оснащено подставкой для мешочка для выращивания клеток, которая устанавливается с возможностью поворота вокруг первой горизонтальной оси. Подставка установлена с возможностью поворота вокруг указанной оси из по существу горизонтального положения для культивирования клеток в по существу вертикальное положение для сбора клеток после культивирования. Вертикальное положение облегчает сбор клеток после культивирования, поскольку клетки перемещаются в средства хранения под действием силы тяжести.

Подставка может быть установлена с возможностью поворота вокруг второй горизонтальной оси, в этом случае подставка должна вибрировать для взбалтывания и гомогенизации содержимого мешочка для выращивания клеток. Первая и вторая оси поворота подставки предпочтительно должны быть параллельны друг другу.

Предпочтительно, подставка оснащена клапанами управления для подачи в мешочек для выращивания клеток, сбора содержимого мешочка и забора проб.

Опорное средство для взбалтывания может быть дополнительно оснащено вертикальным рычагом, на верхнем конце которого размещено приспособление для подвешивания мешочка, образующего воздухоуловитель, соединенного с мешочком для выращивания клеток.

Средства для хранения предпочтительно установлены с возможностью поворота вокруг горизонтальной оси и могут перемещаться вокруг указанной оси из по существу вертикального в по существу горизонтальное положение, в котором эти средства расположены полностью ниже мешочка для выращивания клеток. Это позволяет обеспечивать перенос под действием силы тяжести всех клеток из мешочка для выращивания клеток в средства для хранения.

Например, в конкретном случае культивирования стволовых клеток CD34+ для обеспечения стерильности, необходимой на протяжении всего цикла хранения клеток CD34+, необходимо применять и устанавливать расходные материалы, представленные в виде одноразового комплекта для культивирования клеток.

Настоящее изобретение относится также к комплекту для культивирования клеток, предпочтительно стерильного и одноразового, для работы с автоматом по культивированию клеток. Его отличительной особенностью является наличие по меньшей мере одного мешочка для выращивания клеток и соединительных гибких трубки для подключения к другим мешочкам или резервуарам, предварительно собранным трубкам и мешочку для выращивания клеток, а также мешочка для выращивания клеток с одним входным отверстием, одним выходным отверстием и при необходимости одним отверстием для забора проб.

Комплект может дополнительно содержать все необходимые детали для соединения трубок между собой и с мешочками и/или резервуарами, а также средства, подключенные к третьему отверстию мешочка для выращивания клеток для забора проб клеток при необходимости. Все эти элементы могут входить в состав вышеупомянутого предварительно собранного модуля.

Предпочтительно, входное отверстие мешочка для выращивания клеток подсоединено с помощью трубок к входному и выходному отверстию мешочка с факторами роста, и входным и выходным отверстиям мешочка с культивируемыми клетками. Входное отверстие мешочка для выращивания клеток дополнительно должно быть подключено к выходному отверстию мешочка для выращивания клеток.

Комплект может дополнительно включать в себя два мешочка, образующих воздухосборники, из которых один мешочек подсоединен к выходным отверстиям мешочков факторов роста и культивирования клеток, а другой подсоединен к входному отверстию мешочка для расширения клеток.

Комплект может также включать в себя один или два мешочка для сбора клеток после культивирования, которые соединены с помощью трубок с выходным отверстием мешочка для выращивания клеток.

В варианте реализации изобретения мешочки с факторами роста, мешочки для культивирования клеток и мешочки, формирующие воздухоуловитель, имеют внутренний объем приблизительно 150 мл, мешочек для выращивания клеток имеет теоретический объем примерно 3000 мл, и каждый из двух мешочков 10 для сбора имеет объем около 600 мл. Мешочек для переноса культуральной среды может иметь объем около 1000 мл.

Предпочтительно, комплект образует и представляет собой закрытую систему для культивирования клеток, которая после установки оснащена требуемыми ресурсами, необходимыми для выполнения культивирования без необходимости добавления какого-либо продукта или какого-либо вмешательства оператора. Это позволяет ограничить риски заражения комплекта и культуральной среды.

Кроме того, изобретение относится к опорному средству для взбалтывания автомата для культивирования клеток, его отличительной особенностью является наличие опорной подставки для мешочка для выращивания клеток. На этой подставке расположены три клапана, которые устанавливаются с возможностью поворота вокруг первой горизонтальной оси для наклона подставки из по существу горизонтального положения в по существу вертикальное, и вокруг второй горизонтальной оси, вокруг которой пластина должна вибрировать для взбалтывания и гомогенизации содержимого мешочка для выращивания клеток. Средство также включает в себя средства управления наклоном подставки вокруг указанных горизонтальных осей.

Средство может быть оснащено вертикальным рычагом, на верхнем конце которого размещено приспособление для подвешивания мешочка, образующего воздухоуловитель.

Изобретение также относится к автоматизированному способу культивирования клеток, с использованием автомата, как описано выше, который отличается тем, что включает следующие этапы:

а) подача культуральной среды, факторов роста и культивируемых клеток в мешочек для выращивания клеток, камера инкубатора остается закрытой;

б) взбалтывание мешочка для выращивания клеток для гомогенизации его содержимого;

в) сохранение мешочка для выращивания клеток в условиях инкубации в течение множества дней; и

г) сбор содержимого мешочка для выращивания клеток в средства для хранения, камера инкубатора остается закрытой.

Способ в соответствии с изобретением может включать один или несколько этапов:

- до этапа а), этап установки предварительно собранного модуля с расположением мешочка для выращивания клеток на средство для взбалтывания, путем установки трубопроводов в средства для прохода в инкубаторе и клапаны и соединения этих трубопроводов с резервуарами или мешочками;

- до этапа а), этап удаления воздуха, содержащегося в трубопроводах, при прохождении культуральной среды из резервуара с культуральной средой в мешочек или мешочки, образующие воздухоуловитель;

- после подачи в мешочек для выращивания клеток факторов роста на этапе а), этап промывки резервуара с факторами роста перемещением культуральной среды в этом резервуаре с последующим сливом содержимого в мешочек для выращивания клеток;

- после подачи в мешочек для выращивания клеток на этапе а), этап промывки резервуара с культивируемыми клетками перемещением культуральной среды в этом резервуаре с последующим сливом содержимого в мешочек для выращивания клеток;

- на этапе в), один или более этапов забора проб содержимого мешочка для выращивания клеток, каждому из которых предшествует этап наклона опорной подставки из горизонтального положения емкости с клеточной культурой до наклонного положения, в котором отверстие в мешочке для забора проб находиться в самой низкой точке;

- до этапа в), этап удаления резервуаров с культуральной средой, факторами роста и культивируемыми клетками путем обрезания и спаивания или пережимания трубопроводов или трубок этих резервуаров, соединенных с входным отверстием мешочка для выращивания клеток;

- до или во время этапа г), наклон подставки по существу в вертикальное положение, в котором выходное отверстие мешочка для выращивания клеток находится в самой низкой точке.

Наконец, изобретение относится к применению автомата, комплекта или средства для культивирования стволовых клеток типа CD34+ или мононуклеарных клеток крови, таких как, например, лимфоциты. Стволовые клетки могут быть получены из одного или множества источников, таких как, например, пуповинная кровь, костный мозг и цельная кровь.

Настоящее изобретение, его характерные особенности и преимущества будут более понятны после прочтения последующего описания некоторых примеров и изучения прилагаемых чертежей:

- фиг. 1 и 2 представляют собой схематическое изображение автомата по культивированию клеток в соответствии с изобретением в перспективе. Этот автомат состоит из шкафа, образующего корпус, представленный в закрытом виде на фиг. 1 и открытом виде на фиг. 2;

фиг. 3 - схематическое изображение автомата, представленного на фиг. 1 и 2, без компьютерной системы;

фиг. 4 - схематическое изображение компонентов, размещенных в средстве для взбалтывания в автомате, представленном на фиг. 1 и 2;

фиг. 5 - схематическое изображение комплекта для культивирования клеток в соответствии с изобретением;

фиг. 6 - схематическое изображение в перспективе приспособлений для прокладки трубопроводов с жидкостью в автомате, представленном на фиг. 1 и 2;

фиг. 7 - схематическое изображение в перспективе средства для взбалтывания в соответствии с настоящим изобретением;

фиг. 8 и 9 - схематическое изображение в перспективе средства, представленного на фиг. 7, с изображением двух разных положений наклона подставки данного средства;

фиг. 10 представляет собой еще одно схематическое изображение в перспективе средства для взбалтывания, представленного на фиг. 7, частично в разрезе обшивки средства;

фиг. 11 - схематическое изображение в перспективе подставки и средств управления наклоном подставки средства, представленного на фиг. 7, вид снизу;

фиг. 12 и 13 представляют собой схематическое изображение в перспективе управляемой системы блокировки поворота подставки средства, изображенного на фиг. 7. Эта система блокировки в рабочем состоянии изображена на фиг. 11, в нерабочем - на фиг. 12;

фиг. 14 представляет собой блок-схему, показывающую этапы способа культивирования клеток в соответствии с изобретением; и

фиг. 15-24 представляют собой изображения, соответствующие фиг. 3, и представляют этапы способа в соответствии с изобретением.

Обратимся сначала к фиг. 1 и 2, представляющим вариант реализации автомата 10 для культивирования клеток согласно изобретению. При этом этот автомат предназначен, в частности, но не исключительно, для культивирования стволовых клеток, например, в соответствии с биологическим протоколом, описанным в заявке US-A1-2008/0118977, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки.

В представленном примере автомат 10, главным образом, содержит три элемента:

- инкубатор 12 с термостатической камерой 14, в которой расположено опорное средство 16 для взбалтывания мешочка для выращивания клеток (не показано),

- корпус 18 для поддержки мешочков (не показаны) для среды, необходимой для культивирования клеток, на которой расположены средства (клапаны 20, насос 22 и т.д.) распределения и управления расходом текучих сред между мешочками, и

- компьютерную систему 24, подключенную к инкубатору 12 и средствам 20, 22 для управления ими, а также для ввода и регистрации данных и управления биологическим протоколом.

В представленном примере инкубатор 12, корпус 18 и компьютерная система 24 расположены рядом друг с другом на опоре 26, которая установлена на колесах, при этом корпус 18 расположен между компьютерной системой 24 и инкубатором 12.

Как правило, компьютерная система 24 включает в себя средства для ввода и регистрации данных, средства обработки данных, средства отображения и средства передачи сигналов управления и регулирования инкубатора 12 и средств 20, 22 корпуса 18. Предпочтительно, компьютерная система 24 включает в себя дисплей с сенсорным экраном для отображения и ввода данных.

Для ограничения доступа к предварительно записанным данным в компьютерной системе 24 может быть установлено несколько уровней безопасности.

Производитель автомата может иметь право полного доступа ко всей информации, хранящейся в компьютерной системе 24, посредством ввода специального пароля, в то время как администратор и оператор с ограниченным уровнем доступа при использовании специального пароля будут иметь доступ только к определенной информации.

Компьютерная система 24 предпочтительно подключена к компьютерной сети с помощью соединения типа Ethernet или Wi-Fi, например так, что информация в системе 24 может быть доступна с компьютерного терминала сети, удаленного от автомата 10, при необходимости такой терминал может быть использован для выполнения операция и управления автоматом.

Компьютерная система 24 управляет, например, открытием и закрытием клапанов 20, которые могут быть оснащены релейной системой регулирования, регулированием подачи насоса 22, регулированием нагрева камеры 14 инкубатора 12 (например, для поддержания температуры на уровне около 37°С) и подачей газа, такого как СО₂ (в объеме около 5%, например). При необходимости система 24 может обеспечить регулирование других параметров внутри камеры 12 для определения оптимальных условий окружающей среды для культивирования клеток.

Для большей ясности, средства подключения компьютерной системы 24 к средствам 18 и 20 в инкубаторе 12, нагревательные средства и средства газоснабжения инкубатора 12, а также средства электроснабжения не представлены на чертежах.

Корпус 18 имеет форму параллелепипеда и включает в себя вертикальную переднюю панель 28, на которой схематично изображены прямоугольники 30, представляющие положения резервуаров с биологическими материалами в виде мешочков, а также линии 32, представляющие местоположение трубопроводов с текучей средой (текучими средами) между этими мешочками.

Верхняя часть этой панели 28 включает в себя четыре нарисованных прямоугольника 30, которые предоставляют оператору информацию о виде каждого из мешочков, которые необходимо расположить на уровне этих прямоугольников. Такие мешочки относятся к комплекту расходных материалов, который более подробно будет описан ниже.

Первый прямоугольник больших размеров изображен сверху слева от передней панели 28 корпуса 18 и обозначает расположение мешочка с культуральной средой (ссылка на мешочек 34 на фиг. 3). Три прямоугольника 30 меньших размеров изображены в верхней правой части панели 28 и соответственно обозначают расположения мешочка с факторами роста, мешочка с культивируемыми клетками, и мешочка, образующего воздухоуловитель (ссылки 36, 38 и 40 на фиг. 3).

Средняя часть передней панели 28 корпуса 18 включает в себя монтажные отверстия для вышеуказанных клапанов 20 и насоса 22, каждый из этих элементов (клапаны и насос) расположен на линии 32, представляющей трубопровод для текучих сред, образованный гибкой трубкой из комплекта расходных материалов.

В нижней части передней панели 28 рядом друг с другом расположены две копланарные пластины 42. Нижние грани пластин 42 установлены на шарнирах, вращающихся вокруг горизонтальной оси, проходящей параллельно передней панели 28. Пластины 42 могут перемещаться вокруг этой оси из вертикального положения (как показано на фиг. 1 и 2), в котором они расположены параллельно и на небольшом расстоянии от передней панели 28, в горизонтальное, в котором они могут опираться на опору 26.

Прямоугольники 44 изображены на передней стороне панелей 42, когда они находятся в вертикальном положении. Прямоугольники 44 предоставляют оператору информацию о виде мешочков, которые необходимо расположить на панелях. Мешочки для сбора и хранения клеток после культивирования (ссылка 46 на фиг. 3) необходимо размещать на панелях 42.

Мешочки 34, 36, 38, 40 и 46 комплекта расходных материалов должны быть зафиксированы или прикреплены к передней панели 28 корпуса 18 и панелям 42 с помощью соответствующих приспособлений, которые не показаны.

Инкубатор 12 содержит шкаф с двумя герметично закрывающимися дверцами, образующего камеру 14. Обе дверцы 48, 50 установлены на шарнире на одной из сторон проема, например, с правой стороны.

Внутренняя дверь 48 - стеклянная, в закрытом положении она должна опираться на периферийный шарнир 52 проема шкафа. Этот шарнир 52 представлен на фиг. 6. Наружная дверь 50 изолирована и имеет периферийный шарнир для опоры на внешний край проема шкафа.

Компьютерная система 24 может быть подключена к датчикам положения (открытого или закрытого) каждой дверцы 48, 50 и может управлять блокировкой этих дверей, в частности, во время фазы инкубации и культивирования клеток.

Внутренний объем камеры 14 в инкубаторе 12 может составлять, например, около 200 л.

В примере, представленном на фиг. 3-5, комплект расходных материалов является одноразовым и включает в себя мешочки 34, 36, 38, 40 и 46 и вышеуказанные трубки, а также мешочек для выращивания клеток 54 и второй мешочек 56, образующий воздухоуловитель. Эти мешочки 54, 56 расположены на средстве для взбалтывания 16, которое будет описано более подробно ниже со ссылками на фиг. 7-13.

Мешочек для выращивания клеток 54, лучше всего представленный на фиг. 4 и 5, может иметь внутренний объем свыше 500 мл (например, 650 мл), и иметь три отверстия: одно отверстие для забора проб 58 соединено посредством трубок 60 со средствами для забора проб 62, выходное отверстие 64 соединено трубой 66 с мешочками 46 для сбора клеток после культивирования, и входное отверстие 68, соединено трубками с мешочками 34, 36, 38 и 56.

Входное отверстие 68 мешочка для выращивания клеток соединено при помощи трубки 70 с входным отверстием 34 мешочка с культуральной средой. Каждый из мешочков 36 и 38 с факторами роста и культивируемыми клетками имеют по входному отверстию, которое соединено с одним концом трубки 72, другой конец которой соединен с трубкой 70, (ниже точек соединения трубок 72 к трубке 70). Мешочек 40 имеет два отверстия, которые присоединены при помощи трубок 76 к трубкам 74, а мешочек 56, образующий воздухоуловитель, имеет отверстие, соединенное с помощью трубки 78 к трубке 70 вблизи входного отверстия 68 мешочка 54 (фиг. 4. 5).

Мешочек для выращивания клеток 54 и трубки 60, 66, 70, 72, 74, 76 и 78, предпочтительно, предварительно собраны и поставляются стерильными. Мешочки 34, 36, 38, 40, 46 и 56 также поставляются стерильными. Мешочки 40, 46 и 56, поставляются пустыми и могут быть предварительно собраны с мешочком для выращивания клеток 54 с помощью вышеупомянутых трубок. Мешочек 38 с культивируемыми клетками также поставляется пустым и может быть предварительно собран с трубками или соединен с трубками во время установки комплекта в автомате. Мешочек 38 может быть заполнен средой, содержащей клетки для культивирования, до или после установки комплекта в автомат. Мешочки 34 и 36 предпочтительно поставляются заполненными, соответственно, культуральной средой и факторами роста.

Вся трубопроводная арматура и трубки для мешочков, а также 2 средства для забора проб, также предпочтительно являются частью предварительно собранного модуля, который схематично представлен на фиг. 5, мешочки 34, 36 и 38, которые не обязательно являются частью этого модуля, представлены пунктирными линиями.

Объем мешочков 36, 38, 40 и 56 составляет около 150 мл, мешочка 46 - около 600 мл, а мешочка 34 с культуральной средой - около 1000 мл.

В случае если автомат 10 используется для культивирования стволовых клеток CD34+, мешочек 38 наполнен клетками этого типа, взятыми из организма пациента, которые при необходимости выделены и очищены. При этом факторами роста в мешочке 36 являются цитокины.

Мешочек для выращивания клеток 54 и мешочек 56, образующий воздухоуловитель, расположены на средстве для взбалтывания 16, и размещаются в камере 14 инкубатора 12 (фиг. 3). Другие мешочки 34, 36, 38, 40 и 46 и средства для забора проб 62 расположены за пределами камеры 14. Соединительные элементы трубок 60, 66 и 70 мешочка для выращивания клеток 54 с элементами, расположенными за пределами камеры 14, проведены через элемент инкубатора, что обеспечивает герметичное закрытие камеры 14. Этот элемент представлен на фиг. 3 и 6.

Этот элемент является деталью стенки и состоит из блока 80 из материала (например, пластик), который закреплен на внешнем краю проема шкафа инкубатора 12, и имеет три параллельных канавки 82 для вставки (т.е. размещения в них) и прохождения вышеуказанных трубок 60, 66, 70. Эти канавки 82 по существу прямые и расположены на некотором расстоянии друг от друга. Блок 80 имеет, как правило, плоскую форму и располагается вертикально. Он включает в себя заднюю панель, опирающуюся на внешний край проема шкафа, и переднюю панель, на которой образованы канавки 82, которые имеют по существу горизонтальное направление и тянутся поперек блока.

Канавки 82 имеют по существу круглое поперечное сечение и внутренний диаметр, который немного больше диаметра трубок 60, 66, 70. Эти трубки должны быть полностью проведены через канавки и в прорези 84 периферийного шарнира 52, который расположен по борту проема шкафа.

В закрытом положении термостатической камеры 14, внешний край внутренней двери 48 опирается на шарнир 52 и покрывает детали штуцера (трубки) 60, 66, 70 проходящие чрез вышеупомянутый разъем шарнира 52, а внешний шарнир наружной двери 50 опирается на переднюю панель перед блоком и покрывает канавки 82 и детали штуцера (трубки) 60, 66, 70, проходящие через эти канавки.

В данном примере нижняя канавка блока 80 образует проход для системы трубок 66, соединяющей мешочек для выращивания 54 клеток с мешочками для сбора клеток 62, верхняя канавка образует проход для системы трубок 70, соединяющей мешочек 70 с мешочками 34, 36, 38 и 40.

Как показано на фиг. 3, трубка 70 связана с насосом 22, соединяющим мешочек 34 с культуральной средой, этот перистальтический насос необходим для исключения возможности заражения этой среды.

Вышеупомянутые клапаны 20 имеют электрический привод, в количестве 12 шт. они представлены на фиг. 3 под номерами 86-108.

Трубки 60, 66, 70 и 78 соединены с электроклапанами 86, 88, 90 и 92, которые расположены в средстве для взбалтывания 16 (фиг. 3 и 4).

Часть трубки 70, расположенной вне термостатической камеры 14, соединена с двумя клапанами 94 и 96, находящимися на расстоянии друг от друга, из которых один находится недалеко от мешочка с культуральной средой 34. Другой клапан 96 находится в конце соединения трубки 70 с трубками 72 и в начале соединения трубки 70 и с трубками 74.

Трубки 72 соединены с входными отверстиями мешочков 36 и 38, которые соответственно соединены с клапанами 98 и 100; трубки 74 соединены с выходными отверстиями мешочков 36 и 38, которые, в свою очередь, соединены с клапанами 102 и 104.

Трубки 76 от мешочка 40, образующего воздухоуловитель, соединены с клапанами 106 и 108.

Насос 22 и клапаны предпочтительно имеют поперечную канавку для монтажа системы трубок посредством ее перемещения перпендикулярно продольной оси трубки или канавки.

Согласно изображению на фиг. 3 и фиг. 2 мешочки 34, 36, 38, 40 и 56 и трубки 40, 72, 74, 76, 78 этих мешочков, ведущие к мешочку для выращивания клеток 54, находятся в верхней части этого мешочка, если он расположен горизонтально. Мешочки 46, средства для забора проб 62 и трубки 60, 66 этих мешочков с мешочком для выращивания клеток 54 находятся в нижней части этого мешочка 54, если он расположен горизонтально.

Мешочки 36, 38 и 56 расположены на той же горизонтальной плоскости, находящейся ниже горизонтальной плоскости, на которой расположены мешочки 34 и 40.

Комплект расходных материалов может быть установлен в автомате следующим образом. Двери 48, 50 инкубатора 12 открыты. Мешочки 34, 36, 38, 40, 46 закрепляются на корпус, а мешочек 56 закрепляется на рычаге средства для взбалтывания 16. Мешочек 54 помещается горизонтально на поверхность средства для взбалтывания 16. Трубка 70 подключается к клапанам 94, 96, а также к насосу 22, трубка 72 подключается к клапанам 98, 100, трубка 74 подключается к клапанам 102, 104, трубка 76 подключается к клапанам 106, 108. Трубки 66, 60, 70 и 78 подключаются соответственно к клапанам 86, 88, 90 и 92, находящимся в средстве 16, затем трубки 66, 60, 70 прокладываются соответственно в канавках 82 блока 80. Трубки подключаются к мешочкам, которые не были предварительно собраны с трубками, после чего двери 48, 50 инкубатора 12 закрываются.

Рассмотрим фиг. 7-13, на которых изображен способ реализации средства для взбалтывания 16 согласно изобретению.

Средство для взбалтывания 16 включает в себя подставку для поддержания мешочка для выращивания клеток 54 (не представлен на фиг. 7-13). Эта подставка устанавливается с возможностью поворота относительно первой горизонтальной оси А для перемещения подставки из горизонтального положения, представленного на фиг. 7 и 11, в по существу вертикальное положение, представленное на фиг. 8 и 10 (подставка 110 может принимать любые положения в рамках указанного диапазона, 30 например, в положении, представленном на фиг. 9, в котором он наклонен приблизительно под углом 45 градусов, по отношению к горизонтальной плоскости), и относительно второй горизонтальной оси В, вокруг которой подставка 110 должна поворачиваться (в пределах угла приблизительно +/- 8 градусов) для взбалтывания и гомогенизации содержимого мешочка для выращивания клеток.

Подставка 110 имеет прямоугольную форму, он немного больше мешочка 54 для выращивания клеток (на 40 см в длину и на 22 см в ширину), который устанавливается горизонтально на подставку. Подставка 110 состоит из наружной кромки 112, удерживающей мешочек, и перфорирована таким образом, чтобы поверхность мешочка 54, опирающаяся на подставку, по крайней мере, частично подвергалась воздействию условий среды, существующих в камере 14 инкубатора 12.

Подставка 110 имеет на одном из краев, соответствующим меньшим сторонам подставки, крючок 114 для фиксации мешочка для выращивания клеток 54. Этот крючок является самой высокой точкой средства 16, если подставка находится в вертикальном положении (фиг. 8). На противоположной от крючка 114 стороне подставка 110 имеет три отверстия для установки вышеуказанных клапанов 86, 88, 90.

Средство состоит из U-образной детали 116, свободные концы двух боковин которого закреплены посредством шарниров 118 на боковых краях подставки 110, на котором расположены клапаны 86, 88, 90. Шарниры 118 лежат на одной прямой и определяют главную описанную выше ось А поворота подставки 110.

Ветви U-образной детали 116 соединены посередине с рамой 122 средства 16 посредством шарниров 120, которые расположены по прямой и определяют вышеуказанную ось В поворота подставки 110.

Когда подставка 110 расположена горизонтально (фиг. 7), U-образная деталь 116 проходит вдоль трех сторон подставки, а именно вдоль самых длинных сторон и короткой стороны, где находится крючок 114.

Перемещение подставки 110 вокруг оси А обеспечивается приводом 124, расположенным между ветвей U-образной детали 116, цилиндр которого закреплен посередине этой детали 116, поршневой шток закреплен на краю подставки, на котором расположены клапаны 86, 88 и 90.

Как видно на фиг. 10 и 11, поршневой шток привода 124 шарнирно закреплен на оси с помощью скобы 121, закрепленной на краю подставки 110, на котором расположены клапаны, при этом ось по существу горизонтальна. Цилиндр привода 124, шарнирно закреплен на по существу горизонтальной оси, расположенной на первой скобе 123, которая, в свою очередь, шарнирно закреплена на по существу вертикальной оси, расположенной на второй скобе 125. Вторая скоба закреплена на средней части детали 116, по существу, посередине.

Когда поршневой шток привода 124 находится в выдвинутом положении, подставка находится по существу в горизонтальном положении, как показано на фиг. 7 и 11. Когда поршневой шток привода 124 находится в полностью задвинутом положении, подставка находится по существу в вертикальном положении, как показано на фиг. 8 и 10. В случае фиг. 9, поршневой шток привода 124 находится в частично задвинутом или выдвинутом положении.

Движение подставки вокруг оси В осуществляется посредством электрического двигателя 126, передаточный вал которого передает движение ведомому зубчатому колесу одного из шарниров 120, находящихся на U-образной детали 116 с помощью приводного ремня 127 (фиг. 10). Двигатель 126 установлен на раме 122 средства с помощью соответствующих средств.

Как представлено на фиг. 12 и 13, на раме 122 средства для взбалтывания 16 расположена система 129 блокировки поворота подставки 110 вокруг оси В, эта система 129 имеет выдвижной штифт 131, который взаимодействует с элементом 133, находящимся на U-образной детали 116, блокируя движение подставки.

Штифт 131 может перемещаться из выдвинутого положения, как представлено на фиг. 12, в задвинутое положение, как представлено на фиг. 13, перемещением этого штифта управляет компьютерная система 24.

Элемент 133, находящийся на U-образной детали 116, имеет вытянутую форму, первый конец жестко крепится к одному из шарниров 120 детали, второй конец имеет выемку для штифта 131 блокировки поворота подставки 110 вокруг оси В. Когда штифт выдвинут (фиг. 12), боковые поверхности в пазе элемента 133 упираются в штифт, препятствуя тем самым любому вращению подставки вокруг оси В. Когда штифт находится в задвинутом положении (фиг. 13), элемент 116 и подставка 110 могут вращаться вокруг оси В.

Блокировка поворота подставки 110 вокруг оси В может быть осуществлена посредством компьютерной системы 24, в случае если подставка перемещается вокруг оси А в наклонное или вертикальное положения для забора проб и сбора клеток из мешочка для выращивания клеток 54, во избежание поворота подставки вокруг оси В с учетом нагрузки, создаваемой с одной стороны под действием веса мешочка для выращивания клеток.

Средство для взбалтывания 16 также имеет вертикальный рычаг 128 для крепления вышеуказанного клапана 92 и крепления мешочка 56, образующего воздухоуловитель. Клапан 92 расположен по существу посередине рычага 128, верхний конец рычага 130 оснащен крючком для крепления мешочка 56 (фиг. 7-9).

Средство 16 также оснащено датчиками 132 положения подставки 110 относительно осей А и/или В, которые установлены на раме 122.

На фиг. 14 представлена схема с указанием этапов способа в соответствии с изобретением.

Первый этап способа 130 заключается в вводе и сохранении посредством компьютерной системы 24 параметров культуры согласно биологическому протоколу. Ввод производится оператором, вводятся такие параметры, как личные данные пациента, информация о расходных материалах, объем мешочка для выращивания клеток 54 и т.д. Для упрощения ввода этих параметров, компьютерная система 24 может быть оборудована системой для считывания штрихкодов, поскольку комплект расходных материалов может быть оснащен штрихкодом, передающим напрямую компьютерной системе 24 информацию о номере и виде комплекта, а также объеме мешочка.

Способ включает второй этап 132 установки комплекта расходных материалов в автомат 10, как описано выше. Установка может управляться и контролироваться компьютерной системой 24. Установка может быть осуществлена в несколько подэтапов. В компьютерной системе 24 для оператора отображается инструкция по установке, с запросом подтвердить или отклонить реализацию подэтапа и переход к следующему подэтапу. Эти подэтапы могут быть следующими:

- установка различных мешочков на корпус 18 и в камеру 14 инкубатора 12,

- установка трубок 70 мешочка 34 с культуральной средой в клапаны 94, 96 (компьютерная система 24 управляет открытием клапанов 94, 96, которые закрываются после подтверждения данного подэтапа оператором),

- установка трубок 72, 74, 76 мешочка с факторами роста 36 и мешочка 40, образующего воздухоуловитель, в клапаны 98, 102 и 106 (компьютерная система 24 управляет открытием клапанов, которые закрываются после подтверждения данного подэтапа оператором),

- установка трубок 72, 74, 76 мешочка для культивирования клеток 38 в клапаны и мешочка 40, образующего воздухоуловитель, в клапаны 100, 104, 108 (компьютерная система 24 управляет открытием клапанов, которые закрываются после подтверждения этого подэтапа оператором),

- установка трубки 78 мешочка 56, образующего воздухоуловитель, в клапан 92 (компьютерная система 24 управляет открытием клапана, который закрывается после подтверждения данного подэтапа оператором), и

- последовательная установка трубок 70, 60, 66 в клапаны 90, 88, 86 (компьютерная система 24 управляет последовательным открытием каждого из клапанов, которые закрываются после подтверждения данного подэтапа оператором).

Способ в соответствии с изобретением содержит третий этап 134 теста, так называемый «автотест», во время которого компьютерная система 24 контролирует исправность работы клапанов и средств наклона (привод 124 и двигатель 126) подставки 110 средства для взбалтывания 16. Исправность инкубатора 12 может быть по умолчанию проверена при инициализации биологического протокола. Последний может быть инициализирован только тогда, когда, например, температура и уровень СО₂ в термостатической камере стабилизированы в соответствии с установками инкубатора.

Способ в соответствии с изобретением содержит еще один этап 136 распределения текучих сред, который включает несколько подэтапов и представлен на фиг. 15-19.

Первый подэтап этапа 136 подачи схематически представлен на фиг. 15 и заключается в удалении воздуха из трубок 70, 72, 74. Для этого клапаны 94, 96, 106 и 108 открываются, и насос 22 приводится в действие с помощью компьютерной системы 24 для циркуляции культуральной среды из мешочка 34 через трубки 70, 72, 74 в мешочек 40, образующий воздухоуловитель. Затем трубки 70, 72, 74 заполняются культуральной средой, мешочек 40 заполняется культуральной средой по меньшей мере частично. Насос 22 работает с предварительно установленной производительностью и в течение установленного времени, по истечении которого насос прекращает работу и клапаны 94, 96 и 106 закрываются.

Второй подэтап этапа подачи 136 представлен на фиг. 16 и заключается в удалении воздуха из трубок 70 и 78. Для этого клапаны 94, 96, и 92 открываются, и насос 22 приводится в движение с помощью компьютерной системы для циркуляции культуральной среды из мешочка 34 через трубки 70, 78 в мешочек 56, образующий воздухоуловитель. Затем трубка 78 заполняется культуральной средой, и мешочек 56 по меньшей мере частично заполняется культуральной средой.

Насос 22 работает с предварительно установленной производительностью и в течение установленного времени, по истечении которого насос прекращает работу, и клапаны 94, 96 и 92 закрываются.

Третий подэтап этапа подачи 136 представлен на фиг. 17 и заключается в загрузке культуральной среды в мешочек для выращивания клеток 54. Клапаны 94, 96, и 90 открываются, и насос 22 приводится в движение с помощью компьютерной системы для циркуляции культуральной среды из мешочка 34 в мешочек 54. При этом мешочек 54 заполняется культуральной средой. Насос 22 работает с предварительно установленной производительностью и в течение установленного времени согласно параметрам биологического протокола, указывающим количество культуральной среды, которую необходимо загрузить в мешочек 54, а также скорость ее подачи. Затем насос 22 останавливается, и клапаны 94, 96, 90 закрываются.

Четвертый подэтап этапа подачи 136 представлен на фиг. 18 и заключается в загрузке в мешочек для выращивания клеток 54 факторов роста, затем мешочек 36 с факторами роста промывается культуральной средой, и содержимое мешочка 36 перемещается в мешочек для выращивания клеток 54. Сначала клапаны 104 и 90 открываются таким образом, что среда, содержащая факторы роста, перетекает под действием силы тяжести из мешочка 36 в мешочек 54, циркулируя по трубкам 74 и 70 (стрелка 138). Мешочек 54 наполняется факторами роста. Клапаны 104 и 90 открыты в течение времени, определенного в соответствии с объемом среды, содержащей факторы роста, которую нужно перенести в мешочек 54. По истечении этого времени клапаны 104 и 90 закрываются. Затем клапаны 94 и 100 открываются, и насос 22 приводится в действие (в соответствии с заданной подачей и продолжительностью) для наполнения мешочка 36 культуральной средой с целью его промывки. Клапаны 94 и 100 остаются закрытыми, а клапаны 104 и 90 открываются снова для того, чтобы продукты промывания, находящиеся в мешочке 36, перетекли под действием силы тяжести в мешочек для выращивания клеток 54. Клапаны 104 и 90 остаются открытыми в течение заранее определенного времени, в зависимости от объема продуктов промывания, необходимого для подачи в мешочек 54. По окончании этого времени клапаны 104 и 90 снова закрываются. Этапы промывания мешочка 36 и удаления продуктов промывания в мешочек для выращивания клеток 54 могут повторяться один или несколько раз, в зависимости от параметров биологического протокола, чтобы, например, все факторы роста, первоначально находящиеся в мешочке 36, были перенесены в мешочек 54.

Пятый подэтап этапа подачи 136 представлен на фиг. 19 и заключается в загрузке в мешочек для выращивания клеток 54 культивируемых клеток, в промывке мешочка 38, содержащего эти клетки с культуральной средой, и переносе содержимого этого мешочка 38 в мешочек для выращивания клеток 54, аналогично тому, как это было выполнено во время четвертого подэтапа. Сначала клапаны 102 и 90 открываются таким образом, что среда, содержащая клетки для культивирования, перетекает под действием силы тяжести из мешочка 38 в мешочек 54, циркулируя по трубкам 74 и 70 (стрелка 140). Мешочек 54 наполняется культивируемыми клетками. Клапаны 102 и 90 затем закрываются, и открываются клапаны 94 и 98, запускается насос 22 (в соответствии с заданной производительностью и продолжительностью) для наполнения мешочка 38 культуральной средой с целью его промывания. Клапаны 94 и 98 закрываются, а клапаны 102 и 90 открываются снова, чтобы продукты промывания, находящиеся в мешочке 38, были перенесены под действием силы тяжести в мешочек для выращивания клеток 54. После этого клапаны 102 и 90 снова закрываются. Данные этапы промывания мешочка 38 и удаления продуктов промывания в мешочек для выращивания клеток 54 могут повторяться один или несколько раз, в зависимости от параметров биологического протокола, например, для того, чтобы все факторы роста, первоначально находящиеся в мешочке 38, были перенесены в мешочек 54.

За этапом подачи 136 способа может следовать этап гомогенизации содержимого мешочка для выращивания клеток 54, которой схематически представлен на фиг. 20. Во время этого этапа, компьютерная система 24 приводит в действие средство для взбалтывания таким образом, что подставка 110 вращается вокруг оси В, как было объяснено выше (стрелка 142). Амплитуда, частота, длительность и периоды (взбалтывание, покой, взбалтывание и т.д.) таких вибраций определяются в соответствии с параметрами биологического протокола.

Способ в соответствии с изобретением включает инкубационный этап, который может длиться в течение множества дней или, например, десятков дней. Периодически, в соответствии с параметрами биологического протокола, содержимое мешочка для выращивания клеток может быть гомогенизировано посредством поворота подставки вокруг оси В, как указано выше. Данная гомогенизация (периоды, частота, амплитуда) определяется в соответствии с параметрами протокола независимо от этапа гомогенизации, следующего за этапом подачи 136.

В течение этапа инкубации 144 оператор может взять одну или несколько проб 146 из мешочка для выращивания клеток 54 (фиг. 14 и 22). Некоторые из этих проб могут быть рекомендованы компьютерной системой. Например, обязательными могут оказаться три пробы, которые должны быть выполнены сразу после этапа подачи, через три дня после начала инкубационного периода 144, и через семь дней после начала этого этапа 144. Другие пробы могут быть взяты по желанию оператора, компьютерная система может предложить оператору взять эти пробы опционально.

После подтверждения оператора о готовности взятия пробы в компьютерной системе 24, активируется привод 124, перемещая подставку 110 средства для взбалтывания 16, вокруг оси А, наклоняясь приблизительно на 45° относительно горизонтальной плоскости, как это схематически представлено на фиг. 9 и 22. Компьютерная система 24 может определить правильное положение подставки 110 посредством датчиков положения средства 16. Компьютерная система 24 управляет открытием клапана 88 таким образом, что часть содержимого мешочка для выращивания клеток 54 перетекает под действием силы тяжести из мешочка 54 через трубку 60 в одно из средств забора проб 62, находящихся вне камеры 14 инкубатора 12. Оператор может взять пробу образца из мешочка для выращивания клеток 54 посредством шприца 148, имеющего разъем типа «Замок Люэра», который вводится в средства для забора проб 62. После забора пробы клапан 88 закрывается, и подставка 110 средства для взбалтывания 16 возвращается в по существу горизонтальное положение.

Оператор может провести анализы взятого образца, результаты 148 которых могут быть занесены и сохранены в компьютерной системе 24.

Во время этапа инкубации 144 оператор может также извлечь часть комплекта расходных материалов (первый этап извлечения 150 расходных материалов - фиг. 14 и 21). Элементами комплекта расходных материалов, которые могут быть извлечены, являются все мешочки (34, 36, 38, 40) и все трубки (72, 74, 76), соединенные с трубкой 70. Для этого оператор должен обрезать трубку 70 выше места прохождения через вышеупомянутый блок 80 и должен одновременно сжать или заклеить свободный конец обрезанной трубки 70, оставшейся в камере 14 инкубатора 12, во избежание заражения мешочка для выращивания клеток. Данная операция может быть выполнена оператором посредством щипцов-кусачек, герметизирующих конец трубки при отрезании. Клапаны 94 и 108 затем открываются, чтобы дать возможность оператору вытащить трубки 70, 72, 74, 76, а также насос (фиг. 21). Как только оператор подтверждает операцию по извлечению этих элементов в компьютерной системе, последняя дает команду на закрытие клапанов 94 и 98.

Способ в соответствии с изобретением включает помимо этого этап отбора 152 клеток после культивирования (фиг. 14, 23 и 24). По окончании этапа инкубации 144 и по запросу оператора, компьютерная система 24 блокирует вращение подставки 110 вокруг оси В и приводит в действие привод 126, чтобы подставка 110 средства для взбалтывания перемещалась вокруг оси А до по существу вертикального положения, как показано на фиг. 8, 23 и 24. Компьютерная система 24 может определить правильное положение подставки 110 посредством датчиков положения средства для взбалтывания 16.

Компьютерная система 24 затем подает команду на открытие клапана 86 таким образом, чтобы часть содержимого мешочка для выращивания клеток 54 была перенесена под действием силы тяжести из мешочка 54 в два мешочка для сбора 46 через трубку 66 (фиг. 23).

Пластины 42, находящиеся на корпусе 18, на которых закрепляются мешочки для сбора 46, могут быть перемещены из вертикального положения, представленного на фиг. 2 и 23, в горизонтальное положение, представленное схематически на фиг. 24, либо оператором вручную, либо посредством средств перемещения, управляемых компьютерной системой 24. Наклон пластин 46 позволяет мешочкам 46 располагаться под мешочком 54, и по меньшей мере частью трубки 66 таким образом, чтобы содержимое мешочка для выращивания клеток 54, по возможности, переместилось в мешочек для сбора 46. Как только оператор подтверждает компьютерной системе, что взятие проб завершено, система дает команду на закрытие клапана 86 и запуск привода таким образом, чтобы подставка 110 вернулась в по существу горизонтальное положение.

Мешочки 46 затем удаляются из автомата 10 для возможной обработки клеток и повторного введения этих клеток в организм пациента, например, для клеточной терапии. Для этого трубка 66 может быть обрезана и запаяна вышеупомянутыми кусачками, или мешочки 46 отсоединяются от трубки 66.

Последний этап способа состоит из второго этапа извлечения 154 расходных материалов из автомата 10, при этом оставшиеся мешочки 54 и 56 и трубки 66, 60, 70 и 78 уже извлечены. С этой целью компьютерная система дает команду на открытие клапанов 86, 88, 90 и 92, чтобы оператор мог извлечь трубки 66, 60, 70 и 78. После того, как оператор подтвердил операцию по извлечению данных элементов, компьютерная система 24 дает команду на закрытие клапанов 86, 88, 90 и 92.

Как только биологический протокол завершен, компьютерная система может составить отчет о культивировании. Этот отчет может включать в себя следующую информацию для обеспечения отслеживаемости протокола: информация о производителе (идентификационный номер автомата, версия программного обеспечения компьютерной системы, версия программного обеспечения диспетчерского управления биологического протокола), все параметры протокола, если по крайней мере один из этих параметров не используется по умолчанию, все параметры культивирования, все действия, произведенные оператором (включая дату каждого действия в формате ггггммддЧччммсс), исполнитель этого действия, использующий специальный логин для подключения к системе, характер действия посредством кодирования для определения по умолчанию неоднозначной формулировки, "системные" происшествия (включая дату каждого происшествия в формате ггггммддЧччммсс, характер происшествия (аварийный сигнал, предупреждения пользователя, обнаружения неисправности и т.д.) посредством кодирования для определения по умолчанию неоднозначной формулировки, результаты анализа проб (содержащие дату взятия каждой пробы, имя исполнителя, результаты анализа пробы и т.д.) и информацию о трансплантации (исходя из анализа клеток, взятых после культивирования). Этот отчет можно просмотреть через компьютерный терминал вышеупомянутой сети.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложены автомат и автоматизированный способ культивирования клеток, стерильный одноразовый комплект для культивирования клеток в автомате, опорное средство для взбалтывания для автомата и применение вышеуказанных автомата, комплекта и средства для культивирования стволовых клеток типа CD34+ или мононуклеарных клеток крови, таких как лимфоциты. Автомат содержит резервуары с культуральной средой, факторами роста и культивируемыми клетками, инкубатор с термостатической камерой и мешочком для культивирования или выращивания клеток, компьютерную систему управления, опорное средство для взбалтывания емкости для культивирования или выращивания. Комплект содержит один мешочек для выращивания клеток и гибкие трубки для соединения мешочка с другими мешочками или резервуарами, причем мешочек имеет входное и выходное отверстия, а также отверстие для забора проб. Средство для взбалтывания имеет поддерживающую мешочек подставку, три клапана на подставке, причём средство выполнено с возможностью наклона подставки из горизонтального положения в вертикальное положение и вибрирования. Способ включает загрузку в мешочек культуральной среды, факторов роста и культивируемых клеток, взбалтывание мешочка, выдерживание мешочка для выращивания клеток в инкубационных условиях и сбор содержимого мешочка. Изобретения обеспечивают культивирование, размножение или выращивание клеток в улучшенных условиях стандартизации, мониторинга и контроля операций. 7 н. и 20 з.п. ф-лы, 24 ил.

1. Автомат для культивирования клеток, содержащий

резервуары с культуральной средой, факторами роста и культивируемыми клетками,

инкубатор с термостатической камерой, в которой расположена емкость для культивирования или выращивания клеток, и

компьютерную систему управления, включающую средства ввода и регистрации данных, предназначенную для управления условиями культивирования в камере и управления клапанами распределения текучих сред в определенной последовательности,

характеризующийся тем, что он содержит опорное средство для взбалтывания емкости для культивирования или выращивания клеток, управляемое указанной компьютерной системой и расположенное в камере, и тем, что

указанная емкость представляет собой мешочек с по меньшей мере одним входным отверстием, соединенным с указанными резервуарами, и одним выходным отверстием, соединенным со средствами для сбора и хранения клеток после культивирования,

причем указанные средства для сбора и хранения и резервуары расположены вне камеры и соединены с указанными отверстиями мешочка для выращивания клеток трубопроводами, которые вместе с указанным мешочком для выращивания клеток образуют предварительно собранный модуль, размещенный в указанной камере, и которые проведены через стенку указанной камеры таким образом, чтобы обеспечить возможность подачи культуральной среды, факторов роста и культивируемых клеток в указанный мешочек для выращивания клеток и сбора содержимого указанного мешочка для выращивания клеток в средства для сбора и хранения при закрытой камере,

причем опорное средство для взбалтывания имеет подставку для поддерживания мешочка для выращивания клеток, который установлен с возможностью поворота вокруг первой горизонтальной оси и который выполнен с возможностью перемещения вокруг этой оси между по существу горизонтальным положением при культивировании клеток и по существу вертикальным положением для сбора клеток после культивирования.

2. Автомат по п. 1, характеризующийся тем, что

указанный мешочек для выращивания клеток дополнительно содержит отверстие для забора проб, которое соединено трубопроводом со средствами для забора проб, расположенными вне указанной камеры,

при этом указанный трубопровод проходит через указанную стенку указанного инкубатора и является частью предварительно собранного модуля.

3. Автомат по п. 1 или 2, характеризующийся тем, что

указанный инкубатор содержит шкаф с проемом, который оборудован плотно закрываемой дверцей, средства для пропускания указанных трубопроводов, выполненные на наружной кромке указанного проема и имеющие по существу параллельные канавки, в которые вставляются указанные трубопроводы,

причем в закрытом положении указанная плотно закрываемая дверца покрывает указанные канавки.

4. Автомат по одному из пп. 1, 2, характеризующийся тем, что

резервуары с факторами роста и культивируемыми клетками образованы мешочками, которые расположены выше входного отверстия мешочка для выращивания клеток таким образом, что содержимое каждого мешочка с факторами роста и с культивируемыми клетками может перетекать под действием силы тяжести в мешочек для выращивания клеток.

5. Автомат по одному из пп. 1, 2, характеризующийся тем, что

указанные средства для сбора и хранения содержат один или два мешочка, которые по меньшей мере частично расположены ниже выходного отверстия мешочка для выращивания клеток таким образом, что содержимое указанного мешочка для выращивания клеток после культивирования может перетекать в указанный один или два мешочка средства для сбора и хранения под действием силы тяжести.

6. Автомат по одному из пп. 1, 2, характеризующийся тем, что указанный мешочек для выращивания клеток имеет эластичные стенки, не проницаемые для жидкости, но проницаемые для газа, такого как СО₂, и предпочтительно имеющие свойства, ограничивающие адгезию культивируемых клеток к стенкам мешочка.

7. Автомат по одному из пп. 1, 2, характеризующийся тем, что содержит перистальтический насос, управляющий подачей указанной культуральной среды в мешочек для выращивания клеток и указанные резервуары с факторами роста и культивируемыми клетками для промывки данных резервуаров.

8. Автомат по одному из пп. 1, 2, характеризующийся тем, что содержит два мешочка, образующих воздухоуловитель, причем один из них соединен с резервуарами с факторами роста и культивируемыми клетками, а другой соединен с указанным мешочком для выращивания клеток, причем указанные два мешочка предназначены для сбора и хранения воздуха, содержащегося в указанных трубопроводах, в указанном мешочке для выращивания клеток и/или указанных резервуарах.

9. Автомат по одному из пп. 1, 2, характеризующийся тем, что трубопроводы образованы гибкими трубками, некоторые из которых проходят через клапаны, которые предназначены в закрытом положении для зажима данных трубок.

10. Автомат по одному из пп. 1, 2, характеризующийся тем, что подставка установлена с возможностью поворота вокруг второй горизонтальной оси, вокруг которой подставка вибрирует для смешивания и гомогенизации содержимого указанного мешочка для выращивания клеток.

11. Автомат по одному из пп. 1, 2, характеризующийся тем, что на подставке расположены клапаны управления подачей культуральной среды в мешочек для выращивания клеток, сбора содержимого указанного мешочка и взятия проб из указанного мешочка.

12. Автомат по одному из пп. 1,2, характеризующийся тем, что опорное средство для взбалтывания оснащено вертикальным рычагом, на верхнем конце которого имеется средство для крепления мешочка, образующего воздухоуловитель и соединенного с мешочком для выращивания клеток.

13. Автомат по одному из пп. 1, 2, характеризующийся тем, что указанные средства для сбора и хранения установлены с возможностью поворота вокруг горизонтальной оси и выполнены с возможностью перемещения вокруг указанной оси между по существу вертикальным положением и по существу горизонтальным положением, в котором эти средства расположены полностью под указанным мешочком для выращивания клеток.

14. Стерильный одноразовый комплект для культивирования клеток для автомата для культивирования клеток согласно любому из пп. 1-13, характеризующийся тем, что

он содержит по меньшей мере один мешочек для выращивания клеток и гибкие трубки, соединяющие указанный по меньшей мере один мешочек для выращивания клеток с другими мешочками или резервуарами,

причем указанные трубки и указанный мешочек для выращивания клеток предварительно собраны, а указанный мешочек для выращивания клеток имеет входное и выходное отверстия и при необходимости отверстие для забора проб.

15. Комплект по п. 14, характеризующийся тем, что входное отверстие указанного мешочка для выращивания клеток соединено трубками с входными и выходными отверстиями мешочка с факторами роста и с входными и выходными отверстиями мешочка с культивируемыми клетками.

16. Комплект по п. 15, характеризующийся тем, что дополнительно содержит два мешочка, образующих воздухоуловитель, один из которых соединен с выходными отверстиями мешочков с факторами роста и с выращиваемыми клетками, а другой соединен с входным отверстием мешочка для выращивания клеток.

17. Комплект по одному из пп. 14-16, характеризующийся тем, что он содержит один или два мешочка для сбора клеток после культивирования, которые соединены трубками с выходным отверстием мешочка для выращивания клеток.

18. Опорное средство для взбалтывания для автомата для культивирования клеток, характеризующееся тем, что

оно имеет подставку, поддерживающую мешочек для выращивания клеток, при этом на подставке расположены три клапана и она установлена с возможностью поворота вокруг первой горизонтальной оси для наклона подставки из по существу горизонтального положения в по существу вертикальное положение и вокруг второй горизонтальной оси, вокруг которой подставка вибрирует для взбалтывания и гомогенизации содержимого мешочка для выращивания клеток,

причем указанное средство дополнительно содержит средства управления наклоном подставки вокруг указанных горизонтальных осей.

19. Средство по п. 18, характеризующееся тем, что оно содержит вертикальный рычаг, на верхнем конце которого размещено средство для крепления мешочка, образующего воздухоуловитель.

20. Автоматизированный способ культивирования клеток с использованием автомата по одному из пп. 1-13, характеризующийся тем, что он включает следующие этапы:

а) загрузка в мешочек для выращивания клеток культуральной среды, факторов роста и затем культивируемых клеток, при этом камера инкубатора остается закрытой;

б) взбалтывание указанного мешочка для выращивания клеток для гомогенизации его содержимого;

в) выдерживание мешочка для выращивания клеток в инкубационных условиях в течение определенного периода времени; и

г) сбор содержимого указанного мешочка для выращивания клеток в средство для сбора и хранения, при этом камера остается закрытой.

21. Способ по п. 20, характеризующийся тем, что включает:

- перед этапом а) этап установки предварительно собранного модуля путем установки мешочка для выращивания клеток на опорное средство для взбалтывания, установки указанных трубопроводов в средства для прохода указанного инкубатора и в указанные клапаны и соединения указанных трубопроводов с резервуарами или мешочками; и/или

- перед этапом а) этап извлечения воздуха, содержащегося в трубопроводах, посредством пропускания культуральной среды из резервуара с культуральной средой в мешочек или мешочки, образующие воздухоуловитель; и/или

- после загрузки в мешочек для выращивания клеток факторов роста на этапе а), этап промывания указанного резервуара с факторами роста за счет перетекания культуральной среды в резервуар с последующим извлечением его содержимого в мешочек для выращивания клеток; и/или

- после загрузки в мешочек для выращивания клеток культивируемых клеток на этапе а), этап промывания резервуара с указанными клетками за счет перетекания культуральной среды в этот резервуар с последующим извлечением его содержимого в указанный мешочек для выращивания клеток; и/или

- в ходе этапа в) один или более этапов забора проб содержимого мешочка для выращивания клеток, перед каждым из которых идет этап наклона подставки из горизонтального положения для культивирования в наклоненное положение, при котором отверстие для забора проб указанного мешочка для выращивания клеток находится в самой низкой точке мешочка; и/или

- перед этапом в) этап удаления резервуаров с культуральной средой, факторами роста и культивируемыми клетками путем обрезания и запаивания или зажимания трубопровода или трубки, соединяющей указанные резервуары с входным отверстием мешочка для выращивания клеток; и/или

- перед или в ходе этапа г) наклон подставки в по существу вертикальное положение таким образом, чтобы выходное отверстие указанного мешочка для выращивания клеток находилось в самой низкой точке мешочка.

22. Применение автомата по одному из пп. 1-13 для культивирования стволовых клеток типа CD34+ или мононуклеарных клеток крови, таких как лимфоциты.

23. Применение по п. 22, характеризующееся тем, что стволовые клетки получают из одного или более источников, таких как пуповинная кровь, костный мозг или цельная кровь.

24. Применение комплекта по одному из пп. 14-17 для культивирования стволовых клеток типа CD34+ или мононуклеарных клеток крови, таких как лимфоциты.

25. Применение по п. 24, характеризующееся тем, что стволовые клетки получают из одного или более источников, таких как пуповинная кровь, костный мозг или цельная кровь.

26. Применение средства по одному из пп. 18-19 для культивирования стволовых клеток типа CD34+ или мононуклеарных клеток крови, таких как лимфоциты.

27. Применение по п. 26, характеризующееся тем, что стволовые клетки получают из одного или более источников, таких как пуповинная кровь, костный мозг или цельная кровь.