Областью этого изобретения являются медицинские устройства, используемые in vivo или in vitro для получения и доставки применяемых в медицине веществ.
Предпосылки создания изобретения
Средства, используемые для доставки применяемых в медицине веществ, могут значительно влиять на их эффективность. Обычным путем введения для многих таких веществ является пероральный, внутривенный или подкожный. Каждый имеет присущие ему ограничения, которые могут влиять на терапевтический эффект веществ, которые должны быть введены. Например, многие лекарственные вещества на основе белков имеют короткий период полувыведения и низкую биодоступность - факторы, которые должны учитываться при выборе их лекарственной формы и способов доставки. Хотя были разработаны различные устройства для доставки (введения) используемых в медицине веществ, включая разборные портативные насосы и катетеры, все еще существует значительная потребность в усовершенствованных средствах введения (доставки).
Многие используемые в медицине вещества, включая белки, гликопротеины и некоторые пептидные и непептидные гормоны, более эффективно продуцируются культивируемыми клетками, чем получаются путем искусственного синтеза. Соответствующие клетки обычно культивируют в биореакторах и из этой культуры с помощью очистки получают желаемый продукт для введения больному обычным путем, например перорально или с помощью внутривенной или подкожной инъекции. Альтернативно клетки можно имплантировать непосредственно больному, где они будут продуцировать и выделять желаемый продукт. Хотя этот способ обладает рядом теоретических преимуществ по сравнению с введением продукта самого по себе, включая ту возможность, что нормальные клеточные механизмы обратной связи могут быть усилены для того, чтобы обеспечить выделение физиологически необходимого уровня продукта, он создает и дополнительные сложности. Одна из них касается соответствующей среды для клеток во время имплантации. Было бы желательно собрать клетки имплантата в форме, которая совместима с естественной средой in vivo для типа клеток, содержащихся в имплантате (фибробласты, например, в естественных условиях существуют в густой сети внеклеточного матрикса, образованного главным образом коллагеном). Существует также в некоторых случаях потребность обеспечения того, чтобы имплантированные клетки оставались локализованными в определенном месте в организме больного, так чтобы можно было проводить контроль за ними и, возможно, удалять, когда они больше не нужны.
При одной методике, которая была апробована с этой целью, использовано имплантационное устройство, состоящее из твердого единого кусочка коллагенового геля ("коллагеновой матрицы"), в который помещены клетки (например, Bell, US Patent 4485096). В коллагеновый имплантат могут быть включены другие вещества, такие как политетрафторэтиленовые (ПТФЭ) волокна (Moullier et al. , Nature Genetics, 4:154, 1993; WO 94/24298), которые придают прочность или другие желательные свойства коллагеновому гелю.
Краткое изложение изобретения
Было обнаружено, что функционирование коллагеновой матрицы может быть существенно улучшено путем добавления микросфер к коллагеновой матрице с образованием тем самым того, что называется здесь термином "гибридная матрица". Это может быть выполнено путем смешивания микросфер с клетками и растворимым коллагеном перед превращением коллагена в гель с образованием матрицы. Если желательно, микросферы и клетки можно культивировать вместе в течение срока, который дает возможность клеткам прикрепиться к микросферам перед добавлением не превращенного в гель раствора коллагена; альтернативно, три составные части можно смешивать по существу одновременно или в любом желаемом порядке с последующим образованием геля из растворимого коллагена в смеси с образованием гелеобразной смеси, состоящей из фибрилл нерастворимого коллагена, клеток и микросфер. Эта превращенная в гель смесь постепенно становится меньше в результате изгнания жидкости с образованием твердой, сравнительно эластичной имплантируемой частицей, которая содержит как микросферы, так и клетки, помещенные в сетку фибрилл нерастворимого коллагена. Если микросферы образованы тоже большей частью из коллагена, полученная матрица называется здесь термином "гибридная коллагеновая матрица".
Это изобретение, таким образом, включает изделие или устройство, имеющее основу (корпус) из матричного материала, который включает нерастворимые коллагеновые фибриллы и распределенные в основе:
а) множество клеток позвоночных (в частности клеток млекопитающих, таких как клетки, полученные от человека, шимпанзе, мыши, крысы, хомяка, морской свинки, кролика, коровы, лошади, свиньи, козы, овцы, собаки или кошки) и
б) множество микросфер (или бусин), каждая из которых состоит в основном (т. е. более чем на 50% по ее сухому весу) из одного или более веществ, выбираемых из списка, включающего коллаген (предпочтительно коллаген I типа), полистирол, декстран, полиакриламид, целлюлозу, альгинат кальция, латекс, полисульфон и стекло (например, стекло, покрытое гелем, таким как коллаген, для того чтобы улучшить сцепление с клетками).
Обычно по меньшей мере 70% и предпочтительно по меньшей мере 80% (наиболее предпочтительно приблизительно между 90% и около 100%, например, по меньшей мере 95%) от сухого веса каждой микросферы составляет одно или более из перечисленных веществ. Коммерческими примерами микросфер, которые описаны как по существу состоящие из очищенного коллагена, включают бусины ICN CellagenТМ и макропористые микросферы Biosciences. Микросферы предпочтительно имеют пористую консистенцию, но могут быть гладкими и обычно имеют примерно сферическую форму с диаметром примерно 0,1-2 мм (например, в интервале между примерно 0,3 и 1 мм). Разумеется форма и размер микросфер из любой конкретной серии препарата будет отличаться в пределах допусков производства.
Изделию может быть придана такая форма, чтобы ее можно было имплантировать животному, например такому млекопитающему, как человек, или может быть предназначена для производства клеточных продуктов in vitro; например в экстракорпоральном аппарате-биореакторе, снабженном средствами для отвода крови от животного к изделию и затем обратно в кровеносный сосуд животного или в биореактор или другой сосуд, из которого среда, содержащая желаемый клеточный продукт, может быть возвращена для очистки и изготовления фармацевтического препарата. Клетки могут быть произведены из одной или более клеток, полученных от больного, и предпочтительно ими являются трансфицированные клетки, содержащие экзогенную ДНК, кодирующую один или более применяемых в медицине полипептидов, таких как ферменты, гормоны, цитокины, колониестимулирующий фактор, фактор, стимулирующий развитие сосудов, вакцинный антиген, антитела, фактор свертывания крови, регуляторные протеины, фактор транскрипции, рецепторы или структурные белки. Примеры таких полипептидов включают человеческий гормон роста (чГР), фактор VIII, фактор IX, эритропоэтин (ЭПО), альбумин, гемоглобин, альфа-1 антитрипсин, кальцитонин, глюкоцереброзидазу, рецепторы липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), рецепторы IL-2, иммуноглобулины, каталитические антитела, интерлейкины, инсулин, инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1), паратиреоидный гормон (ПТГ), лептин, интерфероны, фактор роста нервов (ФРН), основной фактор роста фибробластов (оФРФ), кислотный ФРФ (кФРФ), эпидермальный фактор роста (ЭФР), фактор роста клеток эндотелия, фактор роста, производимый тромбоцитами (ФРПТ), трансформирующий фактор роста, стимулирующий развитие сосудов, фактор эндотелиальных клеток (ФРСЭК), ангиогенин, тканевой активатор плазминогена (т-АП), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (Г-КСФ) и колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (га-КСФ). Альтернативно, экзогенная ДНК может быть регуляторной последовательностью, которая будет активировать экспрессию эндогенного гена (например, используя гомологичную рекомбинацию, как описано в WО94/12650-PCT/US93/11704, который включен здесь в виде ссылки).
Обычно в матрицах этого изобретения может использоваться любой тип клеток, который способен связываться с коллагеном и/или микросферами и который проявляет желаемые свойства, такие как экспрессия применяемых в медицине продуктов клеток или выполнение существенной структурной функции или функции в метаболизме. Примеры включают адипоциты, астроциты, клетки сердечной мышцы, хондроциты, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки, фибробласты, ганглиоциты, железистые клетки, глиальные клетки, кроветворные клетки, гепатоциты, кератиноциты, миобласты, нервные клетки, остеобласты, бета-клетки поджелудочной железы, почечные клетки, клетки гладких мышц и клетки поперечно-полосатых мышц, а также предшественники любых из вышеперечисленных. Если желательно, в данную матрицу может быть включен более чем один тип клеток. Эти клетки могут присутствовать в виде клоновых или гетерогенных популяций.
Коллаген в матричном материале предпочтительно представлен типом I, но может быть и коллагеном любого другого типа. Матричный материал может, необязательно, включать два или более типов коллагена (например, выбранных из типов I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X и XI), а также любые дополнительные компоненты, которые придают желательные свойства получаемой матрице: например, агарозу, альгинат, фибронектин, ламинин, гиалуроновую кислоту, гепарансульфат, дерматансульфат, хондроитинсульфат, сульфатированные протеогликаны, фибрин, эластин или тенасцин. Любой из вышеупомянутых коллагеновых и неколлагеновых компонентов может быть получен от людей или от других животных. Можно было бы включать коллагеновые и неколлагеновые волокна, располагаемые внутри устройства. Такие волокна могут, например, быть изготовлены из материала, который включает найлон, дакрон, политетрафторэтилен, полигликолевую кислоту, полимерные смеси полимолочной/полигликолевой кислоты, полистирол, поливинилхлоридный сополимер, кетгут, хлопок, лен, полиэфир или шелк.
В гибридных матрицах может содержаться большое число клеток. Например, могут быть получены гибридные матрицы, которые содержат по меньшей мере примерно в два раза (а предпочтительно примерно в три раза) больше клеток, чем матрицы, полученные с только одним растворимым коллагеном, принимая, что число введенных клеток и первоначальный объем продукции эквивалентны. Общее количество полипетида, экспрессируемое клетками, помещенными в данную гибридную матрицу за данный период времени обычно значительно выше (например, по меньшей мере на 50% выше, предпочтительно по меньшей мере на 100% выше и более предпочтительно, по меньшей мере на 200% выше), чем достигаемое со стандартной коллагеновой матрицей эквивалентного объема.
Гибридную матрицу этого изобретения обычно получают с помощью способа, который включает следующие стадии:
формирования смеси, которая включает (а) множество клеток позвоночника; (б) множество микросфер, каждая из которых состоит большей частью из одного или более веществ, выбираемых из списка, состоящего из коллагена, полистирола, декстрана, полиакриламида, целлюлозы, альгината кальция, латекса, полисульфона и стекла и (в) раствор, содержащий растворимый коллаген;
побуждения растворимого коллагена в смеси к образованию геля из нерастворимых коллагеновых фибрилл, в который вкраплены клетки и микросферы, и
выдерживания геля в условиях культивирования, которые побуждают гель уменьшаться в размерах путем выделения жидкости с образованием тем самым основы изделия. Образование геля обычно вызывается путем повышения рН относительно кислого коллагенового раствора до показания свыше 5, например путем добавления концентрированной буферной культуральной среды, где коллаген образует нерастворимые фибриллы. Когда эта стадия проводится в форме, гель будет принимать форму внутреннего объема этой формы. В основном на сжатие геля влияют клетки в смеси, которые связываются с фибриллами и заставляют его сжиматься до меньшего варианта создаваемой формы (например, диска, как в случае, когда формой является чашка Петри, которая имеет цилиндрическую форму). Матрица может использоваться непосредственно после получения, ее можно подвергать культивированию для повышения числа клеток, присутствующих в матрице, или для улучшения их функционирования, или она может подвергаться неограниченной криоконсервации при температуре ниже 0oС.
Используемый в медицине полипептид, такой как один из перечисленных выше, можно вводить больному при методе лечения, который включает получение гибридной матрицы, содержащей клетки, которые секретируют полипептид, представляющий интерес, и имплантирование изделия больному в выбранное местоположение, такое как подкожное, интраперитонеальное, субренально в капсулу, паховое, внутримышечное или интратекальное местоположение. Если полипептидом является полипептид, который вызывает заживление ран (например, ФРПТ или ИФР-1), матрицу можно имплантировать в местоположение существующей раны. Как обсуждалось выше, клетки могут быть получены из одной или более клеток, удаляемых у больного, и предпочтительно они трансфицированы in vitro экзогенной ДНК, кодирующей полипептид. Альтернативно они могут быть клетками, которые естественно секретируют полипептид или осуществляют желаемую функцию метаболизма (например, гепатоциты или бета-клетки поджелудочной железы).
При другом варианте воплощения изобретения применяемый в медицине полипептид можно вводить больному путем отвода части крови пациента с помощью аппарата, описанного выше, так что полипептид, секретируемый клетками в гибридной матрице, смешивается с кровью. В основном любой такой аппарат, известный специалистам в этой области, может быть приспособлен для размещения матрицы этого изобретения. Например, отведение крови в устройство, которое содержит проницаемо-селективную мембрану, окружающую матрицу данного изобретения, будет приводить в результате к доставке терапевтического продукта из матрицы в кровь. Для этой цели можно использовать устройство, подобное искусственной поджелудочной железе (Sullivan et al., Science 252: 718-721, 1991).
Еще одним вариантом использования гибридных матриц данного изобретения является использование в качестве средства получения полипептида in vitro. Этот способ включает стадии помещения гибридной матрицы в условия, при которых клетки в матрице экспрессируют и секретируют полипептид; контакт матрицы с жидкостью так, что клетки секретируют полипептид в жидкость, и получения полипептида из жидкости, например, путем стандартных методик, подходящих для данного полипептида. При одном осуществлении матрица закрепляется на поверхности и омывается жидкостью; альтернативно матрица свободно плавает в жидкости. Клетки, помещенные в гибридную матрицу, функционируют на высоком уровне в малом пространстве. Кроме того, первая стадия очистки экспрессируемого полипептида (удаление клеток из среды) значительно более эффективна с матрицами, чем при большинстве других стандартных способов культивирования клеток.
Другие признаки и преимущества этого изобретения будут ясны из формулы изобретения и из детального описания, представленного ниже и не имеющего ограничивающего значения.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 представляет карту плазмиды pXGH302 для экспрессии чГР.
Фиг.2 представляет схематический вид с частичным сечением (срезом) одного из воплощений этого изобретения.
Фиг. 3 является графиком, показывающим уровни чГР in vivo у безволосых мышей, которым имплантирована или коллагеновая матрица или гибридная коллагеновая матрица, содержащая клетки HFI65-24, человеческие фибробласты кожи, стабильно трансфицированные pXGH302 и экспрессирующие чГР.
Подробное описание
Примеры, представленные ниже, иллюстрируют несколько вариантов воплощения этого изобретения. Эти примеры представлены только с иллюстративными целями и не имеют значения ограничивающих.
Пример I
В этом примере описаны методы, использованные для получения клонального клеточного штамма человеческих фибробластов, устойчиво трансфицированных плазмидой pXGH302, секретирующих рекомбинантный человеческий гормон роста (чГР), и для соединения их с пористыми коллагеновыми микросферами в гибридной матрице этого изобретения. Такие матрицы называются гибридными коллагеновыми матрицами (ГКМ).
А. Получение первичных человеческих фибробластов, экспрессирующих человеческий гормон роста
Фибробласты выделяли из свежеотсеченной крайней плоти человека с помощью методики ферментативной диссоциации. После слияния первичные культуры снимали с пластиковой поверхности с помощью мягкой трипсинизации, разводили и снова высевали для получения вторичной клеточной культуры для трансфицирования.
Плазмида pXGH302 была сконструирована, как описано в примере II, и трансфицирование проводили путем электропорации - процесса, при котором клетки суспендируют в растворе плазмидной ДНК, помещают между парой противоположно заряженных электродов и подвергают воздействию коротких электрических импульсов.
Обработанные клетки подвергали селекции в содержащей G-418 среде в течение 10-14 дней. Клетки, которые включили плазмиду в свои геномы, стабильно экспрессируют продукт nео гена и образовывают колонии устойчивого к действию неомицина аналога G418. Каждую колонию, состоящую из клоновой популяции клеток, отдельно удаляли с ее положения на чашке с культурой ткани с помощью трипсинизации. Эти клоны, положительно оцененные на экспрессию чГР, размножали для количественной оценки, и клон HFI65-24 был выбран для дальнейшего использования. Более детально процедуры для получения и трансфицирования клеток, подходящие для использования в матрицах этого изобретения, представлены в WО93/09222 (PCT/US92/09627), который приведен здесь в виде ссылки.
Б. Получение гибридных коллагеновых матриц
1. Получение микросфер
Коллагеновые микросферы (Cellex Biosciences cat. YBOO-0015UW) переносили из каждой первоначальной бутылочки, поставленной производителем (~10 мл на бутылочку) в 50 мл конические пробирки (1 пробирка на одну бутылочку) Микросферам в пробирке давали осесть и буферный раствор для хранения отсасывали. В градуированную пробирку добавляли среду для промывания микросфер (DMEM с 1% телячьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина) до метки 50 мл, микросферам давали осесть и среду отсасывали. Эту серию стадий промывания повторяли до общего числа в 4 промывания. Микросферы переносили в 250 мл колбу Эрленмейера, используя 25 мл пластиковую пипетку, ограничивая объем микросфер до 100 мл на 250 мл колбу. Добавляли среду для промывания до отметки 250 мл и колбу закрывали и помещали в инкубатор для тканевых культур при 37oС на 2-3 часа. Колбу вынимали из инкубатора и микросферам давали осесть, а среду для промывания отсасывали. Эту серию инкубаций и стадий промывания повторяли до общего числа в 3 промывания.
2. Получение гибридной коллагеновой матрицы
Клетки и микросферы смешивали непосредственно перед добавлением раствора коллагена. Промытые микросферы добавляли в 15 мл градуированные конические пробирки до желаемого объема (объем = число матриц, умноженное 1 мл; см. таблица 1) Микросферам давали осесть в течение по меньшей мере 10 минут перед измерением объема. Избыток среды для промывания удаляли отсасыванием.
Клетки, которые нужно разместить в матрице, собирали с помощью трипсинизации и число клеток подсчитывали. Необходимое число клеток (число клеток на матрицу, умноженное на общее число матриц, которое нужно получить) центрифугировали при 1500 об/мин (500•g) в течение 7 мин при комнатной температуре. В соответствующих по размеру полипропиленовых пробирках с коническим дном готовили смесь равных объемов модифицированной 2х DMEM (2x DMEM с 9 г/л глюкозы, 4 мМ L-глютамина и 22,5 мМ HEPES) и телячьей сыворотки в соответствии с таблицей 1. (Примечание: для объемов более 250 мл общий объем должен быть разделен на пробирки соответствующего размера.) Осадок клеток снова суспендировали в смеси 2x DMEM - телячьей сыворотки. Коллагеновые микросферы смешивали с клеточной суспензией путем добавления 1-2 мл суспензии клеток к уплотненным микросферам и затем переноса концентрированных микросфер с помощью 10 мл пипетки в оставшуюся суспензию клеток с последующим осторожным перемешиванием с помощью пипетки. Смесь помещали на лед и добавляли соответствующий объем раствора коллагена (коллаген крысиного хвоста типа I; UBI кошачий 08-115, разведенный до концентрации 4,0 мг/мл 0,02 М уксусной кислотой), как указано в таблице 1. Содержимое пробирки тщательно перемешивали (избегая появления пузырьков или вспенивания), используя 10 мл стеклянную пипетку, до тех пор, пока раствор матрицы не принимал вид гомогенного.
Чтобы получить матрицу, соответствующий объем смеси коллагена/клеток/микросфер/среда добавляли в стерильную чашку Петри с помощью пипетки (объемом 10 или 25 мл) в соответствии с общим объемом на чашку из перечисленных в приведенной в конце описания табл.1. (Эту смесь перемешивали с помощью пипетки при заполнении чашек, чтобы предотвратить оседание клеток или микросфер.) Заполненные чашки помещали в термостат для тканевых культур с температурой 37oС, 5% СO2, 98% относительной влажности и оставляли в покое примерно на 24 часа, в течение этого времени содержимое превращалось в гель и гель уменьшался в размерах по всем направлениям с образованием гибридных матриц этого изобретения, которые были диаметром примерно 50% и объемом примерно 10% от объема смеси, не превращенной в гель.
Одно из воплощений гибридной матрицы этого изобретения иллюстрируется на фиг. 2. Матрица 10 состоит из массы сжатого коллагенового геля 12, в который помещены клетки позвоночных 14 и микросферы 16. Для ясности на этой фигуре клетки показаны как точки, отдельные от микросфер. Фактически нужно ожидать, что большинство клеток связано с микросферами, и они должны быть значительно меньше, чем представленные на чертеже.
Пример II
pXGH302 была сконструирована путем субклонирования фрагмента HindIII в 6,9 т. п. о., располагающегося в положении 11960-18869 в последовательности человеческого HPRT (Edwards et al., Genomics, 6:593-608, 1990; Genbank entry HUMHPRTB) и включения экзонов 2 и 3 гена HPRT в сайт HindIII pTZ18R (Pharmacia P-L Biochemicals, Inc.). Полученный клон расщепляли в особом сайте XhoI в экзоне 3 фрагмента гена HPRT и вставляли фрагмент SalI-XhoI в 1,1 т. п.о., содержащий ген nео из pMClNeo (Stratagene), разрывая кодирующую последовательность экзона 3. Была выбрана одна ориентация, с направлением транскрипции nео, противоположном направлению в HPRT, и обозначена рЕ3nео.
Чтобы объединить ген чГР, последовательности HPRT и ген nео в одной и той же плазмиде, pXGH5 (Selden et al., Mol. Cell. Biol. 6:3173-3179, 1986) расщепляли с помощью EcoRI и выделяли фрагмент в 4,0 т.п.о., содержащий ген чГР и связанный мышиный промотор металлотионеин-1 (mMT-1). Выступы ExoRI заполняли с помощью фрагмента Кленова из ДНК-полимеразы E.coli. pE3Neo расщепляли с помощью XhoI, который разрезает в месте соединения фрагмента пео и экзона 3 HPRT (соединение 3' вставки в экзон 3). Свисающие концы XhoI линеаризированной плазмиды заполняли с помощью фрагмента Кленова из ДНК-полимеразы E. coli и полученный фрагмент лигировали в 4,0 т.п.о. фрагмент mMT/hGH с тупыми концами. Колонии бактерий, полученные из смеси лигирования, отсортировывали с помощью ферментативного рестрикционного анализа по единственной копии вставки фрагмента mMT-1/hGH. Один субклон, в котором ген чГР (hGH) транскрибируется в том же направлении, что и ген nео, был обозначен pXGH302. Карта плазмиды pXGH302 представлена на фиг.1. На этой фигуре отмечены положение и ориентация кодирующей чГР области и мышиного промотора металлотионеина-1 (тМТ-1), контролирующего экспрессию чГР. Показано положение основных элементов промотора (ТАТА), сайтов инициации транскрипции (CAP) и сайтов инициации трансляции (ATG). Как показано, транскрипция гена пео контролируется энхансером полиомы/промотором гена тимидинкиназы (ТК) вируса простого герпеса (HSV). HPRT обозначает положения последовательностей из локуса человеческой гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы. В плазмиде pXGH302 используется в качестве основы pTZ18R (Pharmacia P-L Biochemicals, Inc. ), производная плазмиды pUC18 (Yanisch-Perron et al., Gene 33: 103-119, 1985), несущая промотор Т7 РНК-полимеразы и сайт инициации репликации fl.
Пример III
Этот пример иллюстрирует способ получения гибридной коллагенавой матрицы, при котором трансфицированные клетки, приготовленные, как описано выше, предварительно культивируют с микросферами перед образованием гибридной коллагеновой матрицы. Такие "предварительно культивируемые" коллагеновые матрицы называются ПКГКМ.
А. Предварительное культивирование клеток и микросфер
Трипсинизированные трансфицированные клетки высевают в промытые коллагеновые микросферы в соотношении 2•106 клеток на мл микросфер (например, 10•106 клеток на 5 мл микросфер) с помощью следующей методики:
1. В колбу Эрленмейера на 125 мл добавляют суспензию клеток в объем среды для роста, который в два раза больше объема микросфер. Предел составляет 10 мл микросфер на колбу.
2. Удаляют 1-2 мл этой суспензии и добавляют к 5 мл (уплотненный объем) предварительно отмеренных микросфер в 15 мл пробирку.
3. Переносят суспензию клеток/микросферы обратно в 125 мл колбу Эрленмейера.
4. Помещают колбу в термостат для культур тканей и мягко перемешивают вращением в течение примерно 5 секунд через каждый час в течение 4-5 часов. Добавляют среду для роста до деления 50 мл на колбе и оставляют клетки и микросферы в инкубаторе на ночь.
Через 20-24 часа со времени посева определяют число клеток, связанных с коллагеновыми микросферами, с помощью следующей процедуры:
1. Определяют вес 5 мл полистироловой пробирки для испытаний с круглым дном.
2. Отбирают небольшой образец микросфер (0,1-0,2 мл) из колбы Эрленмейера и добавляют в предварительно взвешенную пробирку для испытаний.
3. Отсасывают среду с образца микросфер и определяют вес пробирки плюс образца. Рассчитывают вес образца путем вычитания веса пробирки из веса пробирки вместе с образцом.
4. Добавляют 1 мл расщепляющего матрицу фермента [коллагеназа IA (Sigma cat С9891) при концентрации 1-2 мг/мл в ФБР (фосфатно-буферном физрастворе) с Са2+ и Mg2+] к образцу микросфер и осторожно перемешивают путем выливания жидкости на стенку пробирки.
5. Закрывают пробирку парафильмом и помещают в водяную баню с температурой 37oС на 1 час, вызывая дезинтеграцию микросфер путем пропускания жидкости через пипетку Пастера через 15 минутные интервалы.
6. После инкубации производят дополнительную диссоциацию клеток путем энергичного пропускания через 5 мл стеклянную пипетку. (Примечание: если все еще остаются комочки, в пробирку добавляют раствор 10х трипсина-ЭДТА в объеме 1/10 от объема добавленного раствора коллагеназы и инкубируют еще 10 мин).
7. Выполняют подсчет клеток, используя гемацитометр.
8. Определяют плотность клеток на мл микросфер, используя следующую формулу, в которой принимается, что 50% объема этих микросфер во влажном уплотненном состоянии является промежуточным пространством.
Общее число клеток/мл микросфер = 1000 мг/(вес образца в мг) х (число клеток в образце) х 0,5.
Смесь клеток/микросфер переносят из 125 мл колбы Эрленмейера в 250 мл вращаемую колбу (Bellco Microcarrier Spinner Flasks, 250 мл с роторными штоками (крыльчатками) модели 1965-60001), среду для роста добавляют до градуировочной метки 150 мл и вращаемую колбу помещают на диск магнитной мешалки (установить на 50 об/мин) в термостат для культур тканей. Культуру подпитывают свежей средой на следующий день и 3 раза в неделю после этого, давая возможность микросферам осесть на дно колбы, отсасывая "истощенную" среду до отметки 50 мл на колбе и добавляя свежую среду для роста до отметки 200 мл. Плотность клеток на мл микросфер можно определить в желательные моменты времени, как описано выше.
Б. Получение предварительно культивированных гибридных коллагеновых матриц. (ПКГКМ)
ПКГМК получали с помощью следующей методики:
1. Когда достигнута желаемая плотность клеток на мл микросфер (что определялось подсчетом клеток), микросферы, содержащие клетки, удаляют из вращаемой колбы.
2. Получают матрицы по методике, описанной выше для получения ГКМ, со следующими изменениями:
I. Клетки не трисинизируют.
II. Добавляют культивированные микросферы, содержащие клетки, в 15 мл грудуированные конические пробирки до желаемого уплотненного объема (объем = число матриц • 0,5 мл).
III. Добавляют пустые микросферы в 15 мл градуированные конические пробирки до желаемого уплотненного объема (объем = число матриц • 0,5 мл).
3. Готовят модифицированную смесь 2х DMEM и телячьей сыворотки, как описано в примере I, выше. К модифицированной смеси 2х DMEM/телячьей сыворотки (см. в конце описания табл.2) добавляют пустые микросферы (50% от всего объема микросфер) и микросферы, содержащие клетки (50% от общего объема микросфер). Смесь микросфер/DMEM/телячьей сыворотки помещают на лед и добавляют соответствующий объем раствора коллагена (коллагена типа I хвоста крысы; UBI кошачьего 08-115, разведенного до концентрации 4,0 мг/мл в 0,02 М уксусной кислоте), как точно указано в таблице 2. Содержимое пробирки тщательно перемешивают (избегая образования пузырьков или вспенивания), используя 10 мл стеклянную пипетку, до тех пор, пока раствор матрицы не примет вид гомогенного.
Пример IV
А. Гибридные матрицы (ГКМ или ПКГКМ) поддерживаются в культуре путем подпитывания матриц в первый день, а затем 2-3 раза в неделю с использованием следующей методики:
1. Осторожно отсасывают культуральную среду.
2. Добавляют необходимый объем соответствущей среды роста, принимая во внимание размер чашки, используемый для каждой матрицы (5-7 мл на 60 мм чашку, 10-15 мл на 100 мм чашку, 30-40 мл на 150 мм чашку). Среда может быть дополнена аскорбиновой кислоты 2-фосфатом и/или ТГФ-β (например, 10-50 мкг/мл аскорбиновой кислоты 2-фосфата и/или 1-10 нг/ ТГФ-β.
Б. Диаметр гибридной коллагеновой матрицы может быть определен с использованием следующей процедуры:
1. Помещают чашку Петри, содержащую матрицу, которую нужно измерить, на верхнюю часть измерительной линейки, лежащей на темном основании.
2. Регистрируют диаметры (в сантиметрах), как желательно: например, ежедневно в течение первых 2 недель, через день после первых двух недель и в дни подсчета клеток в продолжение эксперимента.
В. Клетки могут быть выделены из гибридной коллагеновой матрицы и подсчитаны следующим образом:
1. Ферментативное расщепление гибридных коллагеновых матриц.
а. Готовят раствор коллагеназы IA (1,0 мг/мл для ГКМ и ПКГКМ, 2,0 мг/мл для ГКМ или ПКГКМ, дополненным 2-фосфатом аскорбиновой кислоты и/или ТГФ-β в ФБР.
б. Распределяют раствор коллагеназы по 15 мл коническим центрифужным пробиркам объемом по 1 мл для матриц, засеянных (1-5)•106 клеток, и 5 мл для матриц, засеянных более чем 5•106 клеток на матрицу. Готовят столько пробирок с коллагеназой, сколько матриц нужно подсчитать.
в. Удаляют каждую матрицу из ее чашки, используя плоский пинцет, и осторожно промокают избыток жидкости
с матрицы, используя салфетку из абсорбентной бумаги (если клетки будут выброшены после подсчета) или стерильную абсорбентную подушечку.
г. Помещают каждую матрицу в отдельную содержащую коллагеназу пробирку, плотно закрывают и укрепляют на орбитальном шейкере, установленном на 40 об/мин, в термостате для культур тканей.
д. Инкубируют матрицы в течение примерно 1 часа до тех пор, пока не завершится расщепление. Чтобы ускорить расщепление, разбивают матрицы с помощью пропускания через пипетку через 5-минутные интервалы.
2. Подсчет клеток
а. Измеряют общий объем каждой расщепленной суспензии клеток, используя градуировку на стенке центрифужной пробирки.
б. Для определения жизнеспособности клеток отбирают 0,1 мл суспензии клеток и добавляют 0,1 мл 0,08% трипанового синего в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Смешивают путем легкого постукивания по пробирке.
в. Подсчитывают живые и мертвые клетки, используя гемацитометр. Если необходимо, дополнительно разводят суспензию клеток ФБР перед добавлением трипанового синего. Подсчитывают общее число клеток, принимая во внимание общий объем, измеренный на стадии 2а.
Пример V
В этом примере описаны эксперименты, отличающиеся плотностью посева клонов человеческих фибробластов, стабильно трансфицированных плазмидой pXGH302 в гибридной коллагеновой матрице с целью определения плотности клеток, которая может поддерживаться в ГКМ. Также контролировалась продукция чГР каждой ГКМ.
Получали гибридные коллагеновые матрицы с 3 плотностями посева (ПП) стабильно трансфицированного экспрессирующего чГР клона фибробластов крайней плоти новорожденных, обозначаемого HF165-24. Плотности составляли 5, 10 и 20•106 клеток на ГКМ. Для каждой ПП получали 9 ГКМ в 60 мм чашках. Среда для продукции гибридных матриц для каждой ПП состояла из 9 мл модифицированной 2х DMEM, 9 мл телячьей сыворотки, 9 мл коллагеновых микросфер и 9 мл растворимого коллагена хвоста крыс 4 мг/мл в 50 мл конических пробирках.
HF165-24, собранные с монослойных культур, объединяли для получения достаточного материала для каждой ПП для 9 ГКМ:
5•106 клеток на 9 ГКМ = всего 45•106 клеток;
10•106 клеток на 9 ГКМ = всего 90•106 клеток;
20•106 клеток на 9 ГКМ = всего 180•106 клеток.
Объединенные клетки для каждой ПП центрифугировали при 1500 об/мин в течение 7 мин, супернатант отсасывали, осадок снова суспендировали в 9 мл модифицированной 2х DMEM и 9 мл телячьей сыворотки и переносили в 50 мл пробирки. К смеси клеток/2х DMEM/телячьей сыворотки добавляли девять мл коллагеновых микросфер, предварительно отмеренных в 15 мл градуированные пробирки, и смешивали путем мягкого пропускания через пипетку с помощью 10 мл пипетки. Эту смесь затем помещали на лед и добавляли 9 мл ледяного холодного раствора коллагена хвоста крыс типа I (4 мг/мл) и перемешивали с помощью 10 мл пипетки до получения гомогенного раствора. Четыре мл этой смеси добавляли в каждую из девяти 60 мм чашек Петри для каждой плотности. Чашки Петри ставили в инкубатор для культур тканей и оставляли в покое на 24 часа. После 24 часов инкубации (среду аккуратно отсасывали из каждой чашки, а ГКМ снова подпитывали ростовой средой (DMEM, 10% телячьей сыворотки 1% пен. /стрепт. ), используя 5 мл на чашку. Для обеспечения большего объема среды роста на матрицу ГКМ переносили на 3 дня с 60 мм чашек Петри на 100 мм, используя плоский пинцет, и добавляли по 10 мл среды роста на чашку. На 6 день среду от каждой ГКМ отсасывали, матрицы промывали 5 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (ССРХ) и отсасывали, и в каждую чашку добавляли 10 мл среды для роста. Время добавления ростовой среды к ГКМ отмечали, чтобы взять образец среды через 24 часа на следующий день (день 7). Эту процедуру промывания и подпитывания повторяли на 13 и 20 день, чтобы получить образцы среды на 14 и 21 день. Образцы среды исследовали на чГР, как указано ниже. ГКМ также подпитывали на 10 и 17 дни без стадии промывания. Расщепление 3 ГКМ на ПП для подсчета клеток проводили на 7, 14 и 21 день после того, как были отобраны образцы, как описано в примере IV. Продукция чГР в ГКМ в указанные моменты времени определяли количественно с помощью радиоиммуноисследования (Институт Николса) в образцах среды, взятых через 24 часа, как описано в примере XII, ниже. В табл.3 (см. в конце описания) сведены данные по числу клеток для трех повторностей ГКМ на каждую ПП и продукции чГР в ГКМ при каждой ПП на 7 (n=9), 14 (n=6) и 21 (n=3) дни. Значения представлены как среднее арифметическое ± стандартное отклонение. Как показано, равновесная плотность, определенная на 14 и 21 день для ГКМ, полученных, как описано выше, составляет примерно (7-10)•106 клеток на матрицу. Продукция чГР на клетку для полностью сформированных матриц на 21 день сходна для всех трех испытанных уровней ПП.
Пример VI
"Стандартные" коллагеновые матрицы (КМ) не включают коллагеновых микросфер. Чтобы сравнить КМ с ГКМ, получали КМ путем замещения объема, занятого микросферами в ГКМ дополнительным растворимым коллагеном с получением соотношения из 1 части 2х DMEM, 1 части телячьей сыворотки и 2 частей растворимого коллагена на КМ. Прямое сравнение КМ с ГКМ проводили следующим образом.
Использовали клон человеческих фибробластов, стабильно трансфицированных плазмидами pXGH302, обозначенный HF165-24. Получали девять матриц каждого типа с каждой из двух ПП (1•106 и 5•106 клеток на матрицу). Для обоих, КМ и ГКМ, 9•106 клеток (для ПП 1•106) и 45•106 клеток (для ПП 5•106) повторно суспендировали в 9 мл 2х DMEM + 9 мл телячьей сыворотки в 50 мл пробирках. Для КМ в ряд по каждой ПП добавляли в целом 18 мл раствора коллагена типа I хвоста крысы (4 мг/мл), и матрицы формировали, как описано выше в примере I. Для ГКМ в ряд для каждой ПП добавляли 9 мл коллагеновых микросфер и 9 мл раствора коллагена типа I хвоста крыс (4 мг/мл) и ГКМ формировали в соответствии с примером I. Матрицы содержали в первоначальных 60 мм чашках и подпитывали объемом в 5 мл среды роста. Число клеток на матрицу, а также продукцию чГР на матрицу определяли на 7, 14 и 30 день, как описано в примере V. Максимальные плотности клеток (измеренные на 14 день) и продукция чГР в 2-х типах матриц при 2 плотностях суммированы в табл.4 (см. в конце описания). Как показано в таблице, гибридный тип матрицы давал возможность более высокой плотности клеток и существенно большую продукцию чГР на матрицу по сравнению со стандартной коллагеновой матрицей без микросфер.
Пример VII
В этом примере описана продукция и анализ предварительно культивированных гибридных коллагеновых матриц (ПКГМ). Клетки клона человеческих фибробластов, стабильно трансфицированные плазмидами pXGH302 (HF165-24), высевали в коллагеновые микросферы в соотношении 2•106 клеток на мл микросфер следующим образом. Суспензию 48•106 клеток в 40 мл среды роста получали из собранных монослойных культур. 5 мл этой суспензии добавляли в каждую из четырех 15 мл градуированных пробирок, содержащих 6 мл уплотненных коллагеновых микросфер, и каждую смесь клеток/микросфер переносили в 125 мл колбу Эрленмейера. Добавляли дополнительно 5 мл суспензии клеток к смеси клеток/микросфер в 125 мл колбе Эрленмейера для получения конечной суспензии 12•10 клеток с 6 мл микросфер и 10 мл среды роста на колбу (всего 4 колбы). Колбы помещали в инкубатор для культур тканей и содержимое мягко перемешивали вращением в течение 5 секунд через каждый час в течение 4 часов. После четвертого часа в каждую колбу добавляли среду роста до 50 мл отметки и колбы оставляли в покое на 24 часа. Через 24 часа микросферы из каждой колбы Эрленмейера переносили в 250 мл колбу-волчок, добавляли среду роста до 150 мл отметки каждой колбы-волчка и колбы помещали на плату магнитной мешалки, установленной на 50 об/мин в инкубаторе для культур тканей. На следующий день добавляли среду роста до 200 мл отметки в каждую колбу с волчком и в колбах производили подпитку 3 раза в неделю путем отсасывания среды до 50 мл отметки и добавления свежей среды до 200 мл.
На 15 день культивирования в колбе с волчком определяли плотность клеток на мл микросфер. Из каждой колбы отбирали небольшой образец микросфер (~ 0,1-0,2 мл) и помещали в предварительно взвешенные 5 мл полистирольные пробирки. Избыток среды из каждой пробирки удаляли путем аспирации и пробирку, содержащую образец микросфер, взвешивали. В каждую пробирку добавляли один мл раствора коллагеназы типа IA, 2 мг/мл в ФБР и пробирки закрывали парафильмом и помещали в водяную баню с температурой 37oС. Каждые 15 минут по пробиркам, содержащим микросферы, слегка постукивали, чтобы диспергировать сгустки. Через 1 час проводили дополнительную диссоциацию клеток путем энергичного пропускания через пипетку с помощью 5 мл стеклянной пипетки. Чтобы дополнительно разбить комочки, добавляли раствор 10х трипсина: ЭДТА с получением конечной концентрации трипсина 1х в растворе коллагеназы и пробирки инкубировали в течение еще 10 минут. Суспензии диссоциированных клеток разводили 1:2 ФБР и вносили в камеры гемацитометра для подсчета клеток. Плотность клеток на мл микросфер рассчитывали, используя следующую формулу:
Общее количество клеток/мл микросфер = 1000 мг/(1 мг веса образца) х (количество клеток в образце) х 0,5.
В этой формуле принимается, что: 1) влажный коллаген имеет удельный вес, равный 1,0, и поэтому грамм веса коллагена в образце микросфер равен объему коллагена в мл, и 2) половину объема микросфер во влажном уплотненном состоянии занимает промежуточное пространство. Среднее число клеток на мл микросфер (n= 4) в этом эксперименте составило 19,2•106. Микросферы удаляли из каждой колбы и объединяли в 15 мл градуированной пробирке. Весь объем из 6 мл микросфер, содержащий 19,2•106 клеток на мл микросфер, использовали для получения гибридных коллагеновых матриц.
В 100 мл стерильной бутылочке аккуратно смешивали 12 мл модифицированной 2х DMEM, 12 мл телячьей сыворотки, 6 мл пустых коллагеновых микросфер и 6 мл предварительно культивированных микросфер с использованием 10 мл стеклянной пипетки. Эту смесь помещали на лед и добавляли 12 мл охлажденного на льду коллагена типа I из хвоста крысы и аккуратно перемешивали, используя 10 мл стеклянную пипетку. В каждую из двенадцати 60 мм чашек Петри добавляли 4 мл этой смеси и чашки помещали в термостат с температурой 37oС и оставляли на 24 часа.
Конечное число клеток на матрицу составляло 9,6•106, так как каждая матрица состояла из 0,5 мл микросфер, содержащих 19,2•106 клеток на мл. Эти предварительно культивированные гибридные коллагеновые матрицы (ПКГКМ) подпитывали через 24 часа путем отсасывания среды и добавления 5 мл среды роста. ПКГКМ подпитывали на 4, 7, 11, 14, 18 и 20 день 6 мл среды для роста. На 7, 14 и 20 день ПКГКМ также промывали 4 мл ССРХ перед добавлением среды и время добавления среды отмечали. На 8, 15 и 21 день отбирали образец среды после 24 часов культивирования для исследования на продукцию чГР и ПКГКМ расщепляли для получения числа клеток следующим образом. В 15 мл пробирки добавляли раствор 2 мг/мл коллагеназы типа IA в ФБР в объеме 6 мл. ПКГКМ вынимали из чашек с помощью плоского пинцета и промокали на салфетке из абсорбентной бумаги перед переносом в раствор коллагеназы. Пробирки, содержащие ПКГКМ и раствор коллагеназы, закрепляли на орбитальном шейкере в инкубаторе для культур тканей, скорость устанавливали на 40 об/мин и ПКГКМ оставляли для расщепления на 2 часа. После 2 часов инкубации проводили диссоциацию ПКГКМ на единичные клетки с помощью энергичного пропускания смеси через 5 мл стеклянную пипетку. Дополнительная диссоциация считалась необходимой из-за наличия комочков, и добавляли раствор 10х трипсина: ЭДТА (0,5% трипсина, 5,3 мМ ЭДТА) для получения конечной концентрации трипсина в коллагеназе, равной 1х. Затем пробирки дополнительно инкубировали еще в течение 10 мин. Объем в каждой пробирке отмечали и суспензии клеток разводили в 2 раза ФБР и помещали в камеру гемацитометра для подсчета числа клеток. Продукция чГР в ПКГКМ в указанные моменты времени определяли с помощью радиоиммуноисследования образцов среды после 24 часов культивирования, как описано в примере VIII. В табл.5 (см. в конце описания) сведены данные по числу клеток в ПКГКМ в трех повторностях на каждый момент времени и продукции чГР в ПКГКМ на 8 (n=12), 15 (n=9) и 21 (n=6) день. Значения представлены средним арифметическим ± стандартное отклонение. Как показано в таблице 5, эти ПКГКМ поддерживают более высокую плотность клеток, чем ГКМ, описанные в примерах V и VI (таблицы 3 и 4). Степень продукции чГР на матрицу и на клетку была сходной в течение всего срока исследования.
Пример VIII
Экспрессию чГР контролировали путем количественного определения чГР с помощью радиоиммунометрического анализа по типу сэндвич (Allegro hGH Assay, Nichols Institute, Cat. 40-2205) с применением условий, рекомендуемых производителем.
Чтобы определить степень продукции чГР, культуральную среду меняли за 24 часа перед сбором клеток для пассирования. Во время пассажа отбирали образец культуры для исследования на чГР, а затем клетки собирали, подсчитывали и снова высевали. После подсчета собранных клеток рассчитывали уровни чГР и выражали в виде мкг чГР/24 часа/106 клеток.
Пример IX
В этом примере описана имплантация in vivo гибридных коллагеновых матриц (ГКМ), полученных, как описано в примере III, а также стандартных коллагеновых матриц (КМ), полученных, как описано в примере VI.
Для подкожной имплантации матриц мышам [М. musculus, линии N:NIH(S)-nu/nu (nude; Taconic Farms, Germantown, NY) производили внутрибрюшинную инъекцию авертина (раствор 2% вес/объем 2,2,2-трибромэтанола и 2% объем/объем 2-метил-2-бутанола) в дозе 0,0175 мл/г веса тела. Мышей, получивших анестезию, клали в боковое лежачее положение и подготавливали кожу, используя спирт и бетадин. На левом боку животного делали косой разрез. Подкожное пространство увеличивали путем быстрого препарирования до площади, немного большей, чем размер матрицы, которую нужно имплантировать. Матрицу помещали горизонтально в подкожное пространство и равномерно распределяли, используя хирургические щипцы Millipore. Разрез закрывали, используя хирургические скобки из нержавеющей стали.
Кровь собирали путем кровопускания из ретроорбитальной артерии после помещения мыши в большой лабораторный стакан, содержащий метоксифлуран (Pittman-Moore) до достижения легкой анестезии. Уровни чГР в сыворотке определяли, используя коммерчески доступный набор для радиоиммунометрического анализа по типу сэндвич, описанному выше. Анализ проводили, как описано и рекомендовано, за исключением того, что для получения корректных значений распадов/мин для построения стандартной кривой использовали контрольную сыворотку от не подвергавшихся воздействию мышей.
КМ и ГКМ для имплантации голым мышам получали, как описано в примерах I и VI, используя экспрессирующие чГР клетки HF165-24. В первом эксперименте (эксперимент 1, таблицы 6 и 7) было получено 13 матриц каждого типа. ГКМ были получены с плотностью посева (ПП) 5•106 клеток HF165-24 на матрицу, а стандартные коллагеновые матрицы (КМ) были получены с ПП 2•106 HF165-24 на матрицу. Меньшее количество клеток было использовано для посева в КМ потому, что эти матрицы не выдерживают такой высокой плотности клеток, как ГКМ (см. примеры V и VI). В последующих экспериментах (эксперименты 2 и 3, таблицы 6 и 7) испытывали только ГКМ матрицы (13 в каждом из экспериментов 2 и 3). Матрицы сохраняли в первичных 60 мм чашках и подпитывали 5 мл среды роста. Через 13 дней культивирования во все чашки вносили свежую питательную среду для роста; через 24 часа матрицы в трех повторностях каждого набора расщепляли для определения числа клеток и образцы среды от всех 13 матриц в каждом наборе анализировали на чГР.
Для эксперимента 1 во время имплантации среднее число клеток в КМ составляло 2,4•106 клеток/матрицу, тогда как среднее число клеток в ГКМ составляло 7,4•106 клеток/матрицу (таблица 6). Число клеток на матрицу было сходным с числом клеток для ГКМ, полученных в экспериментах 2 и 3 (8,9•106 и 9,2•106 клеток на матрицу ГКМ соответственно). В таблице 6 сведены число клеток (n= 3), продукция чГР на матрицу in vitro (n=13) и степень удельной продукции (мкг/106 клеток/24 часа; n=3) для каждой серии экспериментов in vitro. Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение. Как показано в табл. 6 (см. в конце описания), ГКМ выдерживали высокую плотность клеток и продуцировали более высокий уровень чГР на день имплантации, чем КМ.
Восемь матриц каждого типа имплантировали голым мышам в эксперименте 1, в то время как пять ГКМ имплантировали голым мышам в каждом из экспериментов 2 и 3. Уровни чГР в сыворотке измеряли через установленные интервалы после имплантации. Результаты представлены в табл.7 (см. в конце описания) и на фиг. 3. В эксперименте 1 у животных с имплантированной ГКМ поддерживались существенно более высокие уровни чГР в сыворотке, чем у животных с имплантированными КМ в течение 186 дней после имплантации. У животных с имплантированными ГКМ в экспериментах 2 и 3 показаны близкие высокие уровни чГР в сыворотке.
Пример Х
Гибридные матрицы этого изобретения должны быть изготовлены для имплантации людям следующим образом:
Желаемые клетки, обычно стабильно трансфицированные аутологичные клетки, полученные от больного, собирают с чашек с культурами ткани и обрабатывают для получения ГКМ или ПКГКМ любыми способами, описанными в примерах I-IV. Дозировка для данного больного (т.е. физиологически эффективное количество терапевтического продукта, продуцируемого матрицей) может быть изменена путем использования большей или меньшей матрицы, имллантирования разного числа матриц больному и/или использованием клеток, которые экспрессируют разный уровень продукта на клетку при создании матрицы. Количество терапевтического продукта, продуцируемое у больного, может также меняться путем воздействия на клетки в матрице фармакологического или физиологического сигнала, который изменяет экспрессию терапевтического гена. Например, если терапевтический ген находится под контролем реагирующего на глюкокортикоид промотора, то действие in vivo на клетки лекарства, такого как дексаметазон (путем введения лекарства больному таким образом, который обеспечивает лекарству доступ к имплантату), будет изменять экспрессию терапевтического гена.
Обычно нужно имплантировать много небольших матриц (примерно 1-2 см диаметром), полученных в 60 мы чашках Петри и содержащих порядка 10•106 клеток на матрицу. Таким образом, можно было бы имплантировать примерно 100 млн клеток, используя 10 небольших матриц. Использование матриц со значительно более высокой плотностью клеток (что получается путем включения, например, 2-фосфат-аскорбиновой кислоты) должно приводить к тому, что данному больному будет необходимо меньшее число матриц. Альтернативно, можно использовать большие чашки Петри (> 150 мм диаметром) в качестве формы для получения матриц большего размера, которые можно было бы или имплантировать непосредственно или разрезать на небольшие кусочки, которые и имплантируют.
До имплантации матрицы можно хранить или транспортировать в среде для роста или любом другом растворе, который позволяет сохранить клетки живыми. Альтернативно матрицы можно консервировать путем замораживания в соответствующей среде для замораживания, которую можно отмыть перед имплантацией.
Матрицы могут быть имплантированы в ряд мест, включая, но не ограничиваясь ими, внутрибрюшинное, в селезенке, в сальнике, в паху, интратекальное, интравентрикулярное и внутримышечное местоположение, а также в лимфатические узлы или в жировую ткань. Производится хирургический разрез в соответствующем месте, вводится матрица и разрез закрывается.
Пример XI
Существует ряд статических и перфузионных систем крупномасштабного культивирования in vitro, которые могут быть адаптированы для использования при производстве белка с использованием клеток, содержащихся в гибридных матрицах этого изобретения. В имеющемся ассортименте представлены различные уровни доступа на необходимых стадиях подачи и сбора среды перед очисткой целевых белков. Некоторые описаны ниже.
1. После формирования и созревания гибридных коллагеновых матриц (ГКМ) в обычных чашках Петри (например, после 10-25 дней инкубации) ряд этих ГКМ можно асептически перенести в стерильные Microcarrier Spinner Flask (объемом 250-100 мл). Эти ГКМ получают и сохраняют в условиях, которые обеспечивают максимальную плотность жизнеспособных клеток в каждой матрице. Обычно для этого необходимо 5-20 мл среды на каждый мл объема матрицы. Среду для продукции белка составляют так, чтобы она включала минимум неопределяемых компонентов (например, сыворотки) и могла включать дополнительные факторы, предназначенные для того, чтобы обеспечить максимум выхода продукции белка на клетку. Колбы для вращательного движения среды помещают в инкубатор с увлажнением с температурой 37±1oС, 5±1% CO2 на платформу магнитной мешалки, установленной на 30-70 об/мин. Через 1-3 дня колбу переносят в камеру с биологической защитой класса 100, и асептически отделяют производственную питательную среду, содержащую экспрессируемый белок, не взбалтывая осевшие матрицы. В колбу добавляют эквивалентный объем свежей среды для продукции белка и колбу возвращают на платформу для перемешивания в инкубатор.
2. Матрицы, описанные в (1) выше, можно асептически перенести в 1-5 л биореактор (например, Brunswick) с регулируемой осевой лопастной мешалкой. Уровень производственной питательной среды устанавливается регулирующей системой биореактора. Отбор среды и ее восполнение регулируется внутри стерильной закрытой системы в виде петли, для того чтобы свести к минимуму возможность загрязнения.
3. Для производства матриц больших объемов матрицы формируют из составляющих компонентов и дают образоваться гелю в бутылях для культур тканей с перемешиванием вращением. Бутыли инкубируют в статическом вертикальном положении до тех пор, пока контракция матриц не даст в результате свободно плавающие структуры (3-5 дней). Затем обновляют среду для выращивания и бутылки заполняют воздухом с 5% СО2 и помещают во вращающий аппарат в инкубаторе при 37oС. Среду для роста освежали каждые 2-3 дня до тех пор, пока не созреют ГКМ (10-25 дней инкубации в целом), после этого ГКМ помещали в среду для получения белка. Через 1-3 дня бутылки переносили в камеру с биологической защитой класса 100 и производственную питательную среду, содержащую экспрессируемый белок, асептически отбирали, не взмучивая матрицы. Эквивалентный объем свежей питательной среды для получения белка добавляют в бутылку, которую возвращают во вращаемый аппарат.
4. Составляющие ГКМ можно асептически вводить в стерильные газопроницаемые мешочки из тефлонатм через запаиваемое отверстие. Компонентам в мешочке дают образовать гель внутри мешочка и приобрести в нем форму и структуру. Мешочки инкубируют в увлажняемых термостатах при 37±1oС и 5±1% СО2. Когда ГКМ сжимаются и уменьшаются в объеме, для компенсации восполняют объем средой для роста. Отбор среды и ее обновление выполняется через стерильно соединяемые системы трубок, встроенных в мешочки. Использование снабженных отверстиями инкубаторов и протяженных трубопроводов должно дать возможность создания циклической насосной системы отбора/подачи, которая могла бы исключить необходимость удаления мешочков из инкубаторов во время производственного цикла.
5. Составляющие ГКМ можно асептически вводить в сделанные по заказу термическим формованием лотки с высокообъемной вместимостью. Самой простой формой был бы открытый, имеющий крышку прямоугольный поднос с возможностями для газообмена, сконструированный для использования в инкубаторе для культур тканей с повышенным содержанием СО2. Другая конструкция могла бы включать систему закрытой петли с отверстиями для доступа к резервуару со средой для регуляции подачи и отбора среды, похожую на камеру биореактора.
Другие варианты воплощения изобретения
Гибридные матрицы этого изобретения подходят для выделения (доставки в организм) широкого ряда продуктов клеток, включая не только чГР, но также фактора VIII, фактора IX, эритропоэтина (ЭПО), альбумина, гемоглобина, альфа-1-антитрипсина, кальцитонина, глюкоцереброзидазы, рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), рецепторов ИЛ-2 (IL-2), глобина, иммуноглобулина, каталитических антител, интерлейкинов, инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1), паратиреоидного гормона (ПТГ), лептина, интерферонов, факторов роста нервов, основного фактора роста фибробластов (оФРФ), кислого ФРФ (кФРФ), эпидермального фактора роста (ЭФР), фактора роста эндотелиальных клеток, фактора роста, получаемого из тромбоцитов (ФРПТ), факторов трансформации роста, фактора эндотелиальных клеток, стимулирующего ангиогенез (ЭФСА), ангиогенина, активатора тканевого плазминогена (т-АП), колониесхгимулирующего фактора гранулоцитов (Г-КСФ), колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (ГМ-КСФ). Например, клетки, помещенные в матрицу, могут быть бета-клетками поджелудочной железы, которые природно секретируют инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы в крови и которые поэтому могут восполнять неадекватное выделение инсулина у пациентов с диабетом и преддиабетическим состоянием. Альтернативно они могут быть клетками любого типа, генетически сконструированными для экспрессии и секреции высоких уровней необходимого полипептида, такого как фактор свертывания крови, в организме пациента. Такая конструкция может находиться под контролем структурно активируемого промотора или соответственно физиологически или фармакологически регулируемого промотора.
Часть матрицы из коллагенового геля может целиком состоять из нерастворимых коллагеновых фибрилл или может содержать другие компоненты в дополнение к коллагену: например, агарозу, альгинат; гликозаминогликан, такой как гиалуроновая кислота, гепарансульфат, дерматансульфат или хондроитинсульфат; сульфатированный протеогликан; фибринонектин; ламинин; эластин; фибрин или тенасцин. Такие компоненты (особенно те, которые найдены в межклеточном матриксе тканей животных) способствуют структурной стабильности гибридных матриц этого изобретения и/или обеспечивают дополнительную способность связывания для клеток в матрицах и с тканями хозяина в месте имплантации. Они должны включаться в матрицы путем смешивания с раствором коллагена перед образованием геля.
Другие потенциальные добавки включают цитокины и/или факторы роста, которые применимы для оптимизации сохранения клеток или стимуляции благоприятного взаимодействия с тканями хозяина (например, васкуляризации), включая оФРФ (bFGF), КФРФ (aFGF), фактор роста эндотелиальных клеток (ФРЭК) (PDGF), фактор эндотелиальных клеток, стимулирующий ангиогенез (ЭСАФ) (ESAF), лейкотриен С4, простагландины (например, ПГЕ1 (PGE1), ПГЕ2 (PGE2) ), ИФР-1 (IGF-1), ГКСФ (GCSF), ангиогенин, ТГФ-α (TGF-α), ТГФ-β (TGF-β), аскорбиновая кислота, ЭФР (EGF) и онкостатин М. Эти добавки могут включаться в матрицу путем их смешивания с раствором коллагена перед образованием геля, путем их введения в промежуточное пространство микросфер или путем включения их в среду, которая омывает матрицы.
В качестве альтернативы могут быть генетически сконструированы для экспрессии желаемого продукта. Например, клетки матрицы могут быть сотрансфицированы ДНК, кодирующей фактор ангиогенеза, и ДНК, кодирующей второй терапевтический белок, или единственным вектором, кодирующим оба типа белков, связанным с подходящими регулирующими экспрессию последовательностями.
Коллаген, используемый в геле, может быть любого подходящего типа (например, типа I-XI) или смесью любых двух или более. В форму перед образованием геля из коллагена могут быть помещены волокна, так что они становятся интегральной частью матрикса и способствуют прочности матрицы и удобству обращения с ней. В обычном случае волокна могли бы быть изготовлены в основном из коллагена (например, кетгута) или неколлагенового материала, такого как найлон, дакрон, политетрафторэтилен (Gore-Texтм или Teflonтм), полигликолевая кислота, смесь полимолочной/полигликолевой кислот (Vicrylтм), полистирол, поливинилхлоридный сополимер, целлюлоза (например, хлопок или лен), полиэфир, гидратцеллюлоза или шелк. Волокна могут быть сплетены в сетку или ткань или использованы в виде нитей.
Вместо микросфер из коллагена типа I, описанных в вышеприведенных примерах, можно использовать микросферы, состоящие главным образом из коллагена другого типа, полистирола, декстрана (например, Cytodexтм, Pharmacia), полиакриламида, целлюлозы, альгината кальция, латекса, полисульфона, стекла (покрытого веществом, таким как коллаген, которое способствует связыванию клеток) или комбинаций коллагена с любым из вышеперечисленных. Такие микросферы коммерчески доступны или могут быть изготовлены стандартными способами и затем простерилизованы для использования в гибридных матрицах этого изобретения.
Другие варианты воплощения данного изобретения находятся в пределах объема нижеследующей формулы изобретения.
Изобретение может быть использовано в медицине для получения и доставки применяемых в медицине веществ. Имплантируемое устройство имеет корпус из матричного материала, образованный фибриллами нерастворимого коллагена и расположенными в нем: (а) множеством клеток млекопитающих и (б) множеством микросфер, каждая из которых состоит в основном из одного или более следующих веществ: коллагена, полистирола, декстрана, полиакриламида, целлюлозы, альгината кальция, латекса, полисульфона или стекла. Изобретение расширяет ассортимент средств, предназначенных для получения и доставки применяемых в медицине веществ. 6 с. и 78 з.п.ф-лы, 7 табл., 3 ил.
| US 4857053 15.08.1989 | |||
| US 4485096 27.11.1984 | |||
| Домовый номерной фонарь, служащий одновременно для указания названия улицы и номера дома и для освещения прилежащего участка улицы | 1917 |
|
SU93A1 |
| ТРЕХМЕРНЫЙ БИОАКТИВНЫЙ НОСИТЕЛЬ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ | 1992 |
|
RU2014359C1 |
| ТКАНЕВЫЙ ТРАНСПЛАНТАТ | 1991 |
|
RU2037317C1 |
