СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ВТОРИЧНОГО ИММУНОДЕФИЦИТНОГО СОСТОЯНИЯ ПО Т-КЛЕТОЧНОМУ ТИПУ Российский патент 1995 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, преимущественно к иммунологии, и может найти применение для моделирования недостаточности иммунной системы по тимусзависимому типу с целью изучения патогенетических механизмов развития вторичного иммунодефицитного состояния, включая и синдром вторичного иммунодефицита, разработки новых методов иммунокоррекции, принципов лекарственной терапии и прогнозирования лечения.

В последние годы увеличилось число заболеваний, в основе которых лежит нарушение различных звеньев иммунной системы. К ним относятся аутоиммунные заболевания, аллергозы, поствакцинальные осложнения, вялотекущие хронические инфекции и другие болезни, развитие которых обусловлено угнетением Т- или В-систем иммунитета. Особое значение эта проблема приобретает при синдроме вторичного иммунодефицита (СПИД), изучении патогенеза, способах лечения, прогнозирования течения этого заболевания. До сих пор нет достаточно эффективных способов иммуносупрессивной и иммуностимулирующей терапии таких заболеваний, вследствие отсутствия расшифровки их возникновения и участия различных биологически активных веществ макроорганизма в данных процессах и реакциях. Поэтому разработка простых и эффективных способов моделирования вторичных иммунодефицитных состояний тимусзависимого и тимуснезависимого характера является актуальной проблемой прикладной и фундаментальной иммунологии.

Проведенными исследованиями по патентной и научной медицинской литературе выявлены различные способы моделирования вторичных иммунодефицитных состояний. Так, в работах А.В.Максимова "Экспериментальное изучение аутоиммунной гемолитической анемии и влияние иммуномодуляторов на ее течение" (1987); Б. Н. Софронова, Т.Г.Шемеровской "Иммунологическая толлерантность, индуцируемая у взрослых иммунореактивных организмов" ж. Иммунология, 1990, N 4, с. 4-6; а также в авт. св. N 1005157 "Способ моделирования гиперфункции иммунной системы", Лубэ В.М. с соавт. и авт.св. N 1205169 "Способ моделирования иммунодефицитного состояния", Сизякина Л.П с соавт. описаны способы, предусматривающие подавление реакций иммунной системы с помощью химических факторов лекарственных иммунодепрессантов, таких как циклофосфомид, батриден, гепарин, антилимфоцитарный глобулин и физических факторов низкочастотного ультразвука или жесткого рентгеновского облучения. Этим способам свойственны следующие недостатки: общее недифференцированное антиметаболическое влияние на организм, необходимость многократного использования больших доз препаратов для получения ожидаемого эффекта, а также трудность точного подбора эффективных, но не смертельных доз и схем применения иммунодепрессантов, сочетая их с выраженным антигенным воздействием.

Прототипом настоящего изобретения является способ моделирования вторичного иммунодефицитного состояния, авт.св. N 1476517, Сизякина Л.П. Москаленко Е.П. Клембицкая И.В. Способ заключается в следующем. Подопытным животным (белые беспородные мыши-самцы массой 10-12 г) вводят гамма-глобулин против СКО (субкомиссуральный орган) мозга, полученный следующим образом: у крупного рогатого скота выделяется область четверохолмия мозга и иссекается субкомиссуральный орган, расположенный под задней комиссурой мозга. Затем 1 г СКО мозга измельчается с 1 мл стерильного физраствора до получения одноpодной консистенции и смешивается с 2 мл полного адъюванта Фрейнда, этой эмульсией иммунизируют собак в подушечки задних лап и в кожу спины из расчета 0,2 мл/кг массы тела. Через 14 дней после иммунизации у собак берут кровь, получают гипериммунную сыворотку, выделяют из нее гамма-глобулиновую фракцию спиртовым осаждением. Полученный гамма-глобулин против СКО мозга в дозе 0,1 мг внутрибрюшинно однократно вводят беспородным белым мышам-самцам массой 10-12 г. Для контроля полученных изменений в иммунной системе у животных изучают первичный иммунный ответ на эритроциты барана. Этому способу свойственны следующие недостатки: длительность получения гамма-глобулина против СКО, нестандартность получаемого препарата, вследствие чего при моделировании вторичного иммунодефицита возникает ряд побочных реакций, большая вариабельность получаемых результатов, искажающих воспроизводимую модель.

Целью настоящего изобретения является упрощение способа и повышение воспроизводимости модели за счет применения стандартного препарата.

Способ осуществляется следующим образом. Для осуществления способа используют коклюшную агглютинирующую сыворотку, выпускаемую Московским институтом эпидемиологии и микробиологии АМН СССР им. Н.Ф.Гамалеи. Модель вторичного иммунодефицитного состояния воспроизводят на мышах-самцах путем введения в организм внутрибрюшинно коклюшной агглютинирующей сыворотки в дозе 0,1 мл однократно. Для контроля полученных изменений в иммунной системе у экспериментальных животных изучали первичный иммунный ответ к эритроцитам барана 3 (тимусзависимый антиген) и брюшнотифозному Ви-антигену (тимуснезависимый антиген). Данные исследований свидетельствуют о развитии вторичного иммунодефицитного состояния при отсутствии иммунного ответа к эритроцитам барана и наличии иммунных реакций к брюшнотифозному Ви-антигену.

Это подтверждается следующими данными: 2-м белым беспородным мышам-самцам массой 14 г ввели коклюшную агглютинирующую сыворотку серии 184, полученную из Московского института эпидемиологии и микробиологии АМН СССР им. Н. Ф.Гамалеи в дозе 0,1 мл внутрибрюшинно однократно. Для контроля состояния иммунной системы через 24 ч после введения препарата одно животное иммунизировали эритроцитами барана (тимусзависимый антиген) в дозе 1 х 10⁸ в объеме 0,5 мл. Второе животное иммунизировали брюшнотифозным Ви-антигеном в дозе 5 мкг/мышь в том же объеме. Через 5 сут после инокуляции тест-антигенов определяли уровень антител в сыворотке крови животных: у первой мыши к эритроцитам барана (ЭБ) в реакции геммагглютинации, у второй к брюшнотифозному Ви-антигену в реакции пассивной геммагглютинации.

Данные исследований, представленные в таблице 1, свидетельствуют о развитии вторичного иммунодефицитного состояния по Т-клеточному типу, т.е. подавление имунной реакции к тимусзависимому антигену (эритроциты барана), не касаясь формирования иммунного ответа к тимуснезависимому антигену (брюшнотифозный Ви-антиген).

Применение способа позволяет упростить воспроизведение модели вторичного иммунодефицита по Т-клеточному типу и избежать вариабельности результатов.

Современные представления о способе поддержания гомеостаза свидетельствуют о том, что наибольшее значение имеют те микроорганизмы, реакция на которые может быть направлена на клетки с иммуносупрессивной активностью (Т-супрессоры), следствием чего является развитие системной аутоагрессии. В отношении коклюшной вакцины интерес представляет факт антигенного сходства микробных субстанций с веществом головного мозга млекопитающих (Брусина Л.И. Сапожникова А. М. Перекрестные реакции между антигенами микобактерий БЦЖ, бактерий коклюша и мозговой тканью человека. Ж. Иммунология. 1986, N 6, с. 55-58), которое в свою очередь включает Thy-1 антиген-маркер Т-лимфоцитов (Белокрылов Г. А. с соавт. "Thy-1 антиген; как стимулятор иммуногенеза". Ж. Иммунология, 1982, N 6, с.63). Исходя из общности антигенных детерминант можно предположить воздействие противококлюшных антител на Thy-позитивные клетки. В нашей лаборатории были проведены опыты по изучению механизма действия противококлюшных антител на иммунную систему взрослых иммунореактивных организмов. Для этого отдельные порции противококлюшных антител истощали гомогенатами головного мозга, тимоцитами и отмытой взвесью коклюшных микробов, а затем изучали влияние истощенных сывороток на реакции иммунитета. Результаты опытов показали, что нативная коклюшная сыворотка, а также сыворотка, истощенная гомогенатами печени и эритроцитами, оказывали выраженный супрессивный эффект на формирование гуморальных реакций к тимусзависимому антигену. В том случае, когда истощение коклюшной сыворотки проводили гомогенатами головного мозга, тимоцитами, а также взвесью коклюшных бактерий происходила отмена cупрессии иммунологических реакций. Это свидетельствует о том, что наблюдаемый эффект иммуносупрессии связан с перекрестом антигенных детермитант между тканью головного мозга, тимоцитами и микробными антигенами коклюшных бактерий.

Снятие эффекта после истощения сывороток тимоцитами или суспензией головного мозга свидетельствует о том, что мишенью для коклюшных антител являются Т-клетки. Вероятно при этом может происходить делеция предшественников антигенреактивных Т-клеток за счет механизма, именуемого апоптозом, связанного с деградацией ДНК (Smider R. Lees R. e.a. //J. epx. Med, 1989, vol, 169, N 6, р.2149; Smith Ch. Williams G.T. Kingston R. e.a. // Nature. 1989, vol. 337, N 6203, р.181-184).

В нижеприведенных данных представлены результаты по отработке оптимальных доз противококлюшной сыворотки, индуцирующих вторичное иммунодецифитное состояние по Т-клеточному типу.

Для изучения влияния разных доз коклюшной агглютинирующей сыворотки на формирование иммунодефицитного состояния в макроорганизме, белых беспородных мышей инокулировали коклюшной агглютинирующей сывороткой в дозах составляющих: 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,11 0,12 0,13 0,14 0,15 0,16 мл. Контрольных мышей инокулировали нормальной кроличьей сывороткой в тех же дозах. Спустя сутки, одну часть экспериментальных животных иммунизировали тимусзависимым (ЭБ) антигеном, а вторую часть тимусзависимым антигеном (Ви-антиген). Через 5 сут определяли уровень антител к ЭБ и Ви-антигену у опытных и контрольных животных. Результаты исследования, представленные в табл.2, показали, что оптимальной дозой для индукции вторичного иммунодефицитного состояния по Т-клеточному типу является доза коклюшной агглютинирующей сыворотки, составляющая 0,1 мл, которая приводит к 64-х кратному снижению титра антител к эритроцитам барана, регистрируемого в реакции гемагглютинации и не влияет на уровень антител к тимуснезависимому антигену. Введение коклюшной агглютинирующей сыворотки в дозах 0,09-0,08 мл подавляет уровень гуморального иммунитета к тимусзависимому антигену в 8-16 раз, а использование коклюшной сыворотки в дозах 0,06-0,05 мл практически не влияет на гуморальный ответ к эритроцитам барана. Увеличение дозы коклюшной агглютинирующей сыворотки с 0,11 до 0,16 дает такой же эффект, как и доза 0,10 мл, т.е. подавление гуморального ответа к тимусзависимому антигену соответствовало 64-х кратному снижению титра антител к эритроцитам барана, не касаясь уровня антительного ответа к тимусзависимому антигену.

Таким образом, оптимальной дозой коклюшной агглютинирующей сыворотки для индукции вторичного иммунодефицитного состояния по Т-клеточному типу является доза, составляющая 0,10 мл, так как уменьшение дозы коклюшной сыворотки с 0,09 мл и ниже было недостаточным для воспроизведения эффекта иммуносупрессии, а увеличение дозы сыворотки с 0,11 мл и выше считаем нецелесообразным ввиду неоправданно большого расхода используемого материала.

Специфичность иммуносупрессии гуморального ответа к тимусзависимому антигену именно коклюшной агглютинирующей сывороткой проверяли экспериментами, связанными с использованием противобактериальной сыворотки другой специфичности антитоксической антистафилококковой сывороткой. Данные исследований представлены в табл.3.

Как видно из представленных результатов, обработка мышей антитоксической антистафилококковой сывороткой не приводит к индукции иммунодефицитного состояния и уровень антител к тимусзависимому антигену (ЭБ), выявляемый в РГА, не уступает уровню антител у мышей, обработанных нормальной сывороткой.

П р и м е р 1. Двум беспородным белым мышам внутрибрюшинно однократно ввели коклюшную агглютинирующую сыворотку в дозе 0,09 мл. Двум контрольным мышам ввели нормальную кроличью сыворотку в той же дозе. Через 24 ч контрольных и опытных животных проиммунизировали эритроцитами барана и Ви-антигеном. 5 сут. спустя определяли уровень антител к ЭБ и Ви-антигену.

Как видно из табл.4 обработка мышей коклюшной агглютинирующей сывороткой в дозе 0,09 мл приводила к снижению уровня антител к ЭБ в 16 раз, что было недостаточным для полного воспроизведения эффекта иммуносупрессии по Т-клеточному типу.

П р и м е р 2. Двум беспородным белым мышам внутрибрюшинно однократно ввели коклюшную агглютинирующую сыворотку в дозе 0,10 мл. Двум контрольным мышам ввели нормальную кроличью сыворотку в той же дозе. Через 24 ч контрольных и опытных животных проиммунизировали эритроцитами барана и брюшнотифозным Ви-антигеном. 5 сут спустя в сыворотке крови животных определяли уровень антител к ЭБ и Ви-антигену.

Как видно из таблицы 5, обработка мышей коклюшной агглютинирующей сывороткой в дозе 0,10 мл приводила к резкому угнетению гуморальной реакции к эритроцитам барана. Антитела у мыши, обработанной нормальной сывороткой, выявлялись в титрах 1: 1280, тогда как у мыши, обработанной коклюшной сывороткой, уровень антител к ЭБ снижался в 64 раза и выявлялся в титре 1:20. Уровень антител к тимусзависимому антигену, как у опытной, так и у контрольной мышей не отличался. Угнетение гуморальной реакции к тимусзависимому антигену свидетельствовало о развитии вторичного иммунодефицитного состояния по Т-клеточному типу.

П р и м е р 3. Двум беспородным белым мышам внутрибрюшинно, однократно ввели коклюшную агглютинирующую сыворотку в дозе 0,11 мл. Двум контрольным мышам ввели нормальную кроличью сыворотку в той же дозе. Через 24 ч контрольных и опытных животных иммунизировали ЭБ и Ви-антигеном. 5 сут спустя в сыворотке крови животных определили уровень антител к ЭБ к Ви-антигену.

Результаты опыта, представленные в табл.6, свидетельствуют о том, что предварительное введение коклюшной агглютинирующей сыворотки в дозе 0,11 мл в организм животного также приводит к развитию вторичного иммунодефицитного состояния. Титры антител к тимусзависимому антигену (ЭБ) у мыши, обработанной коклюшной агглютинирующей сывороткой были в 64 раза ниже, чем у контрольного животного.

Таким образом, использование предлагаемого способа по сравнению с прототипом значительно упрощает метод и повышает воспроизводимость моделирования вторичного иммунодецифитного состояния за счет применения стандартного препарата.

Использование: медицина, преимущественно иммунология, для моделирования недостаточности иммуной системы по тимусзависимому типу с целью изучения патогенетических механизмов развития вторичного иммунодефицитного состояния, разработки новых методов лечения, принципов лекарственной иммунокоррекции. Цель: упрощение метода и повышение воспроизводимости модели вторичного иммунодефицитного состояния. Сущность: подопытным животным вводят коклюшную агглютинирующую сыворотку в дозе 0,10 мл однократно внутрибрюшинно. Применение способа позволяет значительно упростить способ и исключить вариабельность результатов за счет использования стандартного препарата. 6 табл.

СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ВТОРИЧНОГО ИММУНОДЕФИЦИТНОГО СОСТОЯНИЯ ПО Т-КЛЕТОЧНОМУ ТИПУ путем иммунизации животного, отличающийся тем, что для иммунизации используют клеточную коклюшную агглютинирующую сыворотку, которую вводят в дозе 0,5 г/кг массы тела внутрибрюшинно, однократно.