Композиция, обладающая иммуностимулирующим действием для сублингвального применения Российский патент 2018 года по МПК A61K9/50 A61K31/7105 A61K31/732 A61K33/06 A61K31/715 A61P37/04 

Область техники

Изобретение относится к биологически активным добавкам для профилактики вирусных заболеваний человека и предназначено для сублингвального применения в период угрозы эпидемий вирусных инфекций и при заболеваниях, приводящих к ослаблению иммунитета.

Уровень техники

Перспективная фармакологическая защита организма человека заключается в применении таких лекарственных средств, когда под их воздействием любая клетка организма выполняет свою, возложенную на нее природой функцию. Индивидуальные особенности любого организма заключаются в том, что экзогеннную рибонуклеиновую кислоту (РНК) иммунная система воспринимает как чужеродную, как посягательство на суверенитет (статус) систем организма. Вследствие этого введение любой формы РНК вызывает стимуляцию его защитных факторов и мобилизацию сил для встречи врага-патогена.

Препараты на основе РНК все шире используются при создании лекарственных средств для профилактики и лечения актуальных инфекционных заболеваний. Наличие в составе фармакологического средства РНК позволяет активировать целый комплекс механизмов защиты клетки и расширяет возможности иммунопрофилактики, особенно в случае высокой изменчивости возбудителей: вирусы гриппа, папилломы человека, ВИЧ. Такими препаратами являются индукторы интерферона на основе двуспиральной РНК микробиологического происхождения - ридостин, ларифан, рифастин [1-4].

Ридостин относится к высокомолекулярным индукторам интерферона природного происхождения, его действующим началом является двуспиральная рибонуклеиновая кислота (дсРНК) киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Ларифан - высокомолекулярный индуктор интерферона природного происхождения, представляет собой дс-РНК фага f2 [4].

Рифастин - индуктор интерферона природного происхождения, представляет собой двуспиральную РНК бактериофага ϕ6.

Препараты на основе индуктора интерферона, двуспиральной РНК, обладают эффективностью при лечении не только вирусных, но и других инфекционных заболеваний, как видно из таблицы 1 [5].

Поскольку действующее начало имеет физико-химическую структуру, близкую к структуре генетического материала патогенных вирусов и бактерий, то введение двуспиральной РНК вызывает мощный иммунный ответ в организме, включающий индукцию интерферонов, стимуляцию фагоцитарной активности макрофагов и нейтрофилов периферической крови и другие процессы, противодействующие инфекции.

Задача изобретения состояла в разработке состава композиции биологически активной добавки на основе РНК, стимулятора иммунитета, для сублингвального применения.

Аналоги и их недостатки

Выпускаемый препарат Ридостин [1-3], представляющий собой смесь натриевых солей двуспиральной и одноцепочечной рибонуклеиновой кислоты, производит Российская фармацевтическая компания ООО «Диа-Фарм» на основе лицензионного договора на передачу прав по Патенту РФ №2083221, МПК А61К 38/20, опубл. 10.07.1997 г. с ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Известно, что указанный препарат рекомендован для профилактики гриппа и ОРЗ инъекционно в дозе 8 мг на человека 1 раз: до заболевания или в день обращения больного к врачу, а при терапии гриппа и ОРЗ препарат назначают инъекционно по 8 мг на человека 2 раза: в день обращения больного к врачу и через 2 дня.

Недостатки способа: для профилактики и лечения заболеваний, вызванных штаммами субтипа H5N1 вируса гриппа птиц, такая схема препарата не дает надежного эффекта, особенно при лечении, и требует разработки иной схемы применения данного индуктора интерферона в комбинации с другими противовирусными препаратами.

Известен патент 2398596, в котором описан способ профилактики и лечения заболеваний, вызванных штаммами субтипа H5N1 вируса гриппа птиц, с использованием индуктора интерферона и ингибитора нейраминидазы, включающий введение в организм препарата индуктора интерферона или совместно индуктора интерферона и ингибитора нейраминидазы озельтамивира, согласно изобретению в качестве индуктора интеферона используют препарат Ридостин, который при профилактике заболеваний вводят в организм инъекционно в диапазоне доз от 0,05 до 0,5 мг/кг 1 раз в сутки и далее через 1 и 3 суток после первого введения Ридостина. При лечении заболеваний вводят в организм Ридостин инъекционно в диапазоне доз от 0,05 до 0,5 мг/кг 1 раз в сутки в день инфицирования и далее через 1 и 3 суток после инфицирования и ингибитор нейраминидазы озельтамивир перорально в диапазоне доз от 0,2 до 2 мг/кг 2 раза в сутки в течение 5-7 суток после инфицирования вирусом гриппа H5N1.

Недостатки способа: препарат Ридостин необходимо вводить инъекционно, несколько раз, под контролем медицинского работника, сочетая с употреблением препарата озельтамивир (тамифлу). Этот способ значительно стимулирует иммунную систему и оправдан при заболевании или угрозе заражения особо опасными инфекциями. При вероятности заражения ОРЗ или сезонным гриппом такая стимуляция иммунной системы избыточна.

Известен также патент РФ 2191594. Средство и способ повышения резистентности к инфекции. МПК А61К 38/21, опубл. 27.10.2002 г. Сущность изобретения состоит в том, что разработан препарат интерферона (ИФН), для чего используют сублингвальные гранулы, содержащие низкие дозы препарата реаферон или реальдирон или ингибитор ИФН (ридостин, ларифан, полудан, амиксин и т.д.). Содержание индукторов интерферона в сублингвальных гранулах составляет 0,01-5 мг в грануле без рекомендации четкой дозировки для каждого препарата из заявленной группы: амиксин, циклоферон, неовир, ридостин, полудан, ларифан, кагоцел, а также из группы: дибазол, папаверин, кофеин, курантил. Сублингвальные гранулы весом по 0,05 г готовятся на основе сахарозы или лактозы. Для диабетиков возможно применение капель.

Данное средство имеет следующие недостатки: сублингвальные гранулы содержат индуктор интерферона в малых дозах, по этой причине, как указано в патенте, даже для профилактики заболевания необходимо одномоментно использовать до 5 гранул и для достижения эффекта принимать их 1-3 раза в день. Данные об эффективности сублингвальных гранул, содержащих индуктор интерферона, при использовании для лечения заболевания отсутствуют. При этом препарат проявляет заявляемый эффект при совместном использовании с препаратом альфа-2 интерферона. Кроме того, нет сведений о лечебно-профилактическом действии препарата в отношении заболеваний, вызванных штаммами субтипа H5N1 вируса гриппа птиц.

Недостатки способа: способ предполагает использование рекомбинантного человеческого интерферона α2β, полученного путем микробиологического синтеза и специальной технологии его очистки. Известно, что при длительном применении рекомбинантных цитокинов организм начинает вырабатывать к ним антитела, которые нейтрализуют активность вводимых белков, и дозы последних приходится увеличивать.

Кроме того, указанные препараты относятся к лекарствам и требуют врачебного назначения в соответствующих лечебных дозах, что не позволяет широко использовать их для профилактических и оздоровительных целей в качестве БАД

Перспективным в качестве профилактического средства представляется использование сублингвальной формы РНК.

Раскрытие изобретения

Задача изобретения состояла в разработке состава композиции биологически активной добавки на основе РНК, стимулятора иммунитета, для сублингвального применения, которая, наряду с использованием полезных свойств РНК, обладала бы более широким спектром эффективного действия на организм, что позволило бы пополнить ассортимент пищевых добавок общеукрепляющего назначения.

Поставленная задача решена путем включения РНК в микрокапсулы, образованные из лактата кальция и пектина, на основе которых создана сублингвальная форма биологически активной добавки для стимуляции иммунитета.

Содержание компонентов: двуспиральная РНК 0,5±0,1 мг, одноцепочечная РНК 4,5±0,5 мг, пектин и лактат кальция используются в количествах, необходимых для образования микрокапсул. Для растворения пектина и лактата кальция используется раствор декстрана с молекулярной массой 40000 Да, применяемый в медицине в качестве кровезаменителя (Реополиглюкин).

Примеры конкретного выполнения

1. Выбор соотношения компонентов для формирования микрокапсул

Были подобраны соотношения компонентов: пектина и кальция лактата таким образом, чтобы образовывались однородные капсулы. Ряд соотношений основных компонентов представлены в таблице 2.

Наиболее однородные микрокапсулы наблюдались при соотношении компонентов, мг/г: пектин - 20, кальция лактат - 15, которые и были выбраны для дальнейших исследований. Препарат назвали Рикальцин.

На Рис. 1 приведен вид микрокапсул при микроскопировании (увеличение 100, 10×10).

2. Получение биологически активной добавки на основе РНК

2.1. Получение биологически активной добавки на основе дрожжевой РНК

Средство получают в два этапа: приготовление растворов (А и Б) и образование микрокапсул при их смешивании.

Для приготовления раствора А навеску ридостина (лиофилизированная пористая масса по ФС 42-3862-99 [6, 7], содержащая смесь натриевых солей нуклеиновых кислот: 10% двуспиральной РНК и 90% одноцепочечной РНК) массой 5 мг растворяют в 0,7 мл раствора реополиглюкина (декстран с молекулярной массой 30000-40000 Да в 0,9%-ном растворе NaCl по ФСП 42-0088-7009-05,2006 [8]), затем добавляют и растворяют 20-22 мг пектина.

Раствор Б готовят растворением навески лактата кальция массой 15-17 мг в 0,3 мл раствора реополиглюкина.

Раствор Б быстро вносят в раствор А при интенсивном перемешивании и оставляют на 10-15 мин для формирования трехмерных микрокапсул.

2.2. Получение биологически активной добавки на основе двуспиральной РНК бактериофага и одноцепочечной дрожжевой РНК

Для приготовления раствора А навеску рифастина, содержащую дсРНК бактериофага ϕ6 (производство ИМБТ ГНЦ ВБ Вектор), массой 0,5 мг растворяют в 0,7 мл раствора реополиглюкина (декстран с молекулярной массой 30000-40000 Да в 0,9%-ном растворе NaCl по ФСП 42-0088-7009-05,2006 [8]), добавляют и растворяют навеску полирибоната (препарат высокополимерной РНК из пекарских дрожжей по ТУ 9381-018-00479979-01 [9]) и затем добавляют и растворяют 20-22 мг пектина.

Раствор Б готовят растворением навески лактата кальция массой 15-17 мг в 0,3 мл раствора реополиглюкина.

Раствор Б быстро вносят в раствор А при интенсивном перемешивании и оставляют на 10-15 мин для формирования трехмерных микрокапсул.

3. Изучение кинетики высвобождения РНК из микрокапсул в физиологическом растворе и соляной кислоте при 37°C путем измерения оптической плотности при 260 нм. При исследовании кинетики высвобождения РНК пластинки препарата размерами: 1,5×1×0,25 см помещали в бюксы, добавляли 5 мл физиологического раствора (или 0,5% соляной кислоты). Через определенные промежутки времени замеряли оптическую плотность при длине волны 260 нм раствора (надосадочной фракции). По результатам измерений строили график зависимости оптической плотности в оптических единицах от времени в минутах.

Максимум концентрации РНК при диффузии в физраствор зафиксирован через 1,5-2,5 часа, он равнялся 3,8 -4 мг РНК (75-80% от исходного содержания), оставаясь на данном уровне в течение 12 часов. При этом внешний вид микрокапсул при микроскопировании значительно не изменялся.

При диффузии в раствор 0,5% соляной кислоты максимум концентрации РНК зафиксирован через 2 часа, значение концентрации было равным 1,5-1,8 мг, далее содержание РНК постепенно снижается до 0 в течение следующих 3 часов. Микрокапсулы при этом деформировались.

4. Оценка стабильности препаратов

Стабильность препаратов оценивали методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.

При анализе электрофорезом в 1%-ном геле агарозы было установлено, что подвижность РНК в препарате снижена по сравнению с подвижностью исходной (субстанция РНК), но структура ее сохраняется (Рис. 1). Аналогичное сохранение РНК было установлено после хранения препарата в течение 90 суток в условиях холодильника, при 6°C.

На Рис. 2 приведена Электрофореграмма (1%-ный гель агарозы, окрашивание бромистым этидием) образцов РНК, диффундировавшей в раствор через 2, 4 и 8 ч из микрокапсул. И - исходная (субстанция РНК).

Слева препарат на основе дрожжевой РНК, справа - двуспиральная РНК бактериофага.

5. Определение иммуностимулирующих свойств препаратов

Для определения фагоцитарной активности использовали двухмесячных сирийских (золотистых) хомяков с массой тела 90-110 г, по 5 голов в каждой группе, полученных из питомника. Для этого им скармливали по 0,2 г препарата. Через 6 и 24 ч брали на анализ кровь и выделяли макрофаги. В качестве объекта фагоцитоза использовали частицы туши. Фагоцитарную активность определяли по фагоцитарному индексу (ФИ) общепринятым способом [10].

Биологическую активность образцов Рикальцина оценивали на хомяках по его способности повышать фагоцитарную активность макрофагов, определяя фагоцитарный индекс.

На Рис. 3 приведен фагоцитарный индекс макрофагов после введения препарата Рикальцина.

Различия с контролем (капсулы, не содержащие РНК) достоверны при P<0,05.

Как видно из графика (Рис. 3), повышение активности наблюдалось через 6 ч после введения препарата, эффект стимуляции усиливался через 24 ч. Эти данные согласуются с результатами работы авторов [11], которые использовали введение препарата вирусоподобных частиц из дрожжей, содержащих РНК.

Результат, достигаемый при использовании изобретения, заключается в таком подборе ингредиентов, который позволяет, с одной стороны, поддерживать и стимулировать иммунную систему организма, благодаря наличию РНК в составе. С другой стороны, предлагаемая БАД будет обеспечивать организм микроэлементами, необходимыми для его нормального функционирования и пищевыми волокнами, оказывающими регулирующее воздействие на обмен веществ.

Также следует отнести к достоинствам БАД сублингвальный способ приема: в этом случае компоненты не будут подвергаться деградирующему воздействию желудочного сока и пищеварительных ферментов.

Технологический процесс получение привлекателен отсутствием технически сложных приемов и состоит из следующих несложных стадий: растворение, смешивание, формование.

Полезность БАД и отсутствие технических сложных решений при изготовлении, может способствовать освоению широкого промышленного выпуска препарата.

Препарат, получаемый в форме пластин, применяется сублингвально в качестве БАД. Рекомендуемая профилактическая доза по одной пластинке ежедневно при угрозе возможной инфекции.

Использованные источники информации

1. Интерфероногены: перспективы клинического применения. Руководство для врачей. Под редакцией М.Г. Романцова. НТФФ "Полисан", Москва - Санкт-Петербург, 1998.

2. ФС 42-3862-99 утверждена 20 января 2000 года «РИДОСТИН - противовирусный препарат, иммуностимулятор, индуктор интерферона».

3. ФСП 42-0197-06-16-00 утверждена 6 декабря 2000 года «РИДОСТИН-МАЗЬ - противовирусный препарат, индуктор интерферона».

4. Что такое Ларифан. URL http://www.larifans.lv/

5. Применение ридостина для лечения вирусных и бактериальных инфекций и перспективы его применения при лечении заболеваний неинфекционной природы. Сб. мат-ов "Круглого стола" науч. конф. / Минздрав РФ. Сиб. отд-ние РАМН. ГНЦ ВБ "Вектор". НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор". Межрегион. ассоциации "Здравоохранение Сибири", - Бердск, 1998. - 81 с.

6. ФС 42-3862-99, утверждена 20 января 2000 года.

7. ФСП 42-0197-5044-04 (лиофилизат) / ЛС-000381 от 03.08.2010.

8. ФСП 42-0088-7009-05,2006, Реополиглюкин.

9. ТУ 9381-018-00479979-01, Полирибонат.

10. Стенко М.И. Справочник по клиническим методам исследования. - М., 1975. - С. 56-57.

11. Shevchenko Z.A., Lebedev L.R., Klimenko V.P. et al. Production methods and properties of virus-like particles of Saccharomyces cerevisiae yeast killer strain/Applied Biochemistry and Microbiology. 2015. T. 51. №8. C. 812-817.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине, в частности иммунологии, и представляет собой композицию, обладающую иммуностимулирующим действием для сублингвального применения, состоящую из двуспиральной РНК бактериофага Ф6 в количестве 0,5±0,1 мг, одноцепочечной дрожжевой РНК в количестве 4,5±0,5 мг, пектина в количестве 21±3 мг, лактата кальция в количестве 15±3 мг, декстрана в количестве 100±10 мг, хлорида натрия в количестве 9±1 мг и воды очищенной до 1 мл. Изобретение обеспечивает иммуностимулирующее действие, а также возможность получения стабильной композиции. 2 табл., 3 ил.

Композиция, обладающая иммуностимулирующим действием для сублингвального применения, состоящая из двуспиральной РНК бактериофага Ф6, одноцепочечной дрожжевой РНК, пектина, лактата кальция, декстрана, хлорида натрия и воды очищенной, при следующем соотношении компонентов:

двуспиральная РНК бактриофага Ф6 0,5±0,1 мг одноцепочечная дрожжевая РНК 4,5±0,5 мг

пектин 21±3 мг

лактат кальция 15±3 мг декстран 100±10 мг хлорид натрия 9±1 мг вода очищенная до 1 мл