Микроорганизмы для получения О-сукцинилгомосерина и способ получения О-сукцинилгомосерина с использованием указанных микроорганизмов Российский патент 2018 года по МПК C12N9/10 C12N1/21 C12N15/54 C12P13/06 

Описание патента на изобретение RU2651517C2

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится выделенному полипептиду, обладающему резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью, микроорганизму, экспрессирующему указанный полипептид, и способу получения О-сукцинилгомосерина с использованием указанного микроорганизма.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известно, что большинство микроорганизмов, представленных в природе, используют О-сукцинилгомосерин или О-ацетилгомосерин в качестве промежуточного продукта биосинтеза метионина. Обычно О-сукцинилгомосерин образует гомосерин-О-сукцинилтрансфераза (MetA), конъюгирующая сукцинильную группу сукцинил-КоА с гомосерином, и О-ацетилгомосерин образует гомосерин-О-ацетилтрансфераза (MetX), конъюгирующая ацетильную группу ацетил-КоА с гомосерином. То есть, применительно к получению О-сукцинилгомосерина наряду с другими промежуточными продуктами, metA является одним из наиболее важных генов при разработке микроорганизмов, продуцирующих О-сукцинилгомосерин. В то же время известно, что, в отличие от MetA, MetX не подвержен ингибированию по принципу обратной связи и обладает высокой ферментной стабильностью.

Накопление О-сукцинилгомосерина происходит при блокаде цистатионин-гамма-синтазы в метаболическом пути биосинтеза метионина, и, таким образом, штамму, продуцирующему О-сукцинилгомосерин, необходим L-метионин. Соответственно, в среду добавляют метионин, который ингибирует активность гомосерин-О-сукцинилтрансферазы, и, в конечном счете, О-сукцинилгомосерин не может быть получен в высокой концентрации.

Соответственно, во многих предшествующих патентах первостепенное внимание было уделено исследованиям по устранению ингибирования metA по принципу обратной связи контрольной системой обратной связи. Тем не менее для гомосерин-О-сукцинилтрансферазы, кодируемой metA, свойственны проблемы низкой стабильности самого белка дикого типа, и введение мутаций для устранения ингибирования по принципу обратной связи усугубляет нестабильность. Соответственно, для разработки штамма, продуцирующего О-сукцинилгомосерин с высокой продуктивностью, необходимо устранение ингибирования гена metA по принципу обратной связи и сохранение стабильности фермента.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

Для решения феномена ингибирования metA по принципу обратной связи и проблемы нестабильности фермента, описанной выше, авторы настоящего изобретения предприняли попытку разработать гомосерин-О-сукцинилтрансферазу с сохраненной стабильностью фермента, не подверженную, в то же время, ингибированию метионином по принципу обратной связи, и провели на предмет этого скрининг новых ферментов, обладающих указанной активностью. В результате отбора генов-кандидатов, прошедших такой скрининг, и культивирования в колбах после их введения в Escherichia sp. авторы настоящего изобретения обнаружили, что происходило образование О-сукцинилгомосерина и что отобранные таким образом гены обладали гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью и резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи, завершив посредством этого настоящее изобретение.

Техническое решение

Задачей настоящего изобретения является обеспечение нового выделенного полипептида, обладающего резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение полинуклеотида, кодирующего новый выделенный полипептид.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение микроорганизма для получения О-сукцинилгомосерина, экспрессирующего новый выделенный полипептид.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения О-сукцинилгомосерина с использованием указанного выше микроорганизма.

Полезные эффекты изобретения

Микроорганизм для получения О-сукцинилгомосерина, содержащий новый выделенный полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью, который может обладать резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и продуцировать О-сукцинилгомосерин с высоким выходом и, таким образом, может быть эффективно использован для получения L-метионина, используемого им в качестве предшественника, с высоким выходом.

Наилучший вариант осуществления изобретения

Для решения указанных выше задач в одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен новый выделенный полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью.

Использованный здесь термин «гомосерин-О-сукцинилтрансферазная активность» относится к активности по превращению гомосерина в О-сукцинилгомосерин.

Использованный здесь термин «ингибирование по принципу обратной связи» относится к ингибированию активности гомосерин-О-сукцинилтрансферазы метионином.

Полипептид по настоящему изобретению характеризуется тем, что он имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, обладающую гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью и резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи. Любой полипептид, последовательность которого на 80% или более гомологична указанному выше полипептиду, конкретно на 90% или более, конкретнее на 95% или более и еще конкретнее на 97% или более, также включен в объем настоящего изобретения, с учетом того, что полипептид обладает гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью и резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи, предложенными в настоящем изобретении. Процент гомологии может быть определен с использованием BLAST 2.0, являющегося эталонным алгоритмом, или FASTA от Pearson [Methods Enzymol., 183, 63(1990), ниже]. На основе алгоритма BLAST разработаны программы, называемые BLASTN и BLASTX [www.ncbi.nlm.nih.gov, ниже].

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий указанный выше полипептид. Конкретно, полипептид может быть кодирован полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. Ввиду вырожденности кодонов объем настоящего изобретения также включает, без ограничения, полинуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 80%, конкретно на 90% или более, конкретнее на 95% или более и еще конкретнее на 97% или более гомологична указанной выше последовательности.

В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен вектор, содержащий функциональный полинуклеотид.

Использованный здесь термин «вектор» относится к ДНК-конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего интересующий белок, где интересующий белок функционально связан с подходящей регуляторной последовательностью, таким образом, что интересующий белок может быть экспрессирован в подходящем хозяине. Регуляторная последовательность может содержать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий домен связывания рибосом на мРНК, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. После трансформации в подходящий хозяин вектор может быть реплицирован, или может функционировать независимо от генома хозяина, или может быть интегрирован в сам геном хозяина.

Относительно вектора, используемого в настоящем изобретении, может не быть существенных ограничений, при условии, что вектор может быть реплицирован в хозяине, и может быть использован любой вектор, известный в данной области.

В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, продуцирующий О-сукцинилгомосерин, экспрессирующий полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью.

Использованный здесь термин «микроорганизм, продуцирующий О-сукцинилгомосерин», может относиться к микроорганизму, способному продуцировать О-сукцинилгомосерин и хранить его внутриклеточно и внеклеточно.

Микроорганизм для получения О-сукцинилгомосерина включает штаммы прокариотических и эукариотических микроорганизмов, например, без ограничения, штаммы микроорганизмов, принадлежащие к роду Escherichia, роду Erwinia, роду Serratia, роду Providencia, роду Corynebacterium и роду Brevibacterium. Конкретно, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, принадлежащий к роду Escherichia, например, Escherichia coli.

Микроорганизм, продуцирующий О-сукцинилгомосерин, может быть получен с использованием штаммов микроорганизмов, продуцирующих L-лизин, L-треонин или L-изолейцин, и, конкретно, с использованием штамма, продуцирующего L-треонин. Поскольку штамм, продуцирующий L-треонин, представляет собой штамм, способный синтезировать L-треонин и гомосерин в качестве предшественника О-сукцинилгомосерина, с использованием этого штамма может быть синтезировано большое количество предшественников метионина, то есть О-сукцинилгомосерина.

В настоящем изобретении экспрессия полипептида может быть достигнута трансформацией рекомбинантным вектором, содержащим функциональный ген, кодирующий полипептид, или введением полинуклеотида, кодирующего полипептид, в хромосому, однако методы не ограничены указанными выше.

Использованный здесь термин «трансформация» относится к процессу введения вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина, что позволяет экспрессировать полинуклеотид, кодируемый белком, в клетке-хозяине. Неважно, введен ли полинуклеотид, используемый для трансформации, в хромосому клетки-хозяина, будучи расположен в ней, или расположен вне хромосомы, при условии что он может быть экспрессирован в клетке-хозяине. Полинуклеотид может быть введен в любой форме, с учетом того, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессирован в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, представляющей собой полинуклеотидную конструкцию, содержащую все основные элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. Обычно экспрессионная кассета может содержать промотор, функционально связанный с открытой рамкой считывания (далее - «ORF») гена, сигнал терминации транскрипции, домен связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции.

Относительно промотора, используемого в настоящем изобретении, может не быть существенных ограничений, при условии, что он способен инициировать транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой белок, в клетке-хозяине с высокой частотой, и может быть использован любой промотор, известный в данной области. Конкретно, но без ограничения, могут быть использованы промотор Т7, промотор trc, промотор tac и промотор cysK (патент Кореи №10-0966324).

В типичном воплощении настоящего изобретения ген metB, кодирующий цистатионин-гамма-синтазу, у микроорганизма может быть дополнительно удален или ослаблен.

В типичном воплощении настоящего изобретения ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу, и ген metA, кодирующий гомосерин-О-сукцинилтрансферазу, у микроорганизма могут быть дополнительно удалены или ослаблены.

В настоящем изобретении последовательности генов могут быть получены из баз данных, таких как Национальный центр биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, NCBI).

Использованный здесь термин «делеция» относится к типу удаления из хромосомы части или всей области нуклеотидной последовательности целевого гена, начиная с нуклеотидной последовательности, соответствующей инициирующему кодону, до нуклеотидной последовательности, соответствующей терминирующему кодону, или части или всей области нуклеотидной последовательности его регуляторной области.

Использованный здесь термин «ослабление» относится к устранению или снижению внутриклеточной активности по меньшей мере одного фермента, кодируемого соответствующей ДНК, у штамма микроорганизма. Например, экспрессия белка может быть ослаблена модификацией промоторной области нуклеотидной последовательности 5'-UTR (5'-нетранслируемой области) гена, или активность белка может быть ослаблена введением мутации в область ORF соответствующего гена.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ получения О-сукцинилгомосерина, включающий культивирование микроорганизма в среде для получения О-сукцинилгомосерина и получение О-сукцинилгомосерина из микроорганизма или среды.

Культивирование штамма микроорганизма для получения О-сукцинилгомосерина, полученного выше, может быть проведено в соответствии с подходящей средой и условиями культивирования, известными в данной области. Способ культивирования может быть легко адаптирован специалистом в данной области для применения в соответствии с выбранным штаммом. Конкретно, культура может представлять собой, без ограничения, периодическую культуру, непрерывную культуру и адаптированную культуру (fetch culture). Эти различные способы культивирования раскрыты, например, в приведенной ссылке ("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp. 138-176).

Среды, используемые для культивирования, должны подходящим образом соответствовать требованиям для определенных штаммов. Примеры сред для различных микроорганизмов раскрыты, например, в приведенной ссылке ("Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981). Среды могут содержать различные источники углерода, источники азота и микроэлементы. Примеры источников углерода для включения в среды могут включать углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти источники углерода могут быть использованы по отдельности или в комбинации. Примеры источников азота для включения в среды могут включать органические источники азота, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной бульон, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт (CSL) и бобовую муку; и неорганические источники азота, такие как мочевина, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота могут быть использованы по отдельности или в комбинации. В качестве источника фосфора среды могут содержать дигидрофосфат калия, гидроортофосфат калия и соответствующие натрийсодержащие соли. В дополнение, культуральные среды могут содержать металлы, такие как сульфат магния и сульфат железа. Кроме того, могут быть включены аминокислоты, витамины, подходящие предшественники и так далее. Эти культуральные среды или предшественники могут быть добавлены в культуру в форме периодической культуры или непрерывной культуры.

В дополнение, во время культивирования рН культуры можно подходящим образом корректировать добавлением такого соединения, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Кроме того, образование пузырьков во время культивирования можно предотвращать с использованием пеногасителя, такого как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты. В дополнение, в культуру может быть добавлен газообразный кислород или газ, содержащий газообразный кислород (например, воздух), для поддержания в культуре аэробных условий. Температура культуры может входить в диапазон от 20°С до 45°С и, конкретно, от 25°С до 40°С. Культивирование можно продолжать до получения желаемого количества продукта О-сукцинилгомосерина и, конкретно, от 10 часов до 160 часов.

О-сукцинилгомосерин, полученный способом по настоящему изобретению, может быть превращен в метионин цистатионин-гамма-синтазой или О-сукцинилгомосеринсульфгидрилазой. Кроме того, возможно получение янтарной кислоты в качестве побочного продукта, в дополнение к L-метионину, посредством взаимодействия O-сукцинил-L-гомосерина, полученного способом по настоящему изобретению, с CH3SH.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению полипептида, обладающего резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. Было подтверждено, что новый выделенный полипептид по настоящему изобретению обладает резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и способен продуцировать О-сукцинилгомосерин с высоким выходом, и, таким образом, указанный полипептид может быть использован для получения О-сукцинилгомосерина.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие Примеры. Тем не менее, эти Примеры приведены лишь в иллюстративных целях, и изобретение не следует ограничивать этими Примерами.

Пример 1: Отбор полипептидов, обладающих новой О-сукцинилтрансферазной активностью

В качестве способа устранения контроля гена metA по принципу обратной связи и сохранения его стабильности был разработан metX, имеющий происхождение от Chromobacterium violaceum, на основании того факта, что ген metX (гомосерин-О-ацетилтрансфераза) не подвержен ингибированию L-метионином по принципу обратной связи, несмотря на то, что ген metX имеет структуру, близкую к структуре гена metA.

В этом отношении, для разработки новой гомосерин-О-ацетилтрансферазы авторы настоящего изобретения провели анализ гомологии аминокислотных последовательностей уже разработанных metX, имеющих происхождение от Chromobacterium violaceum, и в итоге отобрали полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, не подверженный ингибированию метионином по принципу обратной связи. Авторы настоящего изобретения недавно подтвердили, что отобранный полипептид, несмотря на то, что он представляет собой metX, имеющий происхождение от Sideroxydans lithotrophicus ES-1, обладает новой активностью, о которой никогда не сообщалось ранее.

Пример 2: Конструирование плазмид

2-1. Синтез гена metX, имеющего происхождение из Pseudogulbenkiania ferrooxidans 2002

Ген metX, имеющий происхождение из Pseudogulbenkiania ferrooxidans 2002 (SEQ ID NO: 3), синтезировали на основе последовательности гена metX (SEQ ID NO: 2) из базы данных NCBI (эталонная последовательность: ZP_03696709.1) с оптимизацией кодонов, чтобы ген можно было экспрессировать в Е. coli.

2-2. Конструирование плазмиды, экспрессирующей ген metX, имеющий происхождение из Pseudogulbenkiania ferrooxidans 2002

Ген metX амплифицировали посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция) с использованием праймеров SEQ ID NO: 4 и 5 на основе синтезированной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3. Праймер SEQ ID NO: 5 имеет сайт рестрикции HindIII.

ПЦР проводили на протяжении 30 циклов, состоявших из денатурации при 95°С в течение 30 с, отжига при 55°С в течение 30 с и удлинения при 72°С в течение 1 мин. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0%-м агарозном геле и полосу 1,14 т.п.о. элюировали, очищали и обрабатывали HindIII. Вектор pCL1920, содержащий промотор cysK, обрабатывали EcoRV и HindIII и полученные рестрикционные фрагменты клонировали. Плазмида, экспрессирующая ген metX, имеющий происхождение из Pseudogulbenkiania ferrooxidans, полученная в результате клонирования, была названа «pCL-PcysK-metX (pfe)».

Пример 3: Конструирование экспериментальных штаммов

3-1. Делеция гена metB

Проводили делецию гена metB, кодирующего цистатионин-гамма-синтазу, у штамма Е. coli (К12) W3110 дикого типа. Для делеции гена metB применяли метод делеции «FRT-one-step-PCR» (PNAS (2000) vol 97: Р 6640-6645). Для делеции гена metB конструировали делеционную кассету посредством ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 6 и 7 и вектора pKD3 (PNAS (2000) vol 97: P 6640-6645) в качестве матрицы.

ПЦР проводили на протяжении 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°С в течение 30 с, отжига при 55°С в течение 30 с и удлинения при 72°С в течение 1 мин. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0%-м агарозном геле и полосу 1,1 т.п.о. элюировали и очищали. Полученный фрагмент ДНК электропорировали в штамм Е. coli (К12) W3110, уже трансформированный вектором pKD46 (PNAS (2000) vol 97 Р 6640-6645). Для электропорации штамм W3110, трансформированный pKD46, культивировали в среде LB, содержащей 200 мкг/л ампициллина и 5 мМ L-арабинозы, при 30°С до достижения OD600 0,5 и для использования промывали Зраза 10%-м глицерином. Электропорацию проводили при 2500 В. Полученный штамм высевали на чашки со средой LB, содержащей 30 мкг/л хлорамфеникола, культивировали при 37°С в течение 1-2 суток и отбирали штамм, резистентный к хлорамфениколу. Отобранный штамм подвергали ПЦР в тех же условиях, что описаны выше, с использованием праймеров SEQ ID NO: 8 и 9 и делецию гена metB подтверждали, наблюдая присутствие 1,5 т.п.о. полосы гена в 1,0%-м агарозном геле.

Подтвержденный таким образом штамм трансформировали вектором рСР20 (PNAS (2000) vol 97 Р 6640-6645) и культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг/л ампициллина. Конечный штамм с делецией гена metB, имеющего уменьшенный размер, подтвержденный в 1,0%-м агарозном геле, конструировали, проводя ПЦР в тех же условиях, и подтверждали удаление хлорамфениколового маркера из штамма. Сконструированный таким образом штамм, которому необходим метионин, был назван «СС03-0131».

3-2. Делеция гена thrB

Была предпринята попытка увеличить количество О-сукцинилгомосерина, синтезируемого из гомосерина, делецией гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу. В частности, для использования штамма, продуцирующего треонин, необходима делеция гена thrB, поскольку активность утилизации гомосерина очень высока. Делецию гена thrB в штамме СС03-0131, конструированном выше, проводили методом делеции «FRT-one-step-PCR». Делеционную кассету thrB конструировали посредством ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 10 и 11 и вектора pKD3 в качестве матрицы.

ПЦР проводили на протяжении 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°С в течение 30 с, отжига при 55°С в течение 30 с и удлинения при 72°С в течение 1 мин. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0%-м агарозном геле и полосу 1,1 т.п.о. элюировали и очищали. Полученный фрагмент ДНК электропорировали в штамм СС03-0131, уже трансформированный вектором pKD46. Для электропорации штамм СС03-0131, трансформированный pKD46, культивировали в среде LB, содержащей 200 мкг/л ампициллина и 5 мМ арабинозы, при 30°С до достижения OD600 0,5 и для использования промывали 3 раза 10%-м глицерином. Электропорацию проводили при 2500 В. Полученный штамм высевали на чашки со средой LB, содержащей 30 мкг/л хлорамфеникола, культивировали при 37°С в течение 1-2 суток и отбирали штамм, резистентный к хлорамфениколу.

Отобранный штамм подвергали ПЦР в тех же условиях, что описаны выше, с использованием праймеров SEQ ID NO: 12 и 13 и делецию гена thrB подтверждали, наблюдая присутствие 1,5 т.п.о. полосы гена в 1,0%-м агарозном геле.

Подтвержденный таким образом штамм трансформировали вектором рСР20 и культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг/л ампициллина. Конечный штамм с делецией гена thrB, имеющего уменьшенный размер, подтвержденный в 1,0%-м агарозном геле, конструировали, проводя ПЦР в тех же условиях, и подтверждали удаление хлорамфениколового маркера из штамма. Конструированный таким образом штамм был назван «СС03-0131-2».

3-3. Делеция гена metA

Для описания субстратной специфичности и активности гена metX, имеющего происхождение из Pseudogulbenkiania ferrooxidans 2002, у штамма Е. coli проводили делецию исходного гена metA на хромосоме на основе штамма СС03-0131-2, представляющего собой штамм Е. coli (К12) W3110 с делециями генов metB и thrB. Делецию гена metA проводили методом делеции «FRT-one-step-PCR». Делеционную кассету metA конструировали посредством ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 14 и 15 и вектора pKD3 в качестве матрицы.

ПЦР проводили на протяжении 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°С в течение 30 с, отжига при 55°С в течение 30 с и удлинения при 72°С в течение 1 мин. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0%-м агарозном геле и полосу 1,1 т.п.о. элюировали и очищали. Полученный фрагмент ДНК электропорировали в штамм СС03-0131-2, уже трансформированный вектором pKD46. Для электропорации штамм СС03-0131-2, трансформированный pKD46, культивировали в среде LB, содержащей 200 мкг/л ампициллина и 5 мМ арабинозы, при 30°С до достижения OD600 0,5 и для использования промывали 3 раза 10%-м глицерином. Электропорацию проводили при 2500 В. Полученный штамм высевали на чашки со средой LB, содержащей 30 мкг/л хлорамфеникола, культивировали при 37°С в течение 1-2 суток и отбирали штамм, резистентный к хлорамфениколу.

Отобранный штамм подвергали ПЦР в тех же условиях, что описаны выше, с использованием праймеров SEQ ID NO: 16 и 17 и делецию гена metA подтверждали, наблюдая присутствие 1,5 т.п.о. полосы гена в 1,0%-м агарозном геле.

Подтвержденный таким образом штамм трансформировали вектором рСР20 и культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг/л ампициллина. Конечный штамм с делецией гена metA, имеющего уменьшенный размер, подтвержденный в 1,0%-м агарозном геле, конструировали, проводя ПЦР в тех же условиях, и подтверждали удаление хлорамфениколового маркера из штамма. Конструированный таким образом штамм был назван «СС03-0132».

3-4. Конструирование штамма с введенной плазмидой, экспрессирующей ген metX, имеющий происхождение из Pseudogulbenkiania ferrooxidans

Для описания субстратной специфичности и активности гена metX, имеющего происхождение из Pseudogulbenkiania ferrooxidans 2002, в штамм СС03-0132, представляющий собой штамм Е. coli (К12) W3110 с делециями генов metB, thrB и metA, вводили плазмиду pCL-PcysK-metX (pfe), конструированную в Примере 2.

Штамм СС03-0132 с введенной pCL-PcysK-metX (pfe) был назван «СС03-0135» и депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM), расположенном по адресу 361-221, Hongje-1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea, являющемся дочерней структурой Корейской федерации коллекций культур (Korean Federation of Culture Collections, KFCC) и признанном международным органом по депонированию согласно Будапештскому соглашению 10 июня 2013 г., под регистрационным номером КССМ11423Р.

Штамм был конструирован введением плазмиды pCL-PcysK-metA, конструированной таким же образом, как в Примере 2, за исключением того, что в качестве контрольной группы был использован metA дикого типа в штамме СС03-0132. Конструированный таким образом штамм был назван «СС03-0132/pCL-PcysK-metA».

Кроме того, конструировали штамм с использованием штамма CJM002, продуцирующего треонин, не нуждающегося в метионине (регистрационный номер: КССМ-10568), посредством искусственной мутации с использованием NTG на основе штамма TF4076 (регистрационный номер: KFCC-10718), продуцирующего L-треонин, представляющего собой штамм, которому необходим метионин, раскрытый в патенте Кореи №10-0905381, таким же образом, как в Примерах 3-1 - 3-3, и конструированный таким образом штамм был назван «CJM-ВТА».

Плазмиды pCL-PcysK-metX (pfe) и pCL-PcysK-metA, как описано выше, вводили в штамм CJM-ВТА, и конструированные таким образом штаммы были названы «CJM-BTA/pCL-PcysK-metX (pfe)» и «CJM-BTA/pCL-PcysK-metA», соответственно.

Пример 4: Получение О-сукцинилгомосерина с использованием штамма

4-1. Эксперименте культивированием в колбах

Для описания субстратной специфичности и активности гена metX, имеющего происхождение из Pseudogulbenkiania ferrooxidans 2002, введенного в штамм, конструированный в Примере 3, проводили культивирование в колбах Эрленмейера. Состав культур в колбах показан в Таблице 1 ниже.

Штамм СС03-0132 и штамм CJM-ВТА высевали на чашки со средой LB в качестве контрольных групп. Штамм СС03-0135 (трансформированный вектором экспрессии metX), штамм СС03-0132/pCL-PcysK-metA (трансформированный вектором экспрессии metA, полученный с использованием того же вектора) и два других штамма, CJM-BTAIpCL-PcysK-metX(pfe) и CJM-ВТА/pCL-PcysK-metA (трансформированные вектором экспрессии metX или вектором экспрессии metA на основе штамма CJM-ВТА, соответственно), высевали на чашки со средой LB, содержащей спектиномицин, и культивировали при 33°С в течение ночи. Затем отдельные колонии засевали в 2 мл среды LB, содержащей спектиномицин, культивировали при 33°С в течение 2 часов, засевали снова в колбы Эрленмейера объемом 250 мл, содержащие 25 мл среды, до оптической плотности OD600 0,07, культивировали при 33°С и 200 об/мин в течение 48 часов и количество полученного О-сукцинилгомосерина сравнивали посредством HPLC-анализа (высокоэффективная жидкостная хроматография). Результаты показаны в Таблице 2 ниже.

В результате было подтверждено, что ген metX, имеющий происхождение из Pseudogulbenkiania ferrooxidans 2002, как и ген metA Е. coli, продуцирует О-сукцинилгомосерин, используя сукцинил-КоА в качестве субстрата, но не продуцирует О-ацетилгомосерин. При введении гена metX, имеющего происхождение из Pseudogulbenkiania ferrooxidans 2002, не было ингибирования метионином, добавленным в среду, по принципу обратной связи, даже при использовании дикого типа самого по себе, без каких-либо модификаций.

Специалистам в данной области будет ясно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без выхода за рамки его сущности или основных признаков. Описанные воплощения следует рассматривать во всех отношениях только как иллюстративные и не ограничивающие. Таким образом, объем настоящего изобретения определен приложенной формулой изобретения, но не предшествующим описанием. Все изменения в рамках значения и диапазона эквивалентности формулы изобретения следует рассматривать как включенные в объем настоящего изобретения.

Похожие патенты RU2651517C2

название год авторы номер документа
МИКРООРГАНИЗМЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ О-СУКЦИНИЛГОМОСЕРИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ О-СУКЦИНИЛГОМОСЕРИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ 2014
  • Чой Су Джин
  • Ким Со Йоунг
  • Со Чанг Ил
  • Син Ук
  • Янг Юнг Леол
  • Ум Хье Вон
  • Парк Хе Мин
  • Джон Сун Ху
  • Джунг Бьюнг Хун
RU2651519C2
Микроорганизмы для получения О-сукцинилгомосерина и способ получения О-сукцинилгомосерина с использованием указанных микроорганизмов 2014
  • Чой Су Джин
  • Ким Со Йоунг
  • Со Чанг Ил
  • Син Ук
  • Янг Юнг Леол
  • Ум Хье Вон
  • Парк Хе Мин
  • Джон Сун Ху
  • Джунг Бьюнг Хун
RU2757787C1
МИКРООРГАНИЗМ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ О-СУКЦИНИЛГОМОСЕРИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ О-СУКЦИНИЛГОМОСЕРИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННОГО МИКРООРГАНИЗМА 2014
  • Со Чанг Ил
  • Ким Со Йоунг
  • Син Ук
  • На Кванг Хо
  • Ум Хье Вон
  • Хо Ин Кьюнг
RU2662654C2
Микроорганизмы для получения О-сукцинилгомосерина и способ получения О-сукцинилгомосерина с использованием указанных микроорганизмов 2014
  • Со Чанг Ил
  • Ким Со Йоунг
  • Син Ук
  • На Кванг Хо
  • Ум Хье Вон
  • Хо Ин Кьюнг
RU2756104C2
МИКРООРГАНИЗМ, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ ПРОДУЦИРОВАТЬ О-СУКЦИНИЛГОМОСЕРИН ИЛИ ЯНТАРНУЮ КИСЛОТУ, И СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ О-СУКЦИНИЛГОМОСЕРИНА ПОСРЕДСТВОМ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ 2015
  • Парк Хе Мин
  • Хон Кук Ки
  • Сонг Гю Хён
  • Янг Юнг Леол
  • Кан Мин Сун
  • Юн Джон Хён
  • Джун Бён Хун
  • Чой Су Джин
RU2674891C2
О-СУКЦИНИЛГОМОСЕРИН - ПРОДУЦИРУЮЩИЙ МИКРООРГАНИЗМ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ О-СУКЦИНИЛГОМОСЕРИНА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ 2015
  • Чхве Со Чин
  • Хон Кык Ки
  • Ян Юн Лэол
  • Кан Мин Сон
  • Пак Хё Мин
  • Сон Кохон
  • Юн Чон Хён
RU2691581C2
МИКРООРГАНИЗМ, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ О-АЦЕТИЛГОМОСЕРИН, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ О-АЦЕТИЛГОМОСЕРИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО МИКРООРГАНИЗМА 2015
  • Ким Хюн Ах
  • Со Джу Хее
  • Син Ук
  • Ким Со Йоунг
  • Ким Санг Кёум
  • На Кванг Хо
  • Бэ Джее
  • Сон Сунг Кванг
  • Хе Рюн
  • Чой Джин Гын
RU2614253C1
МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ПОЛИПЕПТИД, ОБДАДАЮЩИЙ ГОМОСЕРИНАЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ЕГО МИКРООРГАНИЗМ 2011
  • Ким, Со Йоунг
  • Син, Йонг Юк
  • Сео, Чанг Ил
  • Хео, Ин Киунг
  • Ким, Дзу Еун
  • Ким, Хиун Ах
  • Ли, Хан Дзинь
  • На, Кванг Хо
  • Сон, Сунг Кванг
RU2557411C2
О-СУКЦИНИЛГОМОСЕРИН-ПРОДУЦИРУЮЩИЙ МИКРООРГАНИЗМ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ О-СУКЦИНИЛГОМОСЕРИНА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ 2015
  • Чхве, Со Чин
  • Хон, Кык Ки
  • Ян, Юн Лэол
  • Кан, Мин Сон
  • Пак, Хё Мин
  • Сон, Кохон
  • Юн, Чон Хён
RU2723183C2
Микроорганизм для продуцирования О-ацетилгомосерина и способ получения О-ацетилгомосерина с использованием этого микроорганизма 2015
  • Бэ Джи
  • Ким Хён А
  • Син Ук
  • Ким Со
  • Ким Сан Кём
  • На Кванг Хо
  • Со Джу Хи
  • Сон Сун Кван
  • Ю Хе Рён
  • Чой Джин Гын
RU2676137C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 651 517 C2

Реферат патента 2018 года Микроорганизмы для получения О-сукцинилгомосерина и способ получения О-сукцинилгомосерина с использованием указанных микроорганизмов

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложено применение полипептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 в качестве гомосеринсукцинилтрансферазы или кодирующего его полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 или 3, для получения О-сукцинилгомосерина. Предложен микроорганизм Escherichia sp., продуцирующий О-сукцинилгомосерин, экспрессирующий указанный полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосеринсукцинилтрансферазной активностью. Предложен способ получения О-сукцинилгомосерина с использованием указанного микроорганизма. Группа изобретений позволяет получать О-сукцинилгомосерин с высоким выходом. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.

Формула изобретения RU 2 651 517 C2

1. Применение выделенного полипептида в качестве гомосеринсукцинилтрансферазы для получения О-сукцинилгомосерина, где полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

2. Применение выделенного полинуклеотида, кодирующего полипептид по п.1, для получения О-сукцинилгомосерина, где полинуклеотид имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 или 3.

3. Микроорганизм Escherichia sp., продуцирующий О-сукцинилгомосерин, экспрессирующий полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосеринсукцинилтрансферазной активностью, где полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

4. Микроорганизм Escherichia sp., продуцирующий О-сукцинилгомосерин, по п.3, представляющий собой Escherichia coli.

5. Микроорганизм Escherichia sp. по п.3, где ген metB, кодирующий цистатионин-гамма-синтазу, дополнительно удален или ослаблен.

6. Микроорганизм Escherichia sp. по п.3, где ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу, или ген metA, кодирующий гомосерин-О-сукцинилтрансферазу, дополнительно удален или ослаблен.

7. Способ получения О-сукцинилгомосерина, включающий:

а) культивирование микроорганизма по любому из пп.3-6 в среде; и

б) получение О-сукцинилгомосерина из микроорганизма или среды.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2018 года RU2651517C2

Разборный с внутренней печью кипятильник 1922
  • Петухов Г.Г.
SU9A1
US7851180 B2, 14.12.2010
ПРИМЕНЕНИЕ ДИМЕТИЛДИСУЛЬФИДА ДЛЯ ПРОДУКЦИИ МЕТИОНИНА МИКРООРГАНИЗМАМИ 2006
  • Цельдер Оскар
  • Хефнер Штефан
  • Херольд Андреа
  • Клоппрогге Коринна
  • Шродер Хартвиг
  • Йокум Р. Роджерс
  • Уильямс Марк К.
RU2413001C2

RU 2 651 517 C2

Авторы

Чой Су Джин

Ким Со Йоунг

Со Чанг Ил

Син Ук

Янг Юнг Леол

Ум Хье Вон

Парк Хе Мин

Джон Сун Ху

Джунг Бьюнг Хун

Даты

2018-04-19Публикация

2014-10-22Подача