Область техники
Настоящее раскрытие относится к композиции для предупреждения или лечения заболеваний почек.
Уровень техники
Почка является важным органом, поддерживающим гомеостаз тела. Она контролирует объем жидкости в организме, концентрацию ионов и pH крови; секретирует отходы, такие как, среди прочего, метаболические отходы, токсины и лекарственные средства; и осуществляет контроль кровяного давления, метаболическую и эндокринную функцию. Кроме того, она способствует абсорбции кальция в тонком кишечнике путем активации витамина D, и участвует в синтезе различных гормонов.
Заболевание почек означает статус, при котором общая функция почки понижена или наблюдаются аномалии вследствие невозможности для почки выполнять обычным образом секреторную, контролирующую, метаболическую и эндокринную функции. Гипофункция, вызванная повреждением почки, приводит, среди прочего, к увеличению почки и связанных структур, атрофии почки, изменению объема жидкости организма, дисбаллансу электролитов, метаболическому ацидозу, нарушению газового обмена, ухудшению противоинфекционной функции и аккумуляции уремического токсина.
Заболевания почек подразделяются на острую почечную недостаточность и хроническую почечную недостаточность в зависимости от ее прогрессии; или на гломерулонефрит вследствие депонирования сосудистого комплекса, диабетическую нефропатию, сопровождаемую диабетом или гипертензивным заболеванием почек, сопровождаемым артериальной гипертензией, токсическую нефропатию вследствием введения лекарственных средств, таких как антибиотики или противораковые лекарственные средства, и бактериальную инфекцию, среди прочего, в зависимости от причины заболевания.
Независимо от типов причины заболеваний почек, когда скорость клубочковой фильтрации понижается ниже 50% вследствие хронической прогрессии почечного нарушения, в большинстве случаев скорость клубочковой фильтрации постоянно уменьшается, почечная недостаточность терминальной стадии развивается в конечном счете и может привести к смерти в тяжелом случае вследствие таких осложнений, как, среди прочего, гематологические патологии, неврологические осложнения, желудочно-кишечные осложнения, инфекция или остеодистрофия.
Заболевания почек увеличиваются каждый год во всем мире и часто обнаруживаются, когда заболевание развивается до почечной недостаточности терминальной стадии, в силу отсутствия симптомов или наличия симптомов, которые трудно распознать. Согласно анализу бенефициариев страховой медицинской помощи, о котором сообщалось USRDS (United States Renal Data System), коэффициент заболеваемости почечной недостаточностью терминальной стадии вырос с 2,7% в 2000 году до 8,5% в 2009. В случае Южной Кореи сообщалось, что пациенты, страдающие почечной недостаточностью терминальной стадии, в целом составляли 37,1% в 2010, что означало рост среднегодового показателя на 8,2% по сравнению с 2006. Эти феномены тесно связаны с увеличением диабетической нефропатии вследствие увеличения числа пациентов, страдающих ожирением и диабетом.
DPP-IV (Дипептидил пептидаза IV) является белком, который также известен как комплексообразующий белок аденозин деаминазы 2, или CD26, и он кодируется генами DPP-IV. Сообщалось, что DPP-IV участвует в иммунном ответе, и он известен как играющий важную роли в метаболизме углеводов путем участия в расщеплении GLP-1 (Глюкагоноподобный пептид-1), который промотирует секрецию инсулина и ингибирует секрецию глюкагона. Сообщалось, что DPP-IV обильно распределен в клетках проксимальных почечных канальцев, гломерулярной базальной мембране и подоцитах. Ингибитор DPP-IV имеет функции уменьшения уровня глюкозы крови путем ингибирования расщепления GLP-1 для поддержания его активности, и ингибитор DPP-IV в настоящее время используется в качестве антидиабетического агента, потому что он не имеет никаких побочных эффектов, вызывающих гипогликемию.
Сущность изобретения
Техническая задача
Настоящее раскрытие относится к эффективной композиции для профилактики или лечения заболеваний почек.
Решение задачи
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что DA1229, ингибитор DPP-IV, демонстрирует эффект предотвращения или лечения заболеваний почек, и завершили настоящее раскрытие.
Настоящее раскрытие относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения заболеваний почек, включающей: соединение, представленное химической формулой 1, ниже; его оптический изомер; его фармацевтически приемлемые соли; или его гидрат или сольват в качестве активного ингредиента.
[Химическая формула 1]
(В которой, X обозначает OR1, и R1 обозначает C1-C5 низшую алкильную группу, соответственно.)
R1 в химической формуле 1 может быть трет-бутилом. Соединение упоминается как (R)-4-{(R)-3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)бутаноил}-3-(трет-бутоксиметил)пиперазин-2-он или DA1229, и его структура показана ниже в химической формуле 2.
[Химическая формула 2]
Традиционно ингибитор DPP-IV считается антидиабетическим агентом, контролирующим глюкозу крови, но авторы настоящего изобретения подтверждили посредством экспериментов, что ингибитор DPP-IV имел прямой защитный эффект на почку, отличный от эффекта контроля глюкозы крови, и соответственно, завершили настоящее раскрытие. Ингибитор DPP-IV согласно настоящему раскрытию уменьшает концентрацию липида плазмы и печени путем ингибирования активности DPP-IV и промотирования метаболизма липидов. Кроме того, DPP-IV имеет эффекты улучшения почечной функции; улучшения микроальбуминурии; ослабления почечного фиброза; улучшения патологического увеличения почки; увеличения экспрессии нефрина; и ингибирования экскреции нефрина. Заболевания почек, которые могут быть предотвращены или вылечены с помощью композиции согласно настоящему раскрытию, включают заболевания, которые показывает различные клинические симптомы, вызванные различными причинами; и заболевания почек проявляются независимо от диабета, т.е. недиабетическая нефропатия, а также диабетическая нефропатия.
Заболевания почек, которые могут быть предотвращены или вылечены с помощью композиции согласно настоящему раскрытию, могут быть диабетической нефропатией, гломерулонефритом, гипертензивным заболеванием почек, поликистозной болезнью почек, воспалительным заболеванием почек (гломерулонефритом, среди прочего) и токсической нефропатией, вызванной, среди прочего, лекарственными средствами или различными токсинами. Клинически, заболевание почек может быть, среди прочего, гломерулярным заболеванием почек, являющимся следствием патологии клубочка, связанной с протеинурией, и тубулоинтерстициальным заболеванием, являющимся результатом патологического мезангия канальца, в широком смысле.
Фармацевтически приемлемые соли согласно настоящему раскрытию включают, среди прочего, уксусную кислоту, бензолсульфоновую кислоту, бензойную кислоту, камфорсульфоновую кислоту, лимонную кислоту, этансульфоновую кислоту, фумаровую кислоту, глюконовую кислоту, глутаминовую кислоту, бромистоводородную кислоту, соляную кислоту, изэтионовую кислоту, молочную кислоту, малеиновую кислоту, яблочную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, муциновую кислоту, азотную кислоту, памовую кислоту, пантотеновую кислоту, фосфорную кислоту, янтарную кислоту, серную кислоту, винную кислоту, п-толуолсульфоновую кислоту и адипиновую кислоту. Фармацевтически приемлемые соли могут быть выбраны из группы, состоящей из уксусной кислоты, лимонной кислоты, соляной кислоты, яблочной кислоты, фосфорной кислоты, янтарной кислоты, винной кислоты и адипиновой кислоты, но не ограничены вышеупомянутыми кислотами.
Гидрат соединения согласно настоящему раскрытию, представленного Химической формулой 1, его оптического изомера или его фармацевтически приемлемых солей может включать стехиометрическое или нестехиометрическое количество воды, связанной нековалентными межмолекулярными силами. Гидрат может содержать 1 экв. воды или больше, предпочтительно 1-5 экв. воды. Эти гидраты могут быть получены путем кристаллизации соединения, представленного Химической формулой 1 или 2, его оптического изомера или его фармацевтически приемлемых солей согласно настоящему раскрытию из воды или растворителя, содержащего воду.
Сольват соединения согласно настоящему раскрытию, представленного Химической формулой 1 и его оптического изомера или его фармацевтически приемлемых солей может включать стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя, связанного нековалентными межмолекулярными силами. Предпочтительно, растворитель является нелетучим, нетоксичным, и примеры растворителей, подходящих для использования на человеке, включают, среди прочего, этанол, метанол, пропанол и метиленхлорид.
Соединение, представленное Химической формулой 1, его оптический изомер, его фармацевтически приемлемые соли или его гидрат или сольват является ингибитором DPP-IV (Дипептидил пептидазы IV). Ингибитор DPP-IV имеет способность понижать уровень глюкозы крови путем ингибирования расщепления GLP-1 для поддержания его активности.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему раскрытию может включать другие дополнительные активные ингредиенты кроме соединения Химической формулы 1. Дополнительные активные ингредиенты могут иметь идентичную или отличную активность по отношению к Химической формуле 1.
Например, дополнительные активные ингредиенты могут быть антидиабетическим лекарственным средством. Поэтому фармацевтическая композиция согласно настоящему раскрытию может дополнительно содержать другие антидиабетические лекарственные средства. Антидиабетические лекарственные средства могут быть выбраны из группы, состоящей из бигуанида, сенсибилизатора инсулина, средства, усиливающего секрецию инсулина, ингибитора α-глюкозидазы и антагониста каннабиноидного рецептора 1, но не ограничены вышеупомянутыми средствами.
Бигуанид согласно настоящему раскрытию является лекарственным средством, оказывающим, среди прочего, эффекты промотирования анаэробного гликолиза, включающего бигуанидную структуру; улучшения действия инсулина в периферической области; ингибирования абсорбции глюкозы из кишечника; и ингибирования гликонеогенеза в печени. Бигуанид может быть выбран из группы, состоящей из метформина, буформина, фенетилбигуанида, но не ограничен вышеупомянутым.
Сенсибилизатор инсулина согласно настоящему раскрытию является лекарственным средством, действующим как понижающее уровень глюкозы крови путем улучшения дисфункции инсулина, и он характеризуется как имеющий общую TZD (тиазолидин-дион) структуру. Сенсибилизатор инсулина действует на PPAR (Активируемый пролифератором пероксисомы рецептор). Сенсибилизатор инсулина может быть выбран из группы, состоящей из троглитазона, циглитазона, росиглитазона, пиоглитазона и энглитазона, но не ограничен вышеупомянутым.
Средство, усиливающее секрецию инсулина согласно настоящему раскрытию, является лекарственным средством, промотирующим секрецию инсулина β-клетками поджелудочной железы. Оно может представлять собой лекарственное средство, имеющее структуру сульфонилмочевины или не сульфонилмочевины. Предпочтительно, средство, усиливающее секрецию инсулина, может представлять собой: лекарственные средства, имеющие структуру сульфонилмочевины, выбранные из группы, состоящей из глибенкламида (также известного как глибурид), глипизида, гликлазида, глимепирида, толазамида, толбутамида, ацетогексамида, карбутамида, хлорпропамида, глиборнурида, глихидона, глисентида, глисоламида, глисоксепида, гликлопиамида, глициламида и глипентида; или лекарственные средства, имеющие несульфонилмочевинную структуру, репаглинид или натеглинид, но не ограниченные вышеупомянутым.
Ингибитор α-глюкозидазы согласно настоящему раскрытию является лекарственным средством, имеющим, среди прочего, функцию ингибирования расщепления и абсорбции крахмала и дисахарида путем конкурентного ингибирования α-глюкозидазы, которая является одним из пищеварительных ферментов кишечника. Ингибитор α-глюкозидазы может быть выбран из группы, состоящей из акарбозы, воглибозы, эмиглитата и миглитола, но не ограничен вышеупомянутым.
Антагонист каннабиноидного рецептора 1 согласно настоящему раскрытию является лекарственным средством, контролирующим метаболизм глюкозы и липидов, а также массу тела и энергетический баланс, путем ингибирования избыточной активности эндоканнабиноида. Антагонист каннабиноидного рецептора 1 может быть выбран из группы, состоящей из римонабанта, отенабанта, ибинабанта и суринабанта, но не ограничен вышеупомянутым.
Кроме того, например, дополнительные активные ингредиенты композиции согласно настоящему раскрытию могут быть ингредиентами, которые могут ингибировать действие ангиотензина. Поэтому фармацевтическая композиция согласно настоящему раскрытию может дополнительно включать ингибитор ангиотензинпревращающего фермента или блокатор рецептора ангиотензина II.
Ингибитор ангиотензинпревращающего фермента может быть выбран из группы, состоящей из каптоприла, эналаприла, беназеприла, имидаприла, лисиноприла, приноприла, рамиприла, моэксиприла, фосиноприла и квинаприла, но не ограничен вышеупомянутым.
Блокатор рецептора ангиотензина II может быть выбран из группы, состоящей из кандесартана, эпросартана, ирбесартана, лозартана, телмисартана и валсартана, но не ограничен вышеупомянутым.
Кроме того, например, дополнительные активные ингредиенты композиции согласно настоящему раскрытию могут быть гипотензивными средствами. Поэтому фармацевтическая композиция согласно настоящему раскрытию может дополнительно включать CCB (блокатор кальциевых каналов), бета-блокатор или диуретики, но не ограничиваясь вышеупомянутым.
Термин »фармацевтически приемлемый», используемый в настоящем раскрытии, направлен на молекулярное тело и другие ингредиенты композиций, которые являются физиологически приемлемыми при введении их млекопитающим, включая человека, и обычно не генерируют неприемлемые ответы.
Композиция согласно настоящему раскрытию может дополнительно включать носители. Термин «носитель», представленный в настоящем раскрытии, направлен на разбавители, эксципиенты или носители, вводимые с активными соединениями. Эти фармацевтические носители могут представлять собой: воду; солевой раствор; водный раствор декстрозы; водный раствор глицерина; и стерильную жидкость, такую как масло, включая петролеум, животный жир, растительное масло или синтетическое масло, такое как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло и кунжутное масло. Подходящие фармацевтические носители представлены в следующей ссылке - "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin, 18th Edition. Наиболее предпочтительным носителем для настоящего раскрытия является такой, который обеспечивает непосредственное высвобождение, другими словами, который высвобождает все или большинство активных ингредиентов за короткий период, такой как 60 минут или меньше, предоставляя возможность быстрой абсорбции лекарственных средств.
Предпочтительно, соединение согласно настоящему раскрытию, представленное Химической формулой 1, его оптический изомер, его фармацевтически приемлемые соли или его гидрат или сольват содержатся в количестве 0,1-50,0 вес.% в расчете на общую массы композиции, но не ограничиваются вышеупомянутым. Композиция согласно настоящему раскрытию может быть введена в различных лекарственных формах для перорального введения или парентерального введения, когда ее вводят клинически. Разбавители или добавки, такие как наполнители, экстендеры, связующие, увлажнители, разрыхлители и сурфактанты среди прочего в обычном употреблении могут использоваться для составления.
Твердые лекарственные формы для перорального введения включают, среди прочего, таблетки, пилюли, порошки, гранулы и капсулы, и эти твердые лекарственные формы могут быть получены путем добавления по меньшей мере одной добавки, например, среди прочего, крахмала, карбоната кальция, сахарозы, лактозы и желатина, к фармацевтической композиции согласно настоящему раскрытию. Кроме того, могут также использоваться лубриканты, такие как магний, стеарат и тальк.
Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают суспензии, жидкость для внутреннего употребления, эмульсии и сиропы. Кроме того, могут содержаться различные добавки, такие как увлажнители, подсластители, ароматизаторы и консерванты, отличные от простых разбавителей, такие как вода и жидкий парафин.
Лекарственные формы для парентерального введения включают стерильные водные растворы, неводные растворы, суспензии, эмульсии, лиофилизованные составы и суппозитории. Пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, инъецируемые сложные эфиры, такие как этилолеат, могут использоваться в качестве неводных растворителей и эмульсий. Витепсол, макрогол, tween 61, масло какао, laurinum, глицерин и желатин могут использоваться в качестве основного материала суппозиториев. Фармацевтическая композиция согласно настоящему раскрытию может быть введена подкожно, внутривенно или внутримышечно в случае парентерального введения.
Дозировка фармацевтической композиции согласно настоящему раскрытию может находиться в диапазоне от 0,5 мг до 100 мг в сутки для взрослого человека с массой тела 70 кг. Однако оптимальная дозировка для введения может быть легко определена специалистом, и она может варьировать в зависимости от различных факторов, включая, среди прочего: заболевания и их серьезность; содержание активных ингредиентов и других ингредиентов, содержащихся в композиции; типы состава; возраст, массу тела, здоровье, пол, диету пациентов; путь и время введения; уровень экскреции композиции; период лечения; лекарственные средства, используемые одновременно.
Настоящее раскрытие относится к способу профилактики или лечения заболеваний почек путем введения терапевтически эффективного количества соединения, представленного Химической формулой 1; его оптического изомера; его фармацевтически приемлемой соли; или его гидрата или сольвата пациентам.
Термин ‘пациент’ относится к млекопитающим, включая человека, и 'введение' относится к предоставлению желаемых веществ пациентам любыми подходящими способами. Термин ‘терапевтически эффективное количество’ относится к количеству активного ингредиента или фармацевтической композиции, вызывающему биологические или медицинские ответы от животных или человека, которые рассматриваются так таковые исследователями, ветеринарами, врачами или другими клиническими специалистами. Он включает количество, которое может приводить к облегчению симптомов заболеваний или нарушений, подвергаемых лечению. Для специалиста очевидно, что терапевтически эффективное количество и частота введения активных ингредиентов согласно настоящему раскрытию могут варьировать в зависимости от желаемых эффектов.
Настоящее раскрытие относится к применению соединения, представленного химической формулой 1, его оптического изомера, его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата или сольвата в получении лекарственного средства для лечения заболеваний почек.
Эффект изобретения
Фармацевтическая композиция согласно настоящему раскрытию для предупреждения или лечения заболеваний почек, включающая соединение, представленное химической формулой 1, его оптический изомер, его фармацевтически приемлемые соли или его гидрат или сольват в качестве активного ингредиента, имеет эффекты улучшения метаболизма липидов; предотвращения гистологических повреждений, включая почечный фиброз; и облегчения микроальбуминурии. Поэтому композиция может быть использована для лечения заболеваний почек.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 показывает графики, демонстрирующие изменение активности DPP-IV в плазме согласно стадиям диабета.
Фигура 2 показывает графики, демонстрирующие изменение активности DPP-IV в почке, печени, сердце и жировой ткани согласно стадиям диабета.
Фигура 3 показывает графики, демонстрирующие изменение активности DPP-IV в почке, печени, сердце и жировой ткани после введения ингибитора DPP-IV.
Фигура 4 показывает график, демонстрирующий изменение метаболизма липидов после введения ингибитора DPP-IV.
Фигура 5 иллюстрирует результат наблюдения относительно стеатоза печени после введения ингибитора DPP-IV.
Фигура 6 является графиком, показывающим изменение микроальбуминурии после введения ингибитора DPP-IV.
Фигура 7 показывает увеличение почечного мезангия после введения ингибитора DPP-IV; и график, показывающий результат оценки.
Фигура 8 иллюстрирует депонирование почечного фибриллярного белка после введения ингибитора DPP-IV.
Фигура 9 является графиком, показывающим оценку гистологического изменения на Фигуре 8.
Фигура 10 является графиком, показывающим экспрессию почечных фибриллярных белков после введения ингибитора DPP-IV.
Фигура 11 является графиком, показывающим экспрессию почечных белков метаболизма липидов после введения ингибитора DPP-IV.
Фигура 12 иллюстрирует результат ПЦР почечных белков метаболизма липидов после введения ингибитора DPP-IV.
На Фигуре 13, график с левой стороны показывает мочевую экскрецию нефрина после введения ингибитора DPP-IV на мышиной модели диабетической нефропатии; и правая сторона иллюстрирует эффекты ингибитора DPP-IV на экспрессию нефрина почечных клубочков, наблюдаемые посредством иммунного окрашивания.
Фигура 14 показывает графики, демонстрирующие эффекты на микроальбуминурию (A) и экскрецию нефрина (B) после индукции заболеваний почек и одновременного введения ингибитора DPP-IV мышиной модели недиабетической нефропатии.
Фигура 15 показывает графики, показывающие эффекты на микроальбуминурию (A) и экскрецию нефрина (B) после стимулирования заболеваний почек и затем введения ингибитора DPP-IV мышиной модели недиабетической нефропатии.
Фигура 16 иллюстрирует результат наблюдения относительно экспрессии гена DPP-IV после стимулирования почечных подоцитов, клеток проксимального канальца и клеток мезангия с высокой глюкозой, ангиотензином II и жирной кислотой.
Фигура 17 является графиком, показывающим сравнение ингибирующих действий в отношении активности DPP-IV между стандартными ингибиторами DPP-IV (линаглиптин, саксаглиптин и ситаглиптин) и ингибитором DPP-IV согласно настоящему раскрытию.
Фигура 18 иллюстрирует эффекты стандартных ингибиторов DPP-IV (линаглиптин, саксаглиптин и ситаглиптин) и ингибитора DPP-IV согласно настоящему раскрытию на экспрессию нефрина после стимулирования почечных подоцитов высокой глюкозой и ангиотензином II.
Описание вариантов осуществления
Настоящее раскрытие будет далее описано более полно с помощью сопровождающих примеров. Однако настоящее раскрытие может быть воплощено во многих различных формах и не должно быть истолковано как ограниченное вариантами осуществления, сформулированными здесь.
Кроме того, образцы и растворители, описанные далее, были куплены от Sigma-Aldrich Korea, если не указано иное.
Примеры
<Пример 1> Оценка массы тела, потребления пищи, потребления воды, сахара в крови натощак, диуреза, значения гемоглобина A1c и кровяного давления
(1) Подготовка недиабетической контрольной группы, диабетической группы и группы введения DA1229
Использовались мыши 6-недельного возраста. Мышей db/m принимали как недиабетическую контрольную группу (7 для каждой стадии, n=28), и мышей db/db разделяли на диабетическую группу (7 для каждой стадии, n=28) и группу введения DA1229 (n=8). 0,3% (вес./вес., 300 мг/кг/сутки) DA1229, ингибитора DPP-IV, смешивали с кормом и давали группе введения DA1229, в то время как диабетической группе давали только корм.
(2) Измерение массы тела, потребления пищи, потребления воды, глюкозы крови натощак, диуреза, значения гемоглобина A1c и кровяного давления
Массу тела, потребление пищи, потребление воды, глюкозу крови натощак, диурез, значение гемоглобина A1c (HbAlc) и кровяное давление (т.е. систолическое кровяное давление, SBP) недиабетической контрольной группы (db/m контрольная группа) и диабетической группы (db/db) измеряли в неделю 0, 4, 8 и 12 после введения; и эти параметры для группы введения DA1229 измеряли в неделю 12. HbAlc измеряли с использованием анализатора DCA 2000+ (Bayer Healthcare, Вупперталь, Германия).
Результат показан ниже в Таблице 1.
В Таблице 1 каждое значение выражали как среднее ± SEM, и статистический анализ проводили на каждой группе в тот же период. *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001 по сравнению с контрольной группой db/m; #P <0,05 по сравнению с db/db.
Масса тела увеличивалась; и потребление пищи, потребление воды, глюкоза крови натощак, диурез заметно увеличивались в диабетической группе по сравнению с недиабетической контрольной группой.
В группе введения DA1229, которой DA1229 вводили в течение 12 недель, никаких существенных различий не было обнаружено по сравнению с диабетической группой в отношении массы тела, потребления пищи и диуреза. Однако потребление воды и глюкоза крови натощак были заметно снижены.
Можно было понять, что DA1229 выполняет функции уменьшения глюкозы крови и снижения экскреции глюкозы.
<Пример 2> Оценка активности DPP-IV
DPP-IV (Дипептидил пептидаза IV) является ферментом, расщепляющим инкретин. Инкретин является гормоном, секретируемым из тонкого кишечника и промотирующим секрецию инсулина. Когда активность DPP-IV ингибируется, активность инкретина сохраняется, и секреция инсулина промотируется.
Поэтому активность DPP-IV в плазме и каждом органе оценивали, чтобы подтвердить что активность DPP-IV эффективно ингибировалась с помощью DA1229. Недиабетическую контрольную группу, диабетическую группу и группу введения DA1229 готовили таким же образом, как в Примере 1(1), и использовали для эксперимента.
Активность DPP-IV была измерена при помощи способа флуорофотометрического тестирования (J. Med. Chem. 2005, 48, 141-151), описанного ранее. Фигура 1 показывает активность DPP-IV в плазме. Недиабетическая контрольная группа и диабетическая группа не показали значительной разницы в активности DPP-IV на каждой стадии развития диабета (см. ФИГ. 1A) Однако было замечено, что активность DPP-IV была заметно уменьшена на 20-ю неделю введения в группе введения ингибитора DPP-IV по сравнению с недиабетической контрольной группой и диабетической группой (см. ФИГ. 1B)
Фигура 2 показывает активность DPP-IV каждой стадии развития диабета в почке, печени, сердце и жировой ткани недиабетической контрольной группы и диабетической группы. Было показано, что активность DPP-IV была высокой в каждом органе. Относительно недиабетической контрольной группы и диабетической группы, активность DPP-IV в печени, сердце и жировой ткани не очень отличалась по сравнению друг с другом (см. ФИГ. 2B-2D), но в почке DPP-IV диабетической группы значительно увеличивался по мере прогрессии диабета (см. ФИГ. 2A)
Фигура 3 показывает активность DPP-IV в почке, печени, сердце и жировой ткани недиабетической контрольной группы и диабетической группы и группы введения DA1229 на 20-ю неделю введения. Активность DPP-IV в каждом органе группы введения DA1229 была заметно уменьшена по сравнению с таковой недиабетической контрольной группы и диабетической группы, и это уменьшение было особенно заметно в почке (см. ФИГ. 3A)
Можно было понять на основании вышеупомянутых результатов, что DA1229 ингибирует активность DPP-IV в каждом органе, и в частности, он эффективно ингибирует активность DPP-IV в почке.
<Пример 3> Оценка метаболизма липидов
У страдающих диабетом пациентов липиды крови имеют тенденцию к повышению, и липиды имеют тенденцию депонироваться в печени (т.е. стеатоз печени) вследствие нарушения метаболизма липидов. Следующий эксперимент проводили, чтобы подтвердить, улучшает ли DA1229 метаболизм липидов. Недиабетическую контрольную группу, диабетическую группу и группу введения DA1229 готовили таким же образом, как в Примере 1(1), и использовали для эксперимента.
(1) Оценка концентрации липида крови
Общий холестерин включает этерифицированный холестерин и неэтерифицированный (свободный) холестерин. Проблемы, такие как, среди прочего, артериосклероз возникает, когда концентрация холестерина LDL увеличивается.
Концентрации липидов, которые представляли собой общий холестерин, триглицериды, холестерин HDL и холестерин LDL, плазмы недиабетической контрольной группы, диабетической группы и группы введения DA1229, измеряли на 12-ю неделю введения. Концентрацию общего холестерина и триглицеридов измеряли при помощи ридера ELISA (Micro-Quant, Bio-Tek Instruments, Кольмар, Франция) после использования набора GPO-Trinder (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США); и холестерин HDL и холестерин LDL измеряли при помощи TBA-200FR NEO (Toshiba, Япония).
Концентрации общего холестерина, триглицерида и холестерина LDL в диабетической группе были увеличены приблизительно в 2 раза или больше по сравнению с недиабетической контрольной группой, но было замечено, что это увеличение вернулось на уровень недиабетической контрольной группы после введения DA1229 (см. ФИГ. 4).
(2) Оценка стеатоза печени
Ткани печени, собранные у недиабетической контрольной группы, диабетической группы и группы введения DA1229, нарезали микротомом и заливали в парафин после спиртового обезвоживания на 12-ю неделю введения. Эти срезы окрашивали Гематоксилин-эозином, и затем депонирование липида наблюдали при помощи микроскопа (STM6-LM Olympus NDT Inc, США) (см. ФИГ. 5). Депонирование липидов тканей печени было увеличено в диабетической группе по сравнению с недиабетической контрольной группой, но было замечено, что это увеличение вернулось на уровень недиабетической контрольной группы в группе введения DA1229.
Можно было понять на основании вышеупомянутого результата, что DA1229 имеет эффект увеличения метаболизма липидов, сниженного вследствие диабета.
<Пример 4> Оценка функции почек
Следующий эксперимент проводили, чтобы подтвердить, улучшает ли введение DA1229 функцию почек, сниженную вследствие заболеваний почек. Недиабетическую контрольную группу, диабетическую группу и группу введения DA1229 готовили таким же образом, как в Примере 1(1).
(1) Оценка плазменного креатинина
Креатинин является веществом, секретируемым почкой, и было показано, что его концентрация в плазме является высокой, когда существует проблема с почечным клиренсом.
Каждое значение выражали как ± SEM в Таблице 2, и статистический анализ проводили на каждой группе в тот же период. †P<0,01 по сравнению с db/db.
Концентрацию плазменного креатинина измеряли модифицированным способом Яффе (Kang YS et al., CCR2 antagonism improves insulin resistance, lipid metabolism, and diabetic nephropathy in type 2 diabetic mice. Kidney Int. 2010 Nov;78(9):883-894, Kang YS et al., Visfatin is upregulated in type-2 diabetic rats and targets renal cells. Kidney Int. 2010 Jul;78(2):170-181), используя TBA-200FR NEO (Toshiba, Япония.)
Было подтверждено в Таблице 2, что плазменный креатинин диабетической группы был увеличен по сравнению с недиабетической контрольной группой, и плазменный креатинин группы введения DA1229 был заметно снижен.
(2) Наблюдение относительно микроальбуминурии
Когда диабет прогрессирует, наблюдаются явления деструкции почечных клубочков и экскреции белка (альбумина), и микроальбуминурия относится к случаю, когда объем экскреции является небольшим. Микроальбуминурия является одним из начальных показателей заболеваний почек, и деструкция клубочков становится более тяжелой по мере того как диабет прогрессирует. Соответственно, объем экскреции белка увеличивается. Недиабетическую контрольную группу, диабетическую группу и группу введения DA1229 готовили таким же образом, как в Примере 1(1) и использовали для эксперимента.
Микроальбуминурию наблюдали путем измерения объема экскреции альбумина с мочой в течение 24 часов в недиабетической контрольной группе, диабетической группе и группе введения DA1229 в неделю 0, 4, 8 и 12 введения. Объем экскреции альбумина измеряли при помощи ридера ELISA (Micro-Quant, Bio-Tek Instruments, Кольмар, Франция) после использования набора ELISA (Shibayagi, Shibukawa, Япония).
Объем экскреции альбумина был увеличен в диабетической группе по сравнению с недиабетической контрольной группой, и это увеличение становилось значительным по мере дальнейшей прогрессии диабета. Однако микроальбуминурия не наблюдалась в группе введения DA1229 до 4-й недели. Она наблюдалось после 4-й недели, но объем экскреции альбумина с мочой был намного меньше, чем в диабетической группе (см. ФИГ. 6).
Можно понять на основании вышеупомянутого результата, что экскреция белка уменьшалась вследствие улучшения выделительной функции почек при введении DA1229.
<Пример 5> Гистологическая оценка расширения почечного мезангия
Мезангиальное расширение наблюдается в почке, когда почечная деструкция прогрессирует при почечных заболеваниях. Поэтому наблюдали гломерулярное мезангиальное расширение в недиабетической контрольной группе, диабетической группе и группе введения DA1229. Эксперимент проводили с недиабетической контрольной группой, диабетической группой и группой введения DA1229, подготовленными таким же образом, как в Примере 1(1), и наблюдение проводили на 12-й неделе введения.
Гломерулярные ткани почек собирали и иссекали микротомом, и заливали в парафин после спиртового обезвоживания. Секции окрашивали, используя PAS (Шифф-йодная кислота); наблюдали при помощи микроскопа (STM6-LM Olympus NDT Inc, США) (см. ФИГ. 7B); и патолог производил оценку (см. ФИГ. 7A)
Мезангиальное расширение наблюдалось в диабетической группе по сравнению с недиабетической контрольной группой, но оно было уменьшено до уровня, близкого к недиабетической контрольной группе, в группе введения DA1229.
Можно понять на основании вышеупомянутого результата, что DA1229 уменьшает деструкцию почечных клубочков.
<Пример 6> Оценка почечного фиброза
Заболевания почек демонстрируют симптом почечной деструкции как следствие прогрессирования заболеваний почек к депонированию фибриллярных белков в почке.
TGF β1 (Трансформирующий Фактор Роста β1) является цитокином, вызывающим почечный фиброз, и коллаген типа IV является матриксом, формирующей фиброзные ткани. PAI-1 (Ингибитор Активатора плазминогена 1) вызывает тромбоз. Все эти 3 белка являются маркерами почечного фиброза.
Следующий эксперимент проводили, чтобы подтвердить, имеет ли DA1229 эффект ингибирования почечного фиброза. Эксперимент проводили с недиабетической контрольной группой, диабетической группой и группой введения DA1229, подготовленными таким же образом, как в Примере 1(1), и наблюдали на 12-ю неделю введения.
(1) Гистологическая оценка
Почечные гломерулярные ткани собирали и иссекали микротомом, и заливали в парафин после спиртового обезвоживания. Секции окрашивали иммуногистохимически; каждый из депонированных TGF β1, коллагена типа IV и PAI-1 в почке наблюдали при помощи микроскопа (STM6-LM Olympus NDT Inc, США) (см. ФИГ. 8); и степень и диапазон окрашивания оценивались патологом (см. ФИГ. 9).
TGF β1 в диабетической группе был увеличен по сравнению с недиабетической контрольной группой, но этот эффект был заметно уменьшен в группе введения DA1229 (см. ФИГ. 8А и 9).
Коллаген IV типа в диабетической группе был увеличен по сравнению с недиабетической контрольной группой, но был снижен до уровня недиабетической контрольной группы в группе введения DA1229 (см. ФИГ. 8B и 9).
PAI-1 в диабетической группе был увеличен по сравнению с недиабетической контрольной группой, но был снижен до уровня недиабетической контрольной группы в группе введения DA1229 (см. ФИГ. 8C и 9).
(2) Оценка экспрессии гена
Экспрессию мРНК TGF β1, коллагена типа IV и PAI-1 наблюдали, чтобы увидеть, происходит ли уменьшение фибриллярных белков, подтвержденное в Примере 6(1), на уровне экспрессии гена. мРНК экстрагировали из образца ткани почки и амплифицировали в контейнере ПЦР, содержащем реактив SYBR Green, с использованием системы Light Cycler 1.5 (Roche Diagnostics Corporation, Индианаполис, Индиана, США), инструмента ПЦР в реальном времени. Значения уровня экспрессии каждого целевого гена в диабетической группе и недиабетической контрольной группе, разделенные на уровень экспрессии β-актина, показаны на Фиг. 10.
Экспрессия мРНК TGF β1 в диабетической группе была увеличена по сравнению с недиабетической контрольной группой, но была заметно уменьшена в группе введения DA1229.
Экспрессия мРНК коллагена типа IV в диабетической группе была увеличена в два раза или больше по сравнению с недиабетической контрольной группой, но была заметно уменьшена в группе введения DA1229.
Экспрессия мРНК PAI-1 в диабетической группе была увеличена в два раза или больше по сравнению с недиабетической контрольной группой, но была заметно уменьшена в группе введения DA1229.
Можно понять на основании вышеупомянутых результатов, что DA1229 показывает превосходные эффекты в ингибировании почечного фиброза.
<Пример 7> Оценка почечного метаболизма липидов
ABCA1 является белком, участвующим в экскреции липидов из тканей, и HMG-CoA редуктаза является белком, участвующим в синтезе липидов.
Экспрессию мРНК гена ABCA1 и гена HMG-CoA редуктазы наблюдали, чтобы увидеть, был ли метаболизм липидов в почке уменьшен и было ли это явление улучшено введением DA1229. Эксперимент проводили с недиабетической контрольной группой, диабетической группой и группой введения DA1229, подготовленными таким же образом, как в Примере 1(1), и наблюдали на 12-ю неделю введения.
мРНК экстрагировали из образца ткани почки и амплифицировали в контейнере ПЦР, содержащем реактив SYBR Green, с использованием системы Light Cycler 1.5 (Roche Diagnostics Corporation, Индианаполис, Индиана, США), инструмента ПЦР в реальном времени. Результат показан на ФИГ. 11 и 12.
Экспрессия мРНК ABCA1 в диабетической группе была уменьшена по сравнению с недиабетической контрольной группой, но была заметно увеличена в группе введения DA1229.
Экспрессия мРНК HMG-CoA редуктазы в диабетической группе была увеличена по сравнению с недиабетической контрольной группой, но была уменьшена до уровня недиабетической контрольной группы в группе введения DA1229.
Можно понять на основании вышеупомянутого результата, что DA1229 ингибирует депонирование липида в тканях почек и снижает синтез липидов.
<Пример 8> Оценка эффектов на экскрецию нефрина и экспрессию нефрина
Нефрин является белком, экспрессирующимся на клеточной мембране подоцита, формирующего гломерулярную фильтрующую мембрану. Нефрин формирует фильтрующий барьер путем связывания со смежным подоцитом. Когда возникает протеинурия вследствие повреждения клубочка, нефриновый барьер повреждается, потому что экспрессия нефрина в подоците снижается, и соответственно, экскреция нефрина с мочой увеличивается. Поэтому наблюдали экскрецию нефрина с мочой и экспрессию нефрина в почке в недиабетической контрольной группе, диабетической группе и группе введения DA1229. Недиабетическую контрольную группу, диабетическую группу и группу введения DA1229 готовили таким же образом, как в Примере 1(1) и использовали для эксперимента.
(1) Оценка экскреции нефрина
Мочу каждой из недиабетической контрольной группы, диабетической группы и группы введения DA1229 собирали, и содержание нефрина в моче определяли количественно с использованием набора EIA (Exocell Inc Филадельфия, Пенсильвания, США). Это значение затем нормализовывали экскрецией креатинина, которая пропорциональна объему мочеиспускания (измеренному модифицированным способом Яффе), и оно показано на графике с левой стороны на ФИГ. 13. Как показано на этом графике, было подтверждено, что содержание нефрина в моче было увеличено в диабетической группе по сравнению с недиабетической контрольной группой, но заметно уменьшено в группе введения DA1229.
(2) Оценка экспрессии нефрина
Кроме того, изолировали почки от каждой группы; почечные ткани отделяли, имунно окрашивали нефрин-специфическим антителом и наблюдали при помощи микроскопа. Результат показан в правой стороне ФИГ. 13. Показано, что наблюдаемый нефрин меньше в диабетической группе по сравнению с недиабетической контрольной группой, но больше в группе введения DA1229.
Можно понять на основании вышеупомянутого результата, что гломерулярная структура сохранялась вследствие сохранения гломерулярного нефринового барьера, и экскреция нефрина с мочой была уменьшена.
<Пример 9> Наблюдение микроальбуминурии на недиабетической мышиной модели заболевания почек и оценка эффектов на экскрецию нефрина
Следующий эксперимент проводили для подтверждения эффекта DA1229 на почке независимо от уровня глюкозы крови или диабета путем получения недиабетической мышиной модели заболевания почек.
(1) Получение недиабетической мышиной модели заболевания почек
Недиабетические заболевания почек появляются индукцией гломерулярного повреждения подоцита при инъекции адриамицина (в дальнейшем, ADX), который является противораковым средством.
Тридцать мышей в возрасте 6 недель разделяли на 3 группы (n=10/группа) после единственной внутривенной инъекции 13 мг/кг ADX. Для первой группы введение DA1229 инициировали немедленно и поддерживали в ходе возникновения и развития заболевания почек. Для второй группы введение DA1229 осуществляли спустя 3 недели после единственной инъекции ADX в целях введения DA1229 после того, как заболевание почек прогрессировало до некоторой степени. Третья группа была установлена как контрольная группа без какого-либо дополнительного действия. DA1229 вводили в форме смеси с кормом в количестве 0,3% (вес./вес., 300 мг/кг/сутки) первой и второй группам. Контрольной группе давали только корм. Микроальбуминурию и экскрецию нефрина каждой группы измеряли на 5-ю неделю введения.
(2) Наблюдение микроальбуминурии и оценка эффектов на экскрецию нефрина
Микроальбуминурию (т.е., альбумин в моче) в группах с первой по третью наблюдали на 3-ю неделю введения таким же образом, как в способе, описанном в Примере 4(2), и эффекты на экскрецию нефрина с мочой оценивали таким же образом, как в способе, описанном в Примере 8.
Результат первой группы, в которой индукцию заболевания почек и введение DA1229 осуществляли одновременно, показан на ФИГ. 14 (черные столбцы соответствуют третьей группе т.е. контрольной группе; и белые столбцы соответствуют первой группе). На ФИГ. 14 было подтверждено, что как экскреция альбумина с мочой (A), так и экскреция нефрина с мочой (B) были значительно уменьшены введением DA1229.
Результат второй группы, в которой введение DA1229 осуществляли после индукции заболевания почек, показан на ФИГ. 15 (черные столбцы соответствуют третьей группе т.е. контрольной группе; и белые столбцы соответствуют первой группе.) На ФИГ. 15 было подтверждено, что как экскреция альбумина с мочой (A), так и экскреция нефрина с мочой (B) были значительно уменьшены введением DA1229. Было подтверждено в верхней части ФИГ. 15, что эффект уменьшения экскреции белка DA1229 стал более значительным с течением времени.
Можно понять на основании вышеупомянутых результатов, что DA1229 имеет эффект защиты клубочка при почечной болезни, вызванной недиабетическим повреждением клубочков, а также диабетическими заболеваниями почек.
<Пример 10> Оценка экспрессии DPP-IV клеток почечного эпителия после стимуляции со стороны диабета
Следующий эксперимент проводили, чтобы подтвердить, увеличивается ли экспрессия гена DPP-IV в клетках, формирующих почку, стимуляцией, происходящей при диабете.
Высокую глюкоза (30 мМ), 100 нМ ангиотензина II или 100 мкМ свободной жирной кислоты (т.е., пальмитиновой кислоты), которые подобны стимулам, происходящим при диабете, добавляли в течение 48 часов к подоциту, клетке проксимального канальца и мезангиальной клетке, которые являются клетками, формирующими почечные ткани; и затем наблюдали экспрессию гена DPP-IV. Общую РНК экстрагировали из образцов, полученных из каждой клетки, и мРНК амплифицировали в контейнере ПЦР, содержащем реактив SYBR Green, с использованием системы Light Cycler 1.5 (Roche Diagnostics Corporation, Индианаполис, Индиана, США), инструмента ПЦР в реальном времени.
Увеличение экспрессии гена DPP-IV не наблюдалось в мезангиальной клетке, но наблюдалось в подоците и клетке проксимального канальца (см. ФИГ. 16) Можно понять на основании вышеупомянутого результата, что экспрессия DPP-IV клеток почечного эпителия, включая подоцит, увеличивается при диабетических заболеваниях почек.
<Сравнительный Пример> Сравнение защитных эффектов в отношении почек среди DA1229 и других ингибиторов DPP-IV
Защитный эффект в отношении почек DA1229 сравнивали с таковым других ингибиторов DPP-IV, таких как линаглиптин, саксаглиптин и ситаглиптин.
(1) Сравнение эффектов DPP-IV ингибирующей активности в подоците
Подоциты культивировали в течение 72 часов в среде, содержащей DA1229, линаглиптин, саксаглиптин или ситаглиптин в концентрации 0 нМ, 1 нМ, 10 нМ и 100 нМ, соответственно. После этого среду удаляли; подоциты промывали фосфатным буфером; и активность DPP-IV измеряли таким же образом, как в Примере 2, используя способ флуорофотометрического тестирования, описанного ранее (J. Med. Chem. 2005, 48, 141-151.)
На ФИГ. 17 показано, что DA1229 ингибирует активность DPP-IV в подоцитах в дозозависимым образом; и его эффект превосходит таковой линаглиптина и ситаглиптина и сравним с таковым саксаглиптина.
(2) Сравнение влияния на экспрессию нефрина после тех же стимулов, как диабет
Влияние DA1229, линаглиптина, саксаглиптина и ситаглиптина на экспрессию нефрина под стимулами глюкозы и ангиотензина II, которые являются теми же, как при стимуляции, происходящей при диабете, наблюдали ниже.
Подоциты культивировали в течение 72 часов в среде, содержащей 30 мМ глюкозы, 100 нМ ангиотензина II; и любой из 10 нМ DA1229, 10 нМ линаглиптина, 1 нМ саксаглиптина и 10 нМ ситаглиптина. После этого среду удаляли; клетки лизировали; и изменения внутриклеточно экспрессируемого нефрина измеряли вестерн-блоттингом с использованием поликлонального антитела (SantaCruz, SC-19000.)
На ФИГ. 18 подтверждено, что экспрессия нефрина уменьшалась вследствие обработки глюкозой и ангиотензином II (вторая слева) по сравнению с контрольной группой, обработанной нормоглюкозой (NG, первая слева), но экспрессия нефрина остается равной контрольной группе DA1229 (третья слева). Между тем экспрессия нефрина групп, обработанных линаглиптином или саксаглиптином, была выше, чем в группе, обработанной только глюкозой и ангиотензином II, но намного ниже, чем в группе, обработанной DA1229, и экспрессия нефрина в группе, обработанной ситаглиптином, не имела почти никакого различия по сравнению с группой, обработанной только глюкозой и ангиотензином II.
Можно понять на основании вышеупомянутого результата, что DA1229 имеет более сильное ингибирующее действие на DPP-IV почки, чем у коммерчески доступных стандартных ингибиторов DPP4, т.е., линаглиптина, саксаглиптина и ситаглиптина; и имеет более сильный эффект в отношении поддержания экспрессии нефрина в почечных клубочках даже под теми же стимулами, которые происходят при диабете.
Промышленная применимость
Фармацевтическая композиция согласно настоящему раскрытию для предупреждения или лечения заболеваний почек улучшает метаболизм липидов, предупреждает гистологическое повреждение, включая почечный фиброз, облегчает микроальбуминурию и поддерживает нефрин почечных клубочков. Поэтому композиция может быть использована для лечения заболеваний почек.
Настоящее изобретение относится к области фармацевтики и раскрывает композицию для предупреждения или лечения заболеваний почек. Композиция согласно настоящему изобретению содержит соединение (R)-4-{(R)-3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)бутаноил}-3-(трет-бутоксиметил)пиперазин-2-он, или его фармацевтически приемлемые соли; или его гидрат или сольват. Заявленная композиция улучшает метаболизм липидов, предотвращает гистологическое повреждение, включая почечный фиброз, облегчает микроальбуминурию и поддерживает нефроны почечных клубочков и может быть использована для лечения заболеваний почек. 6 з.п. ф-лы, 18 ил., 2 табл., 10 пр.
1. Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения заболеваний почек, включающая соединение, представленное химической формулой 1, приведенной ниже; или его фармацевтически приемлемые соли; или его гидрат или сольват
[Химическая формула 1]
в которой X обозначает OR1, и R1 обозначает трет-бутил, в качестве активных ингредиентов.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой фармацевтически приемлемая соль выбрана из группы, состоящей из уксусной кислоты, бензолсульфоновой кислоты, бензойной кислоты, камфорсульфоновой кислоты, лимонной кислоты, этансульфоновой кислоты, фумаровой кислоты, глюконовой кислоты, глутаминовой кислоты, бромистоводородной кислоты, соляной кислоты, изэтиновой кислоты, молочной кислоты, малеиновой кислоты, яблочной кислоты, миндальной кислоты, метансульфоновой кислоты, муциновой кислоты, азотной кислоты, памовой кислоты, пантотеновой кислоты, фосфорной кислоты, янтарной кислоты, серной кислоты, винной кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты и адипиновой кислоты.
3. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой соединение, представленное химической формулой 1; или его фармацевтически приемлемые соли; или его гидрат или сольват являются ингибиторами DPP-IV (дипептидил пептидазы-IV).
4. Фармацевтическая композиция по п.1, дополнительно содержащая антидиабетические средства, выбранные из группы, состоящей из бигуанида, сенсибилизатора инсулина, средства, усиливающего секрецию инсулина, ингибитора α-глюкозидазы и антагониста каннабиноидного рецептора 1.
5. Фармацевтическая композиция по п.1, дополнительно содержащая ингибитор ангиотензинпревращающего фермента или блокатор рецептора ангиотензина II.
6. Фармацевтическая композиция по п.1, где заболевание почек является гломерулярным заболеванием почек.
7. Фармацевтическая композиция по п.1, где заболевание почек является диабетическим заболеванием почек.
| WO2005049022, 02.06.2005 | |||
| BERTHOLD HOCHER ET AL, Renal and Cardiac Effects of DPP-4 Inhibitors from Preclinical Development to Clinical Research, KIDNEY AND BLOOD PRESSURE RESEARCH, CH, (20120201), vol | |||
| Коридорная многокамерная вагонеточная углевыжигательная печь | 1921 |
|
SU36A1 |
| WO2008130151, 30.10.2008 | |||
| KIM, HEUNG JAE ET AL., Discovery of DA-1229: A potent, long acting dipeptidyl peptidase-4 inhibitor for the treatment of type 2 diabetes, BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, (20110615), vol | |||
| Выбрасывающий ячеистый аппарат для рядовых сеялок | 1922 |
|
SU21A1 |
