Способ получения модифицированных кристаллов магнетита Российский патент 2018 года по МПК C30B29/16 C30B30/06 C30B29/60 A61K33/26 A61K41/00 A61K49/06 B82B3/00 B82Y5/00 B82Y30/00 B82Y40/00 

Изобретение относится к области неорганической химии и касается способа получения модифицированных кристаллов магнетита (Fe₃O₄), содержащих на поверхности флуоресцентный краситель, что дает возможность визуализировать и отслеживать их поведение, как в живой клетке, так и в живом организме in vivo. Такие кристаллы могут найти применение в качестве средств доставки лекарств и Т2-контрастных агентов.

Известен способ получения модифицированных кристаллов магнетита путем смешения дисперсии кристаллов магнетита сферической формы, имеющих размер 26-38 нм, в хлороформе с раствором, содержащим смесь 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропана и холестерина в хлороформе, добавлением в полученную смесь дистиллированной воды, обработки смеси ультразвуком, удаления хлороформа и повторной обработки смеси ультразвуком (Namiki Y. et al. A novel magnetic crystal-lipid nanostructure for magnetically guided in vivo gene delivery // Nature Nanotechnology. 2009. V. 4, P. 598-606). Данный способ получения модифицированных кристаллов магнетита имеет такие признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого способа, как смешение дисперсии кристаллов магнетита в хлороформе с раствором в хлороформе смеси холестерина и липида, добавления в нее воды и обработки смеси ультразвуком.

Недостатками данного способа является то, что полученные модифицированные кристаллы магнетита не содержат флуоресцентного красителя, необходимого для визуализации, и обладают относительно невысокими магнитными свойствами, что затрудняет проведение с их помощью эффективной МРТ-диагностики и осложняет удаленное манипулирование ими во внешнем магнитном поле.

Известен способ получения модифицированных кристаллов магнетита путем диспергирования сферических кристаллов магнетита, имеющих диаметр 4-11 нанометров (нм), в хлороформе под действием ультразвука, добавления в дисперсию раствора дипальмитоилфосфатидилхолина, выпаривания хлороформа из смеси в инертной атмосфере, удаления остаточного растворителя в вакуумной камере, добавления фосфатного буферного раствора, нагрева смеси до 50°C и обработки ее ультразвуком (Gonzales М. & Krishnan K.M. Synthesis of magnetoliposomes with monodisperse iron oxide nanocrystal cores for hyperthermia // Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 2005. V. 293, P. 265-270). Данный способ получения модифицированных кристаллов магнетита имеет такие признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого способа, как смешение дисперсии кристаллов магнетита в хлороформе с раствором липида в хлороформе, удаление из смеси хлороформа и воздействие на смесь ультразвука.

Недостатками данного способа является то, что полученные модифицированные кристаллы магнетита не содержат флуоресцентного красителя, необходимого для визуализации, и обладают относительно невысокими магнитными свойствами, что затрудняет проведение с их помощью эффективной МРТ-диагностики и осложняет удаленное манипулирование ими во внешнем магнитном поле.

Наиболее близким к заявляемому является известный способ получения модифицированных кристаллов оксида железа, в котором используют исходную навеску оксида, обладающего магнитными свойствами, содержащую 5 мг по железу. В данном техническом решении нет уточнений относительно того, какой из магнитных оксидов железа, обладающих гидрофобными свойствами, был использован (γ-Fe₂O₃ или Fe₃O₄). Следовательно, описанная в известном техническом решении модификация оксида железа является универсальной и может быть применима в том числе и для используемого в предлагаемом способе магнетита. Проведенный расчет показывает, что 5 мг по железу содержится в 6,91 мг магнетита. Таким образом, известный способ получения модифицированных кристаллов магнетита осуществляют путем смешения 6,91 мг (138 мас. ч. (мас. ч.)) магнетита, имеющих размер 16 нм, и 0,05 мг (1 мас. ч.) смеси холестерина, фосфолипида DSPC, имеющего название по химической номенклатуре 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6517?lang=en&region=RU), липидоида С12-200, имеющего название по химической номенклатуре 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ол (https://www.google.com/patents/WO2011017548A1?cl=en) и липида mPEG2000-DMG, имеющего название по химической номенклатуре 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоль)-2000 (https://www.nofamerica.corn/store/index.php?dispatch=products.view&product_id=329), взятых в массовом соотношении 15:7:75:3, соответственно, вначале с 2 мл (60000 мас. ч.) хлороформа, затем с 4 мл (82240 мас. ч.) N-метил-2-пирролидона, обработки смеси ультразвуком, удаления хлороформа и добавления в нее воды с последующим диализом полученной дисперсии модифицированных кристаллов против воды (Jiang S., Eltoukhy A.A., Love K.T., Langer R. & Anderson, D.G. Lipidoid-coated iron oxide nanoparticles for efficient DNA and siRNA delivery // Nano Letters, 2013. V. 13, P. 1059-1064 - прототип). Данный способ получения модифицированных кристаллов магнетита имеет такие признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого способа, как смешение 138 мас. ч. кристаллов магнетита и 1 мас. ч. смеси холестерина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ола и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоля)-2000, взятых в массовом соотношении 15:7:75:3, соответственно, вначале с 60000 мас. ч. хлороформа, затем с 82240 мас. ч. N-метил-2-пирролидона, обработка смеси ультразвуком, удаление хлороформа и добавление в нее воды с последующим диализом полученной дисперсии модифицированных кристаллов магнетита против воды.

Недостатками данного способа является то, что полученные модифицированные кристаллы магнетита не содержат флуоресцентного красителя, необходимого для визуализации, и обладают относительно невысокими магнитными свойствами (см. контрольный пример 4), что затрудняет проведение с их помощью эффективной МРТ-диагностики и осложняет удаленное манипулирование ими во внешнем магнитном поле.

Задача изобретения заключается в разработке способа получения модифицированных кристаллов магнетита, лишенного вышеуказанных недостатков.

Технический результат изобретения заключается в придании кристаллам флуоресцентных свойств и улучшении магнитных свойств кристаллов за счет увеличения их намагниченности насыщения и повышения скорости их r₂-релаксивности.

Предварительно были проведены эксперименты с различными исходными кристаллами магнетита, с различным составом модифицирующего покрытия на кристаллах и разными вводимыми флуоресцентными красителями, которые показали, что указанный технический результат достигается в том случае, когда в способе получения модифицированных кристаллов магнетита путем смешения 138 мас. ч. кристаллов магнетита и 1 мас. ч. смеси холестерина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ола и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоля)-2000, взятых в массовом соотношении 15:7:75:3, соответственно, вначале с 60000 мас. ч. хлороформа, затем 82240 мас. ч. N-метил-2-пирролидона, обработки смеси ультразвуком, удаления хлороформа и добавления в нее воды с последующим диализом полученной дисперсии модифицированных кристаллов магнетита против воды, в качестве кристаллов используют кристаллы магнетита, полученные путем смешения октадецена с олеатом железа(III) или ацетилацетонатом железа(III), олеиновой кислотой и олеатом натрия, нагрева смеси до 70°C и ее выдерживания при этой температуре в течение 30 мин, повторного нагрева смеси в атмосфере инертного газа с 70°C до 320°C, ее выдерживания при этой температуре и охлаждения смеси до комнатной температуры, проводимыми в атмосфере инертного газа, введения в систему изопропанола, отделения кристаллов магнетита, их диспергирования в неполярном высококипящем органическом растворителе, выбранном из группы, включающей дибензиловый эфир, октадецен и триоктиламин, в присутствии олеиновой кислоты и олеата натрия, нагрева полученной дисперсии до температуры 290-350°C в атмосфере инертного газа с последующим введением в нагретую дисперсию по каплям раствора олеата железа(III) в неполярном высококипящем органическом растворителе в течение 1-10 ч и охлаждения дисперсии до комнатной температуры, проводимыми в атмосфере инертного газа, повторного введения в систему изопропанола и отделения магнетита, а после диализа дисперсию концентрируют, добавляют в нее раствор в диметилсульфоксиде флуоресцентного красителя, выбранного из группы, включающей 1,1-диоктадецил-3,3,3,3 тетраметилиндодикарбоцианин, 1,1-диоктадецил-3,3,3,3-тетраметилиндотрикарбоцианионид и 9-(диэтиламино)бензо[а]феноксазин-5-он, отделяют модифицированный магнетит методом центрифугирования, затем его промывают смесью воды и диметилсульфоксида, потом водой.

Предлагаемый способ является новым и не описан в патентной и научно-технической литературе. Способ получения используемых в предлагаемом техническом решении исходных кристаллов магнетита также является новым и не описан в патентной и научно-технической литературе.

Исходные кристаллы магнетита в предлагаемом способе получают в два этапа с использованием на втором этапе синтеза неполярного высококипящего органического растворителя, выбранного из группы, включающей дибензиловый эфир, октадецен и триоктиламин. Если на этой стадии предложенного способа синтеза вместо неполярного высококипящего органического растворителя использовать полярный высококипящий органический растворитель, то технический результат изобретения не достигается.

В предложенном техническом решении при получении исходных кристаллов магнетита в качестве органического соединения трехвалентного железа можно использовать олеат железа(III) или ацетилацетонат железа(III). При этом концентрация органического соединения железа(III) в неполярном высококипящем органическом растворителе может варьироваться и составлять, например, 0,02-0,10 моль/л. Концентрации олеиновой кислоты и олеата натрия также могут варьироваться и составлять, например, 0,02-0,10 моль/л и 0,06-0,3 моль/л, соответственно.

В предлагаемом способе оптимальная температура первоначального нагрева смеси органического соединения железа(III), олеиновой кислоты, олеата натрия и октадецена, равная 70°C, и оптимальная продолжительность первоначального нагрева вышеуказанной смеси при 70°C, равная 30 мин, были установлены экспериментально. При этом скорость нагрева смеси зависит от мощности электрической плитки, нагревающей используемую при осуществлении способа масляную баню, и может составлять, например, 2-6°C/мин. Следует отметить, что проводить вышеуказанные стадии синтеза кристаллов магнетита можно в присутствии воздуха. После проведения вышеуказанных стадий синтеза необходимо повторно нагреть реакционную смесь от 70°C до 320°C. При этом скорость нагрева смеси может быть различна и составлять, например, 2-6°C/мин, причем данную стадию синтеза кристаллов магнетита необходимо проводить в атмосфере любого инертного газа, например, такого, как азот, аргон и т.д. После нагрева смеси до 320°C реакционную смесь необходимо выдержать при данной температуре в атмосфере инертного газа в течение определенного времени, например, в течение 25-60 мин, при этом данную операцию также необходимо проводить в атмосфере инертного газа. Затем реакционную смесь необходимо охладить до комнатной температуры в атмосфере инертного газа. Продолжительность охлаждения реакционной смеси может также быть различной и составлять, например, 30-120 мин. Если вышеуказанные стадии синтеза проводить не в атмосфере инертного газа, а, например, в присутствия воздуха или хотя бы одну из вышеуказанных стадий синтеза вообще не проводить, то технический результат изобретения не достигается.

После охлаждения смеси до комнатной температуры в предложенном способе в систему необходимо ввести изопропанол для декантации полученных кристаллов магнетита, причем для выполнения этой стадии синтеза атмосфера инертного газа не требуется и ее можно проводить в присутствии воздуха. При этом количество вводимого изопропанола может варьироваться и составлять, например, 200-400% от объема реакционной смеси.

После введения изопропанола кристаллы магнетита необходимо отделить с использованием традиционно применяемых для этих целей методов, например, таких, как центрифугирование или магнитная декантация. Второй этап синтеза исходных кристаллов магнетита необходим для контролированного увеличения размера кристаллов.

В предлагаемом техническом решении на втором этапе синтеза отделенные кристаллы диспергируют в неполярном высококипящем органическом растворителе, выбранном из группы, включающей дибензиловый эфир, октадецен и триоктиламин. При этом в неполярный высококипящий органический растворитель необходимо добавить олеиновую кислоту и олеат натрия. На этой стадии синтеза концентрации олеиновой кислоты и олеата натрия в неполярном высококипящем органическом растворителе могут варьироваться и составлять, например, 0,02-0,10 моль/л и 0,06-0,30 моль/л, соответственно.

На второй стадии синтеза концентрация дисперсии ранее полученных кристаллов магнетита в смеси неполярного высококипящего органического растворителя, олеиновой кислоты и олеата натрия также может варьироваться и составлять, например, 3,20-15,5 г/л. В предлагаемом способе после диспергирования кристаллов магнетита полученную дисперсию нагревают до температуры 290-350°C в атмосфере любого инертного газа, например, аргона. Затем в нагретую дисперсию в атмосфере инертного газа по каплям вводят раствор олеата железа(III) в неполярном высококипящем органическом растворителе в течение 1-10 ч. При этом концентрация олеата железа(III) в вышеуказанном растворителе может варьироваться и составлять, например, 0,04-0,50 моль/л. Если в предлагаемом способе любую из вышеуказанных стадий синтеза кристаллов магнетита не проводить, или их проводить в других условиях, например, вводить раствор олеата железа(III) не по каплям в течение 1-10 ч, а ввести его за один прием, то предлагаемый способ утрачивает работоспособность.

В предлагаемом техническом решении после введения раствора олеата железа(III) в нагретую дисперсию кристаллов магнетита ее охлаждают до комнатной температуры в течение 30-120 мин в атмосфере инертного газа, затем в систему повторно вводят изопропанол, необходимый для декантации полученных кристаллов магнетита, увеличивших свой размер, причем для выполнения этой стадии синтеза атмосфера инертного газа не требуется и ее можно проводить в присутствии воздуха. При этом количество повторно вводимого изопропанола также может варьироваться и составлять, например, 200-400% от объема реакционной смеси. Затем увеличившие свой размер в процессе второй стадии синтеза кристаллы магнетита отделяются с использованием традиционно применяемых для этих целей методов, например, таких, как центрифугирование или магнитная декантация.

В предлагаемом техническом решении модифицированные кристаллы магнетита получают путем смешения 138 мас. ч. кристаллов магнетита и 1 мас. ч. смеси холестерина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ола и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоля)-2000, взятых в массовом соотношении 15:7:75:3, соответственно, вначале с 60000 мас. ч. хлороформа, затем 82240 мас. ч. N-метил-2-пирролидона, обработки смеси ультразвуком, удаления хлороформа и добавления в нее воды с последующим диализом полученной дисперсии модифицированных кристаллов магнетита против воды. Однако в прототипе полученные таким образом модифицированные кристаллы магнетита используют в качестве носителей для доставки нуклеиновых кислот в клетки биологических объектов. При этом введение в вышеописанные кристаллы флуоресцентных красителей, осуществляемое в предлагаемом техническом решении, ни в прототипе, ни в научно-технической литературе не описано и является новым.

При этом также экспериментально было показано, что смешение вышеуказанных количеств магнетита, смеси холестерина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1 -ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ола и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоля)-2000, хлороформа и N-метил-2-пирролидона не сопровождается полной адсорбцией холестерина и вышеуказанных липидов на кристаллах магнетита (Love, K. Т. et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing // Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010. V. 107, P. 1864-1869).

Следует отметить, что в предлагаемом способе можно использовать любой холестерин. Синтез 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ола описан (Love, K. Т. et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing // Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010. V. 107, P. 1864-1869). Реагенты 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоля)-2000 коммерчески доступны (http://www.echelon-inc.com/index.php?module=Products&func=detail&id=618 и https://avantilipids.com/product/880150, соответственно).

В данном техническом решении выбор в качестве растворителя хлороформа обусловлен тем, что он хорошо растворяет смесь холестерина и вышеуказанных липидов, обладает низкой температурой кипения и впоследствии может быть легко удален из реакционной системы.

Экспериментально было показано, что N-метил-2-пирролидон не только хорошо смешивается с хлороформом и водой, но и инициирует процесс образования на кристаллах магнетита покрытия, состоящего из холестерина и вышеуказанных липидов.

В предлагаемом техническом решении после введения N-метил-2-пирролидона полученную смесь обрабатывают ультразвуком с получением дисперсии частиц магнетита. Продолжительность обработки смеси ультразвуком может варьироваться и составлять, например, 0,5-7,0 ч. При этом мощность ультразвука также может быть различна и составлять, например, 116-580 Вт.

В предложенном способе после обработки смеси ультразвуком полученную дисперсию помещают в круглодонную колбу, хлороформ удаляют на роторном испарителе, затем в колбу добавляют воду, при этом объем введенной воды может варьироваться и составлять, например, 400-600% от объема смеси после упаривания хлороформа. После добавления воды содержимое колбы переносят в мешок для диализа с размером пор, например, 25-50 кДа и проводят диализ дисперсии против воды. Продолжительность диализа может варьироваться и составлять, например, 24-48 ч.

После диализа получают разбавленную водную дисперсию модифицированных кристаллов магнетита, которую концентрируют путем удаления части воды, например, с использованием роторного испарителя или центрифугирования. При этом содержание магнетита в сконцентрированной водной дисперсии может варьироваться и составлять, например, 0,7-2,8 мг/мл. Затем в водную дисперсию модифицированных кристаллов магнетита добавляют раствор в ДМСО одного известного флуоресцентного красителя, выбранного из группы, включающей 1,1-диоктадецил-3,3,3,3 тетраметилиндодикарбоцианин, 1,1-диоктадецил-3,3,3,3-тетраметилиндотрикарбоцианионид и 9-(диэтиламино)бензо[а]феноксазин-5-он. Все вышеуказанные флуоресцентные красители коммерчески доступны. При этом концентрация красителя в ДМСО может варьироваться и составлять, например, 1-5 мг/мл. Экспериментально было показано, что в данных условиях происходит связывание любого из вышеуказанных красителей путем гидрофобного взаимодействия с поверхностью модифицированного магнетита.

Полученный модифицированный магнетит с флуоресцентной меткой отделяют от остальных компонентов смеси методом центрифугирования, после чего отделенный магнетит промывают вначале смесью воды и ДМСО, затем водой. Объемы воды и ДМСО могут варьироваться и составлять, например, вначале 1-5 мл воды и 1-5 мл ДМСО, затем 1-5 мл воды, соответственно.

Следует отметить, что получить магнетит с флуоресцентной меткой без предварительной модификации магнетита вышеуказанной смесью холестерина и трех липидов не удается.

Модифицированные кристаллы магнетита можно хранить в водной среде или в различных буферных растворах в закрытой стеклянной емкости, например, при 4°C. В этих условиях продолжительность хранения модифицированных кристаллов магнетита составляет не менее 1 мес.

Преимущества предложенного способа иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1

В трехгорлую колбу, помещенную в масляную баню и снабженную обратным холодильником, высокотемпературным термометром и системой подачи инертного газа, при комнатной температуре вводят 20,0 мл октадецена, 1,800 г олеата железа(III), 0,570 г олеиновой кислоты и 1,220 г олеата натрия. Затем включают нагрев масляной бани, содержимое колбы нагревают до 70°C со скоростью 6°C/мин и выдерживают при этой температуре в течение 30 мин. После чего в колбу подают ток азота, после дегазации содержимого колбы ее нагревают с 70°C до 320°C со скоростью 2°C/мин с постепенным увеличением мощности плитки. Колбу выдерживают при 320°C в течение 25 мин, затем извлекают из масляной бани и содержимое колбы оставляют остывать до комнатной температуры, проводя эти стадии синтеза в атмосфере азота. Через 30 мин содержимое колбы выливают в химический стакан, содержащий 80,0 мл изопропанола, после чего содержимое стакана перемешивают. Выпавший в осадок кристаллы магнетита отделяют магнитной декантацией, затем их переносят в химический стакан, содержащий 10,0 мл триоктиламина, 0,284 г олеиновой кислоты и 0,912 г олеата натрия, и диспергируют путем перемешивания. Полученную дисперсию переносят в ранее использованную трехгорлую колбу. Содержимое колбы продувают азотом, колбу помещают в масляную баню и нагревают до 350°C со скоростью 2°C/мин, после чего туда в атмосфере азота по каплям вводят раствор 18,000 г олеата железа(III) в 22,0 мл триоктиламина в течение 10 ч. Затем колбу извлекают из масляной бани и охлаждают до комнатной температуры, проводя эти стадии синтеза в атмосфере азота. После чего содержимое колбы переносят в химический стакан, содержащий 200,0 мл изопропанола. Выпавший магнетит отделяют от остальных компонентов реакционной смеси методом магнитной декантации, затем сушат до постоянной массы. Получают 1,701 г кристаллов магнетита.

345 мг (138 мас. ч.) полученных кристаллов магнетита и 2,5 мг (1 мас. ч.) смеси холестерина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ола и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоля)-2000, взятых в массовом соотношении 15:7:75:3, соответственно, смешивают вначале с 100 мл (60000 мас. ч.) хлороформа, затем с 200 мл (82240 мас. ч.) N-метил-2-пирролидона, после чего полученную смесь обрабатывают в течение 6 ч ультразвуком мощностью 580 Вт. После этого смесь переносят в круглодонную колбу и хлороформ удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме при температуре 40°C. Затем в колбу добавляют 1000 мл воды, содержимое колбы переносят в мешок для диализа с размером пор 25 кДа и проводят диализ дисперсии против воды продолжительностью 24 ч. Получают разбавленную водную дисперсию модифицированных кристаллов магнетита, которую концентрируют до 250 мл путем удаления части воды с использованием роторного испарителя. Затем к 1 мл водной сконцентрированной дисперсии модифицированных кристаллов магнетита с концентрацией 1,38 мг/мл добавляют 1 мкл раствора в ДМСО флуоресцентного красителя 1,1-диоктадецил-3,3,3,3 тетраметилиндодикарбоцианина с концентрацией 1 мг/мл. Полученный модифицированный магнетит с флуоресцентной меткой отделяют от остальных компонентов смеси методом центрифугирования, отделенный магнетит промывают вначале смесью 1 мл воды и 1 мл ДМСО, затем 1 мл воды.

Модифицированные кристаллы магнетита хранят в водной среде в закрытой стеклянной емкости при 4°C. В этих условиях продолжительность хранения модифицированных кристаллов магнетита составляет не менее 1 мес.

Методом просвечивающей электронной микроскопии было показано, что полученные кристаллы магнетита имеют кубическую форму со стороной 25 нм. С помощью прибора Вибромагнетометр VSM-250 было показано, что у полученных кристаллов намагниченность насыщения равна 78 А*м²/кг. Скорость r₂-релаксивности полученных кристаллов магнетита, определенная методом МРТ-томографии, составляет 310 мМ^-1*с^-1. С помощью дифрактометра Rigaku Smartlab было выявлено, что положение рентгеновских рефлексов полученных кристаллов соответствует справочным значениям рефлексов магнетита. Методом сканирующей ион-проводящей микроскопии с конфокальной приставкой на клетках клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека Hep G2 было показано, что при облучении электромагнитным излучением с длиной волны в области 750 нм клеточной культуры с введенными в нее модифицированными кристаллами магнетита наблюдается флуоресценция в области 782 нм благодаря наличию флуоресцентного красителя, связанного с кристаллами магнетита.

Пример 2

В трехгорлую колбу, помещенную в масляную баню и снабженную обратным холодильником, высокотемпературным термометром и системой подачи инертного газа, при комнатной температуре вводят 15,0 мл октадецена, 0,900 г олеата железа(III), 0,280 г олеиновой кислоты и 0,610 г олеата натрия. Затем включают нагрев масляной бани, содержимое колбы нагревают до 70°C со скоростью 5°C/мин и выдерживают при этой температуре в течение 30 мин. После чего в колбу подают ток аргона и после дегазации содержимого колбы ее нагревают с 70°C до 320°C со скоростью 5°C/мин, затем содержимое колбы выдерживают при 320°C в течение 30 мин, после чего колбу извлекают из масляной бани и оставляют остывать до комнатной температуры в атмосфере аргона. Через 60 мин содержимое колбы выливают в химический стакан, содержащий 30 мл изопропанола, после чего содержимое стакана перемешивают. Выпавшие в осадок кристаллы магнетита отделяют магнитной декантацией, затем их переносят в химический стакан, содержащий 8,0 мл октадецена, 0,057 г олеиновой кислоты и 0,180 г олеата натрия, и диспергируют путем перемешивания. Полученную дисперсию переносят в ранее использованную трехгорлую колбу. Содержимое колбы продувают аргоном, колбу помещают в масляную баню и нагревают со скоростью 5°C/мин до 318°C, после чего туда в атмосфере аргона по каплям вводят раствор 9,00 г олеата железа(III) в 18 мл октадецена в течение 5 ч. Затем колбу извлекают из масляной бани и охлаждают до комнатной температуры, проводя эти стадии синтеза в атмосфере аргона. После этого содержимое колбы переносят в химический стакан, содержащий 110 мл изопропанола. Выпавший магнетит отделяют от остальных компонентов реакционной смеси методом магнитной декантации, затем сушат до постоянной массы. Получают 0,851 г кристаллов магнетита.

691 мг (138 мас. ч.) полученных кристаллов магнетита и 5 мг (1 мас. ч.) смеси холестерина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ола и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоля)-2000, взятых в массовом соотношении 15:7:75:3, соответственно, смешивают вначале с 200 мл (60000 мас. ч.) хлороформа, затем с 400 мл (82240 мас. ч.) N-метил-2-пирролидона, после чего полученную смесь обрабатывают в течение 7 ч ультразвуком мощностью 290 Вт. После этого смесь переносят в круглодонную колбу и хлороформ удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме при температуре 43°C. Затем в колбу добавляют 1600 мл воды, содержимое колбы переносят в мешок для диализа с размером пор 50 кДа и проводят диализ дисперсии против воды продолжительностью 48 ч. Получают разбавленную водную дисперсию модифицированных кристаллов магнетита, которую концентрируют до 246 мл путем удаления части воды с использованием роторного испарителя. Затем к 1 мл водной сконцентрированной дисперсии модифицированных кристаллов магнетита с концентрацией 2,8 мг/мл добавляют 1 мкл раствора в ДМСО флуоресцентного красителя 1,1-диоктадецил-3,3,3,3 тетраметилиндодикарбоцианина с концентрацией 2,5 мг/мл. Полученный модифицированный магнетит с флуоресцентной меткой отделяют от остальных компонентов смеси методом центрифугирования, отделенный магнетит промывают вначале смесью 5 мл воды и 5 мл ДМСО, затем 5 мл воды.

Модифицированные кристаллы магнетита хранят в водной среде в закрытой стеклянной емкости при 4°C. В этих условиях продолжительность хранения модифицированных кристаллов магнетита составляет не менее 1 мес.

Методом просвечивающей электронной микроскопии было показано, что полученные кристаллы магнетита имеют кубическую форму со стороной 23 нм. С помощью прибора Вибромагнетометр VSM-250 было показано, что у полученных кристаллов намагниченность насыщения равна 73 А*м²/кг. Значение скорости r₂-релаксивности полученных кристаллов магнетита, определенное методом МРТ-томографии, составляет 293 мМ^-1*с^-1. С помощью дифрактометра Rigaku Smartlab было выявлено, что положение рентгеновских рефлексов полученных кристаллов соответствует справочным значениям рефлексов магнетита. Методом сканирующей ион-проводящей микроскопии с конфокальной приставкой на клетках клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека Hep G2 было показано, что при облучении электромагнитным излучением с длиной волны в области 648 нм клеточной культуры с введенными в нее модифицированными кристаллами магнетита наблюдается флуоресценция в области 668 нм благодаря наличию флуоресцентного красителя, связанного с кристаллами магнетита.

Пример 3

В трехгорлую колбу, помещенную в масляную баню и снабженную обратным холодильником, высокотемпературным термометром и системой подачи инертного газа, при комнатной температуре вводят 25,0 мл октадецена, 0,177 г ацетилацетоната железа(III), 0,142 г олеиновой кислоты и 0,456 г олеата натрия. Затем включают нагрев масляной бани, содержимое колбы нагревают до 70°C со скоростью 2°C/мин и выдерживают при этой температуре в течение 30 мин. После чего в колбу подают ток аргона и после дегазации содержимого колбы ее нагревают с 70°C до 320°C со скоростью 4°C/мин, затем колбу выдерживают при 320°C в течение 60 мин, после чего колбу извлекают из масляной бани и содержимое колбы оставляют остывать до комнатной температуры, проводя эти стадии синтеза в атмосфере аргона. Через 120 мин содержимое колбы выливают в химический стакан, содержащий 75,0 мл изопропанола, после чего содержимое стакана перемешивают. Выпавшие в осадок кристаллы магнетита отделяют магнитной декантацией, затем их переносят в химический стакан, содержащий 12,0 мл дибензилового эфира, 0,068 г олеиновой кислоты и 0,219 г олеата натрия, и диспергируют путем перемешивания. Полученную дисперсию переносят в ранее использованную трехгорлую колбу. Содержимое колбы продувают аргоном, колбу помещают в масляную баню и нагревают до 290°C со скоростью 6°C/мин. После чего туда в атмосфере аргона по каплям подают раствор 1,368 г олеата железа(III) в 38,0 мл дибензилового эфира в течение 1 ч, затем колбу извлекают из масляной бани и охлаждают до комнатной температуры, проводя эти стадии синтеза в атмосфере аргона, и содержимое колбы переносят в химический стакан, содержащий 100,0 мл изопропанола. Выпавший магнетит отделяют от остальных компонентов реакционной смеси методом магнитной декантации, затем сушат до постоянной массы. Получают 0,155 г кристаллов магнетита.

138 мг (138 мас. ч.) полученных кристаллов магнетита и 1 мг (1 мас. ч.) смеси холестерина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ола и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоля)-2000, взятых в массовом соотношении 15:7:75:3, соответственно, смешивают вначале с 40 мл (60000 мас. ч.) хлороформа, затем с 80 мл (82240 мас. ч.) N-метил-2-пирролидона, после чего полученную смесь обрабатывают в течение 0,5 ч ультразвуком мощностью 580 Вт. После этого смесь переносят в круглодонную колбу и хлороформ удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме при температуре 35°C. Затем в колбу добавляют 480 мл воды, содержимое колбы переносят в мешок для диализа с размером пор 50 кДа и проводят диализ дисперсии против воды продолжительностью 36 ч. Получают разбавленную водную дисперсию модифицированных кристаллов магнетита, которую концентрируют до 197 мл путем удаления части воды с использованием роторного испарителя. Затем к 1 мл водной сконцентрированной дисперсии модифицированных кристаллов магнетита с концентрацией 1,38 мг/мл добавляют 1 мкл раствора в ДМСО флуоресцентного красителя 9-(диэтиламино)бензо[а]феноксазин-5-он с концентрацией 5 мг/мл. Полученный модифицированный магнетит с флуоресцентной меткой отделяют от остальных компонентов смеси методом центрифугирования, отделенный магнетит промывают вначале смесью 3 мл воды и 3 мл ДМСО, затем 3 мл воды.

Модифицированные кристаллы магнетита хранят в водной среде в закрытой стеклянной емкости при 4°C. В этих условиях продолжительность хранения модифицированных кристаллов магнетита составляет не менее 1 мес.

Методом просвечивающей электронной микроскопии было показано, что полученные кристаллы магнетита имеют кубическую форму со стороной 27 нм. С помощью прибора Вибромагнетометр VSM-250 было показано, что у полученных кристаллов намагниченность насыщения равна 88 А*м²/кг. Скорость r₂-релаксивности полученных кристаллов магнетита, определенная методом МРТ-томографии, составляет 332 мМ^-1*с^-1. С помощью дифрактометра Rigaku Smartlab было выявлено, что положение рентгеновских рефлексов полученных кристаллов соответствует справочным значениям рефлексов магнетита. Методом сканирующей ион-проводящей микроскопии с конфокальной приставкой на клетках клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека Hep G2 было показано, что при облучении электромагнитным излучением с длиной волны в области 550 нм клеточной культуры с введенными в нее модифицированными кристаллами магнетита наблюдается флуоресценция в области 633 нм благодаря наличию флуоресцентного красителя, связанного с кристаллами магнетита.

Пример 4 (контрольный, по прототипу)

690 мг (138 мас. ч.) сферических кристаллов магнетита с диаметром 16 нм и 5 мг (1 мас. ч.) смеси холестерина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ола и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоля)-2000, взятых в массовом соотношении 15:7:75:3, соответственно, смешивают вначале с 200 мл (60000 мас. ч.) хлороформа, затем с 400 мл (82240 мас. ч.) N-метил-2-пирролидона, после чего полученную смесь обрабатывают в течение 5 ч ультразвуком мощностью 290 Вт. После этого смесь переносят в круглодонную колбу и хлороформ удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме при температуре 43°C. Затем в колбу добавляют 2000 мл воды, содержимое колбы переносят в мешок для диализа с размером пор 50 кДа и проводят диализ дисперсии против воды продолжительностью 48 ч. Получают разбавленную водную дисперсию модифицированных кристаллов магнетита, которую концентрируют до 500 мл путем удаления части воды с использованием роторного испарителя.

С помощью прибора Вибромагнетометр VSM-250 было показано, что у полученных кристаллов намагниченность насыщения равна 35 А*м²/кг. Скорость r₂-релаксивности полученных кристаллов магнетита, определенная методом МРТ-томографии, составляет 240 мМ^-1*с^-1.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предлагаемый способ действительно дает возможность получать модифицированные кристаллы магнетита, обладающие флуоресцентными свойствами и улучшенными магнитными свойствами. Так, намагниченность кристаллов магнетита возрастает в 2,09-2,51 раза, а значение скорости r₂-релаксивности увеличивается в 1,22-1,38 раза.

Изобретение относится к области неорганической химии и касается способа получения модифицированных кристаллов магнетита Fe₃O₄, содержащих на поверхности флуоресцентный краситель, что дает возможность визуализировать и отслеживать их поведение как в живой клетке, так и в живом организме in vivo. Такие кристаллы могут найти применение в качестве средств доставки лекарств и Т2-контрастных агентов. Способ получения модифицированных кристаллов магнетита включает смешение 138 мас. ч. кристаллов магнетита и 1 мас. ч. смеси холестерина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ола и 1,2-димиристоил-sn-глицерометокси(полиэтиленгликоля)-2000, взятых в массовом соотношении 15:7:75:3, соответственно, вначале с 60000 мас. ч. хлороформа, затем с 82240 мас. ч. N-метил-2-пирролидона, обработку смеси ультразвуком, удаление хлороформа и добавление в нее воды с последующим диализом полученной дисперсии модифицированных кристаллов магнетита против воды, при этом в качестве кристаллов используют кристаллы магнетита, полученные путем смешения октадецена с олеатом железа(III) или ацетилацетонатом железа(III), олеиновой кислотой и олеатом натрия, нагрева смеси до 70°C и ее выдерживания при этой температуре в течение 30 мин, повторного нагрева смеси в атмосфере инертного газа с 70°C до 320°C, ее выдерживания при этой температуре и охлаждения смеси до комнатной температуры, проводимыми в атмосфере инертного газа, введения в систему изопропанола, отделения кристаллов магнетита, их диспергирования в неполярном высококипящем органическом растворителе, выбранном из группы, включающей дибензиловый эфир, октадецен и триоктиламин, в присутствии олеиновой кислоты и олеата натрия, нагрева полученной дисперсии до температуры 290-350°C в атмосфере инертного газа с последующим введением в нагретую дисперсию по каплям раствора олеата железа(III) в неполярном высококипящем органическом растворителе в течение 1-10 ч и охлаждения дисперсии до комнатной температуры, проводимыми в атмосфере инертного газа, повторного введения в систему изопропанола и отделения магнетита, а после диализа дисперсию концентрируют, добавляют в нее раствор в диметилсульфоксиде флуоресцентного красителя, выбранного из группы, включающей 1,1-диоктадецил-3,3,3,3 тетраметилиндодикарбоцианин, 1,1-диоктадецил-3,3,3,3-тетраметилиндотрикарбоцианионид и 9-(диэтиламино)бензо[а]феноксазин-5-он, отделяют модифицированный магнетит методом центрифугирования, затем его промывают смесью воды и диметилсульфоксида, потом водой. Изобретение позволяет получать кристаллы магнетита с улучшенными магнитными свойствами: намагниченность насыщения магнетита по сравнению с прототипом возрастает в 2,09-2,51 раза, значение скорости r₂-релаксивности увеличивается в 1,22-1,38 раза. 4 пр.

Способ получения модифицированных кристаллов магнетита, включающий смешение 138 мас. ч. кристаллов магнетита и 1 мас. ч. смеси холестерина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ола и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоля)-2000, взятых в массовом соотношении 15:7:75:3, соответственно, вначале с 60000 мас. ч. хлороформа, затем с 82240 мас. ч. N-метил-2-пирролидона, обработку смеси ультразвуком в течение 0,5-7,0 ч с мощностью ультразвука 116-580 Вт, удаление хлороформа и добавление в нее воды объемом 400-600% от объема смеси с последующим диализом полученной дисперсии модифицированных кристаллов магнетита против воды в течение 24-48 ч в диализном мешке с размером пор 25-50 кДа, концентрирования водной дисперсии до концентрации 0,7-2,8 мг/мл под вакуумом, при этом в качестве кристаллов используют кристаллы магнетита, полученные путем смешения октадецена с олеатом железа(III) или ацетилацетонатом железа(III) в диапазоне концентраций 0,02-0,10 моль/л, олеиновой кислотой и олеатом натрия в диапазоне концентраций 0,02-0,10 моль/л и 0,06-0,3 моль/л соответственно, нагрева смеси до 70°С и ее выдерживания при этой температуре в течение 30 мин, повторного нагрева смеси в атмосфере инертного газа с 70°С до 320°С со скоростью от 2 до 6°С/мин, ее выдерживания при этой температуре в течение 25-60 мин и охлаждения смеси до комнатной температуры в течение 30-120 мин, проводимыми в атмосфере инертного газа, введения в систему изопропанола объемом 200-400% от объема реакционной смеси, отделения кристаллов магнетита, их диспергирования в неполярном высококипящем органическом растворителе, выбранном из группы, включающей дибензиловый эфир, октадецен и триоктиламин, до достижения концентрации 3,20-15,5 мг/мл по магнетиту в присутствии олеиновой кислоты и олеата натрия с концентрациями в диапазоне 0,02-0,10 моль/л и 0,06-0,30 моль/л соответственно, нагрева полученной дисперсии до температуры 290-350°С в атмосфере инертного газа со скоростью 2-6°С/мин с последующим введением в нагретую дисперсию по каплям раствора олеата железа(III) в неполярном высококипящем органическом растворителе с концентрацией 0,04-0,50 моль/л в течение 1-10 ч и охлаждения дисперсии до комнатной температуры в течение 30-120 мин, проводимыми в атмосфере инертного газа, повторного введения в систему изопропанола и отделения магнетита, а после диализа дисперсию концентрируют, добавляют в нее раствор в диметилсульфоксиде флуоресцентного красителя, выбранного из группы, включающей 1,1-диоктадецил-3,3,3,3 тетраметилиндодикарбоцианин, 1,1-диоктадецил-3,3,3,3-тетраметилиндотрикарбоцианионид и 9-(диэтиламино)бензо[а]феноксазин-5-он, отделяют модифицированный магнетит методом центрифугирования, затем его промывают смесью воды и диметилсульфоксида, потом водой.