СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ Российский патент 2018 года по МПК A61K38/08 A61P43/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к патофизиологии и фармакологии, и может быть использовано для лечения больных с патологическими состояниями, при которых наблюдается дисфункция эндотелия: синдром системного воспалительного ответа (СВО) после операций на сердце и сосудах, сочетанная травма, тяжелый сепсис и септический шок, синдром ишемии-реперфузии тканей при инсульте и инфаркте миокарда, диабет, метастазирование раковых опухолей, отек легкого и острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), ожоговая болезнь и другие. Способ позволяет устранить эндотелиальную дисфункцию, уменьшить проницаемость эндотелия, предупредить или уменьшить степень выраженности полиорганной недостаточности (ПОН), сократить сроки лечения и увеличить выживаемость больных при критических состояниях.

Эндотелий формирует внутренний слой кровеносных и лимфатических сосудов. Помимо барьера между кровеносным руслом и тканями, эндотелий выполняет множество других физиологических функций: поддержание онкотического давления, участие в свертывании крови, воспаление и проч. Эндотелиальная дисфункция является важной составляющей патогенеза многих заболеваний, таких как: сепсис, ишемия-реперфузия, тяжелая сочетанная травма, системный воспалительный ответ в раннем послеоперационном периоде, метастазирование раковых опухолей и другие [M., P.Vanhoutte. Endothelial dysfunction: amultifaceted disorder. Heartand Circulatory Physiology, 2006; 291:985-1002]. Нарушение барьерной функции эндотелия (повышение проницаемости) приводит к возникновению отеков и, в крайних случаях, к угрожающему жизнесостоянию - полиорганной недостаточности.

Современное лечение эндотелиальной дисфункции имеет определенные ограничения. Ряд препаратов обладает различным, но не полным эффектом в восстановлении барьерной функции эндотелия. Поиск новых препаратов для лечения эндотелиальной дисфункции остается актуальной задачей фармакологии.

Среди первых лекарств, использовавшихся для лечения эндотелиальной дисфункции, использовались различные антиоксиданты: витамины С и Е, N-ацетилцистеин, гинестеин и другие. Было показано, что витамин С защищает эндотелий от воздействия супероксид-радикала, что препятствует окислению липидов, адгезии нейтрофилов и, в конечном счете, развитию эндотелиальной дисфункции [Taddei S., Virdis A., Ghiadoni L, Magagna A., Salvetti A. Vitamin С improvesendo the lium-dependent vasodilation byrestoring nitricoxide activity in essential hypertension. Circulation. 1998; 97:2222-2229]. Витамин E также оказывает защитное влияние на эндотелий при гиперхолестеринемии, но его применение при диабете оказывает противоположный эффект [Economides Р.А, Khaodhiar L, Caselli A, Caballero A.E, Keenan H, Bursell S.E., King G.L., Johnstone M.T., Horton E.S., Veves A. The effect of vitamin E on endothelial function of micro- and macrocirculation and left ventricular function in type 1 and type 2 diabetic patients. Diabetes. 2005; 54:204-211]. N-ацетилцистеин влияет на продукцию глутатиона, основного эндогенного антиоксиданта, который защищает эндотелий от свободных радикалов и повреждающего влияния различных цитокинов, например фактора некроза опухоли альфа [Bourraindeloup М., Adamy С., Candiani G., Cailleret М., Bourin М.С., Badoual Т., Su J.В., Adubeiro S., Roudot-Thoraval F., Dubois-Rande J.L. N-acetylcysteine treatment normalizes serum tumor necrosis factor-alpha level and hinders the progression of cardiac injury in hypertensive rats. Circulation. 2004;110:2003-2009]. Более того, N-ацетилцистеин регулирует экспрессию металлопротеиназ, которые расщепляют белки межклеточных контактов эндотелия, что вносит значительный вклад в развитие эндотелиальной дисфункции [Moshal K.S., Sen U., Tyagi N., Henderson В., Steed M., Ovechkin A.V., Tyagi S.C. Regulation of homocysteine-induced MMP-9 by ERK1/2 pathway. Am J Physiol Cell Physiol. 2006; 290:С883-С891]. Основная сфера применения описанных выше веществ - хронические заболевания, сопровождающиеся эндотелиальной дисфункцией. Целесообразность применения их при таких острых, жизнеугрожающих состояниях, как сепсис или синдром ишемии-реперфузии, остается дискуссионным.

Эндотелиальные клетки экспрессируют специальную форму NO-синтазы - фермента, который превращает аминокислоту L-аргинин в оксид азота (II). NO, в свою очередь, запускает гуанилат-циклазный путь, что приводит к расслаблению гладкой мускулатуры сосудов. Кроме того, через различные ферментативные каскады NO оказывает противовоспалительное и антикоагуляционное действие. Поэтому в терапевтической практике используют различные органические нитраты: нитроглицерин, изосорбида нитрат, пентаэритриттетранитрат и другие. Несмотря на положительное влияние упомянутых веществ их эффект при длительном применении быстро теряется вследствие развития толерантности и последующего окислительного стресса [U.Jurt, T.Gori, A.Ravandi, S.Babaei, P.Zeman, and J.D.Parker. Differential effects of pentaerythritoltetranitrate and nitroglycerin on the development of tolerance and evidence of lipid peroxidation: a human in vivo study. J. AmCollCardiol 2001; 38: 854-859]. Кроме того, область применения органических нитратов ограничена. Так, они не улучшали прогноз пациентов с ишемической болезнью сердца и хронической сердечной недостаточностью [G.Ambrosio, M.Del Pinto, I.Tritto, G.Agnelli, M. Bentivoglio, C.Zuchi, F.A. Anderson, J.M. Gore, J.Lopez-Sendon, A.Wyman, B.M. Kennelly and K.A. Fox. Chronic nitrate therapy is associated with different presentation and evolution of acute coronary syndromes', insights from 52, 693 patients in the Global Registry of Acute Coronary Events. European Heart Journal 31: 430-438, 2010]. Более того, некоторые ретроспективные исследования показали, что применение нитратов может иметь негативные последствия у больных диабетом [H.Yiu, V.Pong, C.W. Siu, C.P. Lau, and H.F. Tse. Long-term oral nitrate therapy is associated with adverse outcome in diabetic patients following elective percutaneous coronary intervention. Cardiovasc. Diabetol 2011; 10:52].

Еще одна группа лекарственных препаратов связана с простациклином - веществом из класса простагландинов. Простагландины представляют собой эндогенные биологически активные вещества липидной природы, синтезирующиеся практически во всех клетках организма. В то время как простагландин Е2 участвует в развитии воспаления, простациклин и некоторые другие простагландины оказывают вазодилататорный эффект, а также препятствуют агрегации тромбоцитов с клетками эндотелия. Простациклин и его синтетические аналоги (илопрост, белапрост, вентавис и проч.) успешно используются для уменьшения проницаемости эндотелия в комплексном лечении ишемии-реперфузии [Н. Schutte, A.Lockinger, W.Seeger, et al. Aerosolized PGE1, PGI2 and nitroprusside protect against vascular leakage in lung ischaemia-reperfusion. Eur. Respir. J., 2001; 18:15-22]. Считается, что данные вещества в клетках эндотелия индуцируют аденилатциклазный механизм, в результате которого происходит усиление эндотелиального барьера путем образования новых или усиления уже существующих межклеточных адгезионных комплексов. Так, было показано, что простациклин уменьшает проницаемость эндотелия в LPS-индуцированном воспалении у мышей посредством активации белка Rap1 - одного из последних участников аденилатциклазного пути [Birukova А.А., Meng F.,Tian Y., Meliton A., Sarich N., Quilliam LA., Birukov K.G. Prostacyclinpost-treatmentimproves LPS-induce dacutelung in juryandendo the lialbarrier recovery via Rap 1. BiochimBiophysActa. 2015; 852(5):778-91]. Однако при определенных условиях действие простациклина может быть блокировано другими цитокинами, что может приводить к противоположным эффектам, то есть усилению эндотелиальной дисфункции [Blanco-Rivero J., Cachofeiro V., Lahera V., Aras-Lopez R., -Marquez-Rodas I., Salaices M., Xavier F.E., Ferrer M., Balfagon G. Participation of prostacyclininendo the lialdysfunction induced byaldosterone in normotensive and hypertensiverats. Hypertension 2005; 46:107-112].

Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) и блокаторы рецепторов ангиотензина (АР) также являются антигипертензивными средствами и оказывают протекторное влияние на эндотелий. Ангиотензин II - гормон белковой природы, образующийся из неактивного предшественника ангиотензина I под действием АПФ. Ангиотензин II оказывает сильный вазоконстрикторный эффект, поэтому АПФ является мишенью многих лекарственных препаратов, таких как периндоприл, фозиноприл, лозартан и проч. Среди положительных эффектов ингибиторов АПФ наблюдаются следующие: повышение экспрессии NO-синтазы при ишемии-реперфузии [B.Gemici, R.Tan, G.Ongut, V.N. Izgut-Uysal Expressions of induciblenitricoxidesynthase and cyclooxygenase-2 ingastricis chemia - reperfusion: role of angiotensinll. J SurgRes, 2010; 161:126-133], уменьшение апоптоза эндотелиальных клеток, уменьшение концентрации фактора некроза опухоли альфа и других провоспалительных цитокинов [A.M. Kampoli, D.Tousoulis, C.Tentolouris, С.Stefanadis Novelagentstargetingnitricoxide. CurrVascPharmacol, 2012; 10:61-76]. Также было показано, что ингибиторы АПФ и блокаторы рецепторов ангиотензина положительно воздействуют на эндотелий при ишемической болезни сердца и гиперхолестеринемии [В.Hornig, U.Landmesser, C.Kohler, D.Ahlersmann, S.Spiekermann, A.Christoph, Comparative effect of aceinhibition and angiotensin II type 1 recept or antagonism on bioavailability of nitricoxidein patients with coronaryarterydisease: role of superoxidedismutase. Circulation, 2001; 103:799-805]. Тем не менее, ни ингибиторы АПФ, ни блокаторы ангиотензиновых рецепторов не обеспечивают полную защиту эндотелия, особенно при тяжелых состояниях. Возможно, это связано с тем, что они по каким-то причинам не полностью блокируют свои мишени.

Даларгин разрешен для клинического применения при лечении язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и желудка в период обострения; острого панкреатита; острого некротического панкреатита; облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей в составе комплексной терапии; алкоголизма. Дозировка: внутривенное разовое дозирование при лечении острого некротического панкреатита составляет 5 мг даларгина. Вливания производятся 3-4 раза в сутки с равномерными интервалами. Курс терапии от 2 до 6 дней.

Патент RU 2266752 раскрывает применение даларгина для эндоскопического гемостаза при осложненных кровотечением хронических гастродуоденальных язвах. Патент MD 1296F раскрывает применение даларгина для лечения плоского лишая. Патент RU 2104717 раскрывает применение даларгина для анестезии при операциях пациентов с синдромом Лериша. Патент RU 2113856 раскрывает применение даларгина для профилактики рецидивов ангинозной боли при инфаркте миокарда. Патент RU 2122415 раскрывает применение даларгина для интенсивной терапии пациентов с травматическим шоком. Патент RU 2142736 раскрывает применение даларгина для премедикации. Патент RU 2142814 раскрывает применение даларгина как средства, обладающего холелитолитическим действием. Патент RU 2146530 раскрывает применение даларгина для анестезии при операциях на головном мозге. Патент RU 2164153 раскрывает применение даларгина для лечения демпинг-синдрома. Патент RU 2167671 раскрывает применение даларгина для лечения пациентов с клещевым энцефалитом. Патент RU 2180591 раскрывает применение даларгина для лечения сексуальных дисфункций у мужчин. Патент RU 2180598 раскрывает применение даларгина для лечения токсического гепатита у пациентов с хронической наркоманией. Патент RU 2181564 раскрывает применение даларгина для метаболической коррекции в комплексе интенсивной терапии гиповолемического шока. Патент RU 2185176 раскрывает применение даларгина для лечения дистрофических заболеваний роговицы и болезни трансплантата роговицы. Патент RU 2185849 раскрывает применение даларгина для лечения опийного абстинентного синдрома. Патент RU 2188675 раскрывает применение даларгина для лечения пациентов с аменореей центрального генеза. Патент RU 2196603 раскрывает применение даларгина для лечения ожоговой болезни. Патент RU 2198641 раскрывает применение даларгина для лечения глазных болезней. Патент RU 2200026 раскрывает применение даларгина как антиангинального средства. Патент RU 2217139 раскрывает применение даларгина для стимулирования моторной активности кишечника. Патент RU 2217186 раскрывает применение даларгина для лечения доброкачественных заболеваний шейки матки. Патент RU 2218896 раскрывает применение даларгина для лечения поствоспалительной буллезной кератопатии. Патент RU 2228148 раскрывает применение даларгина для послеоперационного обезболивания пациентов с некрозом поджелудочной железы после оментобурсостомии с многократными программированными санационными релапаротомиями. Патент RU 2228762 раскрывает применение даларгина для ранней терапии желудочно-кишечных кровотечений. Патент RU 2230549 раскрывает применение даларгина для лечения аллергических дерматозов. Патент RU 2241488 раскрывает применение даларгина для приготовления раствора для инъекций. Патент RU 2254890 раскрывает применение даларгина для стимуляции моторной активности кишечника у пациентов с травмами позвоночника. Патент RU 2258529 раскрывает применение даларгина для раннего лечения геморрагического шока II, III степеней. Патент RU 2261713 раскрывает применение даларгина для лечения тяжелой формы острого оптического неврита у пациента с рассеянным склерозом. Патент RU 2261721 раскрывает применение даларгина для внутриоперационной нейропротекции у пациентов с церебральными артериальными аневризмами. Патент RU 2261722 раскрывает применение даларгина для лечения скрытой формы генитального герпеса у женщин с синдромом потери плода. Патент RU 2266130 раскрывает применение даларгина для лечения аритмического синдрома при прогрессирующей стенокардии. Патент RU 2413528 раскрывает применение даларгина для лечения сахарного диабета. Патент UA 61449 раскрывает применение даларгина для профилактики образования послеоперационных спаек брюшной полости. Патент UA 61455 раскрывает применение даларгина для профилактики раннего образования послеоперационных спаек брюшной полости. Патент UA 6576U раскрывает применение даларгина для стабилизации ремиссии у пациентов с опийной наркоманией. Патент UA 67601 раскрывает применение даларгина для стимулирования сращения переломов кости. Патент UA 67626 раскрывает применение даларгина для коррекции экспериментального хронического стресса. Патент UA 67629 раскрывает применение даларгина для коррекции стресса экспериментальной модели перитонита. Патент UA 67630 раскрывает применение даларгина для коррекции стресса экспериментальной модели острого аднексита. Патент UA 67631 раскрывает применение даларгина для коррекции стресса экспериментальной модели острого панкреатита, вызываемого L-аргинином. Патент UA 67632 раскрывает применение даларгина для коррекции стресса экспериментальной модели хронического панкреатита. Патент UA 7497U раскрывает применение даларгина для лечения первично диагностированной язвы двенадцатиперстной кишки у пациентов возбудимого типа личности. Патенты UA 6829U, 6823U и 6826U раскрывают применение даларгина для лечения острого экспериментального панкреатита.

Известные применения даларгина связаны, в основном, с его лечебным эффектом на отдельные патологии, напрямую не связанные с эндотелиальной дисфункцией. Из уровня техники неизвестно использование даларгина в качестве средства для лечения критических состояний, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией.

Цель настоящего изобретения - лечение эндотелиальной дисфункции, обязательного компонента полиорганной недостаточности, с помощью даларгина (Тирозил-D-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат (Tyrosine-D-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-argininediacetate)), для лечения критических состояний, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией. Применение даларгина позволяет оказывать протекторное действие на эндотелиальные клетки сосудов человека, защищая их от гибели (апоптоза), а также разборки межклеточных контактов эндотелиальных клеток. Такое защитное действие обеспечивает сохранение функционального сосудистого барьера при опасных для жизни критических состояниях, сопровождаемых развитием полиорганной недостаточности, ассоциированной с эндотелиальной дисфункцией: сепсис, системный воспалительный ответ после операций на сердце и сосудах, отек легкого и острый респираторный дистресс-синдром, тяжелые ожоги, ишемия-реперфузия, диабетические осложнения, метастазирующие опухоли.

Указанный результат достигается тем, что способ лечения эндотелиальной дисфункции заключается во введении пациенту даларгина в виде стерильного кристаллоидного раствора для инфузий. Причем при лечении и профилактики синдрома полиорганной недостаточности при критических состояниях раствор вводят внутривенно капельно из расчета 50-200 мкг/кг массы тела пациента; при тяжелом сепсисе и септическом шоке раствор вводят внутривенно капельно, ежедневно до нормализации лейкоцитарной формулы из расчета 50-200 мкг/кг массы тела пациента; при синдроме системного воспалительного ответа после операций на сердце и сосудах раствор вводят внутривенно в интраоперационном периоде и в первые 6 часов после операции из расчета 50-100 мкг/кг массы тела пациента; при синдроме ишемии-реперфузии при ишемическом инсульте и инфаркте миокарда раствор вводят внутривенно в течение первых суток из расчета 50-100 мкг/кг массы тела пациента; а при отеке легкого и остром респираторном дистресс-синдроме раствор вводят внутривенно до нормализации показателей оксигенирующей функции из расчета 50-100 мкг/кг массы тела пациента.

Краткое описание графических материалов.

На фиг. 1 приведены данные о влиянии даларгина в концентрации 1, 10, 50 и 100 мкг/мл на расщепление VE-кадгерина в контактах эндотелиальных клеток Ea.hy926 под действием сывороток септических больных. Данные представлены в виде среднего (столбик) ± среднее отклонение.

На фиг. 2 приведены данные о влиянии даларгина в концентрации 1, 10, 50 и 100 мкг/мл на образование межклеточных промежутков в монослое эндотелиальных клеток Еа.hy926 под действием сывороток пациентов с сепсисом. Данные представлены в виде среднего (столбик) ± среднее отклонение.

На фиг. 3 приведены данные о влиянии даларгина в концентрации 1, 10, 50 и 100 мкг/мл на расщепление клаудина в контактах эндотелиальных клеток Ea.hy926 под действием сывороток септических больных. Данные представлены в виде среднего (столбик) ± среднее отклонение.

На фиг. 4 приведены данные о влиянии даларгина концентрации 1, 10, 50 и 100 мкг/мл на апоптоз эндотелиальных клеток Еа.hy926, наступающий в результате действия сывороток септических больных. Данные представлены в виде среднего (столбик) ± среднее отклонение.

На фиг. 5 приведены данные о влиянии даларгина в концентрации 1, 10, 50 и 100 мкг/мл на расщепление клаудина в контактах эндотелиальных клеток Ea.hy926 под действием сывороток больных с СВО после операций на сердце с ИК. Данные представлены в виде среднего (столбик) ± среднее отклонение.

На фиг. 6 приведены данные о влиянии даларгина в концентрации 1, 10, 50 и 100 мкг/мл на расщепление VE-кадгерина в контактах эндотелиальных клеток Ea.hy926 под действием сывороток больных с СВО после операций на сердце с ИК. Данные представлены в виде среднего (столбик) ± среднее отклонение.

На фиг. 7 приведены данные о влиянии даларгина в концентрации 1, 10, 50 и 100 мкг/мл на образование межклеточных промежутков в монослое эндотелиальных клеток Еа.hy926 под действием сывороток пациентов с СВО после операций на сердце с ИК. Данные представлены в виде среднего (столбик) ± среднее отклонение.

На фиг. 8 приведены данные о влиянии даларгина концентрации 1, 10, 50 и 100 мкг/мл на апоптоз эндотелиальных клеток Еа.hy926, наступающий в результате действия сывороток пациентов с послеоперационным СВО. Данные представлены в виде среднего (столбик) ± среднее отклонение.

Способ по изобретению иллюстрируется конкретными нижеследующими примерами, которые, тем не менее, не ограничивают всю область применения данного изобретения.

Пример 1.

Изучалось влияние даларгина на расщепление белка плотных контактов (клаудина) и белка адгезионных контактов (VE-кадгерина) у эндотелиальных клеток человека линии Ea.hy926 под действием сыворотки септического больного in vitro. Клетки растили в среде DMEM с добавлением телячьей эмбриональной сыворотки (FBS) при температуре 37°С в увлажненной атмосфере с 6% CO₂ в культуральных флаконах или на 6-луночных планшетах. Доросшую до монослоя культуру клеток инкубировали в течение 3 часов при 37°С с 5%-ной телячьей эмбриональной сывороткой (контроль), с сывороткой здорового человека, а также с сывороткой пациента с сепсисом без даларгина и в его присутствии в концентрациях 1, 10, 50 и 100 мкг/мл. Затем клетки лизировали в специальном буфере (62,5 mМТрис-HCl, рН 6,8; 2% SDS; 10% глицерин; 50 mМ ДТТ, 0,01% бромфенолового синего) в течение 3 мин при 94°С. Белки разделяли в 12% полиакриламидном геле и переносили на PVDF-мембраны. Были использованы антитела к VE-кадгерину и клаудину, а также вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. Визуализацию проводили набором ECL. Для денситометрического анализа использовали программу Image J 1.44р.

Авторами показано, что даларгин даже в низких концентрациях (1 мкг/мл) уменьшает расщепление VЕ-кадгерина (фиг. 1) и клаудина (фиг. 4) в контактах под действием сыворотки пациентов с сепсисом. В относительно высоких концентрациях (50 и 100 мкг/мл) даларгин практически полностью предотвращает разборку VE-кадгерина (фиг. 1) и клаудина (фиг. 4) под действием сыворотки пациентов с сепсисом. Для всех экспериментов n=5 и р<0,05. Во всех экспериментах использовались сыворотки различных больных и здоровых людей. Характеристики пациентов с сепсисом представлены ниже.

Больной 1: М., 60 лет, Спонтанный разрыв пищевода, Медиастинит, левосторонний гнойный плеврит. Тяжелый сепсис, ОРДС, ОПН I по RIFLE.

Больной 2: Б., 19 лет, ГЛПС, Нозокомиальная пневмония. Септический шок.

Больной 3: Л., 27 лет, Внебольничная двусторонняя пневмония. Тяжелый сепсис,

Больной 4: П., 45 лет, Разлитой перитонит. Правосторонняя пневмония. Септический шок.

Больной 5: Б., 53 года. Мочекаменная болезнь. Правосторонний гидронефроз.

Пиелонефрит. Септический шок.

Здоровый донор 1: Г., 53 года.

Здоровый донор 2: Ч., 30 лет.

Здоровый донор 3: Г., 28 лет.

Здоровый донор 4: И., 55 лет.

Здоровый донор 5: Б., 22 года.

Пример 2.

Изучалось влияние даларгина на образование межклеточных щелей под действием сыворотки септического больного в эндотелиальных клетках человека линии Ea.hy926. Клетки растили так же, как описано в примере 1. Инкубацию производили так же, как описано в примере 1. После инкубации клетки промывали теплым раствором DMEM без сыворотки, а зачем фиксировали 2%-ным раствором параформа. Фиксированные клетки окрашивали первичными антителами к VE-кадгерину, а затем инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентым красителем, а также с фаллоидином красным (окрашивающим актин - белок цитоскелета клетки) и красителем Hoechst 33342 (окрашивает ядра). Обработку изображений, полученных на флуоресцентном микроскопе, а также их количественный анализ проводили с помощью программ ImageJ 1.44р и MetaVue 4.6.

Под действием сыворотки пациента с сепсисом в монослое эндотелиальных клеток образовывались межклеточные промежутки, относительная площадь которых обсчитывалась с помощью программы MetaVue 4.6. Для каждого эксперимента обрабатывалось не менее 7 полей. Количество и площадь межклеточных промежутков уменьшалась при добавлении даларгина (фиг. 2). Как и в остальных экспериментах, действие даларгина дозозависимое.

Для экспериментов использовались те же сыворотки, что и в примере 1.

Пример 3.

Изучалось влияние даларгина на апоптоз эндотелиальных клеток человека линии Еа.hy926 под действием сыворотки септического больного. Клетки растили также, как описано в примере 1. Инкубацию производили так же, как описано в примере 1, после чего меняли им среду на 5%-ную телячьую эмбриональную сыворотку (контроль), 5%-ную сыворотку здорового человека и 5%-ную сыворотку пациента с сепсисом без даларгина и в его присутствии в концентрациях 1, 10, 50 и 100 мкг/мл. После инкубации в течение 8 часов при температуре 37°С клетки снимали раствором трипсин-версена и фиксировали 70%-ным этанолом, после чего окрашивали йодистым пропидием по методу, описанному ранее [A.KRISHAN. Rapid flow cytofluorometric analysis of mammaliancell cycle by propidium iodide stainig. J.CellBiol., 1975; 66(1):188-193]. Добавление сыворотки больного с сепсисом повышало количество апоптотических клеток более чем в 2,5 раза по сравнению с контролем и сывороткой здорового человека (фиг. 4). Добавление даларгина к клеткам с сывороткой септических больных понижало уровень апоптоза в дозозависимой манере: в концентрации 1 мкг/мл даларгин незначительно уменьшает количество апоптотических клеток, в то время как для концентрации 100 мкг/мл количество апоптотических клеток сопоставимо с таковым в контроле (фиг. 4).

Таким образом, даларгин позволяет уменьшить апоптоз клеток эндотелия под действием септической сыворотки практически до уровня контроля (n=5, р<0,05).

Для экспериментов использовались те же сыворотки, что и в примере 1.

Пример 4.

Изучалось влияние даларгина на на расщепление белка плотных контактов (клаудина) и белка адгезионных контактов (VE-кадгерина) у эндотелиальных клеток человека линии Ea.hy926 под действием сыворотки пациента с СВО после операций на сердце с ИК. Все манипуляции с клетками проводились так же, как описано в примере 1, но вместо сыворотки пациента с сепсисом использовалась сыворотка пациента с послеоперационным SIRS. Как и в примере 1, даларгин в концентрации 10 мкг/мл и выше достоверно предотвращает расщепление VE-кадгерина (фиг. 6) и клаудина (фиг. 5) под действием сыворотки пациента с послеоперационным СВО.

Для всех экспериментов n=5 и р<0,05. Во всех экспериментах использовались сыворотки различных больных и здоровых людей, как и в примере 1. Характеристика пациентов с послеоперационным СВО представлены ниже. Сыворотки здоровых больных - как в примере 1 настоящего изобретения.

Больной 1: А., 54 года. ИБС, ПИКС. Состояние после операции АКШ с ИК. ОСН, 2 сутки после операции.

Больной 2: М., 57 лет. Аортальный стеноз. Протезирование аортального клапана в условиях ИК. 1 сутки после операции.

Больной 3: С, 49 лет. ИБС, ПИКС. АКШ на работающем сердце. 4 шунта. 1 сутки после операции.

Больной 4: Ш., 54 года. Митральный стеноз. Протезирование митрального клапана. ОСН. ОРДС. 1 сутки после операции.

Больной 5: Н., 64 года. ИБС, ПИКС. Состояние после операции АКШ с ИК. ОСН, 1 сутки после операции.

Пример 5.

Изучалось влияние даларгина на образование межклеточных промежутков под действием сывороток пациентов с СВО после операций на сердце с ИК в эндотелиальных клетках человека линии Ea.hy926. Bce манипуляции с клетками проводились так же, как описано в примере 2, но вместо сыворотки пациента с сепсисом использовалась сыворотка пациента с послеоперационным СВО. Как и в примере 2, сыворотка пациента с СВО значительно увеличивала относительную площадь межклеточных промежутков, в то время как добавление даларгина уменьшало ее вплоть до значений, близких к контролю (фиг. 7).

Для всех экспериментов n=5 и р<0,05. Для экспериментов использовались те же сыворотки, что и в примере 4.

Пример 6.

Изучалось влияние даларгина на апоптоз эндотелиальных клеток человека линии Ea.hy926 под действием сыворотки пациента с СВО. Все манипуляции с клетками проводились так же, как описано в примере 3, но вместо сыворотки пациента с сепсисом использовалась сыворотка пациента с послеоперационным СВО. Как и в примере 3, даларгин в концентрациях 10 мкг/мл и выше достоверно уменьшал уровень апоптоза клеток эндотелия под действием сыворотки пациента после операции на сердце в условиях ИК (фиг. 8).

Для всех экспериментов n=5 и р<0,05. Для экспериментов использовались те же сыворотки, что и в примере 4.

Проведенные эксперименты позволяют выделить механизмы действия даларгина на уменьшение влияния, а в некоторых случаях полную нейтрализацию патофизиологических механизмов, лежащих в основе развития эндотелиальной дисфункции и, как следствие, полиорганной недостаточности:

- в концентрациях 50 и 100 мкг/мл даларгин практически полностью предотвращает разборку и расщепление белков плотных контактов: VE-кадгерина и клаудина;

- в дозозависимой манере даларгин уменьшает количество и площадь межклеточных промежутков эндотелиальных клеток, наилучшие результаты достигаются в концентрациях 50 и 100 мкг/мл;

- даларгин снижает апоптоз эндотелиальных клеток в дозозависимой манере, а в концентрации 100 мкг/мл доводит уровень апоптоза до нормальных значений.

Изобретение относится к медицине, а именно к патофизиологии и фармакологии, и может быть использовано для лечения больных с патологическими состояниями, при которых наблюдается дисфункция эндотелия. Способ включает введение даларгина в виде стерильного кристаллоидного раствора для инфузий. Использование изобретения позволяет осуществить лечение эндотелиальной дисфункции за счет предотвращения расщепления белков плотных контактов, уменьшения количества и площади межклеточных промежутков эндотелиальных клеток, снижения их апоптоза под действием даларгина. 5 з.п. ф-лы, 8 ил., 6 пр.

1. Способ лечения эндотелиальной дисфункции путем введения даларгина в виде стерильного кристаллоидного раствора для инфузий.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при лечении и профилактике синдрома полиорганной недостаточности при критических состояниях раствор вводят внутривенно капельно из расчета 50-200 мкг/кг массы тела пациента.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при тяжелом сепсисе и септическом шоке раствор вводят внутривенно капельно, ежедневно до нормализации лейкоцитарной формулы из расчета 50-200 мкг/кг массы тела пациента.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при синдроме системного воспалительного ответа после операций на сердце и сосудах раствор вводят внутривенно в интраоперационном периоде и в первые 6 часов после операции из расчета 50-100 мкг/кг массы тела пациента.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при синдроме ишемии-реперфузии при ишемическом инсульте и инфаркте миокарда раствор вводят внутривенно в течение первых суток из расчета 50-100 мкг/кг массы тела пациента.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при отеке легкого и остром респираторном дистресс-синдроме раствор вводят внутривенно до нормализации показателей оксигенирующей функции из расчета 50-100 мкг/кг массы тела пациента.