Способ предотвращения нарушения межклеточных контактов эндотелиоцитов при дисфункции эндотелия Российский патент 2021 года по МПК A61K33/14 A61P43/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к средствам терапевтического воздействия, основным компонентом которых является хлорид лития (LiCl). Изобретение может быть использовано для дальнейшей разработки медикаментозных средств и способов лечения больных с патологическими состояниями, при которых наблюдается дисфункция эндотелия: синдром системного воспалительного ответа после обширных операций, оперативное вмешательство с использованием аппарата искусственного кровообращения, сочетанная травма, тяжелый сепсис и септический шок, синдром ишемии-реперфузии тканей при инсульте и инфаркте миокарда, сахарный диабет, метастазирование опухолей, отек легкого и острый респираторный дистресс-синдром, ожоговая болезнь и другие. Способ позволяет устранить эндотелиальную дисфункцию, уменьшить проницаемость эндотелия.

Уровень техники

Известен способ, описывающий антиапоптотический эффект на эндотелиоциты триметазидина модифицированного высвобождения (Миокардиальные цитопротекторы оказывают антиапоптотический эффект на эндотелиоциты сосудистой стенки / А.И. Инжутова // Кардиоваскулярная терапия и профилактика, 2010; 9(8): 29-32). Способ характеризуется тем, что прием модифицированного триметазидина активирует окислительное декарбоксилирование и усиливает аэробный гликолиз, нормализует функционирование ионных каналов мембран, препятствуя накоплению внутриклеточного Са²⁺, что проявляется уменьшением в крови содержания апоптотических эндотелиальных клеток.

Недостатками известного способа являются: необходимость длительного введения препарата (3 недели), что делает его неактуальным для пациентов, находящихся в критическом состоянии; отсутствие доказанного эффекта на функцию и структуру эндотелиоцитов; отсутствие специфической точки приложения по отношению к эндотелиоцитам.

Известен способ коррекции эндотелиальной дисфункции с помощью синергетической терапевтической композиции, содержащей аддитивную соль мельдония ацетилсалициловой кислоты в качестве корректора эндотелиальной дисфункции и ингибитор редуктазы HMG-CoA (LV14963 Corrector of endothelial dysfunction).

Недостатком данного способа является направленность его на профилактику и/или лечение тромбоза, а также тромботических состояний. При этом предложенный препарат не оказывает непосредственного влияния на эндотелиоциты, их контакты, а также на их протекцию. Более того, эффективность способа была положительно оценена на экспериментальной модели эндотелиальной дисфункции, воспроизводимой с помощью блокатора синтеза NO, что не является ключевым и/или единственным фактором развития дисфункции эндотелия.

Известен также способ предотвращения развития эндотелиальной дисфункции у пациентов, страдающих язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, осложненной гипертонией, включающий введение антибактериальных, гипотензивных препаратов и донора оксида азота - тивортина (UA 44424 Method for prevention of endothelial disfunction development in patients suffering from the duodenum peptic ulcer complicated with hypertension).

Недостатками данного способа являются: ограничение его использования только для пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, осложненной гипертонией, содержание в схеме терапии лекарственных веществ, применение которых неприемлемо и противопоказано для пациентов с иной патологией, невозможность использования предложенного способа для пациентов с синдромом системного воспалительного ответа.

В качестве ближайшего аналога заявляемого изобретения может быть рассмотрен способ лечения эндотелиальной дисфункции путем введения даларгина в виде стерильного кристаллоидного раствора для инфузий (RU 2657416). Способ характеризуется тем, что для коррекции эндотелиальной дисфункции при синдроме полиорганной недостаточности при критических состояниях, при тяжелом сепсисе и септическом шоке, при синдроме системного воспалительного ответа после операций на сердце и сосудах, при синдроме ишемии-реперфузии при ишемическом инсульте и инфаркте миокарда, при отеке легкого и остром респираторном дистресс-синдроме раствор вводят в различные временные промежутки с различной длительностью внутривенно капельно из расчета 50-200 мкг*кг массы тела пациента.

Недостатками известного способа является невозможность достижения обозначенной в патенте концентрации 50-200 мкг*кг в клинической практике, потому что даларгин является пептидным препаратом и подвержен действию эндогенных пептидаз, согласно литературным данным он не обнаруживается в кровотоке через полчаса после введения. Таким образом, для поддержания концентрации даларгина в плазме крови требуется его непрерывная инфузия в дозе 50-200 мкг*кг*час, что десятикратно превышает максимально разрешенную суточную дозу (согласно инструкции производителей она составляет 20 мг)

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи предотвращения нарушения межклеточных контактов эндотелиоцитов при дисфункции эндотелия у пациентов с критическими состояниями, сопровождающимися развитием системного воспалительного ответа.

Поставленная задача решается тем, что образование и увеличение межклеточных промежутков в монослое эндотелиальных клеток, возникающие вследствие уменьшения расщепления белка адгезионных межклеточных контактов VE-кадгерина и белка плотных межклеточных контактов клаудина в контактах эндотелиальных клеток, угнетения апоптоза эндотелиальных клеток, достигается за счет введения раствора LiCl в концентрации по крайней мере 1 ммоль/л за 1 час до токсического воздействия сыворотки.

Техническим результатом заявляемого способа является коррекция эндотелиальной дисфункции у пациентов с критическими состояниями, сопровождающимися системным воспалительным ответом за счет введения LiCl до воздействия патогенного фактора.

Раскрытие изобретения

Известно, что различные цитокины воспаления, например, TNF-α (Tumor Necrosis Factor α) вызывают расщепление VE-кадгерина - эндотелиального белка адгезионных контактов. Также при действии подобных провоспалительных агентов происходит деградация белков плотных контактов, например, клаудина. Протеолиз этих важнейших белков межклеточных контактов вызывает образование промежутков между клетками, что приводит к увеличению проницаемости и нарушению барьерной функции эндотелия. В крайних случаях, может развиться эндотелиальная дисфункция, которая в настоящее время считается одним из основных факторов развития полиорганной недостаточности при системном воспалительном ответе.

В результате экспериментальных исследований, проведенных авторами заявляемого способа, было установлено, что инкубация монослоя эндотелиальных клеток с 5%-ой токсичной сывороткой приводит к потере белка адгезионных контактов VE-кадгерина, а также вызывает уменьшение количества клаудина, одного из главных белков плотных (замыкающих) контактов эндотелия. Кроме того, при воздействии токсичной сыворотки наблюдается изменение формы клеток: они теряют правильную многоугольную форму, вытягиваются, между ними образовываются промежутки, поскольку разбираются еще и пучки периферических актиновых микрофиламентов. Такие изменения характерны для эндотелиальной дисфункции, сопровождающейся нарушением межклеточных контактов. Подобные эффекты не наблюдались при инкубации монослоя эндотелиальных клеток с 5%-ной телячьей эмбриональной сывороткой (контроль) и с 5% сывороткой здоровых людей. Таким образом, данная модель может рассматриваться как модель эндотелиальной дисфункции при системном воспалительном ответе in vitro.

Для изучения возможного ангиопротекторного эффекта LiCl в рамках данной модели были использованы следующие концентрации данного вещества: 0,01 ммоль/л, 0,1 ммоль/л, 1 ммоль/л, 10 ммоль/л.

По данным иммунофлуоресцентой микроскопии, инкубация с LiCl в концентрации 0,01 ммоль/л не предотвращает разборку клаудина (одного из главных белков плотных (замыкающих) контактов эндотелия), актина (основного белка цитоскелета) и VE-кадгерина (белка адгезионных контактов). Прединкубация с LiCl в концентрации 0,1 ммоль/л статистически незначимо предотвращает разборку клаудина (р>0,05), но в более высоких концентрациях (1 ммоль/л, 10 ммоль/л) практически полностью защищает эндотелиальный монослой от разрушения межклеточных контактов, возникающих под действием сыворотки пациентов с системным воспалительным ответом.

Указанный эффект достигается за счет коррекции эндотелиальной дисфункции путем создания конкурентного взаимодействия иона лития с сайтом связывания Mg²⁺ кофактора фермента GSK-3β, предотвращения разборки клаудина и VE-кадгерина в межклеточных контактах, уменьшения количества апоптотических клеток в монослое эндотелиальных клеток и фосфорилирования GSK-3β.

Преимуществом заявляемого способа, по сравнению с известными, является лечебное воздействие раствора LiCl, позволяющее нивелировать влияние патогенных факторов в виде субстанций, циркулирующих в крови у пациентов в критическом состоянии, сопровождающимся системным воспалительным ответом, на эндотелиоциты благодаря следующим аспектам:

- фосфорилирование GSK-3β;

- ингибирование разборки клаудина и VE-кадгерина в межклеточных контактах эндотелиоцитов;

- инактивация апоптоза в монослое эндотелиальных клеток линии Ea.hy 926;

- малая токсичность препаратов на основе ионов лития.

Авторами заявляемого способа были проведены экспериментальные исследования in vitro в условиях, максимально приближенных к клинической картине возникновения эндотелиальной дисфункции у пациентов в критическом состоянии, состоящие в том, что в питательную культуру с монослоем эндотелиальных клеток Ea.hy926 добавляли токсичную сыворотку от пациентов с системным воспалительным ответом.

Описание процедуры эксперимента

В эксперименте было использовано 30 образцов токсичной сыворотки (10 от пациентов с септическим шоком, 10 от пациентов с ожоговой болезнью, 10 от пациентов, перенесших оперативное вмешательство с использованием аппарата искусственного кровообращения).

По 5 образцов токсичной сыворотки от каждой группы пациентов использовали для исследования влияния токсичной сыворотки на эндотелиоциты без протекции (всего 15 образцов). В основной группе (15 образцов эндотелиальных клеток) за 1 час до введения токсичной сыворотки в культуру эндотелиальных добавляли LiCl.

В эксперименте также использовали 15 образцов сыворотки от практически здоровых доноров-добровольцев. Группы по возрасту и полу были сопоставимы.

Эндотелиальные клетки Ea.hy926 растили в среде DMEM (Gibco, USA) с 10% телячьей эмбриональной сывороткой - FBS (HyClone, USA) до монослоя. Затем клетки инкубировали в течение 3 часов при 37°С

- с сывороткой здорового человека (контроль),

- с сывороткой пациента с системным воспалительным ответом без добавления LiCl.

- с добавлением LiCl в конечных концентрациях 0,01 ммоль/л, 0,1 ммоль/л, 1 ммоль/л, 10 ммоль/л к сыворотке пациентов с системным воспалительным ответом.

LiCl добавляли за 1 час до введения в монослой эндотелиальных клеток токсичной сыворотки пациентов с системным воспалительным ответом.

После инкубации клетки промывали теплым раствором DMEM без сыворотки, а затем фиксировали 2%-ным раствором параформа и пермеабилизовывали 1%-ным раствором Triton Х-100. Фиксированные клетки окрашивали первичными антителами к VE-кадгерину (BD Biosciences, USA), а затем инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентным красителем Oregon Green 488 (Life Technologies, USA), а также с фаллоидином красным (Invitrogen, USA) и красителем Hoechst 33342 (Life Technologies, USA). Обработку изображений, полученных на флуоресцентном микроскопе, их количественный анализ проводили с помощью программ ImageJ 1.44р и MetaVue 4.6.

На Фиг. 1 представлены изображения, полученные путем иммунофлуоресцентной микроскопии эндотелиальных клеток Ea.hy926, инкубированных с различными концентрациями LiCl (указаны в моль/л) и обработанных 5%-ной сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом.

Обозначения:

Актин - окраска клеток на актиновые микрофиламенты;

VE-кадгерин - окраска на белок межклеточных контактов VE-кадгерин;

Ядра - окраска ядер клеток;

1 - контроль;

2 - сыворотка пациента с системным воспалительным ответом;

3 - сыворотка пациента с системным воспалительным ответом+хлорид лития 0,01 ммоль/л;

4 - сыворотка пациента с системным воспалительным ответом+хлорид лития 0,1 ммоль/л;

5 - сыворотка пациента с системным воспалительным ответом+хлорид лития 1,0 ммоль/л.

На Фиг. 2 приведены данные флуоресцентной микроскопии, отражающие влияние LiCl в концентрации 0,01 ммоль/л, 0,1 ммоль/л, 1 ммоль/л, 10 ммоль/л на образование межклеточных промежутков монослоя эндотелиальных клеток под действием 5%-ных сывороток пациентов с системным воспалительным ответом.

Обозначения:

К - контрольная сыворотка FBS;

ЗД - сыворотка здоровых добровольцев;

С - сыворотка пациентов с системным воспалительным ответом;

С + литий - сочетание LiCl в указанных концентрациях с сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом.

Результаты представлены в виде среднего значения со стандартным отклонением. * - р<0,05 по отношению к С.

Для количественной оценки изменения количества белка межклеточных контактов VE-кадгерина был использован Вестерн-блоттинг. Установлено, что инкубация с 5%-ной токсичной сывороткой примерно вполовину уменьшает количество VE-кадгерина в клеточных лизатах. Инкубация с LiCl защищает этот белок от расщепления в дозозависимой степени.

На Фиг. 3 представлены данные иммуноблот-анализа типичного эксперимента, отражающие влияние LiCl в концентрации 0,01 ммоль/л; 0,1 ммоль/л; 1 ммоль/л; 10 ммоль/л на расщепление белка адгезивных контактов VE-кадгерина.

Обозначения:

К - контрольная сыворотка FBS;

С - сыворотка пациентов с системным воспалительным ответом;

С + лития хлорид - сочетание LiCl в указанных концентрациях с сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом;

ГАФД - контрольный белок глицеральдегидфосфатдегидрогеназа

На Фиг. 4 представлены данные флуоресцентной микроскопии, отражающие влияние LiCl в концентрации 0,01 ммоль/л, 0,1 ммоль/л, 1 ммоль/л, 10 ммоль/л на относительное количество белка адгезивных межклеточных контактов VE-кадгерина в монослое эндотелиальных клеток, обработанных 5%-ной токсичной сывороткой.

Обозначения:

К - контрольная сыворотка FBS;

ЗД - сыворотка здоровых добровольцев;

С - сыворотка пациентов с системным воспалительным ответом; С + литий - сочетание LiCl в указанных концентрациях с сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом.

Результаты представлены в виде среднего значения со стандартным отклонением.

* - р<0,05 по отношению к С.

Для количественной оценки изменения количества белка плотных контактов клаудина был также использован Вестерн-блоттинг.Было установлено, что инкубация с LiCl также защищает этот белок от расщепления под действием сыворотки пациентов с системным воспалительным ответом в дозозависимой степени.

На Фиг. 5 представлены данные флуоресцентной микроскопии, отражающие влияние LiCl в концентрации 0,01 ммоль/л, 0,1 ммоль/л, 1 ммоль/л, 10 ммоль/л на относительное количество белка плотных межклеточных контактов клаудина в монослое эндотелиальных клеток, обработанных 5%-ной сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом.

Обозначения:

К - контрольная сыворотка FBS;

ЗД - сыворотка здоровых добровольцев;

С - сыворотка пациентов с системным воспалительным ответом;

С + Литий - сочетание LiCl в указанных концентрациях с сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом.

Результаты представлены в виде среднего значения со стандартным отклонением.

* - р<0,05 по отношению к С.

В процессе эксперимента изучалось также влияние сывороток пациентов с системным воспалительным ответом на апоптоз эндотелиальных клеток. Известно, что в норме in vivo эндотелий практически не подвергается апоптозу. Однако при системном воспалительном ответе количество апоптотических эндотелиальных клеток увеличивается. В моделях in vitro многие провоспалительные агенты, такие как LPS, TNF-α, IL-1, увеличивают апоптоз различных линий эндотелиальных клеток.

Авторами было достоверно установлено, что инкубация с 5%-ными сыворотками пациентов с системным воспалительным ответом приводит к значительному увеличению количества апоптотических клеток. LiCl в концентрации 0,01 ммоль/л не уменьшает количество апоптотических клетках. Прединкубация с LiCl в концентрации 0,1 ммоль/л статистически незначимо снижает уровень апоптоза. В то время как в более высоких концентрациях (1 ммоль/л, 10 ммоль/л) наблюдается достоверное снижение уровня апоптоза.

На Фиг. 6 представлены данные флуоресцентной микроскопии, отражающие влияние LiCl в концентрации 0,01 ммоль/л, 0,1 ммоль/л, 1 ммоль/л, 10 ммоль/л на уровень апоптоза эндотелиальных клеток, обработанных 5%-ной сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом.

Обозначения:

К - контрольная сыворотка FBS;

ЗД - сыворотка здоровых добровольцев;

С - сыворотка пациентов с системным воспалительным ответом;

С + литий - сочетание LiCl в указанных концентрациях с сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом.

Результаты представлены в виде среднего значения (%)±стандартное отклонение.

* - р<0,05 по отношению к С.

Поскольку киназа GSK-3β является основной сигнальной молекулой, участвующей в повреждении многих типов клеток, включая эндотелиальные, в процессе эксперимента было исследовано действие сыворотки пациентов с системным воспалительным ответом на уровень фосфорилирования данной киназы. Было показано, что сыворотка пациентов с системным воспалительным ответом почти не влияет на уровень фосфо-GSK-3β через 5 мин, 15 мин, 30 мин и 1 час после действия сыворотки и вызывает значительное, примерно на 60%, уменьшение уровня фосфо-GSK-3β через 2 и 4 часа. Это свидетельствует об активации GSK-3β при действии факторов крови из данной сыворотки на эндотелиальные клетки.

На Фиг. 7 представлены данные иммуноблот-анализа в различные временные точки после действия на клетки токсичной сыворотки или LiCl, отражающие результаты воздействия сыворотки пациента с системным воспалительным ответом и LiCl в концентрации 1 ммоль/л на фосфорилирование киназы GSK-3β в клетках эндотелия.

Обозначения: К - контрольная сыворотка FBS.

На Фиг. 8 представлены данные иммуноблот-анализа одного из экспериментов по действию токсичной сыворотки на уровень фосфо-GSK-3β. По оси ординат указано относительное количество (%) фосфорилированной киназы GSK-3β относительно общего белка в клетках.

Параллельно с вышеописанным опытом, было изучено действия LiCl в концентрации 1 ммоль/л на динамику фосфорилирования GSK-3β в эндотелиальных клетках. Было обнаружено, что LiCl в концентрации 1 ммоль/л вызывает значительное повышение уровня фосфо-GSK-3β уже через 15 мин после воздействия, и этот эффект сохранялся вплоть до 4 часов.

На Фиг. 9 представлены данные иммуноблот-анализа одного из экспериментов по действию LiCl в концентрации 1 ммоль/л на уровень фосфо-GSK-3B. По оси ординат указано количество (%) фосфорилированной киназы GSK-3β (Ser9) нормированное на тотальный клеточный белок.

При моделировании защиты клеток эндотелия от токсичной сыворотки с помощью LiCl было обнаружено, что прединкубация с LiCl в концентрации 1 ммоль/л в течение менее 1 часа, предотвращает инактивацию (дефосфорилирование) GSK-3β и наоборот, стимулирует ее фосфорилирование на временном интервале 1-4 часа после воздействия сыворотки.

На Фиг. 10 представлены данные иммуноблот-анализа в различных временных точках после совместного воздействия сыворотки больного с системным воспалительным ответом и LiCl в концентрации 1 ммоль/л на фосфорилирование киназы GSK-3β в клетках эндотелия (1 час прединкубации) и токсичной сыворотки (продолжительность инкубации указана над дорожками иммуноблота.

Обозначения: К - контрольная сыворотка FBS.

На Фиг. 11 представлены данные иммуноблот-анализа одного эксперимента по действию LiCl в концентрации 1 ммоль/л на уровень фосфо-GSK-3β в эндотелиоцитах в различные временные интервалы под действием токсической сыворотки. По оси ординат указано относительное количество (%) фосфорилированной киназы GSK-3β в клетках эндотелия, нормированное на тотальный клеточный белок.

К - контрольная сыворотка FBS.

Кроме того было изучено совместное действие сыворотки больного с системным воспалительным ответом и LiCl в концентрациях 0,01 ммоль/л, 0,1 ммоль/л, 1 ммоль/л, 10 ммоль/л на фосфорилирование GSK-3β в клетках эндотелия. Клетки эндотелия прединкубировали 30 мин с указанными концентрациями LiCl, а затем на них воздействовали токсичной сывороткой. Через два часа инкубации с токсичной сывороткой проводили иммуноблот-анализ, на Фиг. 12 представлены данные иммуноблот-анализа после двухчасовой инкубации с токсичной сывороткой.

Обозначения: К - контрольная сыворотка FBS;

С - сыворотка больного с системным воспалительным ответом.

На Фиг. 13 представлены данные иммуноблот-анализа одного из экспериментов на уровень фосфорилирования GSK-3β в клетках эндотелия. Было обнаружено, что LiCl предотвращает дефосфорилирование GSK-3β во всех исследованных концентрациях. При увеличении концентрации LiCl наблюдается дозозависимое повышение уровня фосфорилирования GSK-3β. По оси ординат указано относительное количество (%) фосфорилированной киназы GSK-3β в клетках эндотелия, нормированное на тотальный клеточный белок.

Таким образом достоверно установлено, что LiCl в концентрации не менее 1 ммоль/л предотвращает разборку клаудина и VE-кадгерина в межклеточных контактах, уменьшает количество апоптотических клеток в монослое эндотелиальных клеток линии Ea.hy 926 под действием токсичной сыворотки, что свидетельствует о протекторном эффекте LiCl на эндотелиальный барьер.

Обнаруженный способ протекции межклеточных контактов эндотелиоцитов при воздействии LiCl в концентрации не менее 1 ммоль/л имеет высокую практическую значимость, поскольку клиницисты в своей работе могут рассчитывать на коррекцию эндотелиальной дисфункции у пациентов с критическими состояниями, сопровождающимися системным воспалительным ответом.

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к способу предотвращения нарушения межклеточных контактов эндотелиоцитов. Способ заключается в введении хлорида лития в определенной концентрации в монослой эндотелиальных клеток линии Ea.hy 926 за 1 час до токсического воздействия сыворотки крови человека. Изобретение обеспечивает предотвращение нарушения межклеточных контактов эндотелиоцитов, необходимое для коррекции эндотелиальной дисфункции у пациентов с критическими состояниями, сопровождающимися системным воспалительным ответом, за счет введения LiCl до воздействия патогенного фактора. 13 ил., 1 пр.

Способ предотвращения нарушения межклеточных контактов эндотелиоцитов, заключающийся в том, что осуществляют введение хлорида лития в концентрации не менее 1 ммоль/л в монослой эндотелиальных клеток линии Ea.hy 926 за 1 час до токсического воздействия сыворотки крови человека.