ГЕЛИ ДЛЯ МЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ, СОДЕРЖАЩИЕ С-КОНЦЕВЫЕ ПЕПТИДЫ АЛЬФА-КОННЕКСИНА (ACT) Российский патент 2018 года по МПК A61K31/717 A61K38/16 A61P17/02 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной патентной заявки США № 61/605528, поданной 1 марта 2012, которая включена в данный документ в качестве ссылки во всей полноте.

ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПРЕДСТАВЛЕННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

Содержание прилагающегося текстового файла, представленного в электронном виде, полностью включено в данный документ в качестве ссылки: копия Списка последовательностей в машиночитаемом формате (имя файла: FIRS_006_01WO_SeqList_ST25.txt, дата регистрации: 1 марта 2013, размер файла 32 килобайт).

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к композициям для лечения ран, содержащим полипептиды альфа-коннексина и стабилизирующие средства. Композиции для местного применения, содержащие полипептиды альфа-коннексина и гидроксиэтилцеллюлозу, являются особенно стабильными. Указанные композиции можно использовать для лечения ряда ран, включающих в себя острые послеоперационные раны и хронические язвы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Хотя человеческие ткани, поврежденные в результате механического ранения, болезненного процесса или другой причины, способны к заживлению, сложные структура и функция ткани редко восстанавливаются полностью, если восстановление вообще имеет место. Вместо этого, при восстановлении после повреждения почти всех тканей человека и других высших позвоночных доминирует образование рубцовой ткани. Наиболее известным примером такого восстановления является обесцвеченный и фиброзный рубец, который присутствует после заживления пореза или царапины кожи. Менее известным фактом является образование глиальной рубцовой ткани после повреждения головного или спинного мозга, которое является одним из главных препятствий для восстановления нервной функции после повреждения центральной нервной системы (Silver and Miller JH, 2004). В настоящее время не существует способов лечения или профилактики такого рубцевания и стимулирования регенерации сложных структуры и функции ткани после повреждения.

Помимо разработки таких способов лечения существует потребность в композициях, стабилизирующих активные фармацевтические ингредиенты (API), которые они содержат. Хотя существует большое число потенциальных стабилизирующих средств, не все они работают одинаково хорошо в качестве стабилизаторов конкретных API.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на гелеобразный препарат лекарственного средства для местного применения, содержащий композицию, включающую в себя выделенный полипептид альфа-коннексина. Композиция для местного применения может дополнительно содержать гидроксиэтилцеллюлозный гель, который стабилизирует полипептид альфа-коннексина в процессе хранения. В некоторых вариантах осуществления полипептид альфа-коннексина содержит карбокси-концевую аминокислотную последовательность альфа-коннексина (далее обозначаемую "ACT"). Полипептиды альфа-коннексина настоящего изобретения могут включать в себя или содержать карбокси-концевой участок, в большинстве случаев содержащий от 4 до 30 смежных аминокислот белка альфа-коннексина или его консервативного варианта, где указанный по меньшей мере один полипептид альфа-коннексина связан по амино-концу с транспортером, обеспечивающим клеточную интернализацию.

Целью настоящего изобретения является получение композиции стабильного, простого и текучего гелеобразного носителя для местного применения, который содержит ACT, предназначенной для эстетических, а также терапевтических применений, включающих в себя профилактику рубцевания и ускорение заживления ран у субъекта. Лекарственный продукт можно вводить для лечения острых послеоперационных ран для уменьшения рубцевания, или его можно длительно применять для заживления трудноизлечимых ран, включающих в себя, без ограничения, варикозные язвы, диабетические язвы стоп, пролежневые язвы и т.п. Лекарственный продукт обладает физико-химическими, биохимическими и реологическими свойствами, которые придают ему способность предоставлять терапевтическое и эффективное количество пептида ACT при нанесении на раны любого типа.

В одном аспекте настоящего изобретения из многих стабилизаторов выбирают один или несколько для применения с пептидом ACT, чтобы стабилизировать выделенный полипептид. Предпочтительно стабилизаторы являются не раздражающими, не окрашивающими и не иммунногенными. Стабилизаторы обеспечивают возможность длительного (т.е. в течение 3 месяцев, в течение 6 месяцев, в течение 9 месяцев, в течение 12 месяцев, в течение 18 месяцев, или в течение 24 месяцев) хранения лекарственного продукта в разных температурных условиях (т.е. примерно при 5°C, примерно при 10°C, примерно при 15°C, примерно при 20°C, примерно при 25°C, примерно при 30°C, примерно при 35°C, или примерно при 40°C), а также в разных условиях относительной влажности (т.е. при относительной влажности 0%, при относительной влажности 10%, при относительной влажности 20%, при относительной влажности 30%, при относительной влажности 40%, при относительной влажности 50%, при относительной влажности 60%, при относительной влажности 70%, при относительной влажности 80%, при относительной влажности 90%, или при относительной влажности 100%).

В другом аспекте настоящего изобретения один или несколько наполнителей выбирают из группы, включающей в себя водорастворимые порообразователи, полимеры, ионные соединения, неионные соединения и растворители. В следующем варианте осуществления наполнители действуют как один или несколько из носителей, стабилизаторов и гелеобразующих средств. В одном варианте осуществления по меньшей мере один наполнитель получают с ACT. Предпочтительно наполнители являются не раздражающими, не окрашивающими и не иммуногенными. В одном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере один полимер. В следующем варианте осуществления композиция содержит производное целлюлозы. В следующем варианте осуществления производной целлюлозы представляет собой гидроксиэтилцеллюлозу.

В следующем аспекте настоящего изобретения оптимальный диапазон pH геля для местного применения составляет примерно от pH 5 до pH 7 и поддерживается путем добавления одного или нескольких забуферивающих средств. Предпочтительно забуферивающие средства являются не раздражающими, не окрашивающими и не иммуногенными.

В следующем аспекте настоящего изобретения по меньшей мере один наполнитель представляет собой огеливающее средство. В одном варианте осуществления огеливающее средство представляет собой носитель ACT. В некоторых вариантах осуществления огеливающее средство также действует как стабилизатор. В некоторых вариантах осуществления огеливающее средство можно объединить по меньшей мере с одним из следующих средств: с одним или несколькими забуферивающими средствами и с одним или несколькими другими наполнителями. В одном варианте осуществления огеливающее средство представляет собой гидроксиэтилцеллюлозу.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способ лечения раны, включающий в себя введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиции для местного применения, содержащей по меньшей мере один полипептид альфа-коннексина и гелеобразную гидроксиэтилцеллюлозу.

В иллюстративном варианте осуществления раскрываются стадии получения лекарственного продукта.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Для более полного понимания сущности и преимуществ настоящего изобретения авторы приводят нижеследующее подробное описание в сочетании с фиг. 1, на которой иллюстрируется схема технологического процесса способа получения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Перед описанием композиций и способов настоящего изобретения следует отметить, что данное изобретение не ограничивается конкретными описанными способами, композициями или методологиями, поскольку они могут варьировать. Терминология, используемая в данном документе, предназначается только для описания отдельных версий или вариантов осуществления, но не для ограничения объема настоящего изобретения, который ограничивается лишь приложенной формулой изобретения. Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют традиционные значения, известные специалистам в данной области. Все упомянутые здесь публикации полностью включены в данный документ в качестве ссылки. Ничто в данном документе не должно истолковываться как допущение, что изобретение не наделено правом предшествовать такому раскрытию на основании предшествующего изобретения.

Следует также отметить, что используемые в данном описании и в приложенной формуле изобретения формы, соответствующие единственному числу, включают в себя формы, соответствующие множественному числу, если контекст однозначно не указывает иначе. Так, например, ссылка на "элемент" является ссылкой на один или несколько элементов и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и т.д.

Термин "для местного применения" относится к введению лекарственного продукта настоящего изобретения в точке применения, или в непосредственной близи от точки применения. В данном описании термин "нанесение для местного применения" относится к нанесению на одну или несколько поверхностей, включающих в себя ороговевшую ткань, т.е. к "местному нанесению". Термин местное применение или "местное нанесение" может включать в себя непосредственное нанесение на поверхность желательной основы. Препарат и/или композицию для местного применения, если они находятся в жидком виде, можно наносить путем выливания, нанесения каплями или распыления; если они находятся в виде мази, лосьона, крема, геля и т.п., их можно наносить путем втирания; если они находятся в виде порошка, их можно наносить путем присыпания; если они находятся в виде композиции, представляющей собой жидкость или аэрозоль, их можно наносить посредством любых других подходящих способов.

В данном описании фраза "огеливающие средства" относится к средствам, которые придают препарату для местного применения более плотную или более вязкую консистенцию. Огеливающие средства могут иметь водную или масляную основу. Огеливающие средства также можно называть "загущающие средства". В данном описании термин "наполнители" относится к неактивным ингредиентам, которые служат в качестве носителей активного фармацевтического ингредиента (API). Наполнители также могут выполнять роль огеливающих средств, загущающих средств или стабилизаторов.

Термин "субъект" или "млекопитающее" включает в себя человека или отличного от человека млекопитающего. Отличные от человека млекопитающие включают в себя, без ограничения, домашний скот и домашних питомцев, таких как овцы, жвачные животные, свиньи, а также млекопитающие, относящиеся к семействам собачьих, кошачьих и мышей. В одном варианте осуществления субъект или млекопитающее представляет собой человека.

Термин "введение", используемый в применении к терапевтическим средствам, относится к непосредственному введению терапевтического средства в целевую ткань или на целевую ткань, или к такому введению терапевтического средства пациенту, которое обеспечивает положительное влияние терапевтического средства на ткань, на которую оно направлено. Так, в настоящем описании термин "введение", используемый в применении к лекарственному продукту, может включать в себя, без ограничения, доставку лекарственного продукта и пептида ACT в целевую ткань или на целевую ткань. "Введение" композиции можно осуществлять путем инъекции, местного нанесения, или с помощью любого другого способа, в сочетании с другими известными методами.

Если не указано иначе, термин "кожа" относится к наружному покрову или оболочке организма, состоящему из собственно кожи и эпидермиса, который лежит на подкожной ткани.

В данном описании термин "терапевтическое средство" относится к средству, используемому для лечения, подавления, облегчения, предотвращения или улучшения нежелательного состояния или заболевания у пациента. В частности, варианты осуществления настоящего изобретения направлены на лечение рубцов и отсроченное заживление ран.

В данном описании фраза "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" относится к нетоксичному, но достаточному количеству полипептидов ACT, используемому для осуществления настоящего изобретения, которое позволяет эффективно достигать желательного эффекта, т.е. лечения острых и хронических ран. Активность, рассматриваемая в способах настоящего изобретения, относится к медицинской терапевтической и/или профилактической активности, по обстоятельствам, и включает в себя, например, уменьшение и/или улучшение признаков, симптомов или причин заболевания или расстройства, или любое другое желательное изменение биологической системы. Конкретную дозу композиции, которую вводят, согласно данному изобретению, с целью достижения терапевтических и/или профилактических эффектов, разумеется, определяют с учетом обстоятельств, присутствующих в каждом конкретном случае, таких как, например, конкретный вводимый полипептид и состояние, подлежащее лечению. Терапевтически эффективное количество соединения данного изобретения, как правило, представляет собой количество, которое при введении в составе композиции. Содержащей физиологически приемлемый наполнитель, является достаточным для достижения эффективной внутриклеточной концентрации и локальной концентрации в ткани.

Вообще говоря, термин "ткань" относится к любому скоплению одинаковым образом специализированных клеток, которые объединяются для выполнения конкретной функции. Если не указано иначе, в данном описании термин "ткань" относится к ткани, которая содержит эластин, который является необходимым звеном структуры и/или функции.

Термины "лечить", "подвергаться лечению" или "лечение" в данном описании относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, которые обеспечивают предотвращение, улучшение эффектов нежелательного физиологического состояния, расстройства или заболевания, или замедление развития (облегчение) такого состояния, расстройства или заболевания, или позволяют достичь благоприятных или желательных клинических результатов. В целях данного изобретения благоприятные или желательные клинические результаты включают в себя, без ограничения, облегчение симптомов; уменьшение степени развития состояния, расстройства или заболевания; уменьшение тяжести симптома состояния, заболевания или расстройства; уменьшение частоты появления симптома состояния, заболевания или расстройства; стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) состояния, расстройства или заболевания; замедление появления или замедление развития состояния, расстройства или заболевания; улучшение состояния, расстройства или заболевания; а также ремиссию (частичную или полную), детектируемую или не детектируемую, или облегчение или улучшение состояния, расстройства или заболевания. Лечение включает в себя индукцию клинически значимого ответа при отсутствии чрезмерных уровней побочных эффектов. В некоторых вариантах осуществления лечение может включать в себя предотвращение или уменьшение рубцевания и/или стимуляцию восстановления сложных структуры и функции ткани после повреждения.

В данном описании термины "пептид", "полипептид" или "белок" используются как взаимозаменяемые и относятся к соединению, содержащему аминокислотные остатки, ковалентно соединенные пептидными связями. Белок или пептид содержит по меньшей мере две аминокислоты, а ограничение на максимальное число аминокислот, которое может содержать последовательность белка или пептида, отсутствует. Полипептиды включают в себя любые пептиды или белки, состоящие из двух или более аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. В настоящем описании указанный термин относится как к соединениям с короткой цепью, которые в данной области, как правило, называют пептиды, олигопептиды и олигомеры, так и к соединениям с более длинной цепью, обычно называемым в данной области белки, которые представлены большим числом типов. "Полипептиды" включают в себя, в числе прочих, например, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги и гибридные белки. Полипептиды включают в себя природные пептиды, рекомбинантные пептиды, синтетические пептиды или их сочетания. Нециклический пептид содержит N-конец и C-конец. N-конец содержит аминогруппу, которая может быть свободной (такую как группа NH2), или может быть защищена соответствующим образом (например, группой BOC или aFmoc). C-конец содержит карбоксильную группу, которая может быть свободной (такую как группа COOH), или может быть защищена соответствующим образом (например, бензильной или метильной группой, образующей сложный эфир). Циклический пептид не содержит свободной N- или C-концевой группы, поскольку концы ковалентно связаны посредством амидной связи с образованием циклической структуры. Аминокислоты можно обозначать полными названиями (например, лейцин), 3-буквенными сокращениями (например, Leu) и 1-буквенными сокращениями (например, L). Структуру аминокислот и их сокращенные наименования можно найти в химической литературе, например, в Stryer, "Biochemistry", 3rd Ed., W. H. Freeman and Co., New York, 1988.

Наполнители, которые можно использовать для получения гелей для местного применения, хорошо известны в данной области и описаны, например, в Handbook of Pharmaceutical Excipients (Rowe, R.C. et al, APhA Publications; 5th ed., 2005). Примеры наполнителей могут включать в себя воски, разные сахара и разные типы крахмала, полимеры, гели, мягчительные средства, загущающие средства, реологические модификаторы, увлажняющие средства, глицерин, органические основные соединения, производные целлюлозы, желатин, растительные масла, полиэтиленгликоли и растворители. Примеры реологических модификаторов включают в себя карбопол, гидроксипропилцеллюлозу, C_26-28 алкилдиметикон, C_26-28 алкил метикон, полифенилсисквиоксан, триметилсилоксисиликат, кросполимеры циклопентасилоксана и диметикон/винилтриметилсилоксисиликата, высокодисперсный диоксид кремния (например, Cab-O-Sil M5P), а также их смеси. Примеры смягчающих средств включают в себя глицерин, пентиленгликоль, натрия пирролидонкарбоновая кислота, ланолин, сахарида изомерат, стеароксидиметикон, стеарилдиметикон, а также их смеси. Смягчающие средства можно использовать для предотвращения дегидратации рогового слоя вследствие применения безводных растворителей в составе композиции. Примеры органических оснований включают в себя 2-амино-2-метилпропанол, ниацинамид, метаноламины, триэтаноламины, трисамино, AMP-95, AmP-Ultra PC 2000, триизопропаноламин, диизопропаноламин, Neutrol TE, Ethomeen и их смеси. Органическое основание может обуславливать основной или нейтральный pH лекарственного средства.

Другие типичные наполнители включают в себя водорастворимые порогены. Водорастворимый пороген представляет собой вспомогательное вещество, которое может облегчать поглощение воды и ее диффузию в гель. Можно использовать любой подходящий пороген, однако в некоторых вариантах осуществления пороген может включать в себя хлорид натрия, хлорид калия, сахарозу, глюкозу, лактозу, сорбит, ксилит, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, или их смеси.

Полимеры также можно использовать в качестве наполнителей при получении гелей для местного применения. Примеры полимеров включают в себя гидрофильные полиуретаны, гидрофильные полиакрилаты, сополимеры карбоксиметилцеллюлозы и акриловой кислоты, N-винилпирролидон, поли(гидроксикислоты), полиангидриды, сложные полиортоэфиры, полиамиды, поликарбонаты, полиалкилены (например, полиэтилен и полипропилен), полиалкиленгликоли (например, поли(этиленгликоль)), полиалкиленоксиды (например, полиэтиленоксид), полиалкилен терефталаты (например, полиэтилентерефталат), поливиниловые спирты, простые поливиниловые эфиры, сложные поливиниловые эфиры, поливинилгалогениды (например, поливинилхлорид)), поливинилпирролидон, полисилоксаны, поливинилацетаты), полистиролы, сополимеры полиуретана, целлюлоза, производные целлюлозы (например, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза или ацетат целлюлозы), альгинаты, поли(акриловую кислоту), производные поли(акриловой кислоты), сополимеры акриловой кислоты, метакриловую кислоту, производные метакриловой кислоты, сополимеры метакриловой кислоты, поли(масляную кислоту), поли(валериановую кислоту), поли(лактид-со-капролактон), а также их сополимеры и смеси.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полимеры могут представлять собой суперабсорбирующие полимеры (SAP). Полимер считается суперабсорбирующим, в соответствии с определением IUPAC, если он может абсорбировать и удерживать крайне большие количества воды по сравнению с его собственной массой. SAP могут абсорбировать воду в количествах, которые превышают собственную массу абсорбента в 500 раз или менее, и могут набухать с достижением объема, превышающем исходный объем в 1000 раз или менее. Конкретные представляющие интерес SAP включают в себя полиакрилат натрия, полиуретан Tecophilic TG-2000, а также полимеры, полученные с использованием сополимеров полиакриламида, сополимеров этиленмалеинового ангидрида, перекрестно сшитую карбоксиметилцеллюлозу, сополимеры поливинилового спирта, поливинилпирролидон и перекрестно сшитый полиэтиленоксид.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно использовать полимеры, которые являются относительно гидрофобными. Можно использовать любой подходящий гидрофобный полимер. Примеры относительно гидрофобных полимеров включают в себя ароматические полиуретаны, силиконовый каучук, полисилоксаны, поликапролактон, поликарбонат, поливинилхлорид, полиэтилен, поли-L-лактид, поли-DL-гликолид, полиэтеретеркетон (PEEK), полиамид, полиимид и поливинилацетат. Кроме того, можно использовать основу из гидрофобного геля и/или реологический модификатор.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полимеры могут действовать в составе лекарственных препаратов как загущающие средства. А именно, полимерная часть геля может представлять собой вязкоупругое вещество, которое обеспечивает удержание геля вместе с диспергированными в нем полипептидами альфа-коннексина в участке нанесения.

В некоторых других вариантах осуществления полимер-содержащий гель обладает растекаемостью, которая позволяет ему образовывать тонкую пленку после нанесения на поверхность кожи. Данная пленка может обеспечивать нанесение содержащихся в геле полипептидов альфа-коннексина на обширный участок и удержание полипептидов альфа-коннексина на пораженном участке кожи.

Другие наполнители могут включать в себя разные ионные или неионные соединения, обеспечивающие стабильность композиции путем защиты ее от таких процессов, как деэмульгация, расслоение, аггломерация или разрушение компонентов композиции, которые способны уменьшить ее терапевтическую или эстетическую ценность.

Примеры ионных соединений могут включать в себя соли, такие как хлорид натрия, хлорид калия; катионные, анионные или цвиттерионные поверхностно активные вещества, такие как додецилсульфат натрия (SDS), перфтороктаноат (PFOA), перфтороктансульфонат (PFOS), лаурилсульфат аммония (ALS), сульфат натрий лаурилового эфира (SLES), алкилбензолсульфонат, цетилтриметиламмония бромид (CTAB), цетилпиридиния хлорид (CPC), полиэтоксилированный амин говяжьего жира (POEA), бензалкония хлорид (BAC), бензетония хлорид, додецилбетаин, кокамидопропилбетаин и кокоамфоглицинат.

Примеры неионных соединений, которые можно использовать в качестве наполнителей, включают в себя неионные поверхностно-активные вещества, такие как семейства поверхностно-активных веществ Pluronic, Tween, AMP и Brij; а также поверхностно-активные вещества, полученные из биологических источников, например, природные или полусинтетические поверхностно-активные вещества, такие как олеиновая кислота, сорбитана триолеат, сорбитана моноолеат, лецитин, кокамид MEA, кокамид DEA и кокамидопропил бетаин. Поверхностно-активные вещества (как ионные, так и неионные) могут уменьшать поверхностное натяжение и могут облегчать распределение композиции для местного применения на обширной площади.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в качестве среды-носителя для полипептидов альфа-коннексина можно использовать наполнители-растворители, а также другие наполнители. Полимерные цепи могут взаимодействовать с растворителем и набухать, образуя сеть, способную влиять на вязкоупругие свойства композиции для местного применения. В некоторых вариантах осуществления композиции для местного применения растворитель может испаряться при нанесении, оставляя пленку полимера, содержащую полипептиды альфа-коннексина.

Примеры наполнителей-растворителей, которые можно использовать в гидрофильных композициях, включают в себя диметилизосорбид, пропиленгликоль, глицерин, изопропанол, этанол, бензиловый спирт, этиленгликоль, полиэтиленгликоль, этоксидигликоль, или их смеси. Примеры наполнителей-растворителей, которые можно использовать в гидрофобных композициях, включают в себя триглицериды каприновой/каприловой кислот, изопропилмиристат, минеральное масло, изододекан, изодецилнеопентаноат, бутиленгликоль, пенттиленгликоль, гексиленгликоль, метоксиполиэтиленгликоль, циклопентасилоксан, циклотетрасилоксан, диметикон, каприлилметикон, или их смеси.

Помимо полипептидов альфа-коннексина и наполнителей композиция для местного применения также может содержать по меньшей мере одно другое терапевтическое средство, включающее в себя противомикробные средства, средства от угрей, противовоспалительные средства, болеутоляющие средства, анестетики, антигистаминные средства, антисептические средства, иммуносупрессанты, кровоостанавливающие средства, сосудорасширяющие средства, средства для заживления ран, средства на основе биопленки, а также их смеси.

Примеры противомикробных средств включают в себя пенициллины и родственные лекарственные средства, карбапенемы, цефлоспорины и родственные лекарственные средства, эритромицин, аминогликозиды, бацитрацин, грамицидин, мупироцин, хлорамфеникол, тиамфеникол, фузидат натрия, линкомицин, клиндамицин, макролиды, новобиоцин, полимиксины, рифамицины, спектиномизин, тетрациклины, ваномицин, тейкопланин, стрептограмины, антифолаты, включающие в себя сульфонамиды, триметоприм и их сочетания, а также пириметамин, синтетические противобактериальные средства, включающие в себя нитрофураны, метенамина манделат и метенамина гиппурат, нитроимидазолы, хинолоны, фторхинолоны, изониазид, этамбутол, пиразинамид, пара-аминосалициловая кислота (PAS), циклосерин, капреомицин, этионамид, протионамид, тиацетазон, виомицин, эвеминомицин, гликопептид, гликоциклин, кетолиды, оксазолидинон; имипенен, амикацин, нетилмицин, фосфомицин, гентамицин, цефтриаксон, Зирацин, Линезолид, Синерцид, Азтреонам и Метронидазол, Эпироприм, Санфетринем натрия, Биапенем, Динемицин, Цефлупренам, Цефоселиз, Санфетринем селексетил, Цефпиром, Мерсацидин, Рифалазил, Козан, Ленапенем, Венеприм, Сулопенем, ритипенам акоксил, Циклотиалидин, микакоцидин A, карумонам, Цефозопран и Цефетамет пивоксил.

Примеры противоугревых средств для местного применения включают в себя адапален, азелаиновую кислоту, бензоила пероксид, клиндамицин и клиндамицина фосфат, доксициклин, эритромицин, кератолитические средства, такие как салициловая кислота и ретиноевая кислота (Ретин-A"), норгестимат, органические пероксиды, ретиноиды, такие как изотретиноин и третиноин, сульфацетамид натрия и тазаротен. Конкретные противоугревые средства включают в себя адапален, азелаиновая кислота, бензоила пероксид, клиндамицин (например, клиндамицина фосфат), доксициклин (например, доксициклина моногидрат), эритромицин, изотретиноин, норгестимат, сульфацетамид натрия, тазаротен, этретинат и ацетретин.

Примеры антигистаминных средств включают в себя дифенгидрамина гидрохлорид, дифенгидрамина салицилат, дифенгидрамин, хлорфенирамина гидрохлорид, хлорфенирамина малеат изотифендила гидрохлорид, трипеленамина гидрохлорид, прометазина гидрохлорид, метдилазина гидрохлорид и т.п. Примеры местных анестетиков включают в себя дибукаина гидрохлорид, дибукаин, лидокаина гидрохлорид, лидокаин, бензокаин, гидрохлорид 2-(die-этиламино)этилового эфира п-бутиламинобензойной кислоты, прокаина гидрохлорид, тетракаин, тетракаина гидрохлорид, хлорпрокаина гидрохлорид, оксипрокаина гидрохлорид, мепивакаин, кокаина гидрохлорид, пиперокаина гидрохлорид, диклонин и диклонина гидрохлорид.

Примеры антисептических средств включают в себя спирты, соединения четвертичного аммония, борную кислоту, хлоргексидин и производные хлоргексидина, иод, фенолы, терпены, бактерицидные средства, дезинфицирующие средства, такие как тимеросал, фенол, тимол, бензалкония хлорид, бензетония хлорид, хлоргексидин, повидон-йод, цетилпиридиния хлорид, эвгенол и триметиламмония бромид.

Примеры противовоспалительных средств включают в себя нестероидные противовоспалительные средства (NSAID); производные пропионовой кислоты, такие как ибупрофен и напроксен; производные уксусной кислоты, такие как индометацин; производные эноловой кислоты, такие как мелоксикам, ацетаминофен; метилсалицилат; моногликольсалицилат; аспирин; мефенамовая кислота; флуфенамовая кислота; индометацин; диклофенак; алклофенак; диклофенак натрия; ибупрофен; кетопрофен; напроксен; пранопрофен; фенопрофен; сулиндак; фенклофенак; клиданак; флурбипрофен; фентиазак; буфексамак; пироксикам; фенилбутазон; оксифенбутазон; клофезон; пентазоцин; мепиризол; тиарамида гидрохлорид; стероиды, такие как клобетазола пропионат, бетаметазона диропионат, халбетазола пропионат, дифлоразона диацетат, флуцинонид, хальцинонид, амцинонид, дезоксиметазон, триамцинолона ацетонид, мометазона фуроат, флутиказона пропионат, бетаметазона дипропионат, триамцинолона ацетонид, флутиказона пропионат, дезонид, флуцинолона ацетонид, гидрокортизона валерат, предникарбат, триамцинолона ацетонид, флуцинолона ацетонид, гидрокортизон и другие, известные в данной области, преднизолон, дексаметазон, флуцинолона ацетонид, гидрокортизона ацетат, преднизолона ацетат, метилпреднизолон, дексаметазона ацетат, бетаметазон, бетаметазона валерат, флуметазон, фторметолон, беклометазона дипропионат, флюоцинонид, кортикостероиды для местного применения, в том числе кортикостероиды с более низкой активностью, такие как гидрокортизон, сложные моноэфиры гидрокортизона-21 (например, гидрокортизон-21-ацетат, гидрокортизон-21-бутират, гидрокортизон-21-пропионат, гидрокортизона-21-валерат и др.), сложные диэфиры гидрокортизона-17,21 (например, гидрокортизон-17,21-диацетат, гидрокортизон-17-ацетат-21-бутират, гидрокортизон-17,21-дибутират и др.), алклометазон, дексаметазон, флуметазон, преднизолон или метилпреднизолон, или кортикостероиды с более высокой активностью, такие как клобетазола пропионат, бетаметазона бензоат, бетаметазона дипропионат, дифлоразона диацетат, флюоцинонид, мометазона фуроат, триамцинолона ацетонид.

Примеры болеутоляющих средств включают в себя альфентанил, бензокаин, бупренорфин, буторфанол, бутамбен, капсаицин, клонидин, кодеин, дибукаин, энкефалин, фентанил, гидрокодон, гидроморфон, индометацин, лидокаин, леворфанол, меперидин, метадон, морфин, никоморфин, опий, оксибупрокаин, оксикодон, оксиморфон, пентазоцин, прамоксин, пропаракаин, пропоксифен, проксииетакаин, суфентанил, тетракаин и трамадол.

Примеры обезболивающих средств включают в себя спирты, такие как фенол; бензилбензоат; каламин; хлорксиленол; диклонин; кетамин; ментол; прамоксин; резорцинол; троклозан; прокаиновые лекарственные средства, такие как бензокаин, бупивакаин, хлорпрокаин; цинхокаин; кокаин; дексивакаин; диамокаин; дибукаин; этидокаин; гексилкаин; левобупивакаин; лидокаин; мепивакаин; оксетазаин; прилокаин; прокаин; пропаракаин; пропоксикаин; пиррокаин; ризокаин; родокаин; ропивакаин; тетракаин; и их производные, такие как фармацевтически приемлемые соли и сложные эфиры, включающие в себя бупивакаина HCl, хлорпрокаина HCl, диамокаина цикламат, дибукаина HCl, диклонина HCl, этидокаина HCl, левобупивакаина HCl, лидокаина HCl, мепивакаина HCl, прамоксина HCl, прилокаина HCl, прокаина HCl, пропаракаина HCl, пропоксикаина HCl, ропивакаина HCl и тетракаина HCl.

Примеры кровоостанавливающих средств включают в себя тромбин, фитонадион, протамина сульфат, аминокапроновую кислоту, транексамовую кислоту, карбазохром, карбаксохром натрия сульфонат, рутин и гесперидин.

Помимо биоактивного полипептидного компонента композиция настоящего изобретения также может содержать другие активные средства, такие как ниацинамид, фитантриол, фарнезол, бисаболол и салициловая кислота. Предполагают, что некоторые другие активные средства могут действовать синергически с биоактивным пептидным компонентом, или они могут повышать срок годности композиции.

Примеры лекарственных средств, которые можно использовать в качестве активных ингредиентов для лечения ран вместе с лекарственным продуктом настоящего изобретения, включают в себя фибринолитические ферменты, такие как фибринолизин, дезоксирибонуклеазу, стрептокиназу и стрептодорназу, средства для удаления омертвевшей ткани, содержащие лизозим хлорид, противомикробные средства, содержащие гентамицина сульфат, сульфадиазин-серебро, бацитрацин и фрадиомицина сульфат, средства, способствующие росту грануляций, содержащие трафермин, букладезин натрия, третиноина токоферил (токоретинат), альпростадила альфадекс, солкосерил (экстракт гемолизованной крови молодых особей рогатого скота) и альклокса, препараты йода, содержащие белый мягкий сахар, повидон-йод и йод, а также препараты, содержащие бендазак, диметил изопропилазулен (гвайазулен) и эпинефрин.

Помимо полипептидов альфа-коннексина, наполнителей и других терапевтических средств, гели также могут содержать другие соединения, которые улучшают органолептические свойства композиции для местного применения.

Примеры таких соединений включают в себя отдушки, красители и окрашивающие средства; хелатирующие средства, включающие в себя, без ограничения, эдетат динатрия (EDTA), EGTA, CP94, лимонную кислоту; консерванты, включающие в себя, без ограничения, соединения четвертичного аммония, такие как бензалкония хлорид, бензетония хлорид, цетримид, деквалиния хлорид и цетилпиридиния хлорид; ртуть-содержащие средства, такие как нитрат фенилртути, ацетат фенилртути и тимеросал; спирт-содержащие средства, такие как хлорбутанол, фенилэтиловый спирт и бензиловый спирт; противобактериальные сложные эфиры, такие как сложные эфиры парагидроксибензойной кислоты; а также другие противомикробные средства, такие как хлоргексидин, хлоркрезол, бензойная кислота и полимиксин.

Полипептиды альфа-коннексина, которые можно использовать в композиции настоящего изобретения, описаны в патенте США № 7786074, который включен в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых вариантах осуществления полипептид альфа-коннексина представляет собой полноразмерный белок альфа-коннексина, такой как коннексин 37, коннексин 40, коннексин 43, или коннексин 45. В некоторых вариантах осуществления полипептид отличается от полноразмерного белка коннексина.

Пептиды, подходящие для применения в композициях настоящего изобретения, включают в себя полипептиды альфа-коннексина. Полипептиды альфа-коннексина, подходящие для применения в композициях настоящего изобретения, могут включать в себя или содержать карбокси-концевой участок, содержащий в большинстве случаев от 4 до 30 смежных аминокислот белка альфа-коннексина или его консервативного варианта. Так, полипептиды, подходящие для применения в указанных композициях, могут включать в себя c-концевой участок, содержащий в большинстве случаев от 4 до 30 аминокислот альфа-коннексина, в том числе c-концевой участок, содержащий 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 аминокислот альфа-коннексина. В некоторых аспектах предлагаемый полипептид дополнительно содержит делецию одной или нескольких аминокислот c-концевого участка, включающего в себя от 4 до 30 аминокислот альфа-коннексина, например, делецию 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот c-концевого участка, включающего в себя от 4 до 30 аминокислот альфа-коннексина. Например, в некоторых аспектах полипептиды, подходящие для применения в композициях настоящего изобретения, не содержат 1, 2 или 3 аминокислоты c-концевого участка альфа-коннексина. Например, указанные полипептиды могут состоять в основном из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 92, или ее карбокси-концевого фрагмента, содержащего в длину по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления полипептид альфа-коннексина настоящего изобретения связан по амино- или карбокси-концу с транспортером, обеспечивающим клеточную интернализацию. В отдельных вариантах осуществления полипептид альфа-коннексина не связан с транспортером, обеспечивающим клеточную интернализацию. Транспортер, обеспечивающий клеточную интернализацию, связанный с полипептидами альфа-коннексина, может представлять собой любую известную или недавно открытую в данной области последовательность интернализации, или ее консервативные варианты. Не ограничивающие примеры транспортеров и последовательностей, обеспечивающих клеточную интернализацию, включают в себя последовательности Antennapedia, TAT, HIV-Tat, пенетратина, Antp-3A (мутант Antp), буфорина II, транспортана, MAP (модельный амфипатический пептид), K-FGF, Ku70, приона, pVEC, Pep-1, SynB1, Pep-7, HN-1, BGSC (бис-гуанидин-спермидин-холестерин) и BGTC (бис-гуанидин-Tren-холестерин).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения аминокислотная последовательность полипептида альфа-коннексина выбрана из группы, включающей в себя SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5, или их консервативные варианты. В следующем варианте осуществления настоящего изобретения полипептид альфа-коннексина включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления настоящего изобретения полипептид содержит полипептид альфа-коннексина и транспортер, обеспечивающий клеточную интернализацию. В следующем варианте осуществления полипептид альфа-коннексина связан по амино-концу с транспортером, обеспечивающим клеточную интернализацию. В следующем варианте осуществления аминокислотная последовательность полипептида альфа-коннексина, связанного с транспортером, обеспечивающим клеточную интернализацию, выбрана из группы, включающей в себя SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11 и 12, или их консервативные варианты. В одном варианте осуществления полипептид содержит или включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, а именно RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEI.

В настоящем описании ссылка на конкретные белки подразумевает их варианты, производные и фрагменты. Способы получения вариантов и производных белков хорошо известны специалистам в данной области и могут включать в себя модификации аминокислотных последовательностей. Например, модификации аминокислотных последовательностей обычно включают в себя один или несколько из трех классов: замены, вставки или делеции. Вставки включают в себя получение амино- и/или карбокси-концевых гибридов, а также вставки внутри последовательности одного или нескольких аминокислотных остатков. Обычно вставки являются более маленькими, чем вставки, приводящие к получению амино- или карбокси-концевых гибридов, например, их размер составляет от одного до четырех остатков. Делеции включают в себя удаление одного или нескольких аминокислотных остатков из белковой последовательности. Указанные варианты обычно получают путем сайт-специфического мутагенеза нуклеотидов ДНК, кодирующей белок, с получением ДНК, кодирующей вариант, с последующей экспрессией ДНК в культуре рекомбинантных клеток. Методы проведения заместительных мутаций по заранее определенным участкам ДНК, имеющей известную последовательность, хорошо известны и включают в себя, например, мутагенез с использованием праймера M13 и мутагенез методом ПЦР. Аминокислотные замены обычно проводят по отдельным остаткам, однако их можно проводить одновременно по нескольким разным положениям; размер вставок обычно составляет примерно от 1 до 10 аминокислотных остатков. Делеции или вставки можно осуществить по соседним парам, т.е. можно провести делецию 2 остатков, или вставку 2 остатков. Замены, делеции, вставки или любое их сочетание можно объединить с получением конечной конструкции. Мутации не должны приводить к смещению последовательности из рамки считывания и, предпочтительно, к созданию участков, которые могут вызывать изменение вторичной структуры мРНК, за исключением тех случаев, когда такое изменение вторичной структуры мРНК является желательным. Варианты, полученные в результате замен, представляют собой варианты, в которых по меньшей мере один остаток удален, а другой остаток вставлен на его место. Такие замены обычно представляют собой консервативные замены. Например, замена аминокислотного остатка другим, биологически и/или химически подобным ему остатком, известна специалистам в данной области как консервативная замена. Например, консервативная замена представляет собой замену одного гидрофобного остатка на другой, или одного полярного остатка на другой. Полученные в результате консервативных замен варианты каждой явным образом раскрытой последовательности относятся к предлагаемым здесь полипептидам. Как правило, консервативные замены оказывают небольшое влияние на биологическую активность полученного полипептида. В конкретном примере консервативная замена представляет собой аминокислотную замену в пептиде, которая не оказывает существенного влияния на биологическую функцию пептида. Пептид может содержать одну или несколько аминокислотных замен, например, 2-10 консервативных замен, 2-5 консервативных замен, 4-9 консервативных замен, например, 2, 5 или 10 консервативных замен. Полипептид, содержащий одну или несколько консервативных замен, можно получить путем манипуляций с нуклеотидной последовательностью, кодирующей данный полипептид, с использованием, например, стандартных методов, таких как сайт-направленный мутагенез, или мутагенез методом ПЦР. Альтернативно полипептид, содержащий одну или несколько консервативных замен, можно получить с использованием стандартных методов пептидного синтеза. Сканирование по аланину можно использовать для идентификации аминокислотных положений в последовательности белка, допускающих проведение аминокислотных замен. В одном примере биологическая активность белка уменьшается не более чем на 25%, например, не более чем на 20%, например, не более чем на 10%, если аланин, или другую консервативную аминокислоту (например, одну из приведенных ниже), заменяют одной или несколькими нативными аминокислотами. Дополнительную информацию по консервативным заменам можно найти, в числе прочих публикаций, в Ben-Bassat et al, (J. Bacterial. 169:751-7, 1987), O'Regan et al., (Gene 77:237-51, 1989), Sahin-Toth et al., (Protein Sci. 3:240-7, 1994), Hochuli et al., (Bio/Technology 6:1321-5, 1988), а также в стандартных учебниках по генетике и молекулярной биологии.

В данном описании термин "аналитические методы" включает в себя нижеследующие методы, которые можно использовать для определения природы и количества пептида ACT в конкретной композиции: ЯМР, ВЭЖХ, методы определения аминокислотного состава и молекулярной массы, а также методы определения удельного оптического вращения.

Настоящее изобретение предлагает композицию для местного применения, содержащую по меньшей мере один полипептид альфа-коннексина и гидроксиэтилцеллюлозный гель, где гидроксиэтилцеллюлозный гель стабилизирует полипептид альфа-коннексина. В некоторых вариантах осуществления гидроксиэтилцеллюлозный гель стабилизирует полипептид альфа-коннексина так, что после 3 месяцев хранения при 5°C по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% полипептида альфа-коннексина можно детектировать с помощью аналитических методов. В некоторых вариантах осуществления полипептид альфа-коннексина присутствует в композиции в концентрации, составляющей примерно 0,0025% (масс./масс.), примерно 0,005% (масс./масс.), примерно 0,0075% (масс./масс.), примерно 0,010% (масс./масс.), примерно 0,015% (масс./масс.), примерно 0,020% (масс./масс.), примерно 0,025% (масс./масс.), примерно 0,030% (масс./масс.), примерно 0,035% (масс./масс.), примерно 0,040% (масс./масс.), примерно 0,045% (масс./масс.), примерно 0,050% (масс./масс.), примерно 0,055% (масс./масс.), примерно 0,060% (масс./масс.), примерно 0,065% (масс./масс.), примерно 0,070% (масс./масс.), примерно 0,075% (масс./масс.), примерно 0,080% (масс./масс.), примерно 0,085% (масс./масс.), примерно 0,090% (масс./масс.), примерно 0,095% (масс./масс.), примерно 0,100% (масс/масс), примерно 0,150% (масс./масс.), примерно 0,200% (масс./масс.), примерно 0,250% (масс./масс.), примерно 0,500% (масс./масс.), примерно 0,750% (масс./масс.), примерно 1,00% (масс./масс.), примерно 1,50% (масс./масс.), примерно 2,00% (масс./масс.), примерно 2,50% (масс./масс.) или примерно 5,00 (масс./масс.). В одном варианте осуществления полипептид альфа-коннексина присутствует в композиции в концентрации, составляющей примерно от 0,005% (масс./масс.) до 1,00% (масс./масс.).

В других вариантах осуществления лекарственный продукт настоящего изобретения представляет собой прозрачный бесцветный гель, который содержит 0,0072% (масс./масс.) (20 мкМ) пептида ACT, 0,018% (масс./масс.) (50 мкМ) пептида ACT, 0,036% (масс./масс.) (100 мкМ) пептида ACT или 0,072% (масс./масс.) (200 мкМ) пептида ACT. Пептид ACT можно растворить в полутвердой лекарственной форме, которая содержит >0% воды, >10% воды, >20% воды, >30% воды, >40% воды, >50% воды, >60% воды, >70% воды, >80% воды, или >90% воды, и 0,25% огеливающего средства (полимер), 0,55% огеливающего средства (полимер), 0,75% огеливающего средства (полимер), 1,00% огеливающего средства (полимер), 1,25% огеливающего средства (полимер), 1,50% огеливающего средства (полимер), 1,75% огеливающего средства (полимер), 2,00% огеливающего средства (полимер), 2,25% огеливающего средства (полимер), или 2,50% огеливающего средства (полимер). Пептид ACT может быть хорошо законсервирован и адекватно забуферен до pH 6. В одном варианте осуществления композиция для местного применения имеет качественный и количественный состав, приведенный в таблице 1,

Таблица 1
Качественный и количественный состав гелеобразного лекарственного продукта Ингредиенты Категория Функция Концентрация (% масс./ масс.) Пептид 328967 (ACT пептид) - Активный ингредиент 0,0072; 0,018 0,036; 0,072 Метилпарабен NF Консервант 0,17 Пропилпарабен NF Консервант 0,02 Глицерин USP Растворитель 5,0 Одноосновный фосфат натрия USP Забуферивающее средство 0,263 Двухосновный фосфат натрия USP Забуферивающее средство 0,044 Пропиленгликоль USP Растворитель 3,0 Эдетат натрия (EDTA) USP Хелатирующее средство 0,05 D-маннит USP Стабилизатор 0,05 Гидроксиэтилцеллюлоза, 250ННХ NF Огеливающее средство 1,25% Очищенная вода USP Растворитель 100%

Последовательность пептида ACT1 приведена ниже в таблице 2, где Ahx обозначает L-2-аминогексановую кислоту, также известную как 6-аминогексановая кислота:

Таблица 2
Последовательность пептида 328967 (Antp/ACT1) Biotin-Ahx-Arg-Gln-Pro-Lys-lle-Trp-Phe-Pro-Asn-Arg-Arg-Lys-Pro-Trp-Lys-Lys-Arg- Pro-Arg-Pro-Asp-Asp-Leu-Glu-lle-OH

Общие свойства пептида 328967 приведены в таблице 3.

Таблица 3
Общие физические свойства пептида 328967 Внешний вид Белый или не совсем белый порошок Молекулярная масса 3597,33±2,0 единиц атомной массы Противоион АсОН Растворимость Растворяется в воде при комнатной температуре

В одном аспекте настоящего изобретения наполнители, используемые для получения лекарственного продукта для местного применения, выбирают из группы, включающей в себя одно или несколько из следующих соединений:

Метилпарабен

Пропилпарабен

Глицерин

Одноосновный фосфат натрия

Двухосновный фосфат натрия

Пропиленгликоль

Эдетат динатрия (EDTA)

D-Маннит

Гидроксиэтилцеллюлоза, 250 HHX

Очищенная вода

В одном варианте осуществления препарат лекарственного продукта для местного применения содержит пептид, D-маннит, гидроксиэтилцеллюлозу и очищенную воду. Кроме того, указанный препарат может содержать один или несколько из метилпарабена, пропилпарабена, глицерина, одноосновного фосфата натрия, двухосновного фосфата натрия, пропиленгликоля и эдетата динатрия (EDTA). В следующем варианте осуществления гидроксиэтилцеллюлоза представляет собой 250 HHX. В следующем варианте осуществления пептид представляет собой полипептид альфа-коннексина.

В таких вариантах осуществления препарат лекарственного продукта для местного применения содержит пептид в концентрации, составляющей примерно от 0,001% (масс./масс.) до 0,5% (масс./масс.) (например, примерно 0,0072%, 0,018%, 0,036% или 0,072% (масс./масс.)); метилпарабен в концентрации, составляющей примерно от 0,10% (масс./масс.) до 0,25% (масс./масс.) (например, примерно 0,17% (масс./масс.)); пропилпарабен в концентрации, составляющей примерно от 0,01% (масс./масс.) до 0,03% (масс./масс.) (например, примерно 0,02% (масс./масс.)); глицерин в концентрации, составляющей примерно от 1% (масс./масс.) до 10% масс./масс.) (например, примерно 5% (масс./масс.)); одноосновный фосфат натрия в концентрации, составляющей примерно от 0,1% (масс./масс.) до 0,5% (масс./масс.) (например, примерно 0,263% (масс./масс.)); двухосновный фосфат натрия в концентрации, составляющей примерно от 0,02% до 0,06% (например, примерно 0,044% (масс./масс.)); пропиленгликоль в концентрации, составляющей примерно от 1% (масс./масс.) до 5% (масс./масс.) (например, примерно 3% (масс./масс.)); EDTA в концентрации, составляющей примерно от 0,01% до 0,1% (например, примерно 0,05% (масс./масс.)); D-маннит в концентрации, составляющей примерно от 0,01% (масс./масс.) до 0,1% (масс./масс.) (например, примерно 0,05% (масс./масс.)); гидроксиэтилцеллюлозу в концентрации, составляющей примерно от 0,5% до 2,5% (например, примерно 1,25% (масс./масс.)), и очищенную воду в концентрации, составляющей примерно от 0,1% до 10% (например, примерно 1%). В следующем варианте осуществления пептид представляет собой полипептид альфа-коннексина. В следующем варианте осуществления пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 и 12. В одном варианте осуществления пептид содержит аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 9.

В состав лекарственного продукта включают наполнители, которые по данным исследований in vitro и in vivo являются не раздражающими, не окрашивающими и не иммуногенными. Исследования стабильности демонстрируют, что пептид ACT1 является более стабильным в таком огеливающем средстве, как гидроксиэтилцеллюлоза, 250 HHX (1,25%), чем в гелях Pluronic. Количество пептида ACT, входящее в состав лекарственного продукта, содержащего 1,25% гидроксиэтилцеллюлозы, уменьшается лишь до 98% по сравнению с количеством, указанным на этикетке (т.e. исходной концентрацией), после хранения при 5°C в течение трех месяцев и до 84% от количества, указанного на этикетке, после хранения при 25°C в течение такого же периода времени. В одном аспекте настоящего изобретения эдетат динатрия (EDTA) и маннит включают в состав лекарственного продукта, чтобы обеспечить стабильность пептида ACT1, В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения маннит присутствует в композиции в количестве, составляющем от 0,01% (масс./масс.) до 1,6% (масс./масс.), от 0,01% (масс./масс.) до 1,5% (масс./масс.), от 0,01% (масс./масс.) до 1,4% (масс./масс.), от 0,01% (масс./масс.) до 1,3% (масс./масс.), от 0,01% (масс./масс.) до 1,2% (масс./масс.), 0,01% (масс./масс.) до 1,1% (масс./масс.), от 0,01% (масс./масс.) до 1,0% (масс./масс.), от 0,01% (масс./масс.) до 0,9% (масс./масс.), от 0,01% (масс./масс.) до 0,8% (масс./масс.), от 0,01% (масс./масс.) до 0,7% (масс./масс.), от 0,01% (масс./масс.) до 0,6% (масс./масс.), от 0,01% (масс./масс.) до 0,5% (масс./масс.), от 0,01% (масс./масс.) до 0,4% (масс./масс.), от 0,01% (масс./масс.) до 0,3% (масс./масс.), от 0,01% (масс./масс.) до 0,2% (масс./масс.), от 0,01% (масс./масс.) до 0,1% (масс./масс.), или от 0,01% (масс./масс.) до 0,005% (масс./масс.). В одном варианте осуществления маннит присутствует в композиции в количестве, составляющем примерно 0,05% (масс./масс.).

В другом аспекте настоящего изобретения забуферивающее средство вводят в состав композиции для местного применения, чтобы поддерживать pH в нужном диапазоне. Подходящие забуферивающие средства могут включать в себя, без ограничения, ацетатные буферы, цитратные буферы, фосфатные буферы, буферы, содержащие молочную кислоту, буферы, содержащие яблочную кислоту, буферы, содержащие янтарную кислоту, боратные буферы, гидроксид натрия, гидроксид калия и гидроксид аммония. Также можно использовать соли фосфорной кислоты, такие как мононатрия фосфат (NaH₂PO₄; также известный как одноосновный фосфат натрия), динатрия гидрофосфат (Na₂HPO₄; также известный как двухосновный фосфат натрия), монокалия фосфат (KH₂PO₄), дикалия фосфат (K₂HPO₄) и их смеси. В одном варианте осуществления фосфатный буфер обеспечивает более высокую стабильность, чем цитратный буфер. Обнаружено, что при концентрации 25 мМ буферная емкость является достаточной для лекарственного продукта. Буфер нужен для регуляции pH гелеобразной системы, а также для поддержания стабильности пептидного лекарственного средства. Диапазон pH композиции для местного применения может включать в себя значения pH от 2 до 12, от 4 до 10, или от 6 до 8. В одном варианте осуществления подходящий диапазон pH включает в себя значения pH от 5 до 7. В некоторых вариантах осуществления pH композиция настоящего изобретения для местного применения составляет 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 или 8,0. В следующем аспекте пропиленгликоль в количестве 3% обеспечивает повышенную солюбилизацию парабенов в водной системе.

В одном варианте осуществления композиция, содержащая пептид ACT, включенный в гидроксиэтилцеллюлозу, позволяет проводить широкомасштабное получение продукта, обладающего характеристиками, которые делают его удобным для клинических применений, и удовлетворяют желательным требованиям хранения и стабильности. В то время как композиция ACT1, полученная с использованием геля Pluronic, может требовать относительно длительного времени внедрения, составляющего примерно 2,5 часа, и позволяет получать партии массой только 50 грамм, композиция, содержащая гидроксиэтилцеллюлозу, обеспечивает намного более быстрое внедрение пептида ACT в гель и позволяет получать гораздо более крупные партии. Например, при использовании композиции для местного применения, содержащей гель Pluronic F 127, внедрение полимера занимает более часа, причем для облегчения внедрения требуется помещение композиции в водяную баню. И наоборот, гидроксиэтилцеллюлоза (например, HEC 250 HHX) обеспечивает легкое внедрение при комнатной температуре и гидратируется в течение 30 минут. Следовательно, применение гидроксиэтилцеллюлозы может облегчить широкомасштабное производство. В случае использования геля Pluronic процесс получения может потребовать применения холодной бани для поддержания вязкости в желательном диапазоне и больших затрат энергии, чем процесс получения в случае использования гидроксиэтилцеллюлозы. Кроме того, конечная композиция в геле Pluronic может быть очень тонкой в условиях хранения при 5 градусах C.

Обнаружено, что гидроксиэтилцеллюлоза (HEC) представляет собой подходящее огеливающее средство и приемлемый носитель для лекарственного продукта настоящего изобретения. В одном варианте осуществления огеливающее средство представляет собой гидроксиэтилцеллюлозу (HEC) 250 HHX. В одном варианте осуществления содержание HEC находится в диапазоне 1-5% (масс./масс.). В следующем варианте осуществления содержание HEC составляет 1,25% (масс./масс.). В способе получения HEC очищенную целлюлозу подвергают взаимодействию с гидроксидом натрия с получением набухшей щелочной целлюлозы. Обработанная щелочью целлюлоза является химически более реакционноспособной, чем целлюлоза. В результате взаимодействия щелочной целлюлозы с этиленоксидом получают ряд гидроксиэтилцеллюлозных простых эфиров. В данной реакции атомы водорода гидроксильных групп целлюлозы замещаются гидроксиэтильными группами, которые придают гелю способность растворяться в воде. Предполагается, что в данном изобретении можно использовать отдельные простые эфиры HEC или смеси простых эфиров HEC с разной молекулярной массой и структурой. Категории HEC, подходящие для фармацевтических целей, хорошо известны и подробно описаны в фармацевтической литературе. Подходящие коммерчески доступные марки HEC включают в себя, без ограничения, Fuji HEC-HP; Fuji HEC-AG 15; NATRO-SOL 250HR; NATROSOL 250MH; NATROSOL 250G; CELLOSIZE QP 30000;TYLOSE H SERIES; NATROSOL 180L; NATROSOL 300H; TYLOSE P-X; NATROSOL 250M; CELLOSIZE WP 4400; CELLOSIZE UT 40; NATROSOL 250H4R; Tylose H 20P; NATROSOL LR; TYLOSE MHB; NATROSOL 250HHP; HERCULES N 100; CELLOSIZE WP 300; TYLOSE P-Z SERIES; NATROSOL 250H; TYLOSE PS- X; Cellobond HEC 400; CELLOSIZE QP; CELLOSIZE QP 1500; NATRO-SOL 250; HYDROXYETHYL CELLULOSE ETHER; HESPAN; TYLOSE MHB-Y; NATROSOL 240JR; HYDROXYETHYL STARCH; CELLOSIZE WP; CELLOSIZE WP 300H; 2-HYDROXYETHYL CELLULOSE ETHER; BL 15; CELLOSIZE QP 4400; CELLOSIZE QP3; TYLOSE MB; CELLULOSE HYDROXY-ETHYLATE; CELLOSIZE WPO 9H17; CELLOSIZE 4400H16; CELLULOSE HYDROXYETHYL ETHER; Hydroxyethyl Cellulose; Hydroxyl Ethyl Cellulose (HEC); Hydroxyethyl Cellulose 100H (celocell 100h); TYLOSE MH-XP; NATROSOL 250HX; Natrosol; Daicel EP 500; HEC-Unicel; HEC (Hydroxyethyl cellulose); Cellosize; HEC-Al 5000; Fuji HEC-AL 15; HEC-Unicel QP 09L; Cellulose, ethers, 2-hydroxyethyl ether; Unicel QP 52000H; HEC-QP 4400; SP 250 (целлюлоза); Hetastarch; Cellulose, ethers, 2-hydroxyethyl ether; Glutofix 600; FL 52; Fuji HEC-AX 15F; Tylose H 300P; HEC-Unicel QP 300H; Tylose H 300; Daicel SP 550; Daicel SE 600; Unicel QP 15000; HEC-QP 100MH; HEC-QP 9H; OETs; Daicel EP 850; H. E. Cellulose; Cellobond 25T; Unicel QP 100MH; Tylose H 4000; SE 850K; Tylomer H 20; Daicel SE 850K; Tylose H 30000YP; Unicel QP 4400;SP 407; Tylose H 100000;Daicel SP 200; Culminal HEC 5000PR; Tylopur H 300; Daicel SP 750; Sanhec; BL 15 (производное целлюлозы); Unicel QP 300H; Tylomer H 200; J 164; Tylose H 10; Tylose H 20; AH 15; Daicel SP 600; Daicel SE 900; HEC-Unicel QP 4400H; AX 15; Daicel SP 800; Fuji HEC-AW 15F; HEC-SE 850; HEC-A 5-25CF; Metolose 90SEW; AW 15 (полисахарид); Cellobond HEC 5000; HEC-QP 100M; Cellobond HEC 15A; Tylose H 15000YP2; Walocel HT 6.000PFV; 2-Hydroxyethyl cellulose (Natrosol Type 250HRCS); Fuji HEC-BL 20; Fuji HEC-SY 25F; Telhec; HEC-SP 200; HEC-AH 15; HEC-Unicel QP 30000H; see; HEC 10A; Daicel SP 400; Admiral 3089FS; Fuji HEC-A 5000F; HEC-SP 400; Hydroxyethyl Methyl Cellulose (HEMC); HYDROXYETHYL CELLULOSE (HEC); Hydroxyethyl Starch (CAS No:9004-62-0); Hydroxy Ethyl Cellulose; “Natrosol» [Aqualon]; HEC; 2-HYDROXYETHYL CELLULOSE; NATROSOL 150L; TYLOSE MHB-YP; HYDROXYETHYL ETHER CELLULOSE;NATROSOL 250L; CELLOSIZE WP 400H; TYLOSE P; CELLULOSE, 2-HYDROXYETHYL ETHER; TYLOSE MH-K; NATROSOL 250HHR.

В другом варианте осуществления лекарственный продукт настоящего изобретения упаковывают во флакон объемом 20 мл (USP типа I, сцинтилляционный флакон из боросиликатного прозрачного стекла с карбамидной завинчивающейся крышкой, имеющей многоконусное уплотнение). В качестве консерванта используют смесь, содержащую 0,17% (масс./масс.) метилпарабена и 0,02% (масс./масс.) пропилпарабена.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способ лечения раны, включающий в себя введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиции для местного применения, содержащей по меньшей мере один полипептид альфа-коннексина и гидроксиэтилцеллюлозный гель, где гидроксиэтилцеллюлозный гель стабилизирует полипептид альфа-коннексина. Подлежащая лечению рана может представлять собой острую хирургическую рану или хроническую, неинфицированную язву нижней конечности на всю толщу кожи.

В конкретном воплощении лекарственный продукт настоящего изобретения можно использовать для уменьшения избыточного образования рубцовой ткани, связанного с острыми хирургическими ранами. В данном варианте осуществления лекарственный продукт настоящего изобретения можно применять во время закрытия хирургического разреза, через 1 час после закрытия хирургического разреза, через 2 часа после закрытия хирургического разреза, через 3 часа после закрытия хирургического разреза, через 4 часа после закрытия хирургического разреза, через 5 часов после закрытия хирургического разреза, через 6 часов после закрытия хирургического разреза, через 7 часов после закрытия хирургического разреза, через 8 часов после закрытия хирургического разреза, через 9 часов после закрытия хирургического разреза, через 10 часов после закрытия хирургического разреза, через 11 часов после закрытия хирургического разреза, через 12 часов после закрытия хирургического разреза, через 13 часов после закрытия хирургического разреза, через 14 часов после закрытия хирургического разреза, через 15 часов после закрытия хирургического разреза, через 16 часов после закрытия хирургического разреза, через 17 часов после закрытия хирургического разреза, через 18 часов после закрытия хирургического разреза, через 19 часов после закрытия хирургического разреза, через 20 часов после закрытия хирургического разреза, через 21 час после закрытия хирургического разреза, через 22 часа после закрытия хирургического разреза, через 23 часа после закрытия хирургического разреза, через 24 часа после закрытия хирургического разреза, через 48 часов после закрытия хирургического разреза, через 72 часа после закрытия хирургического разреза, или позже.

В другом варианте осуществления лекарственный продукт настоящего изобретения можно использовать для лечения хронических язв. Например, язвы могут включать в себя диабетические язвы стопы, варикозные язвы и пролежневые язвы. Указанные язвы могут представлять собой хронические, неинфицированные язвы нижних конечностей на всю толщу кожи. В одном варианте осуществления лекарственный продукт настоящего изобретения можно наносить на хроническую язву ежедневно, через день, один раз в неделю, или в другом режиме, до видимого заживления хронической язвы. В другом варианте осуществления режим нанесения лекарственного продукта настоящего изобретения на хроническую язву включает в себя нанесение на 0, 3, 7, 14, 21 и 28 день. В другом варианте осуществления режим нанесения лекарственного продукта настоящего изобретения на хроническую язву включает в себя нанесение на 0 день, 3 день, 1 неделю, 2 неделю, 3 неделю, 4 неделю, 5 неделю, 6 неделю, 7 неделю, 8 неделю, 9 неделю, 10 неделю, 11 неделю и 12 неделю. В другом аспекте настоящего изобретения получение лекарственного продукта включает в себя следующие стадии:

Стадия 1: В химический стакан подходящего размера добавляют пропиленгликоль, глицерин, метилпарабен и пропилпарабен. Перемешивают с помощью пропеллерной мешалки до полного растворения парабенов.

Стадия 2: В сосуд добавляют очищенную воду (часть I), EDTA, одноосновный фосфат натрия, двухсновный фосфат натрия и D-маннит. Перемешивают с помощью пропеллерной мешалки до получения прозрачного раствора.

Стадия 3: Раствор, полученный на стадии 1, добавляют в сосуд. Химический стакан ополаскивают очищенной водой (часть II, разделенная примерно на 3 равные порции) и воду после ополаскивания снова добавляют в сосуд. Перемешивание с помощью пропеллерной мешалки продолжают до получения визуально гомогенного раствора.

Стадия 4: В сосуд, содержащий смесь, полученную на стадии 3, добавляют гидроксиэтилцеллюлозу при гомогенезирующем перемешивании. Перемешивание продолжают до однородного распределения полимера.

Стадия 5: В отдельный химический стакан добавляют очищенную воду (часть III) и полипептид альфа-коннексина (например, пептид 328967 ACT1). Перемешивают с помощью магнитной мешалки или пропеллерной мешалки до полного растворения пептида и образования геля.

Стадия 6: При непрерывном перемешивании с помощью пропеллерной мешалки в сосуд добавляют раствор лекарственного средства, полученный на стадии 5. Химический стакан ополаскивают очищенной водой (часть IV, разделенная примерно на 3 равные порции) и воду после ополаскивания снова добавляют в сосуд. Перемешивают до получения гомогенного геля.

Схема технологического процесса способа получения приведена на фиг. 1: Блок-схема способа получения.

Последовательности

SEQ ID NO:1 (ACT 2) PSSRASSRASSRPRPDDLEI

SEQ ID NO:2 (ACT 1) RPRPDDLEI

SEQ ID NO:3 (ACT 3) RPRPDDLEV

SEQ ID NO:4 (ACT 4) RPRPDDVPV

SEQ ID NO:5 (ACT 5) KARSDDLSV

SEQ ID NO:6

aga cct cgg cct gat gac ctg gag att

SEQ ID NO:7 (Antp) RQPKIWFPNRRKPWKK

SEQ ID NO:8 (Antp/ ACT 2) RQPKIWFPNRRKPWKKPSSRASSRASSRPRPDDLEI

SEQ ID NO:9 (Antp/ ACT 1) RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEI

SEQ ID NO:10 (Antp/ ACT 3) RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEV

SEQ ID NO:11 (Antp/ ACT 4) RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDVPV

SEQ ID NO:12 (Antp/ ACT 5) RQPKIWFPNRRKPWKKKARSDDLSV

SEQ ID NO:13 (кодирует полипептид SEQ ID NO 9)

cgg cag ccc aag atc tgg ttc ccc aac cgg cgg aag ccc tgg aag aag cgg ccc ggc ccg acg acc tgg aga tc

SEQ ID NO:14 (HIV-Tat) GRKKRRQRPPQ

SEQ ID NO:15 (Пенетратин) RQIKIWFQNRRMKWKK

SEQ ID NO:16 (Antp-3A) RQIAIWFQNRRMKWAA

SEQ ID NO:17 (Tat) RKKRRQRRR

SEQ ID NO:18 (Буфорин II) TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK

SEQ ID NO:19 (Транспортан) GWTLNSAGYLLGKINKALAALAKKIL

SEQ ID NO:20 (модельный амфипатический пептид) KLALKLALKALKAALKLA

SEQ ID NO:21 (K-FGF) AAVALLPAVLLALLAP

SEQ ID NO:22 (Ku70) VPMLK-PMLKE

SEQ ID NO:23 (Прион) MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP

SEQ ID NO:24 (pVEC) LLIILRRRIRKQAHAHSK

SEQ ID NO:25 (Pep-1) KETWWETWWTEWSQPKKKRKV

SEQ ID NO:26 (SynB1) RGGRLSYSRRRFSTSTGR

SEQ ID NO:27 (Pep-7) SDLWEMMMVSLACQY

SEQ ID NO:28 (HN-1) TSPLNIHNGQKL

SEQ ID NO:29 (Куриный альфа Cx43 ACT) PSRASSRASSRPRPDDLEI

SEQ ID NO:30 (Человеческий альфа Cx45) GSNKSTASSKSPDPKNSVWI

SEQ ID NO:31 (Куриный альфа Cx45) GSNKSSASSKSGDGKNSVWI

SEQ ID: 32 (Человеческий альфа Cx46) GRASKASRASSGRARPEDLAI

SEQ ID NO: 33 (Человеческий альфа Cx46.6) GSASSRDGKTVWI

SEQ ID NO:34 (Альфа-Cx36 шимпанзе) PRVSVPNFGRTQSSDSAYV

SEQ ID NO:35 (Куриный альфа Cx36) PRMSMPNFGRTQSSDSAYV

SEQ ID NO:36 (Человеческий альфа Cx47) PRAGSEKGSASSRDGKTTVWI

SEQ ID NO:37 (Человеческий альфа Cx40) GYHSDKRRLSKASSKARSDDLSV

SEQ ID NO:38 (Человеческий альфа Cx50) PLSRLSKASSRARSDDLTV

SEQ ID NO:39 (Человеческий альфа Cx59)

PNHVVSLTNNLIGRRVPTDLQI

SEQ ID NO:40 (Крысиный альфа Cx33) PSCVSSSAVLTTICSSDQVVPVGLSSFYM

SEQ ID NO:41 (Овечий альфа Cx44) GRSSKASKSSGGRARAADLAI

SEQ ID NO:42 (Человеческий бета Cx26) LCYLLIRYCSGKSKKPV

SEQ ID NO:43 (Человеческий альфа Cx37) GQKPPSRPSSSASKKQ*YV

SEQ ID NO:44 (консервативный вариант Cx43) SSRASSRASSRPRPDDLEV

SEQ ID NO:45 (консервативный вариант Cx43) RPKPDDLEI

SEQ ID NO:46 (консервативный вариант Cx43) SSRASSRASSRPKPDDLEI,

SEQ ID NO:47 (консервативный вариант Cx43) RPKPDDLDI

SEQ ID NO:48 (консервативный вариант Cx43) SSRASSRASSRPRPDDLDI

SEQ ID NO:49 (консервативный вариант Cx43) SSRASTRASSRPRPDDLEI

SEQ ID NO:50 (консервативный вариант Cx43) RPRPEDLEI

SEQ ID NO:51 (консервативный вариант Cx43) SSRASSRASSRPRPEDLEI,

SEQ ID NO:52 (консервативный вариант Cx45) GDGKNSVWV

SEQ ID NO:53 (консервативный вариант Cx45) SKAGSNKSTASSKSGDGKNSVWV

SEQ ID NO:54 (консервативный вариант Cx37) GQKPPSRPSSSASKKLYV

SEQ ID NO:55 (неактивный контрольный пептид) RQPKIWFPNRRKPWKIELDDPRPR

SEQ ID NO:56 (HIV-Tat/ACT 1) GRKKRRQRPPQ RPRPDDLEI

SEQ ID NO:57 (Пенетратин/ACT 1) RQIKIWFQNRRMKWKK RPRPDDLEI

SEQ ID NO:58 (Antp-3A/ACT 1) RQIAIWFQNRRMKWAA RPRPDDLEI

SEQ ID NO:59 (Tat/ACT 1) RKKRRQRRR RPRPDDLEI

SEQ ID NO:60 (Буфорин II/ACT 1)

TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK RPRPDDLEI

SEQ ID NO:61 (Транспортан/ACT 1)

GWTLNSAGYLLGKINKALAALAKKIL RPRPDDLEI

SEQ ID NO:62 (MAP/ACT 1) KLALKLALKALKAALKLARPRPDDLEI

SEQ ID NO:63 (K-FGF/ACT 1) AAVALLPAVLLALLAP RPRPDDLEI

SEQ ID NO:64 (Ku70/ACT 1) VPMLKPMLKERPRPDDLEI

SEQ ID NO:65 (Прион /ACT 1)

MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKPRPRPDDLEI

SEQ ID NO:66 (pVEC/ ACT 1) LLIILRRRIRKQAHAHSK RPRPDDLEI

SEQ ID NO:67 (Pep-1/ACT 1) KETWWETWWTEWSQPKKKRKV RPRPDDLEI

SEQ ID NO:68 (SynB1/ACT 1) RGGRLSYSRRRFSTSTGR RPRPDDLEI

SEQ ID NO:69 (Pep-7/ACT 1) SDLWEMMMVSLACQY RPRPDDLEI

SEQ ID NO:70 (HN-1/ACT 1) TSPLNIHNGQKL RPRPDDLEI

SEQ ID NO:71 (от 20 до 120 остатков, примыкающих к аминокислоте 363 человеческого Cx43) KGKSDPYHATSGALSPAKDCGSQKYAYFNGCSSPTAPLSPMSPPGYKLVTGDRN NSSCRNYNKQASEQNWANYSAEQNRMGQAGSTISNSHAQPFDFPDDNQNSKKL AAGHELQPLAIVDQR

SEQ ID NO:72 (от 20 до 120 остатков, примыкающих к аминокислоте 362 куриного Cx43) KTDPYSHSGTMSPSKDCGSPKYAYYNGCSSPTAPLSPMSPPGYKLVTGDRNNSS CRNYNKQASEQNWANYSAEQNRMGQAGSTISNSHAQPFDFADEHQNTKKLASG HELQPLTIVDQRP

SEQ ID NO:73 (от 20 до 120 остатков, примыкающих к аминокислоте 377 человеческого Cx45) LGFGTIRDSLNSKRRELEDPGAYNYPFTWNTPSAPPGYNIAVKPDQIQYTELSNAK IAYKQNKANTAQEQQYGSHEENLPADLEALQREIRMAQERLDLAVQAYSHQNNPH GPREKKAKV

SEQ ID NO:74 (от 20 до 120 остатков, примыкающих к аминокислоте 375 куриного Cx45) GFGTIRDTLNNKRKELEDSGTYNYPFTWNTPSAPPGYNIAVKPDQMQYTELSNAK MAYKQNKANIAQEQQYGSNEENIPADLENLQREIKVAQERLDMAIQAYNNQNNPG SSSREKKSKA.

SEQ ID NO:75 (от 20 до 120 остатков, примыкающих к аминокислоте 313 человеческого Cx37) PYLVDCFVSRPTEKTIFIIFMLVVGLISLVLNLLELVHLLCRCLSRGMRARQGQDAPP TQGTSSDPYTDQVFFYLPVGQGPSSPPCPTYNGLSSSEQNWANLTTEERLASSR PPLFLDPP

SEQ ID NO:76 (от 20 до 120 остатков, примыкающих к аминокислоте 258 крысиного Cx33) CGSKEHGNRKMRGRLLLTYMASIFFKSVFEVAFLLIQWYLYGFTLSAVYICEQSPC PHRVDCFLSRPTEKTIFILFMLVVSMVSFVLNVIELFYVLFKAIKNHLGNEKEEVYCN PVELQK.

SEQ ID NO:77 (улучшенный зеленый флуоресцентный белок) MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPV PWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFK IRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLE FVTAAGITLGMDELYK

SEQ ID NO:78 (ACT 2) CCCTCCTCCCGGGCCTCCTCCCGGGCCTCCTCCCGGCCCCGGCCCGACGAC CTGGAGATC

SEQ ID NO:79 (ACT 1) CGGCCCCGGCCCGACGACCTGGAGATC

SEQ ID NO:80 (ACT 3) CGGCCCCGGCCCGACGACCTGGAGGTG

SEQ ID NO:81 (ACT 4) CGGCCCCGGCCCGACGACGTGCCCGTG

SEQ ID NO:82 (ACT 5) AAGGCCCGGTCCGACGACCTGTCCGTG

SEQ ID NO:83 (Antp)

CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAG AAG

SEQ ID NO:84 (Antp/ACT 2) CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAGAAGCCCT CCTCCCGGGCCTCCTCCCGGGCCTCCTCCCGGCCCCGGCCCGACGACCTGG AGATC

SEQ ID NO:85 (Antp/ACT 1) CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAGAAGCGG CCCCGGCCCGACGACCTGGAGATC

SEQ ID NO:86 (Antp/ACT 3) CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAGAAGCGG CCCCGGCCCGACGACCTGGAGGTG

SEQ ID NO:87 (Antp/ACT 4) CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAGAAGCGG CCCCGGCCCGACGACGTGCCCGTG

SEQ ID NO:88 (Antp/ACT 5) CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAGAAGAAGG CCCGGTCCGACGACCTGTCCGTG

SEQ ID NO:89 (Альфа-Cx43 данио) PCSRASSRMSSRARPDDLDV

SEQ ID NO:90 (Куриный альфа Cx36) PRVSVPNFGRTQSSDSAYV

SEQ ID NO:91 (Альфа-Cx36 данио) PRMSMPNFGRTQSSDSAYV

SEQ ID NO:92 (Cx43 с делецией изолейцина) RQPKIWFPNRRKPWKKRASSRASSRPRPDDLE

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Целью настоящего изобретения является разработка стабильного, простого и текучего геля для заживления ран, в котором растворен активный фармацевтический ингредиент (API).

Основной проблемой, встречающейся при разработке композиции, является выбор подходящих стабилизаторов для API (ACT1), а также других наполнителей, которые не вызывают раздражения в случае применения для заживления. Исследования проводят с целью анализа опытных композиций.

R&D исследование в соответствии с протоколом №1062

Первое исследование проводят в соответствии с протоколом №1062. В данном исследовании 6 опытных композиций анализируют, как описано в таблице 4. Целью данного исследования является выбор диапазона pH, подходящего для продукта, а также выбор подходящего огеливающего средства. В данном исследовании API используют в концентрации 0,072%, которая представляет собой исходную целевую концентрацию продукта. Анализируют фосфатные буферы, имеющие pH 5, 6 и 7, и два огеливающих средства, Pluronic и гидроксиэтилцеллюлозу (HEC). Количество API, необходимое для получения композиций, рассчитывают следующим образом:

Размер партии для каждой композиции = 12⋅5 г =60 г или 70 г

Количество API для 6 композиций = 6⋅70⋅0,072%/82,4%=0,37 г

Степень чистоты API = 82,4%

Пять композиций, соответствующих формулам от 2414-10 до -14, огеливают Pluronic 127, который принимают за предпочтительное огеливающее средство. Только одну композицию, 2414-15, огеливают HEC, используемой в качестве резервного средства. Результаты испытания стабильности позволяют сделать нижеследующие выводы.

Буфер необходим для регуляции pH гелевой системы и для поддержания стабильности пептидного средства. Подходящий диапазон pH включает в себя значения от 5 до 7. Фосфатный буфер отвечает требованиям.

Неожиданно было обнаружено, что API, ACT1, является более стабильным в геле HEC, чем в гелях Pluronic. При использовании гелей Pluronic количество API уменьшается в среднем до 85% от исходного заявленного значения (LC), если гели хранят при 5°C в течение одного месяца; и до 79%, если гели хранят при 25°C в течение одного месяца. При использовании геля HEC количество API уменьшается до 98% от исходного заявленного значения, если гель хранят при 5°C в течение 3 месяцев, и до 84%, если гель хранят при 25°C в течение трех месяцев.

Результаты сравнения композиций с составом 2414-14 и 2414-15 показывают, что HEC является лучшим выбором огеливающего средства, чем Pluronic. Обе композиции имеют одинаковый состав за исключением того, что композицию 2414-14 огеливают Pluronic, а композицию 2414-15 огеливают HEC. Количество API в композиции 2414-14 уменьшается до 68% от заявленного значения, которое представляет собой исходную концентрацию, после хранения при 5°C в течение одного месяца, тогда как количество API в композиции 2414-15 уменьшается только до 98% от заявленного значения, которое представляет собой исходную концентрацию, после хранения при 5°C в течение 3 месяцев.

EDTA и маннит обеспечивают одинаковую стабильность пептидного лекарственного средства.

Композиции не являются стабильными при 25°C. Может потребоваться замораживание конечного продукта, которое обычно используют для продуктов, содержащих пептиды и белки.

Композиция 2414-15, содержащая HEC в качестве огеливающего средства, является наиболее стабильной композицией по сравнению с остальными тестируемыми композициями. Ее выбирают для дальнейшей разработки. Результаты исследования стабильности композиций 2414-14 и 2414-15 приведены в таблицах 5 и 6 соответственно.

Таблица 4
Исследование стабильности гелевых композиций для заживления ран в соответствии с протоколом №1062 Компоненты
(% масс./масс.) Состав # 2414-10 Состав # 2414-11 Состав # 2414-12 Состав # 2414-13 Состав # 2414-14 Состав # 2414-15 API 0,072 0,072 0,072 0,072 0,072 0,072 Пропиленгликоль 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Глицерин 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Одноосновный фосфат натрия - 0,300 0,263 0,120 0,263 0,263 Двухосновный фосфат натрия - 0,0036 0,044 0,217 0,044 0,044 Метилпарабен 0,17 0,17 0,17 0,17 0,17 0,17 Пропилпарабен 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 Pluronic 127 (Poloxmer 407) 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 - EDTA динатрия - - - - 0,05 0,05 Маннит - - - - 0,05 0,05 Гидроксиэтилцеллюлоза 250 HHX - - - - - 1,25 Очищенная вода q.s. 100 q.s. 100 q.s. 100 q.s. 100 q.s. 100 q.s. 100 Буфер отсутствует Буфер pH 5 Буфер pH 6 Буфер pH 7 Буфер pH 6 Буфер pH 6 Таблица 5
Результаты исследования стабильности композиции 2414-14, содержащей Pluronic 127, в соответствии с протоколом №1062 Условия хранения Момент времени (месяцы) Физические свойства и внешний вид Химический анализ (%, ГХ) API Метилпарабен Пропилпарабен Начальный Прозрачный и бесцветный гель 98,8 92,0 96,6 Замораживание/ оттаивание Соответствует требованиям 89,8 88,6 94,0 5°С 1 Соответствует требованиям 84,6 93,0 97,9 25°С 1/2 Соответствует требованиям 90,6 93,6 98,6 1 Соответствует требованиям 82,8 88,8 94,0

Таблица 6
Результаты исследования стабильности композиции 2414-15, содержащей HEC, в соответствии с протоколом №1062 Условия хранения Момент времени (месяцы) Физические свойства и внешний вид Химический анализ (%, ГХ) API Метилпарабен Пропилпарабен Начальный Прозрачный и бесцветный гель 101,9 97 103,1 Замораживание/ оттаивание Соответствует требованиям 98,8 97,1 103,9 5°С 1 Соответствует требованиям 96 98,1 104,6 3 Соответствует требованиям 99,7 98,3 101,8 25°С 1/2 Соответствует требованиям 91,6 99,7 106,7 1 Соответствует требованиям 93,4 96,8 103 3 Соответствует требованиям 85,7 92,8 96,5

Пример 2

R&D Исследование в соответствии с протоколом №1074

На основании результатов исследования №1062 получают другие опытные композиции на основе состава 2414-15 и анализируют их в соответствии с протоколом №1074. Для данного исследования получают 7 опытных композиций. Цели исследования включают в себя выбор буферной системы и антиоксидантов, подходящих для композиции. Анализируют пять (5) антиоксидантов: маннит, метионин, ацетилцистеин, лизин и гистидин. Используют две буферные системы: фосфатный буфер при pH 6 и цитратный буфер при pH 5. Глицерин (5%) вводят в состав новых опытных композиций, чтобы придать гелю для местного лечения раны некоторую способность к увлажнению. PEG 200 также анализируют на потенциальный стабилизирующий эффект. Составы опытных композиций, анализируемых в исследовании №1074, приведены в таблице 7.

Таблица 7
Состав опытных композиций, используемых в исследовании №1074 Компонент
(% масс./масс.) Состав # 2414- 18 19 20 21 22 23 26 Пептид 328967 (ACT1) 0,036 0,036 0,036 0,036 0,036 0,036 0,036 Пропилен-гликоль 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 - - PEG 200 - - - - - 5,0 5,0 Глицерин 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Одноосновный фосфат натрия 0,263 0,263 0,263 0,263 0,526 - - Двухосновный фосфат натрия 0,044 0,044 0,044 0,044 0,088 - - Лимонная кислота, безводная - - - - - 0,60 0,60 Цитрат натрия, безводный - - - - - 1,73 1,73 Метилпарабен 0,17 0,17 0,17 0,17 0,17 0,17 0,17 Пропилпарабен 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 EDTA динатрия 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 Маннит 0,05 - - - - 0,05 - Метионин - 0,5 0,5 0,5 0,5 - - Ацетилцистеин - - - - 0,2 - - Лизин - - 0,1 - - - 0,1 Гистидин - - - 0,1 - - - Гидроксиэтилцеллюлоза 250 HHX 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 Очищенная вода 100 100 100 100 100 100 100 25 мМ Буфер pH 6 25 мМ Буфер pH 6 25 мМ Буфер pH 6 25 мМ Буфер pH 6 50 мМ Буфер pH 6 100 мМ Буфер pH 5 100 мМ Буфер pH 5

Вследствие ограничений по доступности API, в данном исследовании используют концентрацию API 0,036%. Состав 2414-18 идентичен 2414-15, за исключением того, что концентрацию API уменьшают с 0,072% до 0,036%. Результаты исследования стабильности, полученные в исследовании #1074 и приведенные в таблице 8, позволяют сделать нижеследующие выводы.

Фосфатный буфер обеспечивает более высокую стабильность пептида, чем цитратный буфер. Буферная емкость при 25 мМ является достаточной для системы.

Маннит обеспечивает достаточную стабильность пептида.

Влияние других антиоксидантов остается неясным вследствие вариабельности химических данных.

По результатам исследований, в основном, исследования №1062 и частично исследования №1074, выбирают конечную композицию для дальнейшей разработки. Конечная композиция содержит 25 мМ фосфатный буфер для поддержания pH композиции, маннит в качестве стабилизатора API и HEC в качестве огеливающего средства. Количество пропиленгликоля в опытных композициях увеличивают от 1% до 3%, чтобы обеспечить более высокую солюбилизацию парабенов в водной системе. Выбирают четыре потенциальные концентрации API: 0,0072%, 0,018%, 0,036% и 0,072%. Конечный состав описан в таблице 9. Также определяют стабильность конечных выбранных композиций, содержащих разные уровни API, используя аналитические методы. Кроме того, оценивают общую стабильность путем визуального наблюдения белого порошка или осадка и определяют содержание воды.

Таблица 8
Результаты исследования стабильности композиций 2414-18, 2414-19, 2414-20, 2414-21, 2414-22, 2414-23 и 2414-26 в соответствии с протоколом №1074 Образец Условия хранения Момент времени (месяцы) Физические свойства Внешний вид Химический анализ
(%, ГХ) Метилпарабен Пропилпарабен Композиция 2414-18 Начальный Прозрачный и бесцветный гель 106,4 94,6 102,2 5°С 1 Соответствует требованиям 90,1 83,4 88,2 2 Соответствует требованиям NA NA NA 3 Соответствует требованиям¹ NA NA NA 25°С 1 Соответствует требованиям 94,3 90,4 95,5 2 Соответствует требованиям NA NA NA 3 Соответствует требованиям¹ NA NA NA Композиция 2414-19 Начальный Прозрачный и бесцветный гель 109,3 94,2 119,7 5°С 1 Соответствует требованиям 101,1 90,4 112,6 2 Соответствует требованиям NA NA NA 3 Соответствует требованиям¹ NA NA NA 25°С 1 Соответствует требованиям 103,3 94,6 117,4 2 Соответствует требованиям NA NA NA 3 Соответствует требованиям¹ NA NA NA

Композиция 2414-20 Начальный Прозрачный и бесцветный гель 107,0 96,9 99,9 5°С 1 Соответствует требованиям 106,8 96,7 98,4 2 Соответствует требованиям NA NA NA 3 Соответствует требованиям¹ NA NA NA 25°С 1 Соответствует требованиям 97,9 94,2 95,6 2 Соответствует требованиям NA NA NA 3 Соответствует требованиям¹ NA NA NA Композиция 2414-21 Начальный Прозрачный и бесцветный гель 104,3 95,1 110,4 5°С 1 Соответствует требованиям 96,7 91,5 104,2 2 Соответствует требованиям NA NA NA 3 Соответствует требованиям¹ NA NA NA 25°С 1 Соответствует требованиям 96,4 95,0 108,4 2 Соответствует требованиям NA NA NA 3 Соответствует требованиям¹ NA NA NA Композиция 2414-22 Начальный Прозрачный и бесцветный гель 112,2 96,1 109,4 5°С 1 Соответствует требованиям 111,4 94,9 106,1 2 Соответствует требованиям NA NA NA 3 Соответствует NA NA NA требованиям 25°С 1 Соответствует требованиям 96,5 89,5 100,0 2 Соответствует требованиям NA NA NA 3 Соответствует требованиям NA NA NA Композиция 2414-23 Начальный Прозрачный и бесцветный гель 87,8 94,7 101,6 5°С 1 Соответствует требованиям 88,3 92,9 97,0 2 Соответствует требованиям NA NA NA 3 Соответствует требованиям NA NA NA 25°С 1 Соответствует требованиям 74,4 84,4 88,4 2 Соответствует требованиям NA NA NA 3 Соответствует требованиям NA NA NA Композиция 2414-26 Начальный Прозрачный и бесцветный гель 83,0 95,5 105,9 5°С 1 Соответствует требованиям 78,5 91,0 98,5 2 Соответствует требованиям NA NA NA 3 Соответствует требованиям NA NA NA 25°С 1 Соответствует требованиям 77,4 93,3 100,7 2 Соответствует требованиям NA NA NA 3 Соответствует требованиям NA NA NA ¹ Частицы на дне флакона; NA = данные отсутствуют

В одном варианте осуществления партию лекарственного продукта можно получить с использованием нижеследующих стадий, указанных на блок-схеме способа получения, и композиции, описанной в таблице 9.

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значения, хорошо известные рядовым специалистам в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя здесь описаны предпочтительные способы и материалы, при осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в данном документе. Все цитирующиеся здесь публикации включены в настоящий документ в качестве ссылки с целью раскрытия и описания конкретных аспектов настоящего изобретения.

Обсуждаемые здесь публикации предоставлены исключительно для их раскрытия до даты регистрации настоящей заявки. Ничто здесь не должно быть истолковано как допущение, что настоящее изобретение не наделено правом предшествовать такой публикации на основании предшествующего изобретения.

Хотя изобретение описано в связи с определенным вариантом его осуществления, следует понимать, что его можно подвергать дополнительным модификациям, и данная заявка предназначена для охвата любых изменений, применений или приспособлений настоящего изобретения, удовлетворяющих, в целом, принципам настоящего изобретения, и включает в себя такие отклонения от настоящего описания, которые попадают в рамки известной или обычной практики в области, к которой принадлежит изобретение, и удовлетворяют основным признакам, сформулированным выше, и объему, определенному ниже в приложенной формуле изобретения.

Таблица 9
Качественный и количественный состав геля для заживления ран Ингредиенты Категория Функция Концентрация (% масс./масс.) Грамм/кг партии Пептид 328967 (ACT1) -- Активный ингредиент 0,0072; 0,018 0,036; 0,072 0,072; 0,18 0,36; 0,72 Метилпарабен NF Консервант 0,17 1,7 Пропилпарабен NF Консервант 0,02 0,2 Глицерин USP Растворитель 5 50 Одноосновный фосфат натрия USP Забуферивающее средство 0,263 2,63 Двухосновный фосфат натрия USP Забуферивающее средство 0,044 0,44 Пропиленгликоль USP Растворитель 3 30 Эдетат динатрия (EDTA) USP Хелатирующее средство 0,05 0,5 D-Маннит USP Стабилизатор 0,05 0,5 Гидроксиэтилцеллюлоза, 250HHX NF Огеливающее средство 1,25 12,5 Очищенная вода qsad USP Растворитель 1 1 кг

Группа изобретений относится к медицине и касается композиции для местного применения, содержащей по меньшей мере один полипептид альфа-коннексина и гидроксиэтилцеллюлозный гель, где гидроксиэтилцеллюлозный гель стабилизирует полипептид альфа-коннексина, причем композиция содержит полипептид альфа-коннексина в концентрации от примерно 0,0025% (масс./масс.) до примерно 5,00% (масс./масс.) и гидроксиэтилцеллюлозу в концентрации от примерно 0,5% (масс./масс.) до примерно 2,5% (масс./масс.). Группа изобретений также касается способа лечения ран, включающего в себя введение указанной композиции субъекту, нуждающемуся в этом; способа получения указанной композиции. Группа изобретений обеспечивает стабильность полипептида альфа-коннексина в композиции. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 1 ил., 9 табл., 2 пр.

1. Композиция для местного применения, содержащая по меньшей мере один полипептид альфа-коннексина и гидроксиэтилцеллюлозный гель, где гидроксиэтилцеллюлозный гель стабилизирует полипептид альфа-коннексина, причем композиция содержит полипептид альфа-коннексина в концентрации от примерно 0,0025% (масс./масс.) до примерно 5,00% (масс./масс.) и гидроксиэтилцеллюлозу в концентрации от примерно 0,5% (масс./масс.) до примерно 2,5% (масс./масс.).

2. Композиция для местного применения по п. 1, где гидроксиэтилцеллюлозный гель стабилизирует полипептид альфа-коннексина так, что после 3 месяцев хранения при 5°C с помощью аналитических методов можно детектировать по меньшей мере 98% полипептида альфа-коннексина.

3. Композиция для местного применения по п. 1, где гидроксиэтилцеллюлозный гель стабилизирует полипептид альфа-коннексина так, что после 3 месяцев хранения при 5°C с помощью аналитических методов можно детектировать по меньшей мере 95% полипептида альфа-коннексина.

4. Композиция для местного применения по п. 1, где гидроксиэтилцеллюлоза присутствует в концентрации, составляющей примерно 1,25% (масс./масс.).

5. Композиция для местного применения по п. 1, где по меньшей мере один полипептид альфа-коннексина присутствует в концентрации, составляющей примерно от 0,005% (масс./масс.) до 1,00% (масс./масс.).

6. Композиция для местного применения по п. 1, дополнительно содержащая забуферивающее средство, которое поддерживает pH композиции для местного применения в диапазоне примерно от 5 до 7.

7. Композиция для местного применения по п. 6, где забуферивающее средство представляет собой фосфатный буфер.

8. Композиция для местного применения по п. 1, где по меньшей мере один полипептид альфа-коннексина содержит карбокси-концевой участок, включающий в себя от 4 до 30 смежных аминокислот белка альфа-коннексина или его консервативного варианта.

9. Композиция для местного применения по п. 8, где указанный по меньшей мере один полипептид альфа-коннексина связан по амино-концу с транспортером, обеспечивающим клеточную интернализацию.

10. Композиция для местного применения по п. 9, где транспортер, обеспечивающий клеточную интернализацию, представляет собой последовательность antennapedia.

11. Композиция для местного применения по п. 8, где по меньшей мере один полипептид альфа-коннексина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

12. Композиция для местного применения по п. 8, где полипептид альфа-коннексина представляет собой коннексин 37, коннексин 40, коннексин 43 или коннексин 45.

13. Способ лечения ран, включающий в себя введение композиции для местного применения по п. 1 субъекту, нуждающемуся в этом.

14. Способ по п. 13, где рана представляет собой острую хирургическую рану.

15. Способ по п. 13, где рана представляет собой хроническую, неинфицированную язву нижней конечности на всю толщу кожи.

16. Способ получения композиции для местного применения по п.1, включающий в себя:

a) смешивание пропиленгликоля, глицерина, метилпарабена и пропилпарабена до полного растворения парабенов;

b) отдельное смешивание очищенной воды, EDTA, одноосновного фосфата натрия, двухосновного фосфата натрия и D-маннита до получения прозрачного раствора;

c) добавление раствора, полученного на стадии a), к раствору, полученному на стадии b), ополаскивание очищенной водой контейнера из-под раствора, полученного на стадии a), добавление этой промывочной воды к объединенным растворам и перемешивание до тех пор, пока объединенные растворы не станут гомогенными на вид;

d) при гомогенизирующем перемешивании, добавление гидроксиэтилцеллюлозы к объединенному раствору, полученному на стадии c), и перемешивание до однородного распределения полимера;

e) отдельное смешивание очищенной воды с полипептидом альфа-коннексина до полного растворения пептида;

f) добавление раствора, полученного на стадии e), к раствору, полученному на стадии d), ополаскивание очищенной водой контейнера из-под раствора, полученного на стадии e), добавление этой промывочной воды к объединенным растворам и перемешивание до тех пор, пока объединенные растворы не станут гомогенными.