КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАДИАЦИОННОГО ПОРАЖЕНИЯ И СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ ТКАНИ Российский патент 2022 года по МПК C07K14/46 A61K9/06 A61K38/10 A61K38/17 A61K47/38 A61P39/00 A61P17/02 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В этой заявке испрашивается приоритет по заявке США с № 62/459924, поданной 16 февраля 2017 года, которая таким образом включена посредством ссылки в ее полном объеме.

ОПИСАНИЕ ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА

Сюда посредством ссылки полностью включено содержимое текстового файла, поданного в электронном виде наряду с этой заявкой: Копия в машиночитаемом формате списка последовательностей (имя файла: FIRS_007_01 WO_SeqList_ST25.txt, дата записи: 16 февраля 2017, размер файла 34 килобайта).

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Происходящие события выдвинули на первый план различные террористические действия, которые в конечном итоге могут быть направлены на организацию ядерного взрыва или распространение радиоактивных материалов с использованием устройства для распыления радиологического материала (например, «грязной» бомбы). В таком случае, в дополнение к травматическим повреждениям, вероятно подвергание населения воздействию больших доз внешнего и/или внутреннего ионизирующего излучения. В случае ядерного взрыва воздействие больших внешних доз сильного ионизирующего излучения может привести к появлению симптомов острой лучевой болезни (ARS) в дополнение или независимо от поражения кожи и подлежащих тканей, которое называется радиационным поражением кожи (CRI).

CRI определяется как поражение кожи в результате прямого или косвенного воздействия слабопроникающего излучения. В случае выпадения осадков горячие частицы на коже могут привести к высоким дозам острого локального радиоактивного облучения. Радиоактивное облучение вызывает поражение базальноклеточного слоя кожи и приводит к воспалению, эритеме, десквамации (шелушению), сильному покраснению, образованию пузырей, ослаблению фиброза, инфекции, изъязвлению и некрозу облученной ткани.

ARS описывает один или комбинацию клинических синдромов, возникающих после воздействия ионизирующего излучения. Синдромы ARS включают гемопоэтический синдром, желудочно-кишечный синдром, нейроваскулярный синдром, сердечный синдром и другие, и каждый из этих синдромов может возникнуть отдельно или в сочетании с другими. В ситуации ядерного взрыва радиоактивное облучение часто имеет место в сочетании с другими травматическими повреждениями, такими как ожоги, тупые травмы и открытые раны, которые могут осложняться инфицированием микроорганизмами. Комбинированное радиационное поражение описывает состояния, при которых радиационное поражение сочетается с другими поражениями, такими как ожоги, раны, инфекция или тупая травма.

Радиационный дерматит представляет собой радиационное поражение, которое происходит в результате лучевой терапии, такой как лучевая терапия или химиолучевая терапия, применяемая к субъекту в качестве лечения, например лечения рака. Радиационный дерматит является распространенным побочным эффектом или токсичностью таких терапий. Радиационный дерматит может быть острым, возникающим в течение приблизительно 90 дней после лучевой терапии, и/или хроническим. Проявления радиационного дерматита включают эритему, десквамацию, некроз, изъязвление, атрофию, телеангиэктазии, фиброз и/или другие изменения кожи. В случае тяжелого радиационного дерматит может потребоваться сокращение, прерывание или прекращение схемы лучевой терапии, что может отрицательно повлиять на эффективность лечения рака или другого заболевания.

Хотя ткани человека, поврежденные в результате механического нанесения раны, болезненных процессов и других причин, способны к заживлению, сложная структура и функция ткани редко, почти никогда, восстанавливаются полностью. Вместо этого при восстановлении почти всех тканей от повреждения у людей и других высших позвоночных преобладает образование рубцовой ткани. Наиболее знакомым примером этого являются изменившие цвет и фиброзные рубцы, которые остаются после заживления пореза или ссадины на коже. Во внимание меньше принимается то, что образование рубцовой глиальной ткани после поражения головного или спинного мозга является одним из основных препятствий на пути восстановления нервной функции после поражения центральной нервной системы (Silver and Miller JH, 2004). В настоящее время нет средств для лечения или предотвращения таких рубцов и стимуляции регенерации сложной структуры и функции ткани после поражения.

В данной области техники существует потребность в подходящих терапевтических средствах, которые могут лечить, предотвращать и/или сдерживать прогрессирование радиационного поражения, включая радиационный дерматит, CRI, ARS и их комбинации. Настоящее изобретение направлено на решение этой и других задач.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предоставляется выделенный полипептид, включающий С-концевую (карбоксиконцевую) аминокислотную последовательность альфа-коннексина (также называемую здесь альфа-коннексиновым С-концевым (ACT) полипептидом), или его консервативный вариант. Здесь предоставляется способ предотвращения, уменьшения и лечения радиационного поражения у субъекта, подверженного риску такого поражения, включающий введение субъекту одной или более предоставляемых здесь композиций (например, полипептидов, нуклеиновых кислот или векторов). Например, здесь предоставляются способы предотвращения, сдерживания прогрессирования и лечения радиационного поражения кожи (CRI), острой лучевой болезни (ARS), комбинированного радиационного поражения или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются способы предотвращения, сдерживания прогрессирования и лечения CRI, ARS и/или комбинированного радиационного поражения после воздействия ионизирующего излучения, например, в результате применения устройств для распыления радиологического материала, самодельных ядерных устройств, ядерного оружия или взрывов атомных электростанций. В некоторых вариантах осуществления здесь предоставляются способы предотвращения, сдерживания прогрессирования и лечения радиационного дерматита.

В некоторых вариантах осуществления здесь предоставляются способы предотвращения, сдерживания прогрессирования и лечения радиационного поражения, вызываемого воздействием солнца, рентгеновских и других диагностических устройств, соляриев и других источников ионизирующего излучения. Например, в некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции используются в способе предотвращения или сдерживания прогрессирования таких поражений до воздействия источника ионизирующего излучения или после воздействия, но до или рано после появления симптомов поражения.

В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются способы предотвращения, уменьшения тяжести и лечения радиационного поражения у субъекта, подверженного риску такого поражения, включающие введение субъекту композиции, содержащей выделенный полипептид, включающий полипептид альфа-коннексина. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят до радиоактивного облучения субъекта. В других вариантах осуществления композицию вводят субъекту после радиоактивного облучения субъекта. Например, в некоторых вариантах композицию вводят субъекту через по меньшей мере один день после радиоактивного облучения. В некоторых вариантах осуществления способ предотвращает прогрессирование радиационного поражения. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту местно. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту местно в дозе от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 2000 мкМ. В дальнейших вариантах осуществления композицию вводят субъекту в дозе, составляющей приблизительно 50 мкМ, приблизительно 100 мкМ, приблизительно 150 мкМ, приблизительно 200 мкМ, приблизительно 300 мкМ, приблизительно 400 мкМ, приблизительно 500 мкМ, приблизительно 600 мкМ, приблизительно 700 мкМ, приблизительно 800 мкМ, приблизительно 900 мкМ или приблизительно 1000 мкл. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят по схеме ежедневного введения доз. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту парентерально. В дальнейших вариантах осуществления композицию вводят субъекту внутривенным, подкожным, внутрибрюшинным или внутримышечным путем. Например, в некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту путем внутривенной инъекции, подкожной инъекции, внутрибрюшинной инъекции или внутримышечной инъекции. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту парентерально в дозе от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг. В дальнейших вариантах осуществления композицию вводят субъекту в дозе, составляющей приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 15 мг/кг, приблизительно 20 мг/кг, приблизительно 25 мг/кг, приблизительно 30 мг/кг, приблизительно 35 мг/кг, приблизительно 40 мг/кг, приблизительно 45 мг/кг или приблизительно 50 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят по схеме ежедневного введения доз. В некоторых вариантах осуществления парентеральное введение композиции лечит, предотвращает и/или ингибирует прогрессирование внутреннего радиационного поражения.

В некоторых вариантах осуществления радиационное поражение выбирают из группы, состоящей из CRI, ARS, радиационных ожогов, радиационного дерматита, радиационного поражения нервной системы или головного мозга, радиационного пневмонита, индуцированного облучением энтерита и внутреннего облучения. В некоторых вариантах осуществления радиационное поражение представляет собой CRI. В некоторых вариантах осуществления радиационное поражение представляет собой ARS. В некоторых вариантах осуществления радиационное поражение представляет собой комбинированное радиационное поражение. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления радиационное поражение включает радиационное поражение в сочетании с ожогами, ранами, инфекцией или тупой травмой. В некоторых вариантах осуществления радиационное поражение происходит в результате воздействия источника излучения, выбираемого из группы, состоящей из оружия массового уничтожения (WMD), ядерных взрывов и «грязных» бомб. В некоторых вариантах осуществления радиационное поражение включает радиационный дерматит, который представляет собой специфический тип радиационного поражения, являющего результатом схем лучевой терапии или других интервенционных медицинских процедур. В некоторых вариантах осуществления радиационное поражение происходит в результате воздействия солнца, рентгеновских и других диагностических устройств или источников ионизирующего излучения, таких как солярии. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь пептиды предоставляются в виде композиции (крема) для зашиты от солнца, солнцезащитного крема или композиции в виде лосьона для загара.

В некоторых вариантах осуществления радиационное поражение возникает в ткани, выбираемой из группы, состоящей из кожи, сердца, кости, головного мозга, спинного мозга, роговицы, сетчатки, кроветворной системы, желудочно-кишечной системы и периферического нерва. В конкретных вариантах осуществления радиационное поражение возникает на коже. В некоторых вариантах осуществления средняя оценка поражения кожи снижается на по меньшей мере приблизительно 30% в присутствии полипептида по сравнению с контролем. В некоторых вариантах осуществления полипептид предотвращает образование рубцов. В некоторых вариантах осуществления полипептид стимулирует регенерацию ткани. В некоторых вариантах осуществления полипептид предотвращает поражение ткани.

В некоторых вариантах осуществления полипептид альфа-коннексина включает от 4 до 30 следующих друг за другом аминокислот самого С-конца альфа-коннексина. В некоторых вариантах осуществления полипептид состоит из 5-19 следующих друг за другом аминокислот самого С-конца альфа-коннексина. В некоторых вариантах осуществления альфа-коннексин представляет собой коннексин 37, коннексин 40, коннексин 43 или коннексин 45. В дальнейших вариантах осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5. В некоторых вариантах осуществления полипептид, кроме того, включает последовательность клеточной интернализации. В дальнейших вариантах осуществления последовательность клеточной интернализации включает аминокислотную последовательность белка, выбираемого из группы, состоящей из Антеннапедии (Antennapedia), TAT, HTV-Tat, Пенетратина, Antp-3A (мутанта Antp), Буфорина II, Транспортана, MAP (модельного амфипатического пептида), K-FGF, Ku70, Приона, pVEC, Pep-1, SynB 1, Pep-7, HN-1, BGSC (бис-гуанидиний-спермидин-холестерина) и BGTC (бис-гуанидиний-трен-холестерина). В некоторых вариантах осуществления последовательность клеточной интернализации представляет собой Antennapedia, и причем последовательность включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7. В некоторых вариантах осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12. В некоторых вариантах осуществления полипептид альфа-коннексина включает биотин на N-конце и/или С-конце полипептида. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит SEQ ID NO:91.

В некоторых вариантах осуществления композицию вводят местно. В некоторых вариантах композиция, кроме того, содержит гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы. В дальнейших вариантах осуществления гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы присутствует в концентрации, составляющей приблизительно 0,25% (в весовом отношении), приблизительно 0,5% (в весовом отношении), приблизительно 0,75% (в весовом отношении), приблизительно 1,00% (в весовом отношении), приблизительно 1,25% (в весовом отношении), приблизительно 1,5% (в весовом отношении) или приблизительно 2,0% (в весовом отношении). В некоторых вариантах осуществления композицию вводят системно. Например, в некоторых вариантах осуществления композицию вводят парентерально. В некоторых вариантах осуществления композиция для системного введения, кроме того, содержит один или более фармацевтически приемлемых наполнителей, подходящих для системного введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления композицию можно вводить как местно, так и системно субъекту, нуждающемуся в этом. Например, в некоторых вариантах осуществления субъекту, подвергшемуся радиационному поражению, вводят предоставляемую здесь композицию как местно, так и системно с целью лечения, предотвращения и/или сдерживания прогрессирования как CRI, так и ARS. Например, в некоторых вариантах осуществления субъекту вводят композицию, содержащую предоставляемый здесь полипептид, местно и вводят композицию, содержащую предоставляемый здесь полипептид, системно. В некоторых вариантах осуществления композиции для местного и системного введения содержат один и тот же полипептид альфа-коннексина. В некоторых вариантах осуществления субъекту, подвергшемуся радиационному поражению, вводят предоставляемую здесь композицию как местно, так и системно с целью лечения, предотвращения и/или сдерживания прогрессирование комбинированного радиационного поражения, включающего CRI и/или ARS в сочетании с ожогами, ранами, инфекцией или тупой травмой.

Дополнительные преимущества раскрытого способа и композиций будут частично изложены в последующем описании и частично будут поняты из описания или могут быть изучены при практическом использовании раскрытых способа и композиций. Преимущества раскрытого способа и композиций будут реализованы и достигнуты при помощи элементов и комбинаций, конкретно указанных в прилагаемой формуле изобретения. Следует понимать, что как предшествующее общее описание, так и последующее подробное описание являются лишь примерными и пояснительными и не ограничивают заявленное изобретение.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Прилагаемые чертежи, которые включены в это описание и составляют его часть, иллюстрируют несколько вариантов осуществления раскрытого способа и композиций и вместе с описанием помогают объяснить принципы раскрытого способа и композиций.

Фиг. 1А, 1В и 1С показывают, что местное введение пептида АСТ эффективно в профилактике, уменьшении и лечении радиационного поражения кожи (CRI). Йоркширских свиней анестезировали и подвергали воздействию отдельных фракций электронов низких энергий (6 МэВ). Начиная с дня 1 и затем каждые 3 дня, участки кожи оценивали на эритему и десвамацию с использованием шкалы Кумара. Местное лечение гелем Granexin® (100 мкМ или 200 мкМ) или носителем начинали после замечания появления эритемы (оценка Кумара >1,0) и назначалось один раз в день на участки воздействия. На фиг. 1А продемонстрированы сравнения средних оценок поражения кожи в случае лечения гелем Granexin® (200 мкМ) и лечения носителем. На фиг. 1B показан эффект применения пептида ACT на места проявления поражения. Лечение гелем Granexin® (200 мкМ) (нижний ряд) сравнивали с лечением носителем (верхний ряд) в дни 1, 22 и 31. На фиг. 1C показано окрашивание H&E биоптатов кожи с участков облучения и необлученных контрольных участков, взятых у одного и того же животного в день 43 (конец исследования).

Фиг. 2 демонстрирует профилактическое действие пептида ACT по предотвращению и уменьшению CRI после воздействия. Облучаемые участки обрабатывали профилактически (до появления симптомов CRI) носителем или гелем Granexin® 1000 мкМ (начиная с дня 1; т.е. через день после радиоактивного облучения) по одинаковой схеме ежедневной обработки. Сравнения снимков, сделанных в день 21, показывают, что профилактическая обработка гелем Granexin® в концентрации 1000 мкМ предотвращает прогрессирование поражения и уменьшает степень тяжести поражения по сравнению с носителем в качестве контроля.

Фиг. 3 иллюстрирует схему производственного процесса для пептида ACT настоящего изобретения.

Фиг. 4 показывает, что полипептид ACT1 снижает раннюю смертность в модели облучения с GI-токсичностью. Мыши C57BL/6, ежедневно получавшие системно доставляемый пептид (10 мг/кг), показали более высокую выживаемость по сравнению с мышами, получавшими контрольный физиологический раствор.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Раскрытый способ и композиции могут быть более понятны при обращении к последующему подробному описанию конкретных вариантов осуществления и включенным в него примерам, а также к чертежам и их предшествующему и последующему описанию.

Предоставляется выделенный полипептид, включающий С-концевую аминокислотную последовательность альфа-коннексина (также называемую здесь альфа-коннексиновым С-концевым (ACT) полипептидом), или его консервативный вариант. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции и способы имеют отношение к предотвращению, лечению и/или сдерживанию прогрессирования радиационного поражения. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции и способы имеют отношение к предотвращению, лечению и/или сдерживанию прогрессирования радиационного поражения кожи (CRI). В некоторых вариантах осуществления композиции и способы здесь имеют отношение к предотвращению, лечению и/или сдерживанию прогрессирования острой лучевой болезни (ARS). В некоторых вариантах осуществления композиции и способы здесь имеют отношение к предотвращению, лечению и/или сдерживанию прогрессирования комбинированного радиационного поражения.

Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что предоставляемые здесь композиции и способы способны оказывать профилактическое действие при радиационном поражении. Например, предоставляемые здесь композиции и способы предотвращают CRI, ARS или комбинированное радиационное поражение и/или сдерживают прогрессирование поражения после радиоактивного облучения, но до появления симптомов. Таким образом, предоставляемые композиции и способы могут использоваться для предотвращения, лечения или сдерживания прогрессирования определенных типов радиационного поражения, вызываемого устройствами для распыления радиологического материала, самодельными ядерными устройствами, ядерным оружием, взрывами атомных электростанций и т.п., в популяциях субъектов, подверженных высокому риску воздействия таких устройств, оружия и взрывов, и/или субъектов, которые недавно подверглись такому воздействию.

ARS, CRI и комбинированное радиационное поражение представляют собой конкретные типы радиационного поражения, которые происходят, например, в результате взрыва «грязной» бомбы или взрыва атомной электростанции. В некоторых вариантах осуществления композиции и способ, предоставляемые здесь, имеют отношение к предотвращению, лечению и/или сдерживанию прогрессирования внутреннего радиационное поражения, а также радиационного поражения кожи и подлежащих тканей. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы, предоставляемые здесь, особенно полезны для предотвращения и/или сдерживания прогрессирования CRI и/или ARS и/или комбинированного радиационного поражения в популяциях субъектов, которые подвержены высокому риску возникновения CRI и/или ARS, и/или комбинированного радиационного поражения.

В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции применяются местно по отношению к субъекту с целью лечения, предотвращения и/или сдерживания прогрессирования поражения кожи и подлежащих тканей в результате радиоактивного облучения. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции вводятся субъекту системно с целью лечения, предотвращения и/или сдерживания прогрессирования системного поражения, такого как поражение внутренних органов, которое является результатом радиоактивного облучения. В некоторых вариантах осуществления одному и тому же субъекту вводят одну или более предоставляемых здесь композиций как местно с целью лечения, предотвращения и/или сдерживания прогрессирования поражения кожи и нижележащих тканей, так и системно с целью лечения, предотвращения и/или сдерживания прогрессирования внутреннего поражения (например, поражения системных органов).

Кроме того, неожиданное профилактическое действие предоставляемых способов и композиций полезно для предотвращения, лечения и сдерживания прогрессирования радиационного поражения, которое происходит в результате воздействия солнца, диагностических устройств и соляриев. Диагностические устройства, в которых используется ионизирующее излучение, включают, например, рентгеновские аппараты и компьютерные томографы (КТ). В некоторых вариантах осуществления способы и композиции могут использоваться для предотвращения, лечения или сдерживания прогрессирования радиационного поражения, вызываемого солнцем, диагностическим устройством или солярием, в популяциях субъектов, которые подвержены высокому риску воздействия уровней ионизирующего излучения от солнца, диагностического устройства или солярия, или тех, кто недавно испытал такое воздействие. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиции и способы, предоставляемые здесь, применяются по отношению к субъекту перед воздействием на субъекта солнца, диагностического устройства или солярия и/или применяются по отношению к субъекту после воздействия на субъекта солнца, диагностического устройства или солярия.

В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции находятся в форме солнцезащитного крема или крема для загара или продукта, который доступен на предприятии, которое предоставляет средства для загара и/или услуги солярия (например, лосьон для загара, ускоритель загара или масло для загара). В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются способы и композиции для введения субъекту до использования субъектом солярия или перед воздействием солнца на субъекта с целью предотвращения, лечения или сдерживания прогрессирования радиационного поражения, которое может быть вызвано этим использованием или воздействием. В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются способы и композиции для введения субъекту после использования субъектом солярия или после воздействия солнца на субъекта с целью предотвращения, лечения или сдерживания прогрессирования радиационного поражения, вызываемого этим использованием или воздействием.

В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются способы и композиции для введения субъекту перед воздействием диагностического устройства или процедуры, которое испускает ионизирующее излучение, такого как рентгеновское сканирование или компьютерная томография (КТ), причем способы и композиции предотвращают, лечат или сдерживают прогрессирование радиационного поражения, вызываемого этим воздействием. В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются способы и композиции для введения субъекту после воздействия диагностического устройства или процедуры, которое испускает ионизирующее излучение, причем способы и композиции предотвращают, лечат или сдерживают прогрессирование радиационного поражение, вызываемого этим воздействие.

Кроме того, неожиданное профилактическое действие предоставляемых способов и композиций полезно для предотвращения, лечения и сдерживания прогрессирования радиационного дерматита. Радиационный дерматит происходит в результате лучевой терапии, такой как терапия для лечения таких заболеваний, как рак. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются способы и композиции для введения субъекту после назначения лучевой терапии, с целью предотвращения, лечения или сдерживания прогрессирования радиационного поражения, вызываемого лучевой терапией. В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются способы и композиции для введения субъекту после подвергания лучевой терапии, причем способы и композиции предотвращают, лечат или сдерживают прогрессирование радиационного поражения, вызываемого лучевой терапией. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь способы и композиции назначают субъекту в течение всего курса лечения с помощью лучевой терапии, причем способы и композиции предотвращают, лечат или сдерживают прогрессирование радиационного поражения, вызываемого лучевой терапией. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь способы и композиции назначают субъекту до, во время и/или после курса лучевой терапии, причем способы и композиции предотвращают, лечат или сдерживают прогрессирование радиационного поражения, вызываемого лучевой терапией.

Следует понимать, что раскрытые композиции и способы не ограничиваются конкретными способами синтеза, конкретными аналитическими методами или конкретными реагентами, если не указано иное, и, как таковые, могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения. Раскрыты материалы, композиции и компоненты, которые могут использоваться для раскрытых способов и композиций, могут использоваться в сочетании с ними, могут использоваться для их приготовления или являются их продуктами. Здесь раскрыты эти и другие материалы, и подразумевается, что в случае раскрытия комбинаций, подмножеств, взаимодействий, групп и т.д. этих материалов, то, хотя конкретная ссылка на каждую различную отдельную комбинацию и общие комбинации и перестановки этих соединений может не быть раскрыта в явном виде, каждая комбинация конкретно предусмотрена и описана здесь. Например, если раскрывается и обсуждается вектор, и обсуждается ряд векторных компонентов, включая промоторы, конкретно предусмотрена каждая и всякая комбинация и перестановка промоторов и других векторных компонентов и возможные модификации, если особо не указано обратное. Таким образом, если раскрыт класс молекул A, B и C, а также класс молекул D, E и F, и раскрыт пример комбинированной молекулы, A-D, то даже если каждая комбинация отдельно не указана, каждая предусмотрена отдельно и в совокупности. Таким образом, в этом примере каждая из комбинаций A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E и C-F конкретно предусмотрена и должна считаться раскрытой из раскрытия A, B и C; D, E и F; и примера комбинации A-D. Аналогично, любое подмножество или их комбинация также конкретно предусмотрено и раскрыто. Таким образом, например, подгруппа A-E, B-F и C-E конкретно предусмотрена и должна считаться раскрытой из раскрытия A, B и C; D, E и F; и примера комбинации A-D. Эта концепция применима ко всем аспектам этой заявки, включая, но без ограничения этим, стадии способов изготовления и применения раскрытых композиций. Таким образом, если существует множество дополнительных стадий, которые могут быть выполнены, понятно, что каждая из этих дополнительных стадий может быть выполнена с любым конкретным вариантом осуществления или комбинацией вариантов осуществления раскрытых способов, и что каждая такая комбинация конкретно предусмотрена и должна считаться раскрытой.

Здесь представлено множество последовательностей, и эти и другие последовательности можно найти в Genbank на сайте www.pubmed.gov. Специалисты в данной области техники сведущи в том, как устранить несоответствия и различия в последовательностях и приспособить композиции и способы, относящиеся к конкретной последовательности, к другим родственным последовательностям. Праймеры и/или зонды могут быть сконструированы для любой последовательности с учетом информации, раскрытой здесь и известной в данной области техники.

Предоставляемый здесь полипептид может представлять собой любой полипептид, включающий аминокислоты самого С-конца альфа-коннексина, причем полипептид не включает полноразмерный белок альфа-коннексина. Таким образом, в одном аспекте предоставляемый полипептид не включает цитоплазматический N-концевой домен альфа-коннексина. В другом аспекте предоставляемый полипептид не включает два экстраклеточных домена альфа-коннексина. В другом аспекте предоставляемый полипептид не включает четыре трансмембранных домена альфа-коннексина. В другом аспекте предоставляемый полипептид не включает цитоплазматический петлевой домен альфа-коннексина. В другом аспекте предоставляемый полипептид не включает ту часть последовательности цитоплазматического С-концевого домена альфа-коннексина, которая является ближайшей к четвертому трансмембранному домену. В альфа-коннексинах имеется консервативный остаток пролина или глицина, всяких раз расположенный приблизительно в 17-30 аминокислотах от самой С-концевой аминокислоты (таблица 2). Например, в случае Cx43 человека остаток пролина в положении аминокислоты 363 расположен на 19 аминокислот позади самого С-концевого изолейцина. В другом примере в случае Cx43 цыпленка остаток пролина в положении аминокислоты 362 расположен на 18 аминокислот позади самого С-концевого изолейцина. В другом примере в случае Cx45 человека остаток глицина в положении аминокислоты 377 расположен на 19 аминокислот позади самого С-концевого изолейцина. В другом примере в случае Cx33 крысы остаток пролина в положении аминокислоты 258 расположен на 28 аминокислот позади самого С-концевого метионина. Таким образом, в другом аспекте предоставляемый полипептид не включает аминокислоты, ближайшие к указанному консервативному остатку пролина или глицина альфа-коннексина. Таким образом, предоставляемый полипептид может включать от 4 до 30 аминокислот самого С-конца альфа-коннексина, в том числе 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 аминокислот самого С-конца альфа-коннексина.

Аминокислоты самого С-конца альфа-коннексина в предоставляемых пептидах могут быть фланкированы аминокислотами не альфа-коннексина или не ACT-пептида коннексина. Примеры фланкирующих аминокислот не альфа-коннексина и не ACT коннексина представлены здесь. Примером аминокислот не ACT коннексина являются 20-120 аминокислот С-конца Cx43 человека (SEQ ID NO:72). Другим примером могут быть 20-120 аминокислот С-конца Cx43 цыпленка (SEQ ID NO:73). Другим примером могут быть 20-120 аминокислот С-конца Cx45 человека (SEQ ID NO:74). Другим примером могут быть 20-120 аминокислот С-конца Cx45 цыпленка (SEQ ID NO:75). Другим примером могут быть 20-120 аминокислот С-конца Cx37 человека (SEQ ID NO:76). Другим примером могут быть 20-120 аминокислот С-конца Cx33 крысы (SEQ ID NO:77).

Примером не-альфа-коннексина является 239-аминокислотная последовательность усиленного зеленого флуоресцентного белка. В другом аспекте, учитывая, что ACT1, как установлено, является функциональным при слиянии с С-концом 239-аминокислотной последовательности GFP, ожидается, что пептиды ACT сохранят функцию при их фланкировании неконнексиновыми полипептидами из по меньшей мере до 239 аминокислот. Действительно, пока последовательность ACT сохраняется в виде свободного С-конца данного полипептида, пептид ACT способен достигать свои мишени. Таким образом, полипептиды, превышающие 239 аминокислот, в дополнение к пептиду ACT, могут осуществлять функцию по уменьшению воспаления, стимуляции заживления, повышению прочности на разрыв, уменьшению рубцевания и стимуляции регенерации ткани после поражения.

Коннексины представляют собой субъединичный белок канала межклеточных щелевых контактов, который отвечает за межклеточную связь (Goodenough and Paul, 2003). Основываясь на закономерностях консервативности нуклеотидной последовательности, гены, кодирующие белки коннексины, делятся на два семейства, называемые генами альфа- и бета-коннексинов. Самые С-концевые аминокислотные последовательности альфа-коннексинов характеризуются множеством отличительных и консервативных признаков (смотрите таблицу 2). Такая консервативность организации согласуется со способностью пептидов ACT образовывать характерные трехмерные структуры, взаимодействовать с множеством являющихся их партнерами белков, опосредовать взаимодействия с липидами и мембранами, взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами, включая ДНК, проходить через и/или блокировать мембранные каналы, и обеспечивать консенсусные мотивы для протеолитического расщепления, перекрестного сшивания белков, АДФ-рибозилирования, гликозилирования и фосфорилирования. Таким образом, предоставляемый полипептид взаимодействует с доменом белка, который обычно опосредует связывание указанного белка с С-концом альфа-коннексина. Например, сверхэкспрессируемый в нефробластоме белок (NOV) взаимодействует с C-концевым доменом Cx43 (Fu et al., J Biol. Chem. 2004 279 (35):36943-50). Считается, что этот и другие белки взаимодействуют с С-концом альфа-коннексинов и, кроме того, взаимодействуют с другими белками, образуя макромолекулярный комплекс. Таким образом, предоставляемый полипептид может ингибировать работу молекулярного аппарата, такого как, например, тот, который участвует в регуляции агрегации каналов щелевых контактов Cx43.

Используемые здесь термины «ингибировать», «ингибирующий» и «ингибирование» означает снижение активности, ответа, состояния, заболевания или другого биологического параметра. Это может включать, но без ограничения, полную потерю активности, ответа, состояния или заболевания. Это может также включать, например, снижение активности, ответа, состояния или заболевания на 10% по сравнению с исходным или контрольным уровнем. Таким образом, снижение может составлять 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% или любую степень уменьшения между ними по сравнению с исходным или контрольным уровнями.

Последовательность ACT предоставляемого полипептида может быть из любого альфа-коннексина. Таким образом, альфа-коннексиновый компонент предоставляемого полипептида может быть от человека, мыши, быка, однопроходного, сумчатого, примата, грызуна, китообразного, млекопитающего, птицы, рептилии, земноводного, рыбы, хордового, протохордового или другого альфа-коннексина.

Таким образом, предоставляемый полипептид может включать ACT коннексина, выбираемого из группы, состоящей из коннексина 47 мыши, коннексина 47 человека, коннексина 46.6 человека, коннексина 46.6 коровы, коннексина 30.2 мыши, коннексина 30.2 крысы, коннексина 31.9 человека, коннексина 31.9 собаки, коннексина 44 овцы, коннексина 44 коровы, коннексина 33 крысы, коннексина 33 мыши, коннексина 36 человека, коннексина 36 мыши, коннексина 36 крысы, коннексина 36 собаки, коннексина 36 цыпленка, коннексина 36 полосатого данио, коннексина 35 мороновых, коннексина 35 мороновых, коннексина 35 тритона, коннексина 36 тетраодона, коннексина 37 человека, коннексина 37 шимпанзе, коннексина 37 собаки, коннексина 37 серого хомячка, коннексина 37 мыши, коннексина 37 средних хомяков, коннексина 37 крысы, коннексина 39 мыши, коннексина 39 крысы, коннексина 40.1 человека, коннексина 38 шпорцевых лягушек, коннексина 39.9 полосатого данио, коннексина 40 человека, коннексина 40 шимпанзе, коннексина 40 собаки, коннексина 40 коровы, коннексина 40 мыши, коннексина 40 крысы, коннексина 40 серого хомячка, коннексина 40 цыпленка, коннексина 43 человека, коннексина 43 мартышки, коннексина 43 дикого кролика, коннексина 43 суслика, коннексина 43 серого хомячка, коннексина 43 мохноногого хомячка, коннексина 43 крысы, коннексина 43 свиньи, коннексина 43 средних хомяков, коннексина 43 мыши, коннексина 43 морской свинки, коннексина 43 коровы, коннексина 43 евразийского ежа, коннексина 43 цыпленка, коннексина 43 шпорцевых лягушек, коннексина 43 дикого кролика, коннексина 43 карпа, коннексина 43 полосатого данио, коннексина 43 данио малабарского, коннексина 43.4 полосатого данио, коннексина 44.2 полосатого данио, коннексина 44.1 полосатого данио, коннексина 45 человека, коннексина 45 шимпанзе, коннексина 45 собаки, коннексина 45 мыши, коннексина 45 коровы, коннексина 45 крысы, коннексина 45 цыпленка, коннексина 45 тетраодона, коннексина 45 цыпленка, коннексина 46 человека, коннексина 46 шимпанзе, коннексина 46 мыши, коннексина 46 собаки, коннексина 46 крысы, коннексина 46 средних хомяков, коннексина 46 серого хомячка, коннексина 56 цыпленка, коннексина 39.9 полосатого данио, коннексина 49 коровы, коннексина 50 человека, коннексина 50 шимпанзе, коннексина 50 крысы, коннексина 50 мыши, коннексина 50 собаки, коннексина 49 овцы, коннексина 50 средних хомяков, коннексина 50 серого хомячка, коннексина 50 цыпленка, коннексина 59 человека или другого альфа-коннексина. Аминокислотные последовательности для альфа-коннексинов известны в данной области техники и включают последовательности, идентифицированные в таблице 1 по номеру доступа.

Таблица 1: Альфа-коннексины

Белок № доступа Белок № доступа Коннексин 47 мыши NP_536702 Коннексин 43 мохноногого хомячка AAR33085 Коннексин 47 человека AAH89439 Коннексин 43 крысы AAH81842 Коннексин 46.6 человека AAB94511 Коннексин 43 свиньи AAR33087 Коннексин 46.6 коровы XP_582393 Коннексин 43 средних хомяков AAO61857 Коннексин 30.2 мыши NP_848711 Коннексин 43 мыши AAH55375 Коннексин 30.2 крысы XP_343966 Коннексин 43 морской свинки AAU06305 Коннексин 31.9 человека AAM18801 Коннексин 43 коровы NP_776493 Коннексин 31.9 собаки XP_548134 Коннексин 43 евразийского ежа AAR33083 Коннексин 44 овцы AAD56220 Коннексин 43 цыпленка AAA53027 Коннексин 44 коровы I46053 Коннексин 43 шпорцевых лягушек NP_988856 Коннексин 33 крысы P28233 Коннексин 43 дикого кролика AAS89649 Коннексин 33 мыши AAR28037 Коннексин 43 карпа AAG17938 Коннексин 36 человека Q9UKL4 Коннексин 43 полосатого данио CAH69066 Коннексин 36 мыши NP_034420 Коннексин 43 данио малабарского AAC19098 Коннексин 36 крысы NP_062154 Коннексин 43.4 полосатого данио NP_571144 Коннексин 36 собаки XP_544602 Коннексин 44.2 полосатого данио AAH45279 Коннексин 36 цыпленка NP_989913 Коннексин 44.1 полосатого данио NP_571884 Коннексин 36 полосатого данио NP_919401 Коннексин 45 человека I38430 Коннексин 35 мороновых AAC31884 Коннексин 45 шимпанзе XP_511557 Коннексина мороновых 35 AAC31885 Коннексин 45 собаки XP_548059 Коннексин 35 тритона BAC22077 Коннексин 45 мыши AAH71230 Коннексин 36 тетраодона CAG06428 Коннексин 45 коровы XP_588395 Коннексин 37 человека I55593 Коннексин 45 крысы AAN17802 Коннексин 37 шимпанзе XP_524658 Коннексин 45 цыпленка NP_990834 Коннексин 37 собаки XP_539602 Коннексин 45 тетраодона CAF93782 Коннексин 37 серого хомячка AAR98615 Коннексин 45.6 цыпленка I50219 Коннексин 37 мыши AAH56613 Коннексин 46 человека NP_068773 Коннексин 37 средних хомяков AAS83433 Коннексин 46 шимпанзе XP_522616 Коннексин 37 крысы AAH86576 Коннексин 46 мыши NP_058671 Коннексин 39 мыши NP_694726 Коннексин 46 собаки XP_543178 Коннексин 39 крысы AAN17801 Коннексин 46 крысы NP_077352 Коннексин 40.1 человека NP_699199 Коннексин 46 средних хомяков AAS83437 Коннексин 38 шпорцевых лягушек AAH73347 Коннексин 46 серого хомячка AAS77618 Коннексин 39.9 полосатого данио NP_997991 Коннексин 56 цыпленка A45338 Коннексин 40 человека NP_859054 Коннексин 39.9 полосатого данио NP_997991 Коннексин 40 шимпанзе XP_513754 Коннексин 49 коровы XP_602360 Коннексин 40 собаки XP_540273 Коннексин 50 человека P48165 Коннексин 40 коровы XP_587676 Коннексин 50 шимпанзе XP_524857 Коннексин 40 мыши AAH53054 Коннексин 50 крысы NP_703195 Коннексин 40 крысы AAH70935 Коннексин 50 мыши AAG59880 Коннексин 40 серого хомячка AAP37454 Коннексин 50 собаки XP_540274 Коннексин 40 цыпленка NP_990835 Коннексин 49 овцы AAF01367 Коннексин 43 человека P17302 Коннексин 50 средних хомяков AAS83438 Коннексин 43 мартышки AAR33082 Коннексин 50 серого хомячка AAR98618 Коннексин 43 дикого кролика AAR33084 Коннексин 50 цыпленка BAA05381 Коннексин 43 суслика AAR33086 Коннексин 59 человека AAG09406 Коннексин 43 серого хомячка AAO61858

Таким образом, предоставляемый полипептид может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90 или SEQ ID NO:91 или его консервативные варианты или фрагменты.

Последовательность из 20-30 самых С-концевых аминокислот альфа-коннексинов характеризуется особой и консервативной организацией. Эта особая и консервативная организация должна включать мотив связывания PDZ типа II (Ф-x-Ф; где x=любая аминокислота и Ф=гидрофобная аминокислота; например, таблица 2, с выделением полужирным шрифтом) и ближайшие к этому мотиву, шарнирные остатки пролина (P) и/или глицина (G); встречающиеся с высокой частотой остатки фосфосерина (S) и/или фосфотреонина (T); и встречающиеся с высокой частотой положительно заряженные аминокислоты аргинин (R), лизин (K) и отрицательно заряженные аминокислоты аспарагиновая кислота (D) или глютаминовая кислота (E). В случае многих альфа-коннексинов остатки P и G встречаются в кластерных мотивах (например, в таблице 2, с выделением курсивом), ближайших к С-концевому мотиву связывания PDZ типа II. Фосфоаминокислоты S и T большинства альфа-коннексинов также, как правило, организованы в виде кластерных повторяющихся мотивов (например, таблица 2, с выделением подчеркиванием). Эта организация особенно характерна для Cx43, в случае которой 90% из 20 самых С-концевых аминокислот состоят из последних семи аминокислот. В следующем примере высокой консервативности последовательности, организация пептида ACT Cx43 является высококонсервативной у различных организмов от людей до рыб (например, сравните последовательности ACT Cx43 в случае человека и полосатого данио в таблице 2). В другом примере организация пептида ACT Cx45 является высококонсервативной у различных организмов от людей до птиц (например, сравните последовательности ACT Cx45 в случае людей и цыплят в Таблице 2). В другом примере организация пептида ACT Cx36 является высококонсервативной у различных организмов от приматов до рыб (например, сравните последовательности ACT Cx36 в случае шимпанзе и полосатого данио в таблице 2).

Таблица 2. Альфа-коннексиновые С-концевые (АСТ) аминокислотные последовательности

Ген Последовательность SEQ ID NO Альфа Cx43 человека P SSRA SSR PRP D DLEI (SEQ ID NO:1) Альфа Cx43 цыпленка P S RA SSRA SSR PRP D DLEI (SEQ ID NO:29) Альфа Cx43 полосатого данио P CSRA SSRM SSRA R P D DLDV (SEQ ID NO:90) Альфа Cx45 человека G SNKS TA SSKS GDG KN SVWI (SEQ ID NO:30) Альфа Cx45 цыпленка G SNKSS A SSKS GDG KN SVWI (SEQ ID NO:31) Альфа Cx46 человека G RA SKAS RASS GRARP E DLAI (SEQ ID NO:32) Альфа Cx46.6 человека G SASS RD G K TVWI (SEQ ID NO:33) Альфа Cx36 шимпанзе P RVSV PNFG R TQ SSD SAYV (SEQ ID NO:34) Альфа Cx36 цыпленка P RMSM PNFG R TQ SSD SAYV (SEQ ID NO:35) Альфа Cx36 полосатого данио P RMSM PNFG R TQ SSD S AYV (SEQ ID NO:90) Альфа Cx47 человека P RAGSEK G SASS R DG KT TVWI (SEQ ID NO:36) Альфа Cx40 человека G HRL PHG YHSDKRRL SKASS KARSD DLSV (SEQ ID NO:37) Альфа Cx50 человека P ELTTDDAR P LSRL SKASS RARSD DLTV (SEQ ID NO:38) Альфа Cx59 человека P NHVV SLTN NLI GRRVP T DLQI (SEQ ID NO:39) Альфа Cx33 крысы P S CV SSS A VLTTIC SS DQVV PVG L SS FYM (SEQ ID NO:40) Альфа Cx44 овцы G R SSKA SKSS GG RARAA DLAI (SEQ ID NO:41) Бета Cx26 человека LC YLLIR YCSGK SKKPV (SEQ ID NO:42)

Таким образом, в одном аспекте предоставляемый полипептид включает один, два, три или все аминокислотные мотивы, выбираемые из группы, состоящей из 1) мотива связывания PDZ типа II, 2) шарнирных остатков пролина (P) и/или глицина (G); 3) кластеров из остатков фосфосерина (S) и/или фосфотреонина (T); и 4) встречающихся с высокой частотой положительно заряженных аминокислот аргинина (R) и лизина (K) и отрицательно заряженных аминокислот аспарагиновой кислоты (D) и/или глютаминовой кислоты (E). В другом аспекте предоставляемый полипептид включает мотив связывания PDZ типа II на С-конце, шарнирные остатки пролина (P) и/или глицина (G) вблизи мотива связывания PDZ и положительно заряженные остатки (K, R, D, E) вблизи шарнирных остатков.

PDZ-домены были первоначально идентифицированы как консервативные элементы последовательности в белке постсинаптического уплотнения PSD95/SAP90, супрессоре опухоли Drosophila dlg-A и в белке плотного контакта ZO-1. Хотя первоначально они назывались мотивами GLGF или DHR, теперь они известны под акронимом, представляющим собой эти первые три PDZ-содержащих белка (PSD95/DLG/ZO-1). Эти 80-90-аминокислотные последовательности в настоящее время идентифицированы в более чем 75 белках и типично экспрессируются в нескольких копиях в пределах одного белка. Таким образом, в одном аспекте предоставляемый полипептид может ингибировать связывание альфа-коннексина с белком, включающим PDZ-домен. PDZ-домен представляет собой особый тип модуля взаимодействия с белком, который имеет структурно четко определенный «карман» для взаимодействия, который может быть заполнен мотивом связывания PDZ, называемым здесь «мотивом для PDZ». Мотивы для PDZ представляют собой консенсусные последовательности, которые находятся обычно, но не всегда, на крайнем внутриклеточном С-конце. Классифицированы четыре типа мотивов для PDZ: тип I (S/T-x-Ф), тип II (Ф-x-Ф), тип III (Ψ-x-Ф) и тип IV (D-x-V), где x представляет собой любую аминокислоту, Ф представляет собой гидрофобный остаток (V, I, L, A, G, W, C, M, F), и Ψ представляет собой основный гидрофильный остаток (H, R, K). (Songyang, Z., et al. 1997. Science 275, 73-77). Таким образом, в одном аспекте предоставляемый полипептид включает мотив связывания PDZ типа II.

Следует отметить, что последовательность из 18 самых С-концевых аминокислот альфа-Cx37 представляет собой исключительную вариацию мотива пептида ACT. АСТ-подобная последовательность Cx37 представляет собой GQKPPSRPSSSASKKQ*YV (SEQ ID NO: 43). Таким образом, 4 аминокислоты С-конца Cx37 соответствуют только частично связывающему PDZ типа II домену. Вместо классического связывающего PDZ типа II домена, Cx37 содержит нейтральный Q* в положении 2, в котором можно было бы ожидать гидрофобную аминокислоту. Как таковой, Cx37 содержит то, что можно назвать последовательностью, подобной связывающему PDZ типа II домену. Тем не менее, в Cx37 строго сохраняются все другие аспекты организации пептидов ACT, включая кластерные остатки серина, часто встречающиеся остатки R и K и P-обогащенную последовательность вблизи последовательности, подобной связывающему PDZ домену. Принимая во внимание этот общий уровень консервативности ACT-подобной организации совместно с другими >70 альфа-коннексинами, перечисленными выше, следует понимать, что подобный АСТ Cx37 С-конец функционирует в предусмотренном качестве.

Для сравнения, бета-коннексин Cx26 представлен в таблице 2. Cx26 не имеет С-концевого мотива связывания PDZ типа II; менее 30% самых С-концевых аминокислот включают остатки S, T, R, D или E; в нем нет признаков мотивов вблизи мотива связывания PDZ типа II или подобного ему, содержащего кластеры шарнирных остатков P и G; и нет признаков кластерных повторяющихся мотивов из фосфоаминокислот серина и треонина. Cx26 имеет три остатка лизина (K), сгруппированных один за другим вблизи С-конца последовательности. Однако альфа-коннексин, исследованный в >70 альфа-коннексинах, перечисленных выше, как установлено, не демонстрировал этот признак домена из трех повторяющихся остатков К на С-конце (Cx26 является бета-коннексином, соответственно по определению не имеет ACT-домена).

Как здесь предусмотрено, уникальные функциональные характеристики этого относительно короткого участка аминокислот включают неожиданные роли в уменьшении воспаления, стимуляции заживления, уменьшении рубцевания, повышении прочности на разрыв и стимуляции регенерации сложной структуры и функции ткани после поражения тканей, настолько различных как кожа и головной мозг. Таким образом, в одном аспекте предоставляемый полипептид включает мотив связывания PDZ типа II (Ф-x-Ф; где x=любая аминокислота, и Ф=гидрофобная аминокислота). В другом аспекте, более 50%, 60%, 70%, 80%, 90% аминокислот предоставляемого полипептида ACT включают один или более из остатков аминокислот пролина (P), глицина (G), фосфосерина (S), фосфотреонина (T), аргинина (R), лизина (K), аспарагиновой кислоты (D) или глютаминовой кислоты (E).

Аминокислоты пролин (P), глицин (G), аргинин (R), лизин (K), аспарагиновая кислота (D) и глютаминовая кислота (E) являются необходимыми детерминантами структуры и функции белка. Остатки пролина и глицина обеспечивают крутые повороты в трехмерной структуре белков, обеспечивая образование свернутых конформаций полипептида, необходимых для функционирования. Заряженные аминокислотные последовательности часто находятся на поверхности свернутых белков и необходимы для химических взаимодействий, опосредованных полипептидом, включая белок-белковые взаимодействия, белок-липидные взаимодействия, фермент-субстратные взаимодействия и взаимодействия белок-нуклеиновая кислота. Таким образом, в другом аспекте участки, богатые пролином (P) и глицином (G), лизином (K), аспарагиновой кислотой (D) и глютаминовой кислотой (E), вблизи мотива связывания PDZ типа II, обеспечивают свойства, необходимые для предусмотренных действий пептидов ACT. В другом аспекте предоставляемый полипептид включает участки, богатые пролином (P) и глицином (G), лизином (K), аспарагиновой кислотой (D) и/или глютаминовой кислотой (E), вблизи мотива связывания PDZ типа II.

Фосфорилирование является самой распространенной посттрансляционной модификацией белков и имеет решающее значение для модуляции или модификации структуры и функции белков. Аспекты структуры и функции белка, модифицированного путем фосфорилирования, включают конформацию белка, белок-белковые взаимодействия, белок-липидные взаимодействия, взаимодействия белок-нуклеиновая кислота, воротный механизм каналов, транспорт белков и белковый обмен. Таким образом, в одном аспекте последовательности, богатые фосфосерином (S) и/или фосфотреонином (T), необходимы для модификации функции пептидов ACT, увеличения или уменьшения эффективности полипептидов в предусмотренных для них действиях. В другом аспекте предоставляемый полипептид включает последовательности или мотивы, богатые фосфосерином (S) и/или фосфотреонином (T).

В другом примере, касательно определения пептида ACT, в свете высокой степени способности к регенерации тканей/органов у низших животных, таких как рыба, весьма благоприятно, что метионин встречается вблизи N-конца последовательности ACT Cx43 полосатого данио (таблица 2). В дополнение к кодированию метионина триплет пар оснований для метионина является альтернативным сайтом начала трансляции. Если бы трансляция инициировалась с этого метионина, была бы получена последовательность SSRARPDDLDV (SEQ ID NO:89). В этом продукте трансляции сохранены все консервативные и отличительные признаки канонического пептида ACT. Конкретно, этот пептид включает С-концевой связывающий PDZ типа II домен и содержит домен, богатый остатками P, R и D, вблизи PDZ-связывающего домена. Кроме того, последовательность включает кластерный S-мотив со способностью к модуляции функции пептида ACT на его N-оконце. Это повышает привлекательную перспективу, что животные с высокой способностью к регенерации тканей/органов, такие как рыбы, могут напрямую транслировать последовательности пептидов ACT.

Таким образом, предоставляемый полипептид может включать С-концевую последовательность Cx43 человека. Таким образом, предоставляемый полипептид может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. Полипептид может включать 9 аминокислот С-конца Cx40 человека. Таким образом, полипептид может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5.

При упоминании здесь конкретных белков предусматриваются варианты, производные и фрагменты. Варианты и производные белков хорошо известны специалистам в данной области техники и могут включать модификации аминокислотных последовательностей. Например, модификации аминокислотной последовательности, как правило, подразделяются на один или более из трех классов: служащие заменами, инсерционные или делеционные варианты. Вставки (инсерции) включают слияния с N- и/или C-концами, а также вставки внутрь последовательности одного или множества аминокислотных остатков. Эти вставки обычно будут вставками меньшего размера, чем вставки в виде слияний с N- и/или C-концами, например, порядка от одного до четырех остатков. Делеции характеризуются удалением одного или более аминокислотных остатков из последовательности белка. Эти варианты обычно получают путем сайт-специфического мутагенеза нуклеотидов в ДНК, кодирующей белок, тем самым получая ДНК, кодирующую вариант, и впоследствии экспрессируя ДНК в культуре рекомбинантных клеток. Способы создания мутаций по типу замены в заранее определенных сайтах в ДНК с известной последовательностью хорошо известны и включают, например, мутагенез с использованием праймера M13 и мутагенез с использованием ПЦР. Замены аминокислот, как правило, состоят из отдельных остатков, но могут происходить сразу в ряде различных мест; вставки обычно будут порядка приблизительно 1-10 аминокислотных остатков. Делеции или вставки предпочтительно выполняют связанными парами, т.е. делецию 2 остатков или вставку 2 остатков. Замены, делеции, вставки или любая их комбинация могут быть объединены для получения конечной конструкции. Мутации не должны помещать последовательность вне рамки считывания и, предпочтительно, не будут создавать комплементарные области, которые могли бы создавать вторичную структуру мРНК, если не требуется такое изменение вторичной структуры мРНК. Служащие заменами варианты являются такими, в которых был удален по меньшей мере один остаток, и на его место вставлен другой остаток. Такие замены, как правило, выполняются в соответствии со следующей таблицей 3 и называются консервативными заменами.

Таблица 3. Замены аминокислот

Первоначальный остаток Примеры замен Ala Ser Arg Lys Asn Gln Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Gln Ile Leu; Val Leu Ile; Val Lys Arg; Gln Met Leu; Ile Phe Met; Leu; Tyr Pro Gly Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp; Phe Val Ile; Leu

Например, замена одного аминокислотного остатка другим, который биологически и/или химически подобен, известна специалистам в данной области техники как консервативная замена. Например, в случае консервативной замены будет заменяться один гидрофобный остаток на другой или один полярный остаток на другой. Замены включают комбинации, представленные в таблице 3. Консервативно замещенные варианты каждой явно раскрытой последовательности включены в предоставляемые здесь полипептиды.

Как правило, консервативные замены практически не влияют на биологическую активность получающегося в результате полипептида. В конкретном примере консервативная замена представляет собой аминокислотную замену в пептиде, которая существенно не влияет на биологическую функцию пептида. Пептид может включать одну или более аминокислотных замен, например, 2-10 консервативных замен, 2-5 консервативных замен, 4-9 консервативных замен, например, 2, 5 или 10 консервативных замен.

Можно получить полипептид, содержащий одну или более консервативных замен, путем манипулирования нуклеотидной последовательностью, которая кодирует этот полипептид, используя, например, стандартные процедуры, такие как сайт-специфический мутагенез или ПЦР. Альтернативно, можно получить полипептид, содержащий одну или более консервативных замен, с использованием стандартных методов синтеза пептидов. Сканирование аланином может быть использовано для определения того, какие аминокислотные остатки в белке могут дозволить аминокислотную замену. В одном примере биологическая активность белка снижается не более чем на 25%, например, не более чем на 20%, например, не более чем на 10%, при замене аланином или другой консервативной аминокислотой (такой как те, которые перечисленные ниже), одной или более встречающихся в природе аминокислот.

Дополнительную информацию о консервативных заменах можно найти, среди прочего, в Ben-Bassat et al. (J. Bacteriol. 169:751-7, 1987), O'Regan et al. (Gene 77:237 51, 1989), Sahin Toth et al. (Protein Sci. 3:240-7, 1994), Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321-5, 1988) и в стандартных учебниках по генетике и молекулярной биологии.

Приводящий к замене или делеционный мутагенез может быть использован для вставки сайтов для N-гликозилирования (Asn-X-Thr/Ser) или O-гликозилирования (Ser или Thr). Делеция цистеина или других лабильных остатков также могут быть желательным. Делеции или замены потенциальных сайтов протеолиза, например, Arg, осуществляются, например, путем делеции одного из основных остатков или его замены остатком глютаминилом или гистидилом.

Некоторые посттрансляционные производные являются результатом действия рекомбинантных клеток-хозяев на экспрессированный полипептид. Остатки глютаминил и аспарагинил посттрансляционно часто дезамидируются до соответствующих остатков глютамила и аспарила. Альтернативно, эти остатки дезамидируются в умеренно кислых условиях. Другие посттрансляционные модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила или треонила, метилирование о-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983]), ацетилирование N-концевого амина и, в некоторых случаях, амидирование С-концевого карбоксила.

Понятно, что существует множество аналогов аминокислот и пептидных аналогов, которые могут быть включены в раскрытые композиции. Например, существует множество D-аминокислот или аминокислот, которые имеют функциональный заместитель, отличный от аминокислот, представленных в таблице 3. Описаны оптические стереоизомеры встречающихся в природе пептидов, а также стереоизомеры пептидных аналогов. Эти аминокислоты могут быть легко включены в полипептидные цепи путем загрузки молекул тРНК выбранной аминокислотой и конструирования генетических конструкций, которые используют, например, терминирующие кодоны, для вставки аналоговой аминокислоты в пептидную цепь сайт-специфическим образом (Thorson et al., Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995), Cahill et al., TIBS, 14 (10):400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994); Ibba and Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994), все из которых включены сюда посредством ссылки, по меньшей мере, ради материала, относящегося к аналогам аминокислот).

Могут быть получены молекулы, которые напоминают полипептиды, но которые не связаны через природную пептидную связь. Например, связи для аминокислот или аналогов аминокислот могут включать CH₂NH--, --CH₂S--, --CH₂----, --CH=CH-- (цис- и транс-), --COCH₂--, --CH(OH)CH₂--, и --CHH₂SO-- (Эти и другие могут быть найдены в Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (общий обзор); Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468; Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (--CH₂NH--, CH₂CH₂--); Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986) (--CH H₂--S); Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (--CH----, цис- и транс-); Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (--COCH₂--); Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (--COCH₂--); Szelke et al. European Appln, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (--CH(OH)CH₂--); Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983) (--C(OH)CH₂--); и Hruby Life Sci 31:189-199 (1982) (--CH₂--S--); каждый из которых включен сюда посредством ссылки. Понятно, что пептидные аналоги могут иметь более одного атома между образующими связи атомами, например, β-аланин, γ-аминомасляная кислота и т.п.

Аналоги аминокислот и пептидные аналоги часто имеют улучшенные или желаемые свойства, такие как более бережливое производство, большая химическая стабильность, улучшенные фармакологические свойства (период полураспада, абсорбция, активность, эффективность и т.д.), измененная специфичность (например, широкий спектр биологических активностей), уменьшенная антигенность, большая способность к пересечению биологических барьеров (например, кишечника, кровеносных сосудов, гематоэнцефалического барьера) и другие.

D-аминокислоты могут использоваться для образования более стабильных пептидов, поскольку D-аминокислоты не распознаются пептидазами и т.п. Систематическое замещение одной или более аминокислот консенсусной последовательности на D-аминокислоту того же типа (например, D-лизин вместо L-лизина) может использоваться для получения более стабильных пептидов. Остатки цистеина могут использоваться для циклизации или связывания двух или более пептидов вместе. Это может быть полезным для удержания пептидов в конкретных конформациях (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), который включен сюда посредством ссылки).

Таким образом, предоставляемый полипептид может включать консервативный вариант С-конца альфа-коннексина (ACT). Как показано в таблице 4, пример одной консервативной замены в последовательности SEQ ID NO:2 приведен в последовательности SEQ ID NO:3. Пример трех консервативных замен в последовательности SEQ ID NO:2 приведен в последовательности SEQ ID NO:4. Таким образом, предоставляемый полипептид может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NQ:3 или SEQ TD NO:4.

Таблица 4. Последовательности вариантов полипептида ACT

Последовательность SEQ ID NO RPRPDDLEI SEQ ID NO:2 RPRPDDLEV SEQ ID NO:3 RPRPDDVPV SEQ ID NO:4 SSRASSRASSRPRPDDLEV SEQ ID NO:44 RPKPDDLEI SEQ ID NO:45 SSRASSRASSRPKPDDLEI SEQ ID NO:46 RPKPDDLDI SEQ ID NO:47 SSRASSRASSRPRPDDLDI SEQ ID NO:48 SSRASTRASSRPRPDDLEI SEQ ID NO:49 RPRPEDLEI SEQ ID NO:50 SSRASSRASSRPRPEDLEI SEQ ID NO:51 GDGKNSVWV SEQ ID NO:52 SKAGSNKSTASSKSGDGKNSVWV SEQ ID NO:53 GQKPPSRPSSSASKKLYV SEQ ID NO: 54

Понятно, что одним из способов определения любых вариантов, модификаций или производных раскрытых здесь генов и белков является определение вариантов, модификаций и производных в виде идентичности последовательностей (также называемой здесь гомологией) с конкретными известными последовательностями. В частности, раскрыты варианты раскрытых здесь нуклеиновых кислот и полипептидов, которые имеют по меньшей мере 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% степенью идентичности последовательности с заданной или известной последовательностью. Специалисты в данной области техники легко поймут, как определить идентичность последовательностей двух белков или нуклеиновых кислот. Например, идентичность последовательности может быть вычислена после совмещения двух последовательностей так, чтобы идентичность последовательности находилась на самом высоком уровне.

Другой способ вычисления идентичности последовательности может быть выполнен с помощью опубликованных алгоритмов. Оптимальное совмещение последовательностей для сравнения может быть проведено с помощью алгоритма для определения локальной идентичности последовательностей Smith и Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), с помощью алгоритма совмещения для определения идентичности последовательностей Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), с помощью способа поиска сходства Пирсона-Липмана (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)), с помощью выполнений с использованием вычислительных машин этих алгоритмов (GAP, BESTFTT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI.) или путем проверки. Эти ссылки включены сюда посредством ссылки во всей их полноте ради способов вычисления идентичности последовательностей.

Те же типы идентичности последовательностей могут быть получены для нуклеиновых кислот, например, с помощью алгоритмов, раскрытых в Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Method Enzymol. 83:281-306, 1989, которые включены сюда посредством ссылки, по меньшей мере, ради материала, относящегося к совмещению нуклеиновых кислот.

Таким образом, предоставляемый полипептид может включать аминокислотную последовательность с по меньшей мере 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% степенью идентичности последовательности с C-концом альфа-коннексина (AC). Таким образом, в одном аспекте предоставляемый полипептид включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% степенью идентичности последовательности с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:89 или SEQ ID NO:90. В качестве примера предоставляется полипептид (SEQ ID NO:4) с 66% степенью идентичности последовательности с таким же участком из 9 аминокислот, который присутствует на С-конце Cx43 человека (SEQ ID NO:2).

Предоставляемые здесь полипептиды можно непосредственно добавить в пораженную ткань у субъекта. Однако эффективность цитоплазматической локализации предоставляемого полипептида повышается за счет транспортера для клеточной интернализации, химически связанного в цис- или транс-положении с полипептидом. Эффективность транспортеров для клеточной интернализации дополнительно повышается с помощью света или совместной трансдукции клеток пептидом Tat-HA.

Таким образом, предоставляемый полипептид может включать транспортер для или последовательность клеточной интернализации. Последовательность клеточной интернализации может быть любой последовательностью интернализации, известной или вновь открытой в данной области техники, или ее консервативными вариантами. Неограничивающие примеры транспортеров или последовательностей для клеточной интернализации включают последовательности Антеннапедии (Antennapedia), TAT, HTV-Tat, Пенетратина, Antp-3A (мутанта Antp), Буфорина II, Транспортана, MAP (модельного амфипатического пептида), K-FGF, Ku70, Приона, pVEC, Pep-1, SynB 1, Pep-7, HN-1, BGSC (бис-гуанидиний-спермидин-холестерина) и BGTC (бис-гуанидиний-трен-холестерина) (смотрите таблицу 5).

Таблица 5: Транспортеры для клеточной интернализации

Название Последовательность SEQ ID NO Antp RQPKIWFPNRRKPWKK (SEQ ID NO:7) HIV-Tat GRKKRRQRPPQ (SEQ ID NO:14) Пенетратин RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:15) Antp-3A RQIAIWFQNRRMKWAA (SEQ ID NO:16) Tat RKKRRQRRR (SEQ ID NO:17) Буфорин II TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK (SEQ ID NO:18) Транспортан GWTLNSAGYLLGKINKALAALA KKIL (SEQ ID NO:19) модельный амфипатический пептид (MAP) KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO:20) K-FGF AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO:21) Ku70 VPMLK-PMLKE (SEQ ID NO:22) Прион MANLGYWLLALFVTMWTDVGL CKKRPKP (SEQ ID NO:23) pVEC LLIILRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO:24) Pep-1 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO:25) SynB1 RGGRLSYSRRRFSTSTGR (SEQ ID NO:26) Pep-7 SDLWEMMMVSLACQY (SEQ ID NO:27) HN-1 TSPLNIHNGQKL (SEQ ID NO:28) BGSC (бис-гуанидиний-спермидин-холестерин) BGTC (бис-гуанидиний-трен-холестерин)

Таким образом, предоставляемый полипептид может, кроме того, включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:14 (Bucci, M. et al. 2000. Nat. Med. 6, 1362-1367), SEQ ID NO:15 (Derossi, D., et al. 1994. Biol. Chem. 269, 10444-10450), SEQ ID NO:16 (Fischer, PM et al. 2000. J. Pept. Res. 55, 163-172), SEQ ID NO:17 (Frankel, AD & Pabo, C.O. 1988. Cell 55, 1189-1193; Green, M. & Loewenstein, P.M. 1988. Cell 55, 1179-1188), SEQ ID NO:18 (Park, C.B., et al. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 8245-8250), SEQ ID NO:19 (Pooga, M., et al. 1998. FASEB J. 12, 67-77), SEQ ID NO:20 (Oehlke, J. et al. 1998. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-139), SEQ ID NO:21 (Lin, Y.Z., et al. 1995. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258), SEQ ID NO:22 (Sawada, M, et al. 2003. Nature Cell Biol. 5, 352-357), SEQ ID NO:23 (Lundberg, P. et al. 2002. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90), SEQ ID NO:24 (Elmquist A. et al.., 2001. Exp. Cell Res. 269, 237-244), SEQ ID NO:25 (Morris, MC, et al. 2001. Nature Biotechnol. 19, 1173-1176), SEQ ID NO:26 (Rousselle, C. et al. 2000. Mol. Pharmacol. 57, 679-686), SEQ ID NO:27 (Gao, C. el al. 2002. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-4065) или SEQ ID NO:28 (Hong, FD & Clayman, G.L. 2000. Cancer Res. 60, 6551-6556). Предоставляемый полипептид может, кроме того, включать BGSC (бис-гуанидиний-спермидин-холестерин) или BGTC (бис-гуанидиний-трен-холестерин) (Vigneron, JP et al. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 9682-9686). Предшествующие ссылки включены сюда посредством ссылки во всей их полноте для рекомендации векторов и последовательностей для клеточной интернализации. Любые другие последовательности интернализации, известные сейчас или идентифицированные позднее, могут быть объединены с пептидом настоящего изобретения.

Предоставляемый полипептид может включать любую последовательность ACT (например, любой из пептидов ACT, раскрытых здесь) в комбинации с любой из предоставляемых здесь последовательностей клеточной интернализации. Примеры указанных комбинаций приведены в таблице 6. Таким образом, предоставляемый полипептид может включать последовательность Antennapedia, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7. Таким образом, предоставляемый полипептид может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12.

Таблица 6: Полипептиды ACT с последовательностями клеточной интернализации (CIS).

CIS/ACT Последовательность SEQ ID NO Antp/ACT 2 RQPKIWFPNRRKPWKK PSSRASSRASSRPRPDDLEI SEQ ID NO:8 Antp/ACT 1 RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDLEI SEQ ID NO:9 Antp/ACT 3 RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDLEV SEQ ID NO:10 Antp/ACT 4 RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDVPV SEQ ID NO:11 Antp/ACT 5 RQPKIWFPNRRKPWKK KARSDDLSV SEQ ID NO:12 HIV-Tat/ACT 1 GRKKRRQRPPQ RPRPDDLEI SEQ ID NO:56 Пенетратин/ACT 1 RQIKIWFQNRRMKWKK RPRPDDLEI SEQ ID NO:57 Antp-3A/ACT 1 RQIAIWFQNRRMKWAA RPRPDDLEI SEQ ID NO:58 Tat/ACT1 RKKRRQRRR RPRPDDLEI SEQ ID NO:59 Буфорин II/ACT 1 TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK RPRPDDLEI SEQ ID NO:60 Транспортан/ACT 1 GWTLNSAGYLLGKINKALAALAKKIL RPRPDDLEI SEQ ID NO:61 MAP/ACT 1 KLALKLALKALKAALKLA RPRPDDLEI SEQ ID NO:62 K-FGF/ACT 1 AAVALLPAVLLALLAP RPRPDDLEI SEQ ID NO:63 Ku70/ACT 1 VPMLKPMLKE RPRPDDLEI SEQ ID NO:64 Прион/ACT 1 MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP
RPRPDDLEI SEQ ID NO:65 pVEC/ACT 1 LLIILRRRIRKQAHAHSK RPRPDDLEI SEQ ID NO:66 Pep-1/ACT 1 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV RPRPDDLEI SEQ ID NO:67 SynB1/ACT 1 RGGRLSYSRRRFSTSTGR RPRPDDLEI SEQ D NO:68 Pep-7/ACT 1 SDLWEMMMVSLACQY RPRPDDLEI SEQ ID NO:69 HN-1/ACT 1 TSPLNIHNGQKL RPRPDDLEI SEQ ID NO:70

Также предоставляются выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие предоставляемые здесь полипептиды. Раскрываемые нуклеиновые кислоты состоят, например, из нуклеотидов, аналогов нуклеотидов или заместителей нуклеотидов. Неограничивающие примеры этих и других молекул обсуждаются здесь. Понятно, что, например, когда вектор экспрессируется в клетке, экспрессированная мРНК будет, как правило, состоять из A, C, G и U.

Под «выделенной нуклеиновой кислотой» или «очищенной нуклеиновой кислотой» подразумевается ДНК, которая не содержит генов, которые во встречающемся в природе геноме организма, из которого получена ДНК настоящего изобретению, фланкируют ген. Следовательно, термин включает, например, рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, такой как автономно реплицирующаяся плазмида или вирус; или встраивается в геномную ДНК прокариота или эукариота (например, трансген); или которая существует в виде отдельной молекулы (например, кДНК или геномного фрагмента или фрагмента кДНК, полученного с помощью ПЦР, расщепления рестрикционными эндонуклеазами или химического синтеза или синтеза in vitro). Он также включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительную полипептидную последовательность. Термин «выделенная нуклеиновая кислота» также относится к РНК, например молекуле мРНК, которая кодируется выделенной молекулой ДНК, или которая химически синтезирована, или которая отделена от или по существу не содержит по меньшей мере некоторых клеточных компонентов, например других типов молекул РНК или полипептидных молекул.

Таким образом, предоставляется выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12.

Таким образом, предоставляемая нуклеиновая кислота может включать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87 SEQ ID NO:88 или SEQ ID NO:89.

Предоставляемая здесь нуклеиновая кислота может быть функционально связана с контролирующей экспрессию последовательностью. Также предоставляется вектор, включающий одну или более предоставляемых здесь нуклеиновых кислот, причем нуклеиновая кислота функционально связана с контролирующей экспрессию последовательностью. Существует ряд композиций и способов, которые могут использоваться для доставки нуклеиновых кислот в клетки либо in vitro, либо in vivo. Эти способы и композиции можно в большинстве случаев разделить на два класса: системы доставки на основе вирусов и системы доставки не на основе вирусов. Например, нуклеиновые кислоты могут быть доставлены путем применения ряда систем прямой доставки, таких как электропорация, липофекция, осаждение с использованием фосфата кальция, плазмиды, вирусные векторы, вирусные нуклеиновые кислоты, фаговые нуклеиновые кислоты, фаги, космиды или посредством переноса генетического материала в клетках или носители, такие как катионные липосомы. Подходящие средства для трансфекции, включая вирусные векторы, химические трансфектанты или физико-механические способы, такие как электропорация и прямая диффузия ДНК, описаны, например, Wolff, J.A., et al., Science, 247, 1465-1468 (1990); и Wolff, J.A. Nature, 352, 815-818 (1991). Такие способы хорошо известны в данной области техники и легко приспосабливаются для применения с композициями и способами, описанными здесь. В некоторых случаях способы будут модифицированы, чтобы специфически работать с большими молекулами ДНК. Кроме того, эти способы могут использоваться для целенаправленного воздействия на определенные заболевания и клеточные популяции с использованием таргетирующих характеристик носителя.

Векторы для переноса могут представлять собой любую нуклеотидную конструкцию, используемую для доставки генов в клетки (например, плазмиду), или в виде части общей стратегии для доставки генов, например, в виде части рекомбинантного ретровируса или аденовируса (Ram et al. Cancer Res 53:83-88 (1993).

Как здесь используются, плазмидные или вирусные векторы представляют собой агенты, которые транспортируют раскрытые нуклеиновые кислоты, такие как SEQ ID NO:6, в клетку без деградации и включают промотор, обеспечивающий экспрессию гена в клетках, в которые он доставляется. В некоторых вариантах осуществления промоторы происходят от либо вируса, либо ретровируса. Вирусными векторами являются, например, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус герпеса, вирус коровьей оспы, полиовирус, вирус СПИДа, вирус нейротрофического синдрома, синдром Синдбис и другие РНК-содержащие вирусы, включая эти вирусы на основе ВИЧ. Также раскрыты любые семейства вирусов, которые обладают свойствами этих вирусов, которые делают их подходящими для применения в качестве векторов. Ретровирусы включают вирус лейкоза Малони у мышей, MMLV, и ретровирусы, которые экспрессируют желаемые свойства MMLV, в качестве вектора. Ретровирусные векторы способны переносить больший генетический груз, т.е. трансген или маркерный ген, чем другие вирусные векторы, и по этой причине являются широко используемым вектором. Однако они не так полезны в непролиферирующихся клетках. Аденовирусные векторы относительно стабильны, и с ними легко работать, они имеют высокие титры и могут доставляться в виде аэрозоля и могут трансфицировать неделящиеся клетки. Векторы на основе поксвируса являются большими и имеют несколько сайтов для встраивания генов, они являются термостабильными и могут храниться при комнатной температуре. Также раскрыт вирусный вектор, который был сконструирован так, чтобы подавлять иммунный ответ организма-хозяина, вызываемый вирусными антигенами. Векторы этого типа могут переносить кодирующие интерлейкин 8 или 10 области.

Вирусные векторы могут иметь большие способности к транзакциям (способность к введению генов), чем химические или физические способы введения генов в клетки. Как правило, вирусные векторы содержат неструктурные ранние гены, структурные поздние гены, транскрипт, полученный с помощью РНК-полимеразы III, инвертированные концевые повторы, необходимые для репликации и инкапсулирования, и промоторы для контроля транскрипции и репликации вирусного генома. При конструировании в качестве векторов из вирусов, как правило, удаляют один или более ранних генов, и ген или кассета ген/промотор вставляется в вирусный геном вместо удаленной вирусной ДНК. Конструкции этого типа могут переносить вплоть до 8 т.п.н. чужеродного генетического материала. Необходимые функции удаленных ранних генов, как правило, обеспечиваются клеточными линиями, которые были сконструированы для экспрессии продуктов ранних генов в транс.

Ретровирус представляет собой вирус животных, относящийся к семейству вирусов Retroviridae, включая любые типы, подсемейства, роды или тропизмы. Ретровирусные векторы, в общем, описаны Verma, I. M., Retroviral vectors for gene transfer. In Microbiology-1985, American Society for Microbiology, pp. 229-232, Washington, (1985), который включен сюда посредством ссылки. Примеры способов применения ретровирусных векторов для генной терапии описаны в патентах США с №№ 4868116 и 4980286; РСТ-заявках WO 90/02806 и WO 89/07136; и Mulligan, (Science 260:926-932 (1993)); учения в которых включены сюда посредством ссылки.

Ретровирус, по существу, представляет собой упаковку, которая содержит в себе груз в виде нуклеиновой кислоты. Груз в виде нуклеиновой кислотой переносится вместе с сигналом упаковки, который гарантирует, что реплицированные дочерние молекулы будут эффективно упакованы в упаковочный слой. В дополнение к сигналу упаковки существует ряд молекул, которые необходимы в цис-форме для репликации и упаковки реплицируемого вируса. Как правило, ретровирусный геном содержит гены gag, pol и env, которые участвуют в создании белковой оболочки. Это гены gag, pol и env, которые, как правило, заменяются чужеродной ДНК, которая должна быть перенесена в клетку-мишень. Ретровирусные векторы, как правило, содержат сигнал упаковки для включения в упаковочный слой, последовательность, которая сигнализирует о начале транскрипции единицы транскрипции gag, элементы, необходимые для обратной транскрипции, включая сайт связывания праймера для связывания тРНК-праймера обратной транскрипции, последовательности концевых повторов, которые руководят переключением цепей РНК во время синтеза ДНК, богатую пуринами последовательность 5' от 3' LTR, которая служит в качестве сайта для праймера для синтеза второй цепи ДНК, и специфические последовательности вблизи концов LTR, которые позволяют встраивать структуру ДНК ретровируса в геном хозяина. Удаление генов gag, pol и env позволяет встраивать приблизительно 8 т.п.н. чужеродной последовательности в вирусный геном, осуществлять обратную транскрипцию и после репликации упаковывать в новую ретровирусную частицу. Этого количества нуклеиновой кислоты достаточно для доставки от одного до множества генов в зависимости от размера каждого транскрипта.

Поскольку аппараты для репликации и белки упаковки в большинстве ретровирусных векторов были удалены (gag, pol и env), векторы, как правило, образуются при помещении их в пакующую линию клеток. Пакующая линия клеток представляет собой линию клеток, которая была трансфицирована или трансформирована ретровирусом, который содержит аппарат для репликации и упаковки, но не обладает каким-либо сигналом упаковки. Когда вектор, переносящий выбранную ДНК, трансфицируют в эти линии клеток, вектор, содержащий представляющий интерес ген, реплицируется и упаковывается в новые ретровирусные частицы с помощью аппарата, предоставляемого в цис-форме клеткой-помощником. Геномы для этого аппарата не упаковываются, потому что им не хватает необходимых сигналов.

Было описано конструирование дефектных по репликации аденовирусов (Berkner et al., J. Virology 61:1213-1220 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virology 57:267-274 (1986); Davidson et al., J. Virology 61:1226-1239 (1987); Zhang "Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis" BioTechniques 15:868-872 (1993)). Преимущество использования этих вирусов в качестве векторов заключается в том, что они ограничены в степени, в которой они могут заражать клетки других типов, поскольку они могут реплицироваться в исходной инфицированной клетке, но не способны образовывать новые инфекционные вирусные частицы. Было установлено, что рекомбинантные аденовирусы успешно выполняют перенос генов с высокой эффективностью после прямой доставки in vivo к эпителию дыхательных путей, гепатоцитам, эндотелию сосудов, паренхиме ЦНС и ряду других участков тканей (Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993); Moullier, Nature Genetics 4:154-159 (1993); La Salle, Science 259:988-990 (1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267:25129-25134 (1992); Rich, Human Gene Therapy 4:461-476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994); Guzman, Circulation Research 73:1201-1207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994); Zabner, Cell 75:207-216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993); и Ragot, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993)). Рекомбинантные аденовирусы успешно выполняют трансдукцию генов путем связывания со специфическими рецепторами клеточной поверхности, после чего вирус интернализуется с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза, так же, как аденовирус дикого типа или дефектный по репликации аденовирус (Chardonnet and Dales, Virology 40:462-477 (1970); Brown and Burlingham, J. Virology 12:386-396 (1973); Svensson and Persson, J. Virology 55:442-449 (1985); Seth, et al., J. Virol. 51:650-655 (1984); Seth, et al., Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533 (1984); Varga et al., J. Virology 65:6061-6070 (1991); Wickham et al., Cell 73:309-319 (1993)).

Вирусный вектор может представлять собой вектор на основе аденовируса, у которого удален ген E1, и эти вироны образуются в линии клеток, такой как линия клеток 293 человека. В одном аспекте оба гена E1 и E3 удалены из генома аденовируса.

Другой тип вирусного вектора основан на аденоассоциированном вирусе (AAV). Этот дефектный парвовирус может инфицировать многие типы клеток и является непатогенным для человека. Векторы AAV-типа могут переносить приблизительно 4-5 т.п.н., и известно, что AAV дикого типа стабильно встраивается в хромосому 19. В качестве примера, этот вектор может представлять собой вектор P4.1 C, производимый Avigen, San Francisco, Calif, который может содержать ген тимидинкиназы вируса простого герпеса, HSV-tk, и/или маркерный ген, такой как ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок, GFP.

В другом типе вируса AAV, AAV содержит пару инвертированных концевых повторов (ITR), которые фланкируют по меньшей мере одну кассету, содержащую промотор, который управляет клеточноспецифической экспрессией, функционально связанный с гетерологичным геном. Гетерологичный в этом контексте относится к любой нуклеотидной последовательности или гену, которая не является родной для паровируса AAV или B19.

Как правило, кодирующие области AAV и B19 удаляются, что приводит к безопасному, не обладающему цитотоксичностью вектору. ITR AAV или их модификации обеспечивают инфективность и сайт-специфическую интеграцию, но не цитотоксичность, и промотор управляет клеточноспецифической экспрессией. Патент США с № 6261834 включен сюда посредством ссылки ради материала, относящегося к вектору AAV.

Таким образом, раскрытые векторы обеспечивают молекулы ДНК, которые способны интегрироваться в хромосому млекопитающего без существенной токсичности.

Вставленные гены в вирусном и ретровирусном векторе обычно содержат промоторы и/или энхансеры, которые помогают контролировать экспрессию желаемого продукта гена. Промотор, как правило, представляет собой последовательность или последовательности ДНК, которые функционируют, когда находятся в относительно фиксированном положении относительно сайта начала транскрипции. Промотор содержит основные элементы, необходимые для основного взаимодействия РНК-полимеразы и факторов транскрипции, и может содержать 5’ элементы и элементы ответа.

Молекулярно-генетические эксперименты с крупными вирусами герпеса человека обеспечили средство, с помощью которого большие гетерологичные фрагменты ДНК можно клонировать, размножать и устанавливать в клетках, допускающих инфицирование вирусами герпеса (Sun et al., Nature Genetics 8:33-41, 1994; Cotter and Robertson, Curr Opin Mol Ther 5:633-644, 1999). Эти крупные ДНК-содержащие вирусы (вирус простого герпеса (HSV) и вирус Эпштейна-Барр (EBV)) способны доставлять фрагменты гетерологичной ДНК человека >150 т.п.н. в определенные клетки. Рекомбинанты EBV могут сохранять большие куски ДНК в инфицированных B-клетках в виде эписомной ДНК. Отдельные клоны, несущие вставки генома человека размером вплоть до 330 т.п.н., казались генетически стабильными. Для сохранения этих эписом необходим специфический ядерный белок EBV, EBNA1, конститутивно экспрессируемый во время инфицирования EBV. Кроме того, эти векторы могут использоваться для трансфекции, когда большие количества белка могут транзиторно образовываться in vitro. Системы ампликонов вируса простого герпеса также используются для упаковки кусков ДНК >220 т.п.н. и для инфицирования клеток, которые могут стабильно сохранять ДНК в виде эписом.

Другие применимые системы включают, например, реплицирующиеся и ограниченные кругом хозяев нереплицирующиеся векторы на основе вируса коровьей оспы.

Раскрытые композиции могут доставляться к клеткам-мишеням различными путями. Например, композиции могут быть доставлены путем электропорации, или путем липофекции, или путем преципитации с использованием фосфата кальция. Выбранный механизм доставки будет зависеть отчасти от типа клетки-мишени и от того, происходит ли доставка, например, in vivo или in vitro.

Таким образом, композиции могут содержать, помимо раскрытых полипептидов, нуклеиновых кислот или векторов, например, липиды, такие как липосомы, такие как катионные липосомы (например, DOTMA, DOPE, DC-холестерин) или анионные липосомы. Липосомы могут, кроме того, включать белки для облегчения нацеливания на конкретную клетку, если это желательно. Композиция, содержащая соединение и катионную липосому, может вводиться в кровь афферентно к органу-мишени или вдыхаться в дыхательные пути для таргетирования клеток дыхательных путей. Относительно липосом смотрите, например, Brigham et al. Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1:95-100 (1989); Feigner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987); патент США с № 4897355. Кроме того, соединение может вводиться в виде компонента микрокапсулы, которая может быть нацелена на конкретные типы клеток, такие как макрофаги, или когда диффузия соединения или доставка соединения из микрокапсулы рассчитана на конкретную скорость или дозу.

В описанных выше способах, которые включают введение и поглощение экзогенной ДНК в клетки субъекта (т.е. трансдукцию или трансфекцию генов), доставка композиций к клеткам может осуществляться с помощью ряда механизмов. В качестве одного примера, доставка может осуществляться через липосому с использованием коммерчески доступных липосомных препаратов, таких как L1POFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, Md.), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Германия) и TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI.), а также другие липосомы, разработанные в соответствии со стандартными в данной области техники процедурами. Кроме того, раскрытая нуклеиновая кислота или вектор могут доставляться in vivo путем электропорации, технология которой доступна от Genetronics, Inc. (San Diego, Calif.), а также с помощью аппарата SONOPORATION (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, Ariz.).

Доставляемые в клетки нуклеиновые кислоты, которые должны быть интегрированы в геном клетки-хозяина, обычно содержат последовательности интеграции. Эти последовательности часто являются относящимися к вирусам последовательностями, особенно когда используются системы на основе вирусов. Эти системы вирусной интеграции также могут быть включены в нуклеиновые кислоты, которые должны быть доставлены с использованием системы доставки, не основанной на нуклеиновых кислотах, такой как липосома, так что нуклеиновая кислота, содержащаяся в системе доставки, может интегрироваться в геном хозяина.

Другие общие методы интеграции в геном хозяина включают, например, системы, предназначенные для стимулирования гомологичной рекомбинации с геномом хозяина. Эти системы, как правило, основываться на фланкирующей нуклеиновую кислоту, которая должна быть экспрессирована, последовательности, которая имеет достаточную степень гомологии с последовательностью-мишенью в геноме клетки-хозяина, чтобы происходила рекомбинация между векторной нуклеиновой кислотой и нуклеиновой кислотой-мишенью, вызывая интеграцию доставленной нуклеиновой кислоты в геном хозяина. Эти системы и способы, необходимые для стимулирования гомологичной рекомбинации, известны специалистам в данной области техники.

Композиции могут быть доставлены в клетки субъекта in vivo и/или ex vivo с помощью ряда механизмов, хорошо известных в данной области техники (например, поглощения голой ДНК, слияние липосом, внутримышечной инъекции ДНК с помощью генной пушки, эндоцитоза и т.п.).

Если используются способы ex vivo, клетки или ткани могут быть извлечены и сохранены вне организма в соответствии со стандартными протоколами, хорошо известными в данной области техники. Композиции могут быть введены в клетки с помощью любого механизма переноса генов, такого как, например, доставка генов, опосредованная фосфатом кальция, электропорация, микроинъекция или протеолипосомы. Затем трансдуцированные клетки могут быть инфузированы (например, в фармацевтически приемлемом носителе) или гомотопически трансплантированы обратно субъекту стандартными способами для типа клеток или тканей. Стандартные способы известны для трансплантации или инфузии различных клеток субъекту.

Как правило, нуклеиновые кислоты, которые доставляются в клетки, содержат контролирующие экспрессию системы. Например, встроенные гены в вирусных и ретровирусных системах обычно содержат промоторы и/или энхансеры, чтобы помочь контролировать экспрессию желаемого продукта гена. Промотор, как правило, представляет собой последовательность или последовательности ДНК, которые функционируют, когда находятся в относительно фиксированном положении относительно сайта начала транскрипции. Промотор содержит основные элементы, необходимые для основного взаимодействия РНК-полимеразы и факторов транскрипции, и может содержать 5’ элементы и элементы ответа.

Промоторы, контролирующие транскрипцию с векторов в клетках млекопитающих-хозяевах, могут быть получены из различных источников, например, геномов вирусов, таких как: полиомавирус, вакуолизирующий обезьяний вирус (SV40), аденовирус, ретровирусы, вирус гепатита В, цитомегаловирус или из гетерологичных промоторов млекопитающих, например, промотора бета-актина. Ранние и поздние промоторы вируса SV40 удобно получать в виде рестрикционного фрагмента SV40, который также содержит начало репликации вируса SV40 (Fiers et al., Nature, 273:113 (1978)). Немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека удобно получать в виде HindIII E-рестрикционного фрагмента (Greenway, P.J. et al., Gene 18:355-360 (1982)). Конечно, здесь также применимы промоторы из клетки-хозяина или родственных видов.

Энхансер, как правило, относится к последовательности ДНК, которая функционирует на фиксированном расстоянии от сайта начала транскрипции и может находится либо 5' (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:993 (1981)), либо 3' (Lusky, M.L., et al., Mol. Cell. Bio. 3:1108 (1983)) относительно единицы транскрипции. Кроме того, энхансеры могут находиться в интроне (Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 (1983)), а также в самой кодирующей последовательности (Osborne, T.F. et al., Mol. Cell. Bio. 4:1293 (1984)). Их длина обычно составляет от 10 до 300 п.н., и они функционируют в цис-положении. Энхансеры функционирую для увеличения транскрипции с ближайших промоторов. Энхансеры также часто содержат элементы ответа, которые опосредуют регуляцию транскрипции. Промоторы также могут содержать элементы ответа, которые опосредуют регуляцию транскрипции. Энхансеры часто определяют регуляцию экспрессии гена. Хотя множество энхансерных последовательностей в настоящее время известно из генов млекопитающих (глобина, эластазы, альбумина, α-фетопротеина и инсулина), для общей экспрессии обычно будет использоваться энхансер из вируса эукариотических клеток. Примерами являются энхансер SV40 на поздней стороне начала репликации (п.о. 100-270), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомавируса на поздней стороне от начала репликации и энхансеры аденовируса.

Промотор и/или энхансер могут быть специфически активированы либо светом, либо специфическими химическими актами, которые запускают их функцию. Системы могут регулироваться такими реагентами, как тетрациклин и дексаметазон. Существуют также способы усиления экспрессии гена вирусного вектора с помощью облучения, такого как гамма-облучение, или воздействия алкилирующих химиотерапевтических средств.

В некоторых вариантах осуществления промоторная и/или энхансерная область может действовать как конститутивный промотор и/или энхансер для максимизации экспрессии области единицы транскрипции, которая должна быть транскрибирована. В некоторых конструкциях промоторная и/или энхансерная область будет активной во всех типах эукариотических клеток, даже если она экспрессируется только в конкретном типе клеток в конкретное время. Промотором этого типа является промотор CMV (650 оснований). Другими такими промоторами являются промоторы SV40, цитомегаловируса (полноразмерный промотор) и LTR ретровирусного вектора.

Было показано, что все специфические регуляторные элементы могут быть клонированы и использованы для конструирования экспрессионных векторов, которые селективно экспрессируются в определенных типах клеток, таких как клетки меланомы. Промотор глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) был использован для селективной экспрессии генов в клетках глиального происхождения.

Экспрессионные векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (дрожжевых клетках, клетках грибов, насекомых, растений, животных, человека или ядросодержащих клетках), также могут содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции, которые могут влиять на экспрессию мРНК. Эти области транскрибируются в виде полиаденилированных сегментов в нетранслируемой части мРНК, кодирующей белок тканевого фактора. 3'-нетранслируемые области также включают сайты терминации транскрипции. Единица транскрипции также может содержать область полиаденилирования. Одной пользой этой области является то, что она увеличивает вероятность того, что транскрибированная единица будет процессироваться и транспортироваться как мРНК. Идентификация и использование сигналов полиаденилирования в экспрессионных конструкциях хорошо известны. Гомологичные сигналы полиаденилирования могут быть использованы в трансгенных конструкциях. В некоторых единицах транскрипции область полиаденилирования происходит от сигнала полиаденилирования раннего гена SV40 и состоит из приблизительно 400 оснований. Транскрибированные единицы могут содержать другие стандартные последовательности отдельно или в комбинации с вышеуказанными последовательностями, увеличивающими экспрессию или стабильность конструкции.

Вирусные векторы могут включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую маркерный продукт. Этот маркерный продукт используется для определения того, доставлен ли ген в клетку, и экспрессируется ли он после доставки. Примерами маркерных генов являются ген lacZ E.coli, который кодирует β-галактозидазу, и зеленый флуоресцентный белок.

В некоторых вариантах осуществления маркер может быть селектируемым маркером. Примерами подходящих селектируемых маркеров для клеток млекопитающих являются дигидрофолатредуктаза (DHFR), тимидинкиназа, неомицин, аналог неомицина G418, гидромицин и пуромицин. Когда такие селектируемые маркеры успешно переносятся в клетку млекопитающего-хозяина, трансформированная клетка млекопитающего-хозяина может выжить, если находится под селективным давлением. Существуют два широко используемых различных вида схем селекции. Первый вид основан на клеточном метаболизме и использовании мутантной клеточной линии, у которой отсутствует способность к росту независимо от дополненной среды. Два примера: DHFR-клетки яичника китайского хомячка (CHO) и LTK-клетки мыши. У этих клеток отсутствует способность к росту без добавления таких питательных веществ, как тимидин или гипоксантин. Поскольку в этих клетках отсутствуют определенные гены, необходимые для полного пути синтеза нуклеотидов, они не могут выжить, если отсутствующие нуклеотиды не будут предоставлены в дополненной среде. Альтернативой дополнению среды является введение интактного гена DHFR или TK в клетки, в которых отсутствуют соответствующие гены, что изменяет их требования к росту. Отдельные клетки, которые не были трансформированы геном DHFR или TK, не будут способны выживать в средах без добавок.

Второй вид представляет собой доминантный отбор, который относится к схеме отбора, используемой в клетках любого типа, и не требует использования мутантной линии клеток. В этих схемах, как правило, используется лекарственное средство для остановки роста клетки-хозяина. Те клетки, которые имеют новый ген, будут экспрессировать белок, придающий лекарственную устойчивость, и выживать при отборе. В примерах такого доминантного отбора используются лекарственные средства неомицин (Southern P. and Berg P., J. Molec. Appl. Genet. 1:327 (1982)), микофеноловая кислота (Mulligan R.C. and Berg P. Science 209:1422 (1980)) или гигромицин (Sugden B. et al., Mol. Cell. Biol. 5:410-413 (1985)). В трех примерах используются бактериальные гены под эукатиотическим контролем для придания устойчивости к соответствующему лекарственному средству G418 или неомицину (генетицину), xgpt (микофеноловой кислоте) или гигромицину, соответственно. Другие включают аналог неомицина G418 и пурамицин.

Также предоставляется клетка, содержащая один или более из предоставляемых здесь векторов. Как здесь используется, «клетка», «клеточная линия» и «культура клеток» могут использоваться взаимозаменяемо, и все такие названия включают потомство. Раскрытая клетка может быть любой клеткой, используемой для клонирования или размножения предоставляемых здесь векторов. Таким образом, клетка может быть из любой первичной клеточной культуры или установленной клеточной линии. Способ может быть применен к любой клетке, в том числе прокариотической или эукариотической, такой как бактериальная клетка, клетка растения, животного и т.п. Тип клетки может быть выбран специалистом в данной области техники на основании выбора вектора и желаемого применения.

Раскрыты животные, получаемые в результате процесса трансфекции клетки внутри организма животного любой из молекул нуклеиновой кислоты или векторов, раскрытых здесь. Раскрыты животные, получаемые в результате процесса трансфекции клетки внутри организма животного любой из молекул нуклеиновой кислоты или векторов, раскрытых здесь, причем животным является млекопитающее. Также раскрыты животные, получаемые в результате процесса трансфекции клетки внутри организма животного любой из молекул нуклеиновой кислоты или векторов, раскрытых здесь, причем млекопитающим является мышь, крыса, кролик, корова, овца, свинья или примат.

Предоставляется композиция, содержащая один или более из предоставляемых здесь полипептидов, нуклеиновых кислот или векторов в фармацевтически приемлемом носителе. Таким образом, предоставляется композиция, содержащая комбинацию двух или более любых из предоставляемых здесь полипептидов АСТ в фармацевтически приемлемом носителе. Например, предоставляется композиция, содержащая SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:5 в фармацевтически приемлемом носителе.

Под «фармацевтически приемлемым» подразумевается материал, который не является биологически или иным образом нежелательным, т.е. материал может быть введен субъекту вместе с нуклеиновой кислотой или вектором без вызова каких-либо нежелательных биологических эффектов или взаимодействия отрицательным образом с любым из других компонентов фармацевтической композиции, в которой оно содержится. Носитель, естественно, будет выбираться с целью минимизации любой деградации активного ингредиента и минимизации любых неблагоприятных побочных эффектов у субъекта, как это хорошо известно специалисту в данной области техники.

Предоставляемая здесь композиция может, кроме того, содержать любое известное или вновь открытое вещество, которое можно вводить в рану, повреждение ткани, очаг воспаления или рак. Например, предоставляемая композиция может, кроме того, содержать один или более классов антибиотиков (например, аминогликозиды, цефалоспорины, хлорамфеникол, клиндамицин, эритромицины, фторхинолоны, макролиды, азолиды, метронидазол, пенициллин, тетрациклины, триметоприм-сульфаметоксазол, ванкомицин), стероиды (например, андраны (например, тестостерон), холестаны (например, холестерин), холевые кислоты (например, холевую кислоту), кортикостероиды (например, дексаметазон), эстрагены (например, эстрадиол), прегнаны (например, прогестерон), наркотические и ненаркотические анальгетики (например, морфин, кодеин, героин, гидроморфон, леворфанол, меперидин, метадон, оксидон, пропоксифен, фентанил, метадон, налоксон, бупренорфин, буторфанол, налбуфин, пентазоцин), химиотерапию (например, противораковые средства, такие как, но без ограничения, алтретамин, аспарагиназу, блеомицин, бусульфан, карбоплатин, каррунстин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, диэтилстилбестерол, этинилэстрадиол, этопозид, флоксуридин, флударабин, фторурацил, флутамид, гозерелин, гидроксимочевину, идарубицин, ифосфамид, леупролид, левамизол, ломустин, мехлоретамин, медроксипрогестерон, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, митомицин, митотан, митоксантрон, паклитаксел, пентастатин, пипоброман, пликамицин, преднизон, прокарбазин, стрептозоцин, тамоксифен, тенипозид, винбластин, винкристин), противовоспалительные средства (например, алклофенак; алклометазона дипропионат; алгестон ацетонид; альфа-амилазу; амцинафал; амцинафид; амфенак натрия; амиприлозы гидрохлорид; анакинру; аниролак; анитразафен; апазон; бальсалазид динатрия; бендазак; беноксапрофен; бензидамина гидрохлорид; бромелаины; броперамол; будесонид, карпрофен, циклопрофен, цинтазон, клипрофен, клобетазола пропионат; клобетазона бутират; клопирак; клотиказона пропионат; корметазона ацетат; кортодоксон; деканоат; дефлазакорт; делатестрил; депо-тестостерон; десонид; дезоксиметазон; дексаметазона дипропионат; диклофенак калия; диклофенак натрия; дифлоразона диацетат; дифлумидон натрия; дифлунизал; дифлупреднат; дифталон; диметилсульфоксид; дроцинонид; эндризон; энлимомаб; эноликам натрия; эпиризол; этодолак; этофенамат; фелбинак; фенамол; фенбуфен; фенклофенак; фенклорак; фендозал; фенпипалон; фентиазак; флазалон; флуазакорт; флуфенамовую кислоту; флумизол; флунизолида ацетат; флуниксин; флуниксин меглумин; флуокортинбутил; фторметолона ацетат; флуквазон; флурбипрофен; флуретофен; флутиказона пропионат; фурапрофен; фуробуфен; галцинонид; галобетазола пропионат; галопредона ацетат; ибуфенак; ибупрофен; ибупрофен алюминия; ибупрофен-пиконол; илонидап; индометацин; индометацин натрия; индопрофен; индоксол; интразол; изофлупредона ацетат; изоксепак; изоксикам; кетопрофен; лофемизола гидрохлорид; ломоксикам; лотепреднол этабонат; меклофенамат натрия; меклофенамовую кислоту; меклоризона дибутират; мефенамовую кислоту; месаламин; месеклазон; местеролон; метандростенолон; метенолон; метенолона ацетат; метилпреднизолона сулептанат; морнифлумат; набуметон; нандролон; напроксен; напроксен натрия; напроксол; нимазон; олсалазин натрия; орготеин; орпаноксин; оксандролан; оксапрозин; оксифенбутазон; оксиметолон; паранилина гидрохлорид; пентосан полисульфат натрия; фенбутазона натрия глицерат; пирфенидон; пироксикам; пироксикам циннамат; пироксикам оламин; пирпрофен; предназат; прифелон; продоловую кислоту; проквазон; проксазол; цитрат проксазола; римексолон; ромазарит; салколекс; салнацедин; салсалат; сангвинария хлорид; секлазон; серметацин; станозолол; судоксикам; сулиндак; супрофен; талметацин; талнифлумат; талосалат; тебуфелон; тенидап; тенидап натрия; теноксикам; тесикам; тесимид; тестостерон; смеси эфиров тестостерона; тетридамин; тиопинак; тиксокортол пивалат; толметин; толметин натрия; триклонид; трифлумидат; зидометацин; зомепирак натрия), или антигистаминные препараты (например, этаноламины (например, дифенгидрамин, карбиноксамин), этилендиамин (например, трипеленнамин пириламин), алкиламин (например, хлорфенирамин, дексхлорфенирамин, бромфенирамин, трипролидин), другие антигистаминные препараты, такие как астемизол, лоратадин, фексофенадин, брофенирамин, клемастин, ацетаминофен, псевдоэфедрин, трипролидин).

Композиции могут вводиться местно, перорально или парентерально. Например, композиции могут вводиться экстракорпорально, внутричерепно, интравагинально, внутрианально, подкожно, внутрикожно, внутрисердечно, внутрижелудочно, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, трансдермально, интраназально или ингаляционно. Используемый здесь термин «внутричерепное введение» означает прямую доставку веществ в головной мозг, включая, например, интратекальную, интрацистернальную, интравентрикулярную или транссфеноидальную доставку через катетер или иглу.

Парентеральное введение композиции, если оно используется, обычно характеризуется инъекцией. Инъецируемые препараты могут быть приготовлены в обычных формах, либо в виде жидких растворов или суспензий, в твердых формах, подходящих для растворения суспензии в жидкости перед инъекцией, либо в виде эмульсий. Совсем недавно пересмотренный подход для парентерального введения включает использование системы с медленным или длительным высвобождением, так что поддерживается постоянная доза. Смотрите, например, патент США с № 3610795, который включен сюда посредством ссылки.

Используемый здесь термин «местное введение через нос» означает доставку композиций в нос и носовые проходы через одну или обе ноздри и может включать доставку с помощью распылительного или капельного механизма или путем превращения в аэрозоль нуклеиновой кислоты или вектора. Введение композиций с помощью ингалятора может осуществляться через нос или рот через доставку с помощью распылительного или капельного механизма. Доставка также может осуществляться непосредственно в любую область дыхательной системы (например, легкие) посредством интубации.

В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции могут применяться местно один раз в день, два раза в день, три раза в день, четыре раза в день, пять раз в день или более. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции могут применяться местно один раз каждые два дня, один раз каждые три дня, один раз каждые четыре дня, один раз каждые четыре дня, один раз каждые пять дней, один раз каждые шесть дней или один раз в неделю. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции могут применяться местно по мере необходимости. Например, в некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции могут применяться во время или после появления или усиления выраженности симптомов радиационного поражения. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции могут применяться местно один раз в день в течение приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 100 или более дней подряд. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции содержат предоставляемый здесь пептид ACT и гель и могут применяться местно. В дальнейших вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции содержат SEQ ID NO:91. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции содержат SEQ ID NO:91 и гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы, причем композиции применяются местно.

В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции включают гель для местного применения, называемый «Granexin®». В некоторых вариантах осуществления Granexin® включает 1,25% гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы и пептид ACT1. Химическая структура пептида ACT1 в Granexin®: биотин-Ahx-Arg-Gln-Pro-Lys-Ile-Trp-Phe-Pro-Asn-Arg-Arg-Lys-Pro-Trp-Lys-Lys-Arg-Pro-Arg-Pro-Asp-Asp-Leu-Glu-Ile-OH (SEQ ID NO: 91), где Ahx представляет собой L-2-аминогексановую кислоту (6-аминогексановую кислоту). В некоторых вариантах осуществления Granexin®, кроме того, включает один или более консервантов, растворителей, буферных веществ, стабилизаторов, комплексообразующих агентов и/или любых дополнительных фармацевтически приемлемых наполнителей или носителей.

В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции вводят местно и/или системно за приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 24, приблизительно 48 или более часов перед воздействием ионизирующего излучения. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции вводят местно и/или системно через приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 24, приблизительно 48 или более часов после воздействия ионизирующего излучения. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции вводят местно и/или системно в период времени от приблизительно 1 до приблизительно 48 часов после воздействия ионизирующего излучения, или от приблизительно 4 до приблизительно 24 часов после воздействия, или от приблизительно 10 до приблизительно 36 часов после воздействия. В конкретных вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции применяют местно через приблизительно 24 часа после воздействия ионизирующего излучения. В некоторых вариантах осуществления тонкий слой предоставляемой здесь композиции (например, композиции, содержащей предоставляемый здесь пептид ACT и гель), наносят на участки, подвергшиеся воздействию ионизирующего излучения. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются способы лечения воздействия ионизирующего излучения, включающие местное нанесение на участок воздействия слоя композиции, содержащей SEQ ID NO:91 и гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы.

В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции могут вводиться системно один раз в день, два раза в день, три раза в день, четыре раза в день, пять раз в день или более. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции могут вводиться системно один раз каждые два дня, один раз каждые три дня, один раз каждые четыре дня, один раз каждые четыре дня, один раз каждые пять дней, один раз каждые шесть дней или один раз в неделю. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции могут вводиться системно по мере необходимости до или после воздействия ионизирующего излучения. Например, в некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции могут вводиться во время или после появления или усиления выраженности симптомов радиационного поражения. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции могут вводиться системно один раз в день в течение приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 100 или более дней подряд. В некоторых вариантах осуществления композиции, предусмотренные здесь для системной доставки субъекту, нуждающемуся в этом, содержат предоставляемый здесь пептид ACT. В некоторых вариантах осуществления композиции, предусмотренные здесь для системной доставки субъекту, нуждающемуся в этом, содержат полипептид ACT1 (SEQ ID NO:2). В дальнейших вариантах осуществления композиции, предусмотренные здесь для системной доставки субъекту, нуждающемуся в этом, содержат один или более фармацевтически приемлемых носителей.

В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции вводят системно через приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 24, приблизительно 48 или более часов после воздействия ионизирующего излучения. В конкретных вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции вводят системно через 24 часа после воздействия ионизирующего излучения. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции вводят системно после воздействия ионизирующего излучения и до появления симптомов ARS. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции вводят системно после воздействия ионизирующего излучения и после появления симптомов ARS, причем композиции лечат, ингибируют или сдерживают прогрессирование ARS.

Точное требуемое количество композиций будет меняться от субъекта к субъекту в зависимости от вида, возраста, веса и общего состояния субъекта, тяжести аллергического заболевания, подвергаемого лечению, конкретной используемой нуклеиновой кислоты или вектора, ее способа введения и т.п. Таким образом, невозможно указать точное количество для каждой композиции. Однако подходящее количество может быть определено специалистом со средним уровнем компетентности в данной области техники, используя лишь обычные эксперименты, приведенные здесь

Материалы могут находиться в растворе или суспензии (например, включены в микрочастицы, липосомы или клетки). Они могут быть нацелены на конкретный тип клеток через антитела, рецепторы или лиганды рецепторов. Следующие ссылки являются примерами использования этой технологии для нацеливания конкретных белков на опухолевую ткань (Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K. D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); и Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). Носители, такие как «стелс» и другие конъюгированные с антителами липосомы (включая липид-опосредованное нацеливание лекарственного средства на рак толстой кишки), рецептор-опосредованное нацеливание ДНК через клеточноспецифические лиганды, таргетирование опухоли с использованием целенаправленных лимфоцитов и высокоспецифичное таргетирование клеток глиомы мыши in vivo с использованием терапевтических ретровирусов. Следующие ссылки являются примерами использования этой технологии для нацеливания специфических белков на опухолевую ткань (Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); и Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). Как правило, рецепторы участвуют в путях эндоцитоза, как конститутивных, так и индуцированных лигандом. Эти рецепторы группируются в клатрин-покрытых ямках, попадают в клетку через клатрин-покрытые везикулы, проходят через подкисленную эндосому, в которой рецепторы сортируются, и затем либо возвращаются на поверхность клетки, становятся хранящимися внутриклеточно, либо подвергаются деградации в лизосомах. Пути интернализации служат различным функциям, таким как поглощение питательных веществ, удаление активированных белков, клиренс макромолекул, ситуационно-обусловленное проникновение вирусов и токсинов, диссоциация и деградация лиганда и регуляция на уровне рецепторов. Многие рецепторы идут более чем одним внутриклеточным путем, в зависимости от типа клетки, концентрации рецептора, типа лиганда, валентности лиганда и концентрации лиганда. Рассмотрены молекулярные и клеточные механизмы рецептор-опосредованного эндоцитоза (Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).

Подходящие носители и содержащие их препараты описаны в Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A. R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1995. Как правило, подходящее количество фармацевтически приемлемой соли используется в препарате для придания препарату изотоничности. Примеры фармацевтически приемлемого носителя включают, но без ограничения ими, физиологический раствор, раствор Рингера и раствор Рингера с декстрозой. рН раствора может составлять от приблизительно 5 до приблизительно 8, от приблизительно 7 до приблизительно 7,5. Другие носители включают препараты с замедленным высвобождением, такие как содержащие антитело полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, матрицы из которых имеют форму профилированных изделий, например пленок, липосом или микрочастиц. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что определенные носители могут быть более предпочтительными в зависимости, например, от пути введения и концентрации вводимой композиции.

Фармацевтические носители известны специалистам в данной области техники. Они чаще всего будут представлять собой стандартные носители для введения лекарственных средств людям, включая растворы, такие как стерильная вода, физиологический раствор и забуференные растворы при физиологическом рН. Композиции можно вводить внутримышечно или подкожно. Другие соединения будут вводиться в соответствии со стандартными процедурами, используемыми специалистами в данной области техники.

Фармацевтические композиции могут включать носители, загустители, разбавители, буферы, консерванты, поверхностно-активные вещества и т.п. в дополнение к выбранной молекуле. Фармацевтические композиции могут также включать один или более активных ингредиентов, таких как противомикробные средства, противовоспалительные средства, обезболивающие средства и т.п.

Фармацевтическая композиция может вводиться рядом способов в зависимости от того, желательно ли местное или системное лечение, и от участка тела, подлежащего лечению. Введение может осуществляться местно (в том числе в глаза, вагинально, ректально, интраназально), перорально, путем ингаляции или парентерально, например, путем инъекции с использованием капельницы, подкожной, внутрибрюшинной или внутримышечной инъекции. В некоторых вариантах осуществления введение осуществляется путем местного применения. В некоторых вариантах осуществления введение осуществляется путем системного введения. Системное введение включает, например, энтеральное или парентеральное введение. В некоторых вариантах осуществления системное введение осуществляется путем внутривенной инъекции, подкожной инъекции, внутрикожной инъекции, внутримышечной инъекции или ингаляции. В некоторых вариантах осуществления системное введение осуществляется путем аэрозольной доставки.

Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Носители на водной основе включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и забуференные среды. Носители для парентерального введения включают раствор хлорида натрия, раствор Рингера с декстрозой, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактатом или жирные масла. Носители для внутривенного введения включают пополняющие жидкости и пищевые добавки, пополняющие электролиты (например, основанные на растворе Рингера с декстрозой) и т.п. Могут также присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные препараты, антиоксиданты, комплексообразующие агенты, инертные газы и т.п.

Препараты для местного применения могут включать мази, лосьоны, кремы, гели (например, гель на основе полоксамера), капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Обычные фармацевтические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и т.п. могут быть необходимыми или желательными. Раскрытые композиции могут быть введены, например, в микроволокне, полимере (например, коллагене), наносфере, аэрозоле, лосьоне, креме, ткани, пластике, сконструированном тканевом каркасе, матричном материале, таблетке, имплантируемом контейнере, порошке, масле, смоле, повязке на рану, шарике, микрошарике, шарике с медленным высвобождением, капсуле, инъекционных препаратах, капельнице, насосном устройстве, силиконовых имплантатах или любых биосконструированных материалах. В некоторых вариантах осуществления препарат для местного применения представляет собой крем для защиты от солнца, солнцезащитный крем или подобный препарат. Такие композиции могут поглощать, фильтровать, отражать или блокировать ультрафиолетовое излучение солнца или другого источника ультрафиолетового излучения. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются препараты, которые функционируют как для уменьшения воздействия ультрафиолетового излучения, так и для предотвращения, лечения или сдерживания прогрессирования радиационного поражения в результате ультрафиолетового излучения. В других вариантах осуществления препарат для местного применения представляет собой лосьон для загара, ускоритель загара, масло для загара или аналогичный препарат. В некоторых вариантах осуществления крем для защиты от солнца, солнцезащитный крем, лосьон для загара, ускоритель загара или масло для загара включает количество предоставляемых здесь полипептидов, которое может предотвратить, лечить или сдерживать прогрессирование радиационного поражения, вызываемого ультрафиолетовым светом (например, от солнца, солярия или другого источника). Например, в некоторых вариантах осуществления солнцезащитный крем включает концентрацию предоставляемого здесь полипептида (например, от приблизительно 0,001% (в весовом отношении) до приблизительно 5,0% (в весовом отношении) или от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 2000 мкМ.

В одном аспекте предусмотренный фармацевтически приемлемый носитель представляет собой полоксамер. Полоксамеры, упоминаемые под торговым названием Pluronics®, представляют собой неионогенные поверхностно-активные вещества, которые образуют прозрачные термообратимые гели в воде. Полоксамеры представляют собой триблоксополимеры полиэтиленоксид-полипропиленоксид-полиэтиленоксид (PEO-PPO-PEO). Две полиэтиленоксидные цепи являются гидрофильными, но полипропиленовая цепь является гидрофобной. Эти гидрофобные и гидрофильные характеристики несут ответственность при помещении в водные растворы. Цепи PEO-PPO-PEO принимают форму небольших цепей, причем гидрофобные центры собираются вместе с образованием мицелл. Как правило, мицеллы, последовательно, имеет тенденцию к гелеобразованию, поскольку они объединяются в группы с образованием твердых веществ (гели), в которых вода присутствует только в небольшом количестве вблизи гидрофильных концов. При охлаждении он становится жидким, но затвердевает при нагревании. Эта характеристика делает его полезным в приготовлении фармацевтических средств, поскольку его можно ввести в шприц для точного измерения дозы, когда он холодный. Когда он нагревается до температуры тела (при нанесении на кожу), он густеет до идеальной консистенции (особенно в сочетании с соевым лецитином/изопропилпальмитатом), что способствует правильному функционированию и адгезии. Pluronic® F127 (F127) широко используется, поскольку его легко получить, и соответственно он используется в таких фармацевтических применениях. F127 имеет отношение EO:PO:EO=100:65:100, которое по весу имеет отношение PEO:PPO=2:1. Гель на основе плюроника представляет собой водный раствор и, как правило, содержит 20-30% F-127. Таким образом, предоставляемые композиции могут вводиться в F127.

Наполнители для применения в гелях для местного применения хорошо известны в данной области техники, и их примеры можно найти в Справочнике по фармацевтическим наполнителям (Rowe, R. C. et al, APhA Publications; 5^th ed., 2005). Примеры наполнителей могут включать воски, различные сахара и типы крахмала, полимеры, гели, смягчающие вещества, загустители, модификаторы реологических свойств, увлажнители, глицерин, органические основные соединения, производные целлюлозы, желатин, растительные масла, полиэтиленгликоли и растворители. Примеры модификаторов реологических свойств включают карбопол, гидроксипропилцеллюлозу, (C_26-28)алкилдиметикон, (C_26-28)алкилметикон, полифенилсесквиоксан, триметилсилоксисиликат, кроссполимеры циклопентасилоксана и диметикона/винилтриметилсилоксисиликата, коллоидальную двуокись кремния (например, Cab-O-Sil M5P) и их смеси. Примеры смягчающих средств включают глицерин, пентиленгликоль, натриевую соль пирролидонкарбоновой кислоты, ланолин, изомерат сахарида, стеароксидиметикон, стеарилдиметикон и их смеси. Смягчающие средства могут быть полезны для предотвращения обезвоживания рогового слоя, возникающего из-за использования в препарате безводных растворителей. Примеры органических оснований включают 2-амино-2-метилпропанол, ниацинамид, метаноламины, триэтаноламины, трисамино, AMP-95, AmP-Ultra PC 2000, триизопропаноламин, диизопропаноамин, Neutrol TE, Ethomeen и их смеси. Органическое основание может сделать рН лекарственного средства основным или нейтральным.

Другие типичные наполнители включают водорастворимые порогены (порообразователи). Водорастворимый пороген является добавкой, которая может облегчать поглощение воды и ее диффузию в гель. Может быть использован любой подходящий пороген, но в некоторых вариантах осуществления пороген может включать хлорид натрия, хлорид калия, сахарозу, глюкозу, лактозу, сорбит, ксилит, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт или их смеси.

Полимеры также могут действовать как наполнители в гелях для местного применения. Типичные полимеры включают гидрофильные полиуретаны, гидрофильные полиакрилаты, сополимеры карбоксиметилцеллюлозы и акриловой кислоты, N-винилпирролидон, полигидроксикислоты, полиангидриды, полиортоэфиры, полиамиды, поликарбонаты, полиалкилены (например, полиэтилен и полипропилен), полиалкиленгликоли (например, полиэтиленгликоль), полиалкиленоксиды (например, полиэтиленоксид), полиалкилентерефталаты (например, полиэтилентерефталат), поливиниловые спирты, простые поливиниловые эфиры, сложные поливиниловые эфиры, поливинилгалогениды (например, поливинилхлорид), поливинилпирролидон, полисилоксаны, поливинилацетаты, полистиролы, уретановые сополимеры, целлюлозу, дериватизированные целлюлозы (например, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу или ацетат целлюлозы), альгинаты, полиакриловую кислоту, производные полиакриловой кислоты, сополимеры акриловой кислоты, метакриловую кислоту, производные метакриловой кислоты, сополимеры метакриловой кислоты, полимасляную кислоту, поливалериановую кислоту, сополимер лактида и капролактона, их сополимеры и их смеси.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полимеры могут быть сверхвпитывающими полимерами (SAP). Полимер считается сверхвпитывающим, в соответствии с определением IUPAC, рассматривается как полимер, который может впитывать и удерживать чрезвычайно большое количество воды относительно его собственной массы. SAP могут впитывать воду в 500 раз больше своего собственного веса и могут набухать в 1000 раз по сравнению с их первоначальным объемом. Конкретные представляющие интерес SAP включают полиакрилат натрия, полиуретан Tecophilic TG-2000 и полимеры, полученные с использованием сополимера акриламида, сополимера этилена и малеинового ангидрида, сшитой карбоксиметилцеллюлозы, сополимеров поливинилового спирта, поливинилпирролиндона и сшитого полиэтиленоксида.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения могут использоваться полимеры, которые являются относительно гидрофобными. Может использоваться любой подходящий гидрофобный полимер. Однако типичные полимеры, которые являются относительно гидрофобными, включают ароматические полиуретаны, силиконовый каучук, полисилоксаны, поликапролактон, поликарбонат, поливинилхлорид, полиэтилен, поли-L-лактид, поли-DL-гликолид, полиэфирэфиркетон (PEEK), полиамид, полиимид и поливинилацетат. Кроме того, можно использовать гидрофобную гелевую основу и/или модификатор реологических свойств.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полимеры могут действовать в качестве загустителей в лекарственных средствах. В частности, полимерная часть геля может действовать как вязкоупругое вещество и может удерживать гель в месте нанесения вместе с диспергированными в нем полипептидами альфа-коннексина.

В некоторых других вариантах осуществления гель, который включает полимер, может обладать способностью к растеканию, так что он образует тонкую пленку при нанесении на поверхность кожи. Эта пленка может сделать возможным нанесение содержащихся полипептидов альфа-коннексина на обширную область и может способствовать сохранению полипептидов альфа-коннексина на пораженной области кожи.

Другие наполнители могут включать различные ионные или неионные соединения для поддержания стабильности препарата, тем самым защищая от деэмульгирования, осаждения, агломерации или разложения компонентов препарата, которая(ое) может снизить его терапевтическую или эстетическую ценность.

Примеры ионных соединений могут включать соли, такие как хлорид натрия, хлорид калия; катионные, анионные или цвиттерионные поверхностно-активные вещества, такие как додецилсульфат натрия (SDS), перфтороктаноат (PFOA), перфтороктансульфонат (PFOS), лаурилсульфат аммония (ALS), сульфат лаурилового эфира натрия (SLES), алкилбензолсульфонат, бромид цетилтриметиламмония (CTAB), хлорид цетилпиридиния (CPC), полиэтоксилированный талловый амин (POEA), хлорид бензалкония (BAC), хлорид бензетония, додецилбетаин, кокамидопропилбетаин и кокоамфоглицинат.

Примеры неионных соединений, которые могут действовать как наполнители, включают неионные поверхностно-активные вещества, такие как поверхностно-активные вещества семейства Pluronic, Tween, AMP и Brij; и поверхностно-активные вещества, полученные из биологических источников, например природные или полусинтетические поверхностно-активные вещества, такие как олеиновая кислота, сорбиттриолеат, сорбитмоноолеат, лецитин, кокамид MEA, кокамид DEA и кокамидопропилбетаин. Поверхностно-активные вещества (как ионные, так и неионные) могут снижать энергию на поверхности раздела и могут способствовать растеканию препарата для местного применения по более обширной области.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения растворители-наполнители могут использоваться в качестве носителя для полипептидов альфа-коннексина и других наполнителей. Полимерные цепи могут взаимодействовать с растворителем и подвергаться набуханию, образуя сеть, которая может придавать вязкоупругие свойства препарату для местного применения. В некоторых вариантах осуществления препарата для местного применения растворитель может испаряться при нанесении, оставляя остаточный слой в виде пленки полимера вместе с захваченными полипептидами альфа-коннексина.

Типичные наполнители-растворители, которые могут применяться в гидрофильных препаратах, могут включать диметилизосорбид, пропиленгликоль, глицерин, изопропанол, этанол, бензиловый спирт, этиленгликоль, полиэтиленгликоль, этоксидигликоль или их смеси. Типичные наполнители-растворители, которые могут применяться в гидрофобных препаратах, могут включать каприновые/каприловые триглицериды, изопропилмиристат, минеральное масло, изододекан, изодецилнеопентаноат, бутиленгликоль, пентиленгликоль, гексиленгликоль, метоксиполиэтиленгликоль, циклопентасилоксан, циклотетрасилоксан, диметикон, каприлилметикон или их смеси.

В дополнение к полипептидам альфа-коннексина и наполнителям, препарат для местного применения может также включать по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, такое как противомикробные средства, средства от угревой сыпи, противовоспалительные средства, обезболивающие средства, анестезирующие средства, антигистаминные препараты, антисептики, иммунодепрессанты, антигеморрагические средства, вазодилататоры, ранозаживляющие средства, антибиопленочные агенты и их смеси.

Примеры противомикробных средств включают пенициллины и родственные препараты, карбапенемы, цефалоспорины и родственные препараты, эритромицин, аминогликозиды, бацитрацин, грамицидин, мупироцин, хлорамфеникол, тиамфеникол, фузидат натрия, линкомицин, клиндамицин, макролиды, новобиоцин, полимиксины, рифамицины, спектиномицин, тетрациклины, ваномицин, тейкопланин, стрептограмины антифолатные агенты, включая сульфонамиды, триметоприм и его комбинации и пириметамин, синтетические антибактериальные средства, включая нитрофураны, метенамин манделат и метенамин гиппурат, нитроимидазолы, хинолоны, фторхинолоны, изониазид, этамбутол, пиразинамид, парааминосалициловую кислоту (PAS), циклосерин, капреомицин, этионамид, протионамид, тиацетазон, виомицин, эвеминомицин, гликопептид, гликликлин, кетолиды, оксазолидинон; имипенен, амикацин, нетилмицин, фосфомицин, гентамицин, цефтриаксон, зирацин, линезолид, синерцид, азтреонам и метронидазол, эпироприм, санфетринем натрия, биапенем, динемицин, цефлупренам, цефоселис, санфетринем целексетил, цефпиром, мерсацидин, рифалазил, косан, ленапенем, венеприм, сулопенем, ритипенам аоксил, циклотиалидин, микакоцидин А, карумонам, цефозопран и цефетамет пивоксил.

Примеры местных средств от угревой сыпи включают адапален, азелаиновую кислоту, бензоилпероксид, клиндамицин и клиндамицина фосфат, доксициклин, эритромицин, кератолитики, такие как салициловая кислота и ретиноевая кислота («Ретин-А»), норгестимат, органические пероксиды, ретиноиды такие как изотретиноин и третиноин, сульфацетамид натрия и тазаротен. Конкретные средства от угревой сыпи включают адапален, азелаиновую кислоту, бензоилпероксид, клиндамицин (например, клиндамицина фосфат), доксициклин (например, доксициклина моногидрат), эритромицин, изотретиноин, норгестимат, сульфацетамид натрия, тазаротен, этретинат и ацитретин.

Примеры антигистаминных препаратов включают дифенгидрамина гидрохлорид, дифенгидрамина салицилат, дифенгидрамин, хлорфенирамина гидрохлорид, хлорфенирамина малеат, изотипендила гидрохлорид, трипеленнамина гидрохлорид, прометазина гидрохлорид, метдилазина гидрохлорид и т.п. Примеры местных анестетиков включают дибукаина гидрохлорид, дибукаин, лидокаина гидрохлорид, лидокаин, бензокаин, 2-(диэтиламино)этилового эфира п-бутиламинобензойной кислоты гидрохлорид, прокаина гидрохлорид, тетракаин, тетракаина гидрохлорид, хлорпрокаина гидрохлорид, оксипрокаина гидрохлорид, мепивакаин, кокаина гидрохлорид, пиперокаина гидрохлорид, диклонин и диклонина гидрохлорид.

Примеры антисептических средств включают спирты, четвертичные аммониевые соединения, борную кислоту, хлоргексидин и производные хлоргексидина, йод, фенолы, терпены, бактерицидные вещества, дезинфицирующие средства, в том числе тимеросал, фенол, тимол, бензалкония хлорид, бензетония хлорид, хлоргексидидин, повидон йод, цетилпиридиния хлорид, эвгенол и триметиламмония бромид.

Примеры противовоспалительных средств включают нестероидные противовоспалительные средства (NSAlD); производные пропионовой кислоты, такие как ибупрофен и напроксен; производные уксусной кислоты, такие как индометацин; производные эноликовой кислоты, такие как мелоксикам, ацетаминофен; метилсалицилат; моногликоль салицилат; аспирин; мефенамовую кислоту; флуфенамовую кислоту; индометацин; диклофенак; альклофенак; диклофенак натрия; ибупрофен; кетопрофен; напроксен; пранопрофен; фенопрофен; сулиндак; фенклофенак; клиданак; флурбипрофно; фентиазак; буфексамак; пироксикам; фенилбутазон; оксифенбутазон; клофезон; пентазоцин; мепиризол; тиамид гидрохлорид; стероиды, такие как клобетазола пропионат, бетаметазона дипропионат, галобетазола пропионат, дифлоразона диацетат, флуоцинонид, галцинонид, амцинонид, дезоксиметазон, триамцинолона ацетонид, мометазона фуроат, флутиказона пропионат, бетаметазона дипропионат, триамцинолона ацетонид, флутиказона пропионат, дезонид, фторцинолона ацетонид, гидрокортизона валерат, предникарбат, триамцинолона ацетонид, флуоцинолона ацетонид, гидрокортизон и другие, известные в данной области техники, преднизолон, дексаметазон, флуоцинолона ацетонид, гидрокортизона ацетат, преднизолона ацетат, метилпреднизолон, дексаметазона ацетат, бетаметазон, бетаметазона валерат, флуметазон, фторметолон, беклометазона дипропионат, флуоцинонид, местные кортикостероиды, и могут представлять собой один из кортикостероидов с низкой активностью, такой как гидрокортизон, гидрокортизон-21-моноэфиры (например, гидрокортизон-21-ацетат, гидрокортизон-21-бутират, гидрокортизон-21-пропионат, гидрокортизон-21-валерат и т.д.), гидрокортизон-17,21-диэфиры (например, гидрокортизон-17,21-диацетат, гидрокортизон-17-ацетат-21-бутират, гидрокортизон-17,21-дибутират и т.д.), алклометазон, дексаметазон, флуметазон, преднизолон или метилпреднизолон, или могут представлять собой кортикостероид с более высокой активностью, такой как клобетазола пропионат, бетаметазона бензоат, бетаметазона дипропионат, дифлоразона диацетат, флуоцинонид, мометазона фуроат, триамцинолона ацетонид.

Примеры обезболивающих средств включают альфентанил, бензокаин, бупренорфин, буторфанол, бутамбен, капсаицин, клонидин, кодеин, дибукаин, энкефалин, фентанил, гидрокодон, гидроморфон, индометацин, лидокаин, леворфанол, меперидин, метадон, морфин, никоморфин, опий, оксибупрокаин, оксикодон, оксиморфон, пентазоцин, прамоксин, пропаракаин, пропоксифен, проксиметакаин, суфентанил, тетракаин и трамадол.

Примеры анестезирующих средств включают спирты, такие как фенол; бензилбензоат; каламин; хлороксиленол; диклонин; кетамин; ментол; прамоксин; резорцин; троклозан; прокаиновые препараты, такие как бензокаин, бупивакаин, хлорпрокаин; цинхокаин; кокаин; дексивакаин; диамокаин; дибукаин; этидокаин; гексилкаин; левобупивакаин; лидокаин; мепивакаин; оксетазаин; прилокаин; прокаин; пропаракаин; пропоксикаин; пиррокаин; ризокаин; родокаин; ропивакаин; тетракаин; и производные, такие как фармацевтически приемлемые соли и сложные эфиры, включая бупивакаина HCl, хлорпрокаина HCl, диамокаина цикламат, дибукаина HCl, диклонина HCl, этидокаина HCl, левобупивакаина HCl, лидокаина HCl, мепивакаина HCl, прамоксина HCl, прилокаина HCl, пракаина HCl, пропаракаина HCl, пропоксикаина HCl, ропивакаина HCl и тетракаина HCl.

Примеры антигеморрагических средств включают тромбин, фитонадион, протаминсульфат, аминокапроновую кислоту, транексамовую кислоту, карбазохром, карбаксохром сульфанат натрия, рутин и гесперидин.

Помимо биоактивного полипептидного компонента настоящее изобретение может также содержать другие активные агенты, такие как ниацинамид, фитантриол, фарнезол, бисаболол и салициловая кислота. Ожидается, что некоторые дополнительные активные агенты будут действовать синергетически с биоактивным пептидным компонентом или увеличат срок годности препарата.

Примеры способов лечения ран, которые могут использоваться вместе с лекарственным средством настоящего изобретения, включают фибринолитические ферменты, такие как фибринолизин, дезоксирибонуклеаза, стрептокиназа и стрептодорназа, средства для некрэктомии ткани, содержащие лизоцима хлорид, противомикробные средства, содержащие гентамицина сульфат, сульфадиазин серебра, бацитрацин и фрадиомицина сульфат, инкарнантные препараты, содержащие трафермин, букладезин натрия, третиноин токоферрил (токоретинат), альпростадил альфадекс, солкосерил (экстракт из гемолизированной крови молодого крупного рогатого скота) и алкоксу, препараты йода, содержащие белый мягкий сахар, повидон-йод и иодин, и препараты, содержащие в качестве активных ингредиентов бендазак, диметилизопропилазулен (гвайазулен) и адреналин.

В дополнение к полипептидам альфа-коннексина, наполнителям и другим терапевтическим средствам, гели могут также включать другие соединения, которые улучшают органолептические свойства препарата для местного применения.

Примеры таких соединений включают отдушки, красители и красители; комплексообразующие агенты, в том числе, но без ограничения этим, эдетат динатрия (EDTA), EGTA, CP94, лимонную кислоту; консерванты, в том числе, но без ограничения этим, соединения четвертичного аммония, такие как бензалкония хлорид, бензетония хлорид, цетримид, деквалиния хлорид и цетилпиридиния хлорид; препараты ртути, такие как фенилртути нитрат, фенилртути ацетат и тимеросал; спиртовые препараты, например, хлорбутанол, фенилэтиловый спирт и бензиловый спирт; антибактериальные сложные эфиры, например сложные эфиры парагидроксибензойной кислоты; и другие противомикробные средства, такие как хлоргексидин, хлоркрезол, бензойная кислота и полимиксин.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется препарат для местного применения, содержащий по меньшей мере один полипептид альфа-коннексина и гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы, причем гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы стабилизирует полипептид альфа-коннексина. В некоторых вариантах осуществления гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы стабилизирует полипептид альфа-коннексина, так что после 3 месяцев хранения при 5°С можно определить с помощью аналитических способов по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% полипептида альфа-коннексина. В некоторых вариантах осуществления полипептид альфа-коннексина присутствует в препарате в концентрации, составляющей приблизительно 0,0025% (в весовом отношении), приблизительно 0,005% (в весовом отношении), приблизительно 0,0075% (в весовом отношении), приблизительно 0,010% (в весовом отношении), приблизительно 0,015% (в весовом отношении), приблизительно 0,020% (в весовом отношении), приблизительно 0,025% (в весовом отношении), приблизительно 0,030% (в весовом отношении), приблизительно 0,035% (в весовом отношении), приблизительно 0,040% (в весовом отношении), приблизительно 0,045% (в весовом отношении), приблизительно 0,050% (в весовом отношении), приблизительно 0,055% (в весовом отношении), приблизительно 0,060% (в весовом отношении), приблизительно 0,065% (в весовом отношении), приблизительно 0,070% (в весовом отношении), приблизительно 0,075% (в весовом отношении), приблизительно 0,080% (в весовом отношении), приблизительно 0,085% (в весовом отношении), приблизительно 0,090% (в весовом отношении), приблизительно 0,095% (в весовом отношении), приблизительно 0,100% (в весовом отношении), приблизительно 0,150% (в весовом отношении), приблизительно 0,200% (в весовом отношении), приблизительно 0,250% (в весовом отношении), приблизительно 0,500% (в весовом отношении), приблизительно 0,750% (в весовом отношении), приблизительно 1,00% (в весовом отношении), приблизительно 1,50% (в весовом отношении), приблизительно 2,00% (в весовом отношении), приблизительно 2,50% (в весовом отношении) или приблизительно 3,00% (в весовом отношении), или приблизительно 3,50% (в весовом отношении), или приблизительно 4,00% (в весовом отношении), или приблизительно 4,50% (в весовом отношении), или приблизительно 5,00% (в весовом отношении) или более. В одном варианте осуществления полипептид альфа-коннексина присутствует в препарате в концентрации от приблизительно 0,005% (в весовом отношении) до приблизительно 1,00% (в весовом отношении).

В других вариантах осуществления лекарственный продукт настоящего изобретения представляет собой прозрачный бесцветный гель, который содержит 0,0072% (в весовом отношении) (20 мкМ) пептида ACT, 0,018% (в весовом отношении) (50 мкМ) пептида ACT, 0,036% (в весовом отношении) (100 мкМ) пептида ACT, 0,072% (в весовом отношении) (200 мкМ) пептида ACT или 0,36% (в весовом отношении) (1000 мкМ) пептида ACT. Пептид ACT может быть растворен в полутвердой лекарственной форме, которая содержит >0% воды, >10% воды, >20% воды, >30% воды, >40% воды, >50% воды, >60% воды, >70% воды, >80% воды или >90% воды и 0,25% гелеобразующего агента (полимера), 0,55% гелеобразующего агента (полимера), 0,75% гелеобразующего агента (полимера), 1,00% гелеобразующего агента (полимера), 1,25% гелеобразующего агента (полимера), 1,50% гелеобразующего агента (полимера), 1,75% гелеобразующего агента (полимера), 2,00% гелеобразующего агента (полимера), 2,25% гелеобразующего агента (полимера) или 2,50% гелеобразующего агента (полимера), или 3,00% гелеобразующего агента (полимера), или 3,50% гелеобразующего агента (полимера), или 4,00% гелеобразующего агента (полимера), или 4,50% гелеобразующего агента (полимера), или 5,00% гелеобразующего агента (полимера).

В некоторых вариантах осуществления пептид АСТ может быть хорошо сохранен и соответственно забуферен до приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7, приблизительно рН 7,5 или приблизительно рН 8. В некоторых вариантах осуществления композиции для местного применения качественный и количественный состав соответствует составу, приведенному в таблице 7.

Таблица 7: Качественный и количественный состав лекарственного средства в виде геля

Ингредиенты Сорт Функция Концентрация (% в весовом отношении) Пептид 328967 (пептид ACT) -- Активный ингредиент 0,0072; 0,018
0,036; 0,072 Метилпарабен NF Консервант 0,17 Пропилпарабен NF Консервант 0,02 Глицерин USP Растворитель 5,0 Одноосновный фосфат натрия USP Буферное вещество 0,263 Двухосновный фосфат натрия USP Буферное вещество 0,044 Пропиленгликоль USP Растворитель 3,0 Динатрия эдетат USP Комплексообразующий агент 0,05 D-маннит USP Стабилизатор 0,05 Гидроксиэтилцеллюлоза, 250HHX NF Гелеобразующий агент 1,25% Очищенная вода, сколько нужно USP Растворитель 100%

В приведенной ниже таблице 8 указана последовательность пептида ACT1, в которой Ahx относится к L-2-аминогексановой кислоте, также известной как 6-аминогексановая кислота:

Таблица 8: Последовательность пептида 328967 (ACT1) (SEQ ID NO: 91)

Биотин-Ahx-Arg-Gln-Pro-Lys-lle-Trp-Phe-Pro-Asn-Arg-Arg-Lys-Pro-Trp-Lys-Lys-Arg-Pro-Arg-Pro-Asp-Asp-Leu-Glu-lle-OH

Общие свойства пептида 328967 перечислены в таблице 9 ниже.

Таблица 9: Общие физические свойства пептида 328967

Внешний вид Порошок белого до почти белого цвета Молекулярная масса 3597,33±2,0 атомных единиц массы Противоион AcOH Растворимость Растворимый в воде при комнатной температуре

В некоторых аспектах наполнители, используемые в лекарственном препарате для местного применения, выбирают из группы, состоящей из одного или более следующих компонентов:

Метилпарабен

Пропилпарабен

Глицерин

Фосфат натрия, одноосновный

фосфат натрия, двухосновный

Пропиленгликоль

Динатрия эдетат (EDTA)

D-маннит

Гидроксиэтилцеллюлоза, 250 HHX

Очищенная вода.

В некоторых вариантах осуществления лекарственный препарат для местного применения содержит пептид, D-маннит, гидроксиэтилцеллюлозу и очищенную воду. Указанный препарат может, кроме того, содержать один или более из метилпарабена, пропилпарабена, глицерина, одноосновного фосфата натрия, двухосновного фосфата натрия, пропиленгликоля и эдетата динатрия (EDTA). В дальнейших вариантах осуществления гидроксиэтилцеллюлоза представляет собой 250 HHX. В других вариантах осуществления пептид представляет собой полипептид альфа-коннексина.

В некоторых вариантах осуществления лекарственный препарат для местного применения содержит пептид в концентрации от приблизительно 0,001% (в весовом отношении) до приблизительно 0,5% (в весовом отношении) (например, приблизительно 0,0072%, 0,018%, 0,036% или 0,072% (в весовом отношении)); метилпарабен в концентрации от приблизительно 0,1% (в весовом отношении) до приблизительно 0,25% (в весовом отношении) (например, приблизительно 0,17% (в весовом отношении)); пропилпарабен в концентрации от приблизительно 0,01% (в весовом отношении) до приблизительно 0,03% (в весовом отношении) (например, приблизительно 0,02% (в весовом отношении)); глицерин в концентрации от приблизительно 1% (в весовом отношении) до приблизительно 10% (в весовом отношении) (например, приблизительно 5% (в весовом отношении)); одноосновный фосфат натрия в концентрации от приблизительно 0,1% (в весовом отношении) до приблизительно 0,5% (в весовом отношении) (например, приблизительно 0,263% (в весовом отношении)); двухосновный фосфат натрия в концентрации от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,06% (например, приблизительно 0,044% (в весовом отношении)); пропиленгликоль в концентрации от приблизительно 1% (в весовом отношении) до приблизительно 5% (в весовом отношении) (например, приблизительно 3% (в весовом отношении); EDTA в концентрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,1% (например, приблизительно 0,05%) (в весовом отношении)); D-маннит в концентрации от приблизительно 0,01% (в весовом отношении) до приблизительно 0,1% (в весовом отношении) (например, приблизительно 0,05% (в весовом отношении)); гидроксиэтилцеллюлозу в концентрации от приблизительно 0,5% до приблизительно 2,5% (например, приблизительно 1,25% (в весовом отношении) и очищенную воду в концентрации от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% (например, приблизительно 1%). В дальнейших вариантах осуществления пептид представляет собой полипептид альфа-коннексина.

Полученные в результате исследований in vitro и in vivo, эти стабилизаторы и наполнители включены в лекарственный препарат, поскольку они не вызывают раздражение, не окрашивают и не являются иммуногенными. Исследования стабильности показали, что пептид ACT1 является более стабильным в гелеобразующем агенте гидроксиэтилцеллюлозе, 250 HHX (1,25%) по сравнению с гелями Pluronic. Пептид ACT в лекарственном препарате, содержащем 1,25% гидроксиэтилцеллюлозы, падает только до 98% от указанной на этикетке концентрации (т.е. исходной концентрации) при хранении при 5°C в течение трех месяцев и до 84% от указанной на этикетке концентрации при хранении при 25°C в течение того же срока. В одном аспекте настоящего изобретения эдетат динатрия (EDTA) и маннит включены в лекарственный препарат для обеспечения стабильности пептида ACT1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения маннит присутствует в препарате в количестве от 0,01% (в весовом отношении) до 1,6% (в весовом отношении), от 0,01% (в весовом отношении) до 1,5% (в весовом отношении), от 0,01% (в весовом отношении) до 1,4% (в весовом отношении), от 0,01% (в весовом отношении) до 1,3% (в весовом отношении), от 0,01% (в весовом отношении) до 1,2% (в весовом отношении), от 0,01% (в весовом отношении) до 1,1% (в весовом отношении), от 0,01% (в весовом отношении) до 1,0% (в весовом отношении), от 0,01% (в весовом отношении) до 0,9% (в весовом отношении), от 0,01% (в весовом отношении) до 0,8% (в весовом отношении), от 0,01% (в весовом отношении) до 0,7% (в весовом отношении), от 0,01% (в весовом отношении) до 0,6% (в весовом отношении), от 0,01% (в весовом отношении) до 0,5% (в весовом отношении), от 0,01% (в весовом отношении) до 0,4% (в весовом отношении), от 0,01% (в весовом отношении) до 0,3% (в весовом отношении), от 0,01% (в весовом отношении) до 0,2% (в весовом отношении), от 0,01% (в весовом отношении) до 0,1% (в весовом отношении) или от 0,01% (в весовом отношении) до 0,05% (в весовом отношении). В конкретных вариантах осуществления маннит присутствует в препарате в количестве приблизительно 0,05% (в весовом отношении).

В других аспектах буферное вещество включено в препарат для местного применения для поддержания рН в определенном диапазоне. Подходящие буферные вещества могут включать, но без ограничения ими, ацетатные буферы, цитратные буферы, фосфатные буферы, забуференные молочной кислотой растворы, забуференные яблочной кислотой растворы, забуференные янтарной кислотой растворы, боратные буферы, гидроксид натрия, гидроксид калия и гидроксид аммония. Фосфатные соли, такие как мононатрийфосфат (NaH₂PO₄; также известный как одноосновный фосфат натрия), динатрия гидрофосфат (Na₂HPO₄; также известный как двухосновный фосфат натрия), монокалийфосфат (KH₂PO₄), дикалия фосфат (K₂HPO₄) и их смеси. В некоторых вариантах осуществления фосфатный буфер обеспечивает лучшую стабильность по сравнению с цитратным буфером. В некоторых аспектах буферная емкость при 25 мМ оказалась соответствующей для лекарственного продукта. Буфер необходим для контроля рН гелевой системы и для поддержания стабильности пептидного лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления диапазон pH препарата для местного применения может составлять от pH 2 до pH 12, от pH 4 до pH 10 или от pH 6 до pH 8. В некоторых вариантах осуществления оптимальный диапазон pH составляет от приблизительно рН 5,0 до приблизительно рН 7,0. В других вариантах осуществления pH препарата для местного применения настоящего изобретения составляет 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 или 8,0. В других аспектах пропиленгликоль в количестве 3% обеспечивает лучшую растворимость парабенов в водной системе.

В некоторых вариантах осуществления препарат с пептидом АСТ, включенным в гидроксиэтилцеллюлозу, обеспечивает возможность крупномасштабного производства продукта с характеристиками, которые делают его удобным для клинического лечения, а также удовлетворяющим желаемым требованиям к хранению и стабильности. В то время как в случае препарата для ACT1 с использованием геля Pluronic может потребоваться относительно длительное время включения, составляющее приблизительно 2,5 часа, и производятся только 50-граммовые партии, препарат с гидроксиэтилцеллюлозой обеспечивает значительно более быстрое включение пептида ACT в гель и производство намного больших партий. Например, при использовании геля Pluronic F127 в препарате для местного применения требуется более часа для включения полимера, и препарат должен быть помещен в водяную баню для облегчения включения. Напротив, гидроксиэтилцеллюлоза (например, HEC 250 HHX) легко включается при комнатной температуре и гидратируется в течение 30 минут. Таким образом, использование гидроксиэтилцеллюлозы может облегчить крупномасштабное производство. В случае процесса производства с использованием геля Pluronic может потребоваться холодная ванна для доведения его вязкости до желаемого диапазона и потребоваться больше энергии, чем в случае процесса производства с использованием гидроксиэтилцеллюлозы. Кроме того, конечный препарат в геле Pluronic может быть очень жидким в условиях хранения при 5°C.

Было обнаружено, что гидроксиэтилцеллюлоза (HEC) является подходящим гелеобразующим агентом и приемлемым носителем лекарственного препарата настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления гелеобразующим агентом является гидроксиэтилцеллюлоза (HEC), 250 HHX. В некоторых вариантах осуществления процент (в весовом отношении) HEC находится в диапазоне 1-5%. В других вариантах осуществления процент (в весовом отношении) HEC составляет 1,25%. При производстве HEC очищенную целлюлозу подвергают реакции с гидроксидом натрия с образованием набухшей щелочной целлюлозы. Обработанная щелочью целлюлоза более химически активна, чем целлюлоза. При взаимодействии щелочной целлюлозы с этиленоксидом получают ряд простых эфиров гидроксиэтилцеллюлозы. В этой реакции атомы водорода в гидроксильных группах целлюлозы заменяются гидроксиэтильными группами, которые придают гелю растворимость в воде. В этом изобретении предусматривается, что можно использовать один простой эфир HEC или смесь простых эфиров HEC с разной молекулярной массой и структурой. Подходящие сорта HEC для фармацевтических целей хорошо известны и полностью описаны в фармацевтической литературе. Подходящие коммерчески доступные сорта HEC включают, но без ограничения ими, Fuji HEC-HP; Fuji HEC-AG 15; NATRO-SOL 250HR; NATROSOL 250 MH; NATROSOL 250G; CELLOSIZE QP 30000; TYLOSE H SERIES; NATROSOL 180L; NATROSOL 300H; TYLOSE P-X; NATROSOL 250М; CELLOSIZE WP 4400; CELLOSIZE UT 40; NATROSOL 250H4R; Tylose H20P; NATROSOL LR; TYLOSE MHB; NATROSOL 250HHP; HERCULES N 100; CELLOSIZE WP 300; TYLOSE P-Z SERIES; NATROSOL 250H; TYLOSE PS-X; Cellobond НЕС 400; CELLOSIZE QP; CELLOSIZE QP 1500; NATRO-SOL 250; Простой эфир гидроксиэтилцеллюлозы; HESPAN; TYLOSE MHB-Y; NATROSOL 240JR; Гидроксиэтилкрахмал; CELLOSIZE WP; CELLOSIZE WP 300H; Простой эфир 2-гидроксиэтилцеллюлозы; BL 15; CELLOSIZE QP 4400; CELLOSIZE QP3; TYLOSE MB; Целлюлозы гидроксиэтилат; CELLOSIZE WPO 9H17; CELLOSIZE 4400H16; Гидроксиэтиловый эфир целлюлозы; Гидроксиэтилцеллюлозу; Гидроксилэтилцеллюлозу (HEC); Гидроксиэтилцеллюлозу 100H (celocell 100h); TYLOSE MH-XP; NATROSOL 250HX; Natrosol; Daicel EP 500; НЕС-Unicel; HEC (Гидроксиэтилцеллюлозу); Cellosize; HEC-A1 5000; Fuji HEC-AL 15; HEC-Unicel QP 09L; Целлюлозу, простые эфиры, 2-гидроксиэтиловый эфир; Unicel QP 52000H; HEC-QP 4400; SP 250 (целлюлозу); Hetastarch; Целлюлозу, простые эфиры, 2-гидроксиэтиловый эфир; Glutofix 600; FL 52; Fuji HEC-AX 15F; Tylose H 300P; HEC-Unicel QP 300H; Tylose H 300; Daicel SP 550; Daicel SE 600; Unicel QP 15000; HEC-QP 100 MH; HEC-QP 9H; OET; Daicel EP 850; H. E. Целлюлозу; Cellobond 25T; Unicel QP 100 MH; Tylose H 4000; SE 850K; Tylomer H 20; Daicel SE 850K; Tylose H 30000YP; Unicel QP 4400; SP 407; Tylose H 100000; Daicel SP 200; Culminal HEC 5000PR; Tylopur H 300; Daicel SP 750; Sanhec; BL 15 (производное целлюлозы); Unicel QP 300H; Tylomer H 200; J 164; Tylose H 10; Tylose H 20; AH 15; Daicel SP 600; Daicel SE 900; HEC-Unicel QP 4400H; AX 15; Daicel SP 800; Fuji HEC-AW 15F; HEC-SE 850; HEC-A 5-25CF; Metolose 90SEW; AW 15 (полисахарид); Cellobond HEC 5000; HEC-QP 100M; Cellobond HEC 15A; Tylose H 15000YP2; Walocel HT 6.000 PFV; 2-гидроксиэтилцеллюлозу( тип Natrosol 250HRCS); Fuji HEC-BL 20; Fuji HEC-SY 25F; Telhec; HEC-SP 200; HEC-AH 15; HEC-Unicel QP 30000H; смотрите HEC 10A; Daicel SP 400; Admiral 3089FS; Fuji HEC-A 5000F; HEC-SP 400; Гидроксиэтилметилцеллюлозу (HEMC); Гидроксиэтилцеллюлозу (HEC); Гидроксиэтилкрахмал (CAS №: 9004-62-0); Гидроксиэтилцеллюлозу; "Natrosol" [Aqualon]; HEC; 2-гидроксиэтилцеллюлозу; NATROSOL 150L; TYLOSE MHB-YP; Гидроксиэтиловый эфир целлюлозы; NATROSOL 250L; CELLOSIZE WP 400H; TYLOSE P; Целлюлозу, 2-гидроксиэтиловый эфир; TYLOSE MH-K; NATROSOL 250HHR.

В других вариантах осуществления лекарственный препарат настоящего изобретения упаковывают во флакон по 20 мл (USP Type I, боросиликатное прозрачное сцинтилляционное стекло с винтовой крышкой с конусом с множеством уплотнением из карбомидной смолы). В качестве консерванта используется смесь метилпарабена в количестве 0,17% (в весовом отношении) и пропилпарабена 0,02% (в весовом отношении).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает способ лечения или предотвращения радиационного поражения у субъекта, подверженного риску такого поражения, включающий введение субъекту препарата для местного применения, содержащего по меньшей мере один полипептид альфа-коннексина и гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы, причем гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы стабилизирует полипептид альфа-коннексина. В некоторых вариантах осуществления лекарственный препарат настоящего изобретения может использоваться для уменьшения чрезмерного образования рубцов, связанного с радиационным поражением. В этих вариантах осуществления лекарственный препарат настоящего изобретения может применяться во время радиоактивного облучения, через 1 час после радиоактивного облучения, через 2 часа после радиоактивного облучения, через 3 часа после радиоактивного облучения, через 4 часа после радиоактивного облучения, через 5 часов после радиоактивного облучения, через 6 часов после радиоактивного облучения, через 7 часов после радиоактивного облучения, через 8 часов после радиоактивного облучения, через 9 часов после радиоактивного облучения, через 10 часов после радиоактивного облучения, через 11 часов после радиоактивного облучения, через 12 часов после радиоактивного облучения, через 13 часов после радиоактивного облучения, через 14 часов после радиоактивного облучения, через 15 часов после радиоактивного облучения, через 16 часов после радиоактивного облучения, через 17 часов после радиоактивного облучения, через 18 часов после радиоактивного облучения, через 19 часов после радиоактивного облучения, через 20 часов после радиоактивного облучения, через 21 час после радиоактивного облучения, через 22 часа после радиоактивного облучения, через 23 часа после радиоактивного облучения, через 24 часа после радиоактивного облучения, через 48 часов после радиоактивного облучения, через 72 часа после радиоактивного облучения или после этого.

В других аспектах лекарственный препарат изготавливают с использованием следующих стадий:

Стадия 1. В химический стакан подходящего размера добавьте пропиленгликоль, глицерин, метилпарабен и пропилпарабен. Смешайте с помощью пропеллерной мешалки до полного растворения парабенов.

Стадия 2. В промышленный сосуд добавьте очищенную воду (часть I), EDTA, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия и D-маннит. Смешайте с помощью пропеллерной мешалки до получения прозрачного раствора.

Стадия 3: Добавьте раствор, полученный на стадии 1, в промышленный сосуд. Ополосните химический стакан очищенной водой (часть II, разделенной приблизительно на 3 равные части) и добавьте ополаскиватель обратно в сосуд. Продолжайте перемешивание пропеллерной мешалкой до тех пор, пока раствор не станет визуально гомогенным.

Стадия 4: При перемешивании до гомогенности добавьте гидроксиэтилцеллюлозу в промышленный сосуд со стадии 3. Смешивайте до полного диспергирования полимера.

Стадия 5: В отдельный химический стакан добавьте очищенную воду (часть III) и полипептид альфа-коннексина (например, пептид 328967, пептид ACT1). Смешайте с помощью мешалки или пропеллерной мешалки до полного растворения пептида и образования геля.

Стадия 6: При непрерывном перемешивании пропеллерной мешалкой добавьте раствор лекарственного средства со стадии 5 в промышленный сосуд. Ополосните химический стакан очищенной водой (часть IV, разделенной приблизительно на 3 равные части) и добавьте ополаскиватель обратно в сосуд. Смешайте, пока гель не станет гомогенным.

Схема производственного процесса представлена на фиг. 3.

Препараты полипептидов альфа-коннексинов, которые могут использоваться в настоящем изобретении, подробно описаны в патенте США с № 8846605, который включен сюда посредством ссылки. Содержание патентов США с № 7786074; 788839; 8357668; 8809257; 8859733; 8916515; и 394351; 9408381; 9844214; и 9855313 в полном объеме также включено сюда посредством ссылки.

Композиции для перорального введения включают порошки или гранулы, суспензии или растворы в воде или неводной среде, капсулы, саше или таблетки. Могут быть желательны загустители, корригенты, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие добавки или связующие вещества.

Некоторые из композиций потенциально могут вводиться в виде фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты или основания, образованной путем взаимодействия с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, хлорная кислота, азотная кислота, тиоциановая кислота, серная кислота и фосфорная кислота, и органическими кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота и фумаровая кислота, или путем реакции с неорганическим основанием, таким как гидроксид натрия, гидроксид аммония, гидроксид калия, и органическими основаниями, такими как моно-, ди-, триалкил- и ариламины и замещенные этаноламины.

Эффективные дозы и схемы введения композиций могут быть определены эмпирически, и такие определения могут быть сделаны в пределах навыков специалиста в данной области техники. Диапазоны доз для введения композиций являются такими, которые являются достаточно большими для вызова желаемого эффекта, при котором симптомы нарушения оказываются затронутыми. Доза не должна быть настолько большой, чтобы вызывать нежелательные побочные эффекты, такие как нежелательные перекрестные реакции, анафилактические реакции и т.п. Как правило, доза будет меняться в зависимости от возраста, состояния, пола и степени тяжести заболевания у пациента, пути введения или от того, включены ли другие лекарственные препараты в схему, и может быть определена специалистом в данной области техники. Доза может быть скорректирована конкретным врачом в случае каких-либо противопоказаний. Доза может варьировать и может вводиться в виде одного или более введений дозы ежедневно, в течение одного или нескольких дней. Руководство может быть найдено в литературе для соответствующих доз для данных классов фармацевтических продуктов. Диапазон доз в значительной степени зависит от применения композиций настоящего изобретения, тяжести состояния и пути их введения.

Например, в применениях в качестве лабораторного инструмента для исследования, композиции с пептидом ACT могут использоваться в дозах до 0,01% в отношении веса к объему. Доза может составлять от всего 0,0002% в отношении веса к объему и, возможно, до 20% в отношении веса к объему при местном лечении кожных ран. Значительно более высокие концентрации композиций сами по себе или в сочетании с другими соединениями могут использоваться в таких применениях, как терапия рака/опухоли, или в качестве раннего концентрированного болюса сразу после острого поражения ткани, такого как CRI. Рекомендуемые верхние пределы дозы для парентеральных путей введения, например, внутримышечных, интрацеребральных, внутрисердечных и интраспинальных, могут составлять вплоть до 1% в отношении веса к объему или в объемном отношении в зависимости от тяжести поражения. Этот верхний предел дозы может варьировать в зависимости от состава, в зависимости, например, от того, как полипептид(ы) комбинируется с другими агентами, стимулирующими его действию или действующими совместно с полипептидом(ами).

В случае непрерывной доставки предоставляемых полипептидов, например, в сочетании с внутривенным капельным введением, могут использоваться верхние пределы 0,01 г/кг веса тела в течение периодов времени, определяемых врачом на основании улучшения состояния. В другом примере верхние пределы концентрации предоставляемых нуклеиновых кислот, доставляемых местно, например, в кожные раны, будут составлять 5-10 мкг/см² раны в зависимости, например, от того, как нуклеиновая кислота комбинируется с другими агентами, стимулирующими ее действие или действующими совместно с нуклеиновыми кислотами. Введение будет повторяться с частотой, определяемой доктором на основании улучшения. В другом примере верхние пределы концентрации предоставляемых нуклеиновых кислот, доставляемых внутрь, например, внутримышечно, интрацеребрально, внутрисердечно и интраспинально, будут составлять 50-100 мкг/мл раствора. Опять же, частота будет определяться врачом на основе улучшения.

Также раскрыто предварительная обработка участка предоставляемыми полипептидами до хирургического вмешательства. Концентрация полипептидов может составлять 10-200 мкМ в смеси с 10-30% гелем на основе плюроника или любым таким носителем, который обеспечивает проникновение пептида(ов) в представляющий интерес участок в течение по меньшей мере 3-6 часов до хирургического вмешательства. Эта допроцедурная обработка может улучшить последующую ответную реакцию в виде заживления на хирургическое вмешательство, включая снижение воспалительной реакции.

Также раскрыто лечение субъекта, подверженного риску радиоактивного облучения, предоставляемыми полипептидами. В некоторых аспектах это лечение предотвращает последующее радиационное поражение, такое как радиационное поражение кожи. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые полипептиды вводят в концентрации от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 1000 мкМ. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые полипептиды вводят в концентрации, составляющей приблизительно 1 мкМ, приблизительно 5 мкМ, приблизительно 10 мкМ, приблизительно 15 мкМ, приблизительно 20 мкМ, приблизительно 25 мкМ, приблизительно 30 мкМ, приблизительно 35 мкМ, приблизительно 40 мкМ, приблизительно 45 мкМ, приблизительно 50 мкМ, приблизительно 55 мкМ, приблизительно 60 мкМ, приблизительно 65 мкМ, приблизительно 70 мкМ, приблизительно 75 мкМ, приблизительно 80 мкМ, приблизительно 85 мкМ, приблизительно 90 мкМ, приблизительно 95 мкМ, приблизительно 100 мкМ, приблизительно 110 мкМ, приблизительно 120 мкМ, приблизительно 130 мкМ, приблизительно 140 мкМ, приблизительно 150 мкМ, приблизительно 160 мкМ, приблизительно 170 мкМ, приблизительно 180 мкМ, приблизительно 190 мкМ, приблизительно 200 мкМ, приблизительно 225 мкМ, приблизительно 250 мкМ, приблизительно 275 мкМ или приблизительно 300 мкМ, или приблизительно 400 мкМ, или приблизительно 500 мкМ, или приблизительно 600 мкМ, или приблизительно 700 мкМ, или приблизительно 800 мкМ, или приблизительно 900 мкМ, или приблизительно 1000 мкМ, или приблизительно 1200 мкМ, или приблизительно 1500 мкМ, или приблизительно 2000 мкМ. В некоторых вариантах осуществления предоставляемые полипептиды вводят в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 100 мкМ. В других вариантах осуществления предоставляемые полипептиды вводят в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 200 мкМ. В еще одних вариантах осуществления предоставляемые полипептиды вводят в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 1000 мкМ.

В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту системно. Например, в некоторых вариантах композицию вводят путем ингаляции. В других вариантах осуществления композицию вводят субъекту парентерально. Например, в некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту путем внутривенной инъекции, подкожной инъекции, внутрибрюшинной инъекции или внутримышечной инъекции. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту парентерально в дозе от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг, или от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг, или от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг, или от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг, или от приблизительно 2 мг/кг до приблизительно 25 мг/кг, или от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 25 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту в дозе, составляющей приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 4 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 6 мг/кг, приблизительно 7 мг/кг, приблизительно 8 мг/кг, приблизительно 9 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 15 мг/кг, приблизительно 20 мг/кг, приблизительно 25 мг/кг, приблизительно 30 мг/кг приблизительно 35 мг/кг, приблизительно 40 мг/кг, приблизительно 45 мг/кг, приблизительно 50 мг/кг, приблизительно 60 мг/кг, приблизительно 70 мг/кг, приблизительно 80 мг/кг, приблизительно 90 мг/кг или приблизительно 100 мг/кг.

В некоторых вариантах осуществления предоставляемые полипептиды вводят субъекту по схеме ежедневного введения доз. В других аспектах предоставляемые полипептиды вводят субъекту по схеме еженедельного введения доз. В других аспектах предоставляемые полипептиды вводят субъекту по схеме ежемесячного введения доз.

В некоторых вариантах осуществления предоставляемые полипептиды вводят субъекту за по меньшей мере приблизительно 2 года, по меньшей мере приблизительно 1 год, по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, по меньшей мере приблизительно 60 дней, по меньшей мере приблизительно 30 дней, по меньшей мере приблизительно 20 дней, по меньшей мере приблизительно 10 дней, по меньшей мере приблизительно 7 дней, по меньшей мере, приблизительно 3 дня, по меньшей мере приблизительно 1 день, по меньшей мере приблизительно 23 часа, по меньшей мере приблизительно 22 часа, по меньшей мере приблизительно 21 час, по меньшей мере приблизительно 20 часов, по меньшей мере приблизительно 19 часов, по меньшей мере приблизительно 18 часов, по меньшей мере приблизительно 17 часов, по меньшей мере приблизительно 16 часов, по меньшей мере приблизительно 15 часов, по меньшей мере приблизительно 14 часов, по меньшей мере приблизительно 13 часов, по меньшей мере приблизительно 12 часов, по меньшей мере приблизительно 11 часов, по меньшей мере приблизительно 10 часов, по меньшей мере приблизительно 9 часов, по меньшей мере приблизительно 8 часов, по меньшей мере приблизительно 7 часов, по меньшей мере приблизительно 6 часов, по меньшей мере приблизительно 5 часов, по меньшей мере приблизительно 4 часа, по меньшей мере приблизительно 3 часа, по меньшей мере приблизительно 2 часа или по меньшей мере приблизительно 1 час до радиоактивного облучения. В других вариантах осуществления предоставляемые полипептиды вводят субъекту через по меньшей мере приблизительно 1 час, по меньшей мере приблизительно 2 часа, по меньшей мере приблизительно 3 часа, по меньшей мере приблизительно 4 часа, по меньшей мере приблизительно 5 часов, по меньшей мере приблизительно 6 часов, по меньшей мере приблизительно 7 часов, по меньшей мере, приблизительно 8 часов, по меньшей мере приблизительно 9 часов, по меньшей мере приблизительно 10 часов, по меньшей мере, приблизительно 11 часов, по меньшей мере приблизительно 12 часов, по меньшей мере приблизительно 13 часов, по меньшей мере приблизительно 14 часов, по меньшей мере приблизительно 15 часов, по меньшей мере приблизительно 16 часов, по меньшей мере приблизительно 17 часов, по меньшей мере приблизительно 18 часов, по меньшей мере приблизительно 19 часов, по меньшей мере приблизительно 20 часов, по меньшей мере приблизительно 21 час, по меньшей мере приблизительно 22 часа, при по меньшей мере приблизительно 23 часов, по меньшей мере приблизительно 1 день, по меньшей мере приблизительно 3 дня, по меньшей мере приблизительно 7 дней, по меньшей мере приблизительно 10 дней, по меньшей мере приблизительно 20 дней, по меньшей мере приблизительно 30 дней, по меньшей мере приблизительно 60 дней, по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, по меньшей мере приблизительно 1 год или по меньшей мере приблизительно 2 года после радиоактивного облучения. В некоторых аспектах предоставляемые полипептиды вводят от по меньшей мере приблизительно 1 дня до по меньшей мере приблизительно 30 дней после радиоактивного облучения. В конкретных вариантах осуществления предоставляемые полипептиды вводят через по меньшей мере приблизительно 1 день после радиоактивного облучения.

В некоторых вариантах осуществления ткань, подвергаемая облучению, включает, без ограничения, кожу, сердце, кость, головной мозг, спинной мозг, роговицу, сетчатку и периферический нерв. В некоторых аспектах ткань, подвергаемая облучению, представляет собой кожу. В некоторых аспектах предотвращение радиационного поражения с помощью предоставляемых полипептидов у субъекта, подверженного риску оказания такого поражения, оценивают путем определения средней оценки поражения кожи. В некоторых вариантах осуществления средняя оценка поражения кожи является сниженной на по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80% или по меньшей мере приблизительно 90% в присутствии предоставляемых полипептидов по сравнению с контролем. В конкретных вариантах осуществления средняя оценка поражения кожи является сниженной на по меньшей мере приблизительно 30% в присутствии предоставляемых полипептидов по сравнению с контролем.

Используемый здесь термин «оценка поражения кожи» относится к любым способам оценки степени поражения кожи и подлежащих тканей. Например, в некоторых вариантах осуществления оценку поражения кожи получают с использованием шкалы, известной как шкала Кумара, пример которой приведен в таблице 11. Таким образом, термин «средняя оценка поражения кожи», используемый здесь, представляет собой среднее значение оценок, полученных с использованием любого способа оценки и оценки поражения кожи и подлежащих тканей.

В некоторых вариантах осуществления радиационное поражение, происходящее в результате радиоактивного облучения, включает, без ограничения, радиационное поражение кожи (CRI; т.е. поражение кожи и подлежащих тканей в результате острого радиоактивного облучения), острую лучевую болезнь (ARS; серьезное заболевание, которое возникает после острой высокой дозы проникающего через все тело излучения), радиационные ожоги, радиационный дерматит, радиационное поражение нервной системы или головного мозга, радиационный пневмонит и радиационный энтерит. В некоторых аспектах радиационное поражение является радиационным поражением кожи. В других аспектах радиационное поражение представляет собой радиационные ожоги. В еще одном аспекте радиационное поражение представляет собой радиационный дерматит.

В некоторых вариантах осуществления ARS включает любой один или более из гемопоэтического синдрома или синдрома поражения костного мозга; желудочно-кишечного синдрома; нервно-сосудистого синдрома; сердечнососудистого синдрома или синдрома поражения центральной нервной системы. Эти термины используются взаимозаменяемо с другими терминами, известными в данной области техники, такими как «ARS с целенаправленным поражением гемопоэза», «ARS с целенаправленным поражением костного мозга», «ARS с целенаправленным поражением желудочно-кишечного тракта (GI)», «ARS с целенаправленным поражением сердца» и т.п. В некоторых вариантах осуществления субъект, подвергшийся воздействию ионизирующего излучения, может иметь любой один или любую комбинацию этих синдромов. В некоторых вариантах осуществления синдромы обозначаются, например, как.

В некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь композиции и способы применимы для лечения субъекта, имеющего комбинированное радиационное поражение. В некоторых вариантах осуществления субъект с комбинированным радиационным поражением имеет повреждение кожи, радиационные ожоги, CRI, ARS, радиационный дерматит и/или любое другое поражение или синдром, связанный с воздействием ионизирующего излучения. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются способы и композиции для лечения различных последствий воздействия ионизирующего излучения, и они могут включать местное, а также системное применение предоставляемых композиций.

В некоторых вариантах осуществления радиационное поражение происходит в результате взрыва грязной бомбы. Грязная бомба представляет собой взрывное устройство, которое рассеивает вредные радиологические вещества. Воздействие высоких уровней радиации от грязной бомбы может привести к появлению симптомов острой лучевой болезни или радиационных ожогов. Радиоактивное облучение вызывает поражение базальноклеточного слоя кожи и приводит к воспалению, эритеме, десквамации, сильному покраснению, образованию пузырей и изъязвлению облученного участка.

В некоторых вариантах осуществления раны и ожоги, загрязненные радионуклидами, способствуют системному поглощению радионуклидов, что значительно усложняет местную деконтаминацию и сортировку раненных и больных. В других вариантах осуществления радионуклидное загрязнение также препятствует заживлению ран. Поэтому в некоторых аспектах предоставляемые полипептиды предотвращают системное поглощение радионуклидов из очага радиационного поражения. В других аспектах предоставляемые полипептиды предотвращают или лечат радиационное поражение путем уменьшения кровоизлияния, тяжести поражения в виде термического ожога и образования рубцовой ткани в очаге радиационного поражения. В еще одних аспектах предоставляемые полипептиды стимулируют регенерации ткани в очаге радиационного поражения.

Также предоставляются материалы, включающие предоставляемые здесь композиции (например, полипептиды, нуклеиновые кислоты или векторы). Например, предоставляются материалы, используемые для лечения ран и/или радиационного поражения, причем материалы покрыты полипептидом АСТ. Неограничивающие примеры материалов, используемых для лечения ран, включают бинты, стерильные полоски, шовный материал, скобы или трансплантаты (например, кожные трансплантаты).

Например, материал (например, бинт, стерильная полоска, шовный материал, скоба, трансплантат) может быть пропитан предоставляемым полипептидом в концентрации в диапазоне 10-200 мкМ. Затем материал может быть высушен и запечатан в стерильный контейнер. Материал также может быть погружен в жидкий 10-30% гель на основе плюроника при 4°С, содержащий полипептид в концентрации 10-200 мкМ. Затем материал может быть доведен до приблизительно комнатной температуры, чтобы гель полимеризовался, оставляя слой пропитанного полипептидом геля вокруг материала, который можно запечатать в стерильный контейнер. Полипептид также может быть включен в сшиваемую гидрогелевую систему, такую как сополимер молочной и гликолевой кислоты (PLGA) или полиуретан, которые затем могут быть превращены в материалы для лечения ран (например, бинт, стерильную полоску, шовный материал, скобу, трансплантат). Таким образом, предоставляются композитные гидрогель-пептидные материалы.

Также раскрыты медицинские имплантаты, покрытые предоставляемым полипептидом перед имплантацией субъекту. Например, общая проблема при таких операциях по установке имплантатов заключается в образовании усадочной капсулы вокруг имплантата в результате образования рубцовой ткани, что приводит к чрезмерному затвердеванию, сжатию и, в конечном итоге, деформации представляющей интерес ткани. Использование полипептидов настоящего изобретения в или на имплантате может уменьшить или предотвратить эту деформацию. Неограничивающие примеры медицинских имплантатов включают: протезирование конечностей, грудные имплантаты, протезы полового члена, протезы яичек, искусственные глаза, лицевые имплантаты, искусственные суставы, протезы клапанов сердца, сосудистые протезы, зубные протезы, лицевые протезы, клапан с наклонным диском, клапан с возвратом шариков, ушной протез, носовой протез, кардиостимулятор, кохлеарный имплантат и заменители кожи (например, свиной гетеротрансплантат/свиная кожа, BIOBRANE, культивируемые кератиноциты).

Здесь предоставляется способ стимулирования заживления ран после поражения ткани у субъекта, включающий введение субъекту одной или более предоставляемых здесь композиций (например, полипептидов, нуклеиновых кислот или векторов) в фармацевтически приемлемом носителе. В некоторых вариантах осуществления рана является результатом радиационного поражения кожи. Кроме того, предоставляется способ лечения субъекта с поражением ткани (например, CRI), включающий введение субъекту одной или более предоставляемых здесь композиций (например, полипептидов, нуклеиновых кислот или векторов) в фармацевтически приемлемом носителе.

«Стимулировать», «стимулирование» и «содействие» относятся к увеличению активности, ответной реакции, состояния, заболевания или другого биологического параметра. Это может включать, но без ограничения, инициирование активности, ответной реакции, состояния или заболевания. Это может также включать, например, увеличение активности, ответной реакции, состояния или заболевания на 10% по сравнению с исходным или контрольным уровнем. Таким образом, увеличение может составлять 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% или любую степень увеличения между ними по сравнению с исходным или контрольным уровнями.

Термин «лечить» или «лечение» означает способ уменьшения последствий заболевания или состояния. Лечение может также относиться к способу устранения первопричины заболевания или состояния, а не только симптомов. Лечение может быть любым снижением по сравнению с исходным уровнем и может быть, но без ограничения, полным удалением заболевания, состояния или симптомов заболевания или состояния. Например, раскрытый способ стимулирования заживления ран считается лечением, если у субъекта с заболеванием наблюдается снижение на 10% одного или более симптомов заболевания по сравнению с исходными уровнями у того же субъекта или контрольных субъектов. Таким образом, снижение может составлять 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% или любую степень снижения между ними по сравнению с исходным или контрольным уровнями.

В некоторых аспектах настоящим изобретением предоставляются композиции и способы для предотвращения ARS, CRI, комбинированного радиационного поражения и/или радиационного дерматита; или сдерживания прогрессирования поражения в результате ARS, CRI, комбинированного лучевого поражения и/или радиационного дерматита в конкретной популяции пациентов, причем популяция пациентов включает субъектов, подверженных риску такого поражения.

Используемый здесь термин «субъект» включает, но без ограничения ими, животных, растения, бактерии, вирусы, паразиты и любой другой организм или существо, который имеет нуклеиновую кислоту. Субъектом может быть позвоночное, конкретнее, млекопитающее (например, человек, лошадь, свинья, кролик, собака, овца, коза, не являющийся человеком примат, корова, кошка, морская свинка или грызун), рыба, птица или рептилия или земноводное. Субъектом может быть беспозвоночное, конкретнее членистоногие (например, насекомые и ракообразные). Термин не обозначает конкретный возраст или пол. Таким образом, охватываются, как подразумевается, взрослые и новорожденные субъекты, а также плоды, будь то мужчины или женщины. В некоторых вариантах осуществления пациент относится к субъекту, пораженному заболеванием или нарушением. В некоторых вариантах осуществления популяция пациентов относится к конкретной, определенной совокупности субъектов, имеющих заболевание или нарушение или подверженных риску развития конкретного заболевания или нарушения. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются способы лечения, предотвращения или уменьшения тяжести радиационного поражения в популяции пациентов, включающей солдат и/или гражданских лиц, присутствующих в районе, подверженном войне и/или терроризму. В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением предоставляются способы лечения, предотвращения или уменьшения тяжести радиационного поражения в популяции пациентов, включающей субъектов с раком, получающих лучевую терапию. Термин «пациент» включает людей и субъектов-пациентов ветеринарных клиник.

Предоставляемый способ может уменьшать образование рубцовой ткани у субъекта после поражения ткани. Под «рубцовой тканью» подразумевается волокнистая (фиброзная) соединительная ткань, которая образуется в очаге поражения или заболевания в любой ткани организма, что вызвано сверхпродукцией дезорганизованного коллагена и других белков соединительной ткани, которая функционирует, чтобы залатать разрыв в ткани. Рубцовая ткань может заменять пораженную кожу и подлежащие мышцы, пораженную сердечную мышцу или пораженные участки внутренних органов, таких как печень. Плотная и толстая, она обычно бледнее окружающей ткани, поскольку она плохо снабжается кровью, и хотя она структурно заменяет разрушенную ткань, она не может выполнять функции отсутствующей ткани. Она состоит из коллагеновых волокон, которые часто ограничивают нормальную эластичность в вовлеченной ткани. Следовательно, рубцовая ткань может ограничивать диапазон мышечного движения или препятствовать правильной циркуляции жидкости при затрагивании лимфатической или кровеносной системы. Глиальная рубцовая ткань после поражения головного или спинного мозга является одним из основных препятствий на пути восстановления нервной функции после поражения центральной нервной системы. Уменьшение образования рубцовой ткани может оцениваться по популяции типов клеток в очаге поражения. Например, уменьшение образования глиальной рубцовой ткани можно оценить по увеличению отношения нейронов к астроцитам. Уменьшение образования рубцовой ткани можно определить путем простого измерения ширины рубца или площади рубцовой ткани (Wilgus et al., 2003). Кроме того, могут быть сделаны гистологические оценки восстановления структурной сложности в заживающей ткани по сравнению с нормальной тканью.

В дополнение к уменьшению образования фиброзной ткани у субъекта после поражения ткани, предоставляемые композиции и способы также могут использоваться для лечения нарушений, связанных с патологическим увеличением образования фиброзной ткани у субъекта, таких как, например, псориаз, кожный и системный мастоцитоз, астма, экзема, синусит, атеросклероз, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, рассеянный склероз, фиброз легких и муковисцидоз. Уменьшение образования фиброзной ткани у субъекта может быть определено согласно клинической оценке врача, оценивающего, привело ли лечение к восстановлению нормальной структуры и функции данной ткани и/или органа у субъекта. В качестве примера, при псориазе врач оценит кожу субъекта, чтобы определить, произошло ли уменьшение пятен на приподнятой красной коже, покрытой чешуйчатыми белыми образованиями. Некоторые виды псориаза характеризуются прыщами (пустулезный псориаз) или обожженным видом (эритродермический псориаз). В таких случаях врач определит, привело ли лечение к уменьшению этих симптомов. В случае ткани или органа у субъекта, в отношении которого врач считает, что биопсия является клинически доступной и/или необходимой, или в модели заболевания человека на животном, будут подготовлены куски ткани биоптатов, и будет оценена гистологическая структура ткани клиническим патологом и/или обученным гистопатологом, чтобы определить, произошло ли уменьшение фиброза и восстановление нормальной структуры и функции ткани. Площадь фиброза относительно нормальной ткани также может быть количественно оценена на таких гистологических препаратах.

Предоставляемый способ может восстанавливать нормальные механические свойства ткани, такие как прочность на разрыв, после поражения ткани у субъекта. «Прочность на разрыв» относится к величине усилия или напряжения, необходимого для разрыва ткани или раны.

Прочность на разрыв подвергнутых лечению ран может составлять 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100% от непораженных тканей в течение 3 месяцев после лечения. Таким образом, предоставляется способ восстановления механических свойств ткани, в том числе увеличения прочности на разрыв зажившего поражения, чтобы приблизиться или достичь таковой нормальной неповрежденной ткани, у субъекта, включающий введение субъекту одной или более предоставляемых здесь композиций (например, полипептидов, нуклеиновых кислот или векторов) в фармацевтически приемлемом носителе.

Тип ран, который будет важен в отношении прочности на разрыв/способность к растяжению, будет включать повреждения мышечно-скелетных структур/тканей и кожи, покрывающей эти структуры. Например, предоставляемые способы могут увеличить прочность на разрыв суставов сочленяющихся костей, костей, хрящей, сухожилий или связок. Предоставляемые способы также могут увеличить прочность на разрыв кожи при более высоких степенях усилий/напряжения, такой как кожа, покрывающая локоть, колено или ступню. Наиболее распространенные проблемы, связанные с заживлением повреждений суставов, заключаются в том, что чрезмерное образование рубцов в этих областях приводит к сокращению и не способности к растяжению залеченной области сустава. Это имеет серьезные косметологические и психологические последствия. Свойства пептидов помогут модулировать и уменьшить образование такой рубцовой ткани, что приводит к большей подвижности сустава.

Предоставляемый способ может увеличить регенерацию ткани после поражения ткани у субъекта. Под «регенерацией» подразумевается обновление, повторный рост или восстановление организма или части тела, ткани или вещества после поражения или как нормальный процесс в организме. В отличие от рубцевания, регенерация ткани включает восстановление ткани до ее первоначального структурного, функционального и физиологического состояния. Это также упоминается здесь как «сложность» ткани. Восстановление может быть частичным или полным, т.е. восстановлением на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% или любой степенью восстановления между ними по сравнению с исходными или контрольными уровнями. В качестве примера, в случае поражения кожи регенерация ткани может включать восстановление волосяных фолликулов, железистых структур, кровеносных сосудов, мышц или жира. В случае поражения головного мозга регенерация тканей может включать поддержание или восстановление нейронов. В качестве примера, в случае кожи увеличение регенерации ткани может быть оценено путем измерения объема фиброзной рубцовой ткани по отношению к нормальной регенерированной коже в виде отношения. В качестве другого примера можно сделать подсчет дискретных регенерирующихся структур, таких как регенерирующиеся кожные железы, приведенных к объему области раны.

В одном аспекте регенерация ткани включает рекрутирование и дифференцировку стволовых клеток для замены пораженных клеток. Используемый здесь термин «стволовая клетка» представляет собой недифференцированную клетку, обнаруживаемую среди дифференцированных клеток в ткани или органе или введенную из внешнего источника, например, в случае эмбриональных стволовых клеток, стволовых клеток костного мозга взрослого субъекта, которые могут сами обновляться и дифференцироваться с выходом основных специализированных типов клеток ткани или органа. Основные роли стволовых клеток в живом организме заключается в поддержании и восстановлении тканей, в которых они находятся. Под дифференцировкой стволовых клеток подразумевается процесс, посредством которого неспециализированная клетка (например, стволовая клетка) приобретает признаки специализированной клетки, такой как клетка кожи, нервная клетка, клетка сердца, печени или мышечная клетка. В качестве примера, в случае поражения кожи регенерация ткани может включать дифференцировку стволовых клеток, присутствующих в эпителии, в волосяных фолликулах (Alonso and Fuchs, 2003). В случае поражения головного мозга регенерация тканей может включать дифференцировку стволовых клеток в нейроны. Предоставляемый способ может усиливать дифференцировку стволовых клеток после поражения ткани у субъекта. Усиление дифференцировки стволовых клеток может быть определено путем обеспечения клинически приемлемых генетических или других средств маркировки эндогенных или трансплантированных стволовых клеток и определения частоты дифференцировки и включения маркированных стволовых клеток в структуры нормальной ткани. В качестве другого примера известно, что определенные структуры, такие как волосяные фолликулы, регенерируются из эндогенных стволовых клеток после поражения ткани. Таким образом, количество волосяных фолликулов, приведенное к площади поражения ткани, будет служить количественной оценкой усиления дифференцировки стволовых клеток.

Предоставляемый способ может уменьшить воспаление у субъекта. Под «воспалением», «воспалительной реакцией» или «иммунным ответом» подразумевается реакция живых тканей на поражение, инфекцию или раздражение, для которой характерно покраснение, повышение температуры в очаге поражения, припухлость, боль и потеря функции, вызванные усилением кровотока и притоком иммунных клеток и секрецией. Воспаление является реакцией организма на вторжение инфекционных микроорганизмов и приводит к увеличению притока крови к пораженному участку, выбросу химических веществ, которые притягивают лейкоциты, увеличению потока плазмы и появлению моноцитов (или астроцитов в случае головного мозга) для избавления от дебриса. Все, что стимулирует воспалительную реакцию, считается воспалительным. Таким образом, в дополнение к уменьшению воспаления у субъекта в ответ на поражение ткани предоставляемые композиции и способы также могут использоваться для лечения нарушений, связанных с патологическим увеличением уровней клеток воспаления, включая, например, астму, экзему, синусит, атеросклероз, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, кожный и системный мастоцитоз, псориаз и рассеянный склероз. Лечение предоставляемым полипептидом может также уменьшить зуд, например, при заживлении ран. Обычно зуд возникает в результате выброса гистамина тучными клетками. Предоставляемый полипептид может уменьшить дегрануляцию тучных клеток и выброс гистамина. Таким образом, предоставляемый полипептид может использоваться для лечения состояний, включающих выброс гистамина, включая, но без ограничения этим, зуд, расчесывание, раздражение в пазухе, аллергический кашель, покраснение глаз, астму и экзему.

Уменьшение воспаления можно определить по уменьшению плотности типов клеток воспаления, таких как, например, моноциты или астроциты. Уменьшение воспаления можно определить по уменьшению плотности типов клеток воспаления, таких как, например, нейтрофилы, тучные клетки, базофилы и моноциты. Уменьшение воспаления можно рассчитать путем измерения активности нейтрофилов in vivo (Jones et al., 1994). Кроме того, такие факторы, как частота дегрануляции тучных клеток, или измерение уровней гистамина или уровней активных форм кислорода, могут использоваться в качестве определений уменьшения воспаления. Уровень воспаления можно также косвенно определить путем проверки уровней транскрипции некоторых генов с помощью количественной ОТ-ПЦР, например, для таких генов, как интерферон-альфа, -бета и -гамма, фактор некроза опухолей-альфа, интерлейкин-1 бета, -2, -4, -5, -6, -8, - 12, - 18, -23, -27, CD4, CD28, CD80, CD86, MHCII и iNOS. Измеряя уровни провоспалительных цитокинов в тканях и/или жидкостях организма субъекта, включая плазму, можно определить уменьшение воспаления. Следует отметить, что механизм действия пептида ACT может заключаться в ингибировании миграции воспалительных клеток и/или ингибировании провоспалительных химических веществ (гистамина, активных форм кислорода) и провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин (IL)-1, IL-6, IL-8 и фактор некроза опухоли (TNF).

Предоставляемый способ может ингибировать пролиферацию трансформированной клетки у субъекта. Под трансформированной клеткой подразумевается новообразование, раковая или опухолевая клетка, которая делится и размножается анормально с неконтролируемым ростом. Таким образом, ингибирование пролиферации (т.е. гиперплазии) указанных трансформированных клеток приводит к уменьшению роста и, следовательно, злокачественности рака. Репрезентативный, но не ограничивающий список раковых заболеваний, для лечения которых могут использоваться описанные композиции и способы, является следующим: глиома, лимфома, В-клеточная лимфома, Т-клеточная лимфома, грибковый микоз, болезнь Ходжкина, миелоидный лейкоз, рак мочевого пузыря, рак головного мозга, рак нервной системы, рак головы и шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи, рак почки, рак легких, такой как мелкоклеточный рак легкого и немелкоклеточный рак легкого, нейробластома, глиобластома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак простаты, рак кожи, рак печени, меланома, плоскоклеточный рак полости рта, горла, гортани и легких, рак толстой кишки, рак шейки матки, карциному шейки матки, рак молочной железы и эпителиальный рак, рак почки, рак мочеполовой системы, рак легких, рак пищевода, карциному головы и шеи, рак толстой кишки, гемопоэтические раки, рак яичка, рак толстой и прямой кишки, рак простаты или рак поджелудочной железы. Таким образом, предоставляемый способ может использоваться для лечения рака у субъекта. Например, предоставляемый способ может использоваться для лечения глиомы у субъекта.

Ингибирование пролиферации трансформированных клеток можно определить с помощью ряда маркеров пролиферации клеток и их наборов, например, для иммуноокрашивания Ki67/MIB-1, индексов мечения 3Н-тимидином или бромдезоксиуридином, фракции S-фазы ДНК, экспрессии ядерного антигена пролиферирующихся клеток, потенциального времени удвоения и анализа белков, ассоциированных с областью ядрышкового организатора (AgNOR). Поскольку пролиферативная активность опухоли зависит как от доли клеток, участвующих в цикле (ростовой фракции), так и от скорости клеточного цикла, фактическая пролиферативная активность опухоли вполне может быть определена с помощью уравнения [PA=оценки Ki67 или MIB-1 X AgNOR] (Pich et al., 2004). В другом примере гистопатологи имеют опыт в оценке срезов тканей биопсии с использованием простых качественных и количественных показателей митоза для определения пролиферации в популяциях трансформированных клеток.

Для исследования рака были разработаны различные модели на мышах. Существуют конкретные модели на мыши определенных типов рака, например, рака мочевого пузыря, рака шейки матки, рака эндометрия, рака желудочно-кишечного тракта, рака мочеполовой системы, рака головы и шеи, гемопоэтического рака, рака почки, рака легких, рака молочной железы, меланомы, миеломы, рака нервной системы, рака ротовой полости, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака простаты, саркомы, рака кожи. Эти модели хорошо описаны и используются. Благоприятные эффекты полипептидов, нуклеиновых кислот или векторов, предоставляемых здесь, могут быть изучены на любой из этих моделей. Например, модель рака кожи на мыши может легко использоваться для демонстрации. Рак можно культивировать, применяя ксенотрансплантатную модель выращивания раковых тканей человека с использованием особой, свободной от патогенов, гомозиготной инбредной мыши (голой мыши) (Yoo, 2004). Предоставляемые здесь полипептиды, нуклеиновые кислоты или векторы могут вводиться местно, например, в случае полученных с помощью биоинженерии материалов, таких как мембраны из полых волокон (Orlandini and Margaria. 1983; Ming Chu et al., 1998), и микроволокона, шарики с медленным высвобождением, иглы для подкожных инъекций, постоянные катетеры, которые могут быть вставлены локально в растущую раковую опухоль, или вводиться системно для достижения своей цели, например, для внутривенных инфузий, внутримышечных, внутрибрюшинных инъекций. Это лечение может быть назначено само по себе или в сочетании с другими терапевтическими соединениями, например, химиотерапевтическими средствами.

Предоставляемый способ может ингибировать метастазирование трансформированной клетки у субъекта. Под «метастазированием» подразумевается перенос раковых клеток из исходного очага в одно или более мест в других частях тела, обычно с помощью кровеносных сосудов или лимфатической системы. Метастазирование можно разбить на ряд событий. Во-первых, миграция раковых клеток начинает процесс, посредством которого опухолевые клетки покидают первичное место роста, часто проникая через базальную мембрану и двигаясь в направлении локальной сосудистой сети. Интравазация описывает процесс проникновения раковых клеток в сосудистую сеть и распространения в отдаленные места. Экстравазация относится к процессу выделения раковых клеток из сосудистой системы. Наконец, на пролиферацию раковых клеток в отдаленном месте оказывает сильное влияние локальная доступность факторов роста, влияние стромальных клеток и окружающая среда в виде экстраклеточного матрикса (так называемая «почва»), а также доступность питательных веществ и факторов, обеспечиваемых с помощью результирующей васкуляризации растущей опухоли. Таким образом, предоставляемые композиции и способы могут ингибировать метастазирование трансформированной клетки у субъекта путем ингибирования миграции (т.е. метастатической миграции) указанной клетки. Канцерогенез является результатом дезорганизации клеточного цикла, что приводит к неконтролируемой пролиферации клеток. Определенные клеточные процессы-механизмы, которые контролируют продвижение по клеточному циклу и прохождение через фазы между митозами в качестве контрольных точек, не регулируются. Обычно эти события являются высококонсервативными из-за существования консервативных механизмов и молекул, таких как гены клеточного цикла и их продукты. Ингибирование метастатической миграции может быть определено по уровням таких генов и продуктов клеточного цикла, например, циклинов, циклинзависимых киназ (Cdks), ингибиторов Cdk (CKI) и экстраклеточных факторов (т.е. факторов роста). Революционные методы с использованием лазерной цитометрии и коммерческого программного обеспечения доступны для количественной оценки и оценки циклических процессов в клетках и клеточного роста. Измерения фракции S-фазы, включая значения плоидности, с использованием гистограмм и оценки таких показателей, как митотический индекс и индексы времени удвоения опухолевых клеток, предоставляют врачу соответствующую информацию для оценки агрессивности опухоли.

Как здесь используется, поражение ткани может быть вызвано, например, царапиной, порезом, рваной раной, раздавленной раной, компрессионной раной, растяжением, укушенной раной, ссадиной, пулевой раной, взрывным поражением, пирсингом тела, колотой раной, ожоговой раной, ветровым ожогом, солнечным ожогом, химическим ожогом, хирургической раной, хирургическим вмешательством, медицинским вмешательством, отторжение хозяином после трансплантации клетки, ткани или органа, фармацевтическим эффектом, фармацевтическим побочным эффектом, пролежнем, радиационным поражением, косметической раной кожи, внутренним поражением органа, процессом заболевания (например, астмой, раком), инфекцией, инфекционным агентом, процессом развития, процессом созревания (например, акне), генетической аномалией, аномалией развития, токсином окружающей среды, аллергеном, травмой скальпа, травмой лица, травмой челюсти, травмой стопы, травмой пальцев ног, травмой пальцев, повреждением костей, повреждением половых органов, повреждением суставов, поражением экскреторных органов, повреждением глаз, повреждением роговицы, повреждением мышц, поражением жировой ткани, поражением легких, поражением дыхательных путей, грыжей, повреждением заднего прохода, геморроем, травмой ушей, травмой сетчатки, травмой кожи, травмой живота, травмой рук, травмой ног, спортивной травмой, повреждением спины, травмой при родах, травмой при преждевременных родах, токсическим укусом, укусом, травмой сухожилий, травмой связок, поражением сердца, поражением клапанов сердца, поражением сосудистой системы, повреждением хряща, поражением лимфатической системы, черепно-мозговой травмой, вывихом, перфорацией пищевода, фистулой, повреждением ногтя, инородным телом, переломом, обморожением, травмой руки, нарушением при тепловом стрессе, рваной раной, травмой шеи, самоповреждением, шоком, травмой мягких тканей, повреждением спинного мозга, повреждением позвоночника, растяжением, растяжением, повреждением сухожилия, повреждением связки, повреждением хряща, повреждением грудной клетки, повреждением зуба, травмой, поражением нервной системы, старением, аневризмой, инсультом, поражением пищеварительного тракта, инфарктом или ишемическим повреждением.

В некоторых вариантах осуществления поражение ткани является результатом радиационного поражения. В некоторых вариантах осуществления радиационное поражение включает, без ограничения, радиационное поражение кожи (т.е. поражение кожи и подлежащих тканей от острого радиоактивного облучения), острую лучевую болезнь (т.е. серьезное заболевание, которое возникает после острой высокой дозы проникающего через все тело излучения), радиационные ожоги, радиационный дерматит, радиационное поражение нервной системы или головного мозга, радиационный пневмонит и радиационный энтерит. В некоторых аспектах радиационное поражение является радиационным поражением кожи. В других аспектах радиационное поражение представляет собой радиационные ожоги. В еще одном аспекте радиационное поражение представляет собой радиационный дерматит. В некоторых вариантах осуществления радиационное поражение кожи происходит в результате взрыва «грязной» бомбы.

В некоторых вариантах осуществления радиационное поражение возникает в ткани, включающей, без ограничения, кожу, сердце, кость, головной мозг, спинной мозг, роговицу, сетчатку и периферический нерв. В некоторых аспектах радиационное поражение возникает на коже. В некоторых вариантах осуществления радиационное поражение ткани вызывает поражение базальноклеточного слоя кожи. В некоторых аспектах радиационное поражение базальноклеточного слоя кожи приводит к симптомам, включающим, но без ограничения ими, воспаление, эритему, десквамацию, сильное покраснение, образование пузырей и изъязвление облученного участка.

В некоторых вариантах осуществления раны и ожоги, загрязненные радионуклидами, способствуют системному поглощению радионуклидов, что значительно усложняет местную деконтаминацию и сортировку раненных и больных. В других вариантах осуществления радионуклидное загрязнение также препятствует заживлению ран. Поэтому в некоторых аспектах предоставляемые полипептиды предотвращают или лечат радиационное поражение путем предотвращения системного поглощения радионуклидов из раны или ожога в очаге радиационного поражения. В других аспектах предоставляемые полипептиды предотвращают или лечат радиационное поражение путем уменьшения кровоизлияния, тяжести поражения в виде термического ожога и образования рубцовой ткани в очаге радиационного поражения. В еще одних аспектах предоставляемые полипептиды стимулируют регенерации ткани в очаге радиационного поражения.

Пептиды и/или другие препараты, воплощающие настоящее изобретение, будут модулировать миграцию и пролиферацию клеток, тем самым уменьшая воспаление, ускоряя заживление ран, уменьшая рубцевание и, в конечном счете, способствуя восстановлению, регенерации и восстановлению структуры и функции во всех тканях. Заживление ран, после применения пептидов, будет включать значительное уменьшение фиброза, следовательно, уменьшение рубцевания кожных ран и фиброзных участков при поражениях внутренних тканей, стимулирование регенерации ткани и восстановлению структуры и функции ткани и органа.

Указанные пептиды и/или другие препараты могут использоваться для лечения внутреннего поражения, вызванного наружным поражением. В некоторых вариантах осуществления наружное поражение вызвано радиационным поражением. В некоторых вариантах осуществления внутреннее поражение может быть вызвано радионуклеотидами, которые вызывают внутреннее системное загрязнение через загрязненные ожоги и раны. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предоставляемые здесь способы и композиции обеспечивают лечение, предотвращение и/или ингибирование прогрессирования внутреннего радиационного поражения. Внутреннее радиационное поражение в некоторых вариантах осуществления является результатом системного радиационного загрязнения. Системное радиационное загрязнение может быть результатом прямого введения радионуклеотидов или проникновения радионуклеотидов из загрязненных ожогов и ран. В некоторых аспектах радиационное поражение включает, без ограничения, радиационное поражение кожи (т.е. повреждение кожи и подлежащих тканей в результате острого радиоактивного облучения), острую лучевую болезнь (т.е. серьезное заболевание, которое возникает после острой высокой дозы проникающего через все тело излучения), радиационные ожоги, радиационный дерматит, радиационное поражение нервной системы или головного мозга, радиационный пневмонит и радиационный энтерит. В некоторых аспектах радиационное поражение является радиационным поражением кожи. В других аспектах радиационное поражение представляет собой радиационные ожоги. В еще одном аспекте радиационное поражение представляет собой радиационный дерматит. В некоторых вариантах осуществления радиационное поражение кожи происходит в результате взрыва «грязной» бомбы.

Поражение внутренних органов вызывает фиброзную реакцию, которая приводит к потере структуры и функции в системах органов. В центральной нервной системе (ЦНС) эта реакция на поражение опосредуется астроцитами (фибробластоподобными клетками в ЦНС) и, соответственно, впоследствии будет называться астроцитарной реакцией. Варианты осуществления настоящего изобретения будут ослаблять эту фиброзную/астроцитарную реакцию, следовательно, помогая в восстановлении и регенерации пораженных тканей и восстановлении структуры и функции тканей и органов. Дальнейшие варианты осуществления настоящего изобретения включают использование указанных пептидов и/или других препаратов для увеличения ангиогенеза путем стимуляции ангиогенных факторов, таких как, но без ограничения этим, VEGF, и увеличения дифференцировки сосудистых тканей, тем самым увеличивая приток крови к очагу поражения ткани. Увеличенное кровоснабжение раневого участка, стимулируемое средствами лечения авторов настоящего изобретения, приведет к уменьшению рубцевания наружных и внутренних ран и будет способствовать улучшенному восстановлению и регенерации тканей и органов. Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения включают применение указанных пептидов и/или других препаратов для регенерации тканей и органов при введении в сочетании со стволовыми клетками и/или лекарственными средствами, и/или другими эндогенными и/или клиническими схемами, способствующими мобилизации стволовых клеток и/или регенерация тканей. Стволовые клетки помогут в регенерации тканей, и лечение авторов настоящего изобретения будет способствовать дифференцировке прямо и/или косвенно с помощью процессов, которые включают, но без ограничения этим, уменьшение образования фиброзного/астроцитарного рубца, тем самым восстанавливая нормальную структуру и функцию ткани.

Композиции и способы способствуют созданию благоприятной среды in vivo для регенерации и восстановления структуры и функции тканей и органов. Регенеративные процессы, которым помогает пептид авторов настоящего изобретения, включают, но не ограничения ими, внутренние и внешние поражения, регенерацию тканей, органов или других частей тела, заживление и восстановление функций после окклюзии и ишемии сосудов, инсульта головного мозга, инфаркта миокарда, повреждения спинного мозга, повреждения головного мозга, повреждения периферических нервов, повреждения сетчатки, повреждения костей, радиоактивного облучения и других повреждений тканей, вызывающих разрушение, повреждение или же являющихся результатом, но без ограничения, травмы, хирургического вмешательства, рака, врожденного порока развития и порока развития, а также заболеваний, вызывающих прогрессирующую потерю структуры и функции ткани, включая, помимо прочего, диабет, бактериальные, вирусные и прионные заболевания, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, СПИД и другие наследственные, экологически обусловленные или идиопатические заболевания, вызывающие потерю структуры и функции ткани/органа/части тела. Кроме того, предоставляемые пептиды могут вводиться с лекарственными средствами или другими соединениями, стимулирующими регенерацию тканей и клеток, включающими, но без ограничения этим, трофические факторы в процессах, включающих, но без ограничения этим, регенерацию головного мозга, сетчатки, спинного мозга и периферической нервной системы (например, NGF, FGF, нейротрофины, нейрегулины, эндотелины, GDNF, BDNF, BMP, TGF, Wnt).

Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения включают доставку указанных пептидов и/или других препаратов с использованием таких методов, как, но без ограничения ими, все последовательности Antennapedia и соответствующие векторы клеточной интернализации (например, домен трансдукции белка TAT, все пептиды TAT, все белки слияния ТАТ), вирусные векторы доставки генов, экспрессионные ДНК-векторы и любой другой метод доставки, который может помочь доставить пептид авторов настоящего изобретения в тканевой и/или клеточный центр действия отдельно или в сочетании с другими агентами, включающими, но без ограничения, кофакторы, способствующие этой доставке (например, включая, но без ограничения этим, TAT-HA2) и/или стволовые клетки, лекарственные средства и другие препараты, которые помогают в восстановлении, регенерации и восстановлении структуры и функции органов и тканей.

Композиции, раскрытые здесь, и композиции, необходимые для осуществления раскрытых способов, могут быть изготовлены с использованием любого способа, известного специалистам в данной области техники, для этого конкретного реагента или соединения, если специально не указано иное.

Например, предоставляемые нуклеиновые кислоты могут быть получены с использованием стандартных способов химического синтеза или могут быть получены с использованием ферментативных способов или любого другого известного способа. Такие способы могут варьировать от стандартного ферментативного расщепления с последующим выделением нуклеотидных фрагментов (смотрите, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratoiy Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), главы 5, 6) до чисто синтетических способов например, цианоэтилфосфорамидитным способом с использованием ДНК-синтезатора Milligen and Beckman System 1Plus (например, автоматического синтезатора модели 8700 Milligen-Biosearch, Burlington, Mass или ABI модели 380B). Синтетические способы, применимые для получения олигонуклеотидов, также описаны Ikuta et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984) (фосфотриэфирный и фосфитный триэфирный способ) и Narang et al., Methods Enzymol, 65:610-620 (1980) (фосфотриэфирный способ). Молекулы нуклеопротеинов могут быть получены с использованием известных способов, таких как способы, описанные Nielsen et al., Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994).

Один из способов получения раскрытых полипептидов, таких как SEQ ID NO:2, заключается в соединении двух или более пептидов или полипептидов вместе методами белковой химии. Например, пептиды или полипептиды могут быть химически синтезированы с использованием доступного в настоящее время лабораторного оборудования, используя химию с использованием Fmoc (9-флуоренилметилоксикарбонила) или Boc (трет-бутилоксикарбоноила) (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif.). Специалист в данной области техники может легко понять, что пептид или полипептид, соответствующий раскрытым белкам, например, может быть синтезирован с использованием стандартных химических реакций. Например, пептид или полипептид может быть синтезирован и не отщеплен от смолы, используемой для его синтеза, тогда как другой фрагмент пептида или белка может быть синтезирован и впоследствии отщеплен от смолы, тем самым снимая защиту концевой группы, которая функционально блокирована на другом фрагменте. В результате реакций конденсации пептидов эти два фрагмента могут быть ковалентно связаны через пептидную связь на их С- и N-конце, соответственно, с образованием белка или его фрагмента (Grant G A (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N.Y. (1992); Bodansky M and Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY (который включен сюда посредством ссылки, по меньшей мере, ради материала, относящегося к синтезу пептидов.) Альтернативно, пептид или полипептид независимо синтезируют in vivo, как здесь описано. После выделения эти независимые пептиды или полипептиды могут быть связаны с образованием пептида или его фрагмента через аналогичные реакции конденсации пептидов.

Например, ферментативное лигирование клонированных или синтетических пептидных сегментов позволяет соединять относительно короткие пептидные фрагменты с получением более крупных пептидных фрагментов, полипептидов или целых белковых доменов (Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991). Альтернативно, встречающееся в природе химическое лигирование синтетических пептидов может быть использовано для синтетического конструирования больших пептидов или полипептидов из более коротких пептидных фрагментов. Этот способ состоит из двухэтапной химической реакции (Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)). Первым этапом является хемоселективная реакция незащищенного синтетического пептида-тиоэфира с другим незащищенным пептидным сегментом, содержащим N-концевой остаток Cys, с получением промежуточного соединения, связанного с тиоэфиром, в качестве первоначального продукта ковалентного соединения. Без изменения условий реакции это промежуточное соединение подвергается спонтанной, быстрой внутримолекулярной реакции с образованием встречающейся в природе пептидной связи в месте лигирования (Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I et al., J. Biol. Chem., 269:16075 (1994); Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)).

Альтернативно, связывают незащищенные пептидные сегменты химически, причем связь, образуемая между пептидными сегментами в результате химического лигирования, представляет собой неприродную (непептидную) связь (Schnolzer, M. et al. Science, 256: 221 (1992)). Этот метод был использован для синтеза аналогов белковых доменов, а также больших количеств относительно чистых белков с полной биологической активностью ((deLisle Milton R C et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267 (1992)).

Раскрыты способы изготовления композиций, а также промежуточных продуктов, приводящих к композициям. Существует ряд способов, которые могут использоваться для изготовления этих композиций, таких как синтетические химические способы и стандартные методы молекулярной биологии. Понятно, что способы изготовления этих и других раскрытых композиций конкретно раскрыты. Раскрыты молекулы нуклеиновых кислот, полученные способом, включающим функциональное связывание нуклеиновой кислоты, кодирующей раскрытый здесь полипептид, и последовательности, контролирующей экспрессию этой нуклеиновой кислоты. Раскрыты клетки, полученные в результате процесса трансформации клетки любой из раскрытых здесь нуклеиновых кислот. Раскрыты любые их раскрытых пептидов, полученные способом экспрессии любых из раскрытых здесь нуклеиновых кислот. Раскрыты животные, полученные в результате процесса трансфекции клетки внутри организма животного любой из молекул нуклеиновых кислот, раскрытых здесь. Раскрыты животные, полученные в результате процесса трансфекции клетки внутри организма животного любой из молекул нуклеиновых кислот, раскрытых здесь, причем животным является млекопитающее. Также раскрыты животные, полученные в результате процесса трансфекции клетки внутри животного любой из молекул нуклеиновых кислот, раскрытых здесь, причем млекопитающим является мышь, крыса, кролик, корова, овца, свинья или примат. Также раскрыты животные, полученные путем добавления к животному любой из раскрытых здесь клеток.

Описанные выше материалы, а также другие материалы могут быть упакованы вместе в любом подходящем сочетании в виде набора, применимого для выполнения или помощи в выполнении раскрытого способа. Полезно, если компоненты набора в данном наборе разработаны и адаптированы для совместного применения в раскрытом способе. Например, раскрыты наборы для ускорения заживления ран, при этом набор включает один или более полипептидов, нуклеиновых кислот или векторов, предоставляемых здесь, в фармацевтически приемлемом носителе. Такие наборы могут также включать гели, повязки, ленты Millipore, Q-наконечники с лекарственными средствами, спреи, опоры, сиропы, жидкости, одноразовые пробирки или пакеты. Наборы также могут содержать инструкции по правильному использованию и информацию о безопасности продукта или препарата. Наборы могут содержать информацию о дозе в зависимости от применения и способа введения, определяемого врачом.

Раскрытые способы и композиции применимы к многочисленным областям, включая, но без ограничения, инструменты для лабораторных исследований. Эти препараты играют регуляторные роли в нескольких клеточных процессах, например, пролиферации клеток, миграции клеток. Эти препараты могут использоваться в лаборатории в модельных системах как in vitro, так и in vivo для изучения различных клеточных процессов, регулирований клеточного цикла, поведения клеток, реакций клеток, органов или тканей на тестируемые соединения и т.д. Препараты могут поставляться сами по себе или в комбинации с другими соединениями или как часть набора, такого как набор для анализа пролиферации клеток. Набор может содержать препараты, упомянутые здесь, сами по себе или в сочетании с другими соединениями. Такой набор будет включать инструкции, предназначенные для облегчения эксперимента. Другие применения раскрыты, очевидны из раскрытия и/или будут понятны специалистам в данной области техники.

Примеры

Пример 1. Эффективность местного применения Granexin® в лечении и предотвращении радиационного поражения кожи - исследование отложенного применения.

Из-за сходства кожи свиньи и человека свинья считается оптимальной моделью на крупном животном для изучения CRI. Валидационные исследования подтверждают, что йоркширские свиньи являются лучшей моделью на животном для оценки эффективности медицинских контрмер по предотвращению и сдерживанию прогрессирования CRI, в случае которого кожное облучение в 45 Гр (в виде одной дозы) приводит к контролируемому, воспроизводимому радиационному поражению всей толщины кожи; без вызова системной заболеваемости или смертности. Используя эту подтвержденную модель CRI на йоркширских свиньях, было проведено исследование эффективности и реакции на дозу для оценки эффективности местного применения Granexin® с целью предотвращения и сдерживания прогрессирования и уменьшения степени тяжести CRI. Использовали четыре животных (2 самца и 2 самки йоркширских свиней (S&S Farms)), приблизительно 3-месячного возраста, 32,4-41,1 кг при облучении. В день 0 каждое животное анестезировали и подвергали воздействию отдельных фракций электронов низких энергий (6 МэВ) с использованием линейного ускорителя Varian CL1NAC 21EX для 10 отдельных участков диаметром 4 см на околопозвоночной задней поверхности кожи при острой целевой дозе 45 Гр. Было установлено, что параметры облучения имитируют характерные особенности снижения дозы на глубине, связанные с бета-облучением, сходным с бета-энергией Sr-90 и других вероятных изотопов из RDD (радиологического распыляющего устройства). Для каждого участка использовалась свинцовая защита, чтобы ограничить поле генерируемого конусом (15×15 см²) электронного пучка требуемой областью воздействия в виде круга диаметром 4 см. Тканеэквивалентный заполнитель (8 мм) помещали на поверхность кожи, чтобы гарантировать, что более 90% предписанной дозы будет ограничено максимальной глубиной 2 см. Для облучения экспозиция (мониторные единицы, MU) рассчитывалась по формуле: MU=Доза/((Общий выходной коэффициент) X (Коэффициент нормализации)), где: MU - настройка блока монитора; Доза представляет собой номинальную доставленную дозу в сГр; Коэффициент общего выходного излучения представляет собой коэффициент выходного излучения, который включает соответствующий конус и вырез свинца на расстоянии 100 см от источника до поверхности; и Коэффициент нормализации представляет собой выходное излучение, измеренное в день облучения.

Цель этого исследования состояла в том, чтобы оценить эффективность местного применения Granexin® в лечении и предотвращении радиационного поражения кожи на его модели с использованием йоркширской свиньи. Конкретнее, исследование проводилось для оценки того, может ли гель Granexin® замедлять прогрессирование и/или уменьшать тяжесть симптомов, связанных с CRI.

Granexin® представляет собой гель для местного применения, содержащий 1,25% геля на основе гидроксиэтилцеллюлозы и пептид ACT1. Химическая структура пептида ACT1 в Granexin® такова: биотин-Ahx-Arg-Gln-Pro-Lys-Ile-Trp-Phe-Pro-Asn-Arg-Arg-Lys-Pro-Trp-Lys-Lys-Arg-Pro-Arg-Pro-Asp-Asp-Leu-Glu-Ile-OH (SEQ ID NO:91), где Ahx представляет собой L-2-аминогексановую кислоту (6-аминогексановую кислоту). Granexin®, использованный в настоящем примере, также включал следующие неактивные ингредиенты:

Консерванты: метилпарабен (0,17% в весовом отношении) и пропилпарабен (0,02% в весовом отношении)

Растворители: глицерин (5% в весовом отношении), пропиленгликоль (3% в весовом отношении) и очищенную воду (достаточное количество)

Буферные вещества: одноосновный фосфат натрия (0,263% в весовом отношении) и двухосновный фосфат натрия (0,044% в весовом отношении)

Комплексообразующий агент: эдетат динатрия (0,05% в весовом отношении)

Стабилизатор: D-маннит (0,05% в весовом отношении).

В исследовании гель Granexin® упаковывали в виде контейнеров для применения для одного пациента, содержащих 5 г геля в каждом тюбике. Granexin® представляет собой прозрачный, без запаха, гипоаллергенный и простой в применении гель.

В этом исследовании местное лечение с использованием Granexin® (100 мкМ или 200 мкМ) или лечение носителем начинали после замечания появления эритемы (оценка Кумара >1,0) на любом участке (между 11-14 днями после поражения в результате радиоактивного излучения) и продолжали на протяжении всего исследования. Начиная с дня 1 и каждые 3 дня после этого протоколировали эритему, десквамацию и повреждение (струп, изъязвление и некроз), и участки кожи систематически (вслепую) оценивали на предмет эритемы и десквамации с использованием шкалы Кумара.

Результаты лечения показаны в таблице 10 ниже и проиллюстрированы на фиг. 1А. Шкала Кумара показана в таблице 11.

Таблица 10: Сравнения средних оценок поражения кожи (± SD)

День после облучения Носитель (n=8) Granexin 100 мкМ (n=8) Granexin 200 мкМ (n=8) 19 1,88 ± 0,25 1,63 ± 0,48 1,63 ± 0,75 22 2,38 ± 0,48 1,75 ± 0,50 1,88 ± 0,75 28 3,63 ± 0,25 2,88 ± 1,25 2,50 ± 1,73 31 3,75 ± 0,29 3,00 ± 1,35 2,63 ± 1,60

Таблица 11: Шкала Кумара

Оценка Оценка изменений кожи 1,0 Отсутствие эффекта 1,5 Минимальная эритема, мягкая сухая кожа 2,0 Умеренная эритема, сухая кожа 2,5 Выраженная эритема, сухая десквамация 3,0 Сухая десквамация, минимальная сухая корочка 3,5 Сухая десквамация, сухая корочка, поверхностные минимальные струпья 4,0 Пятнистая влажная десквамация, умеренные струпья 4,5 Сливная влажная десквамация, язвы, большие глубокие струпья 5,0 Открытая рана, полная потеря слоя кожи 5,5 Некроз

Последующие моменты времени демонстрируют явные визуальные различия лечений, как показано на фиг. 1B.

Результаты исследование показали, что на участках облучения, обработанных Granexin® (100 мкМ или 200 мкМ), отмечалось уменьшение эритемы и развития десквамации, в соответствии с оценкой по шкале Кумара, по сравнению с участками, обработанными носителем. Таким образом, композиция оказалась эффективной в профилактике прогрессирования поражения и степени его тяжести, уменьшении эритемы и развития десквамации.

Наблюдения более низких оценок по шкале Кумара при использовании Granexin® 100 мкМ и 200 мкМ соответствовали микроскопическим гистопатологическим данным. Кожную ткань собирали с каждого участка облучения, фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, обрабатывали до парафинового блока, срезов и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E). Срезы исследовали (вслепую) под микроскопом. Гель Granexin® был более эффективным в уменьшении тяжести поражения, чем в участках, которые обрабатывали гелем-носителем, в соответствии с оценкой по окрашиванию H & E биопсий, полученных при конечной аутопсии животных (день 43; конец исследования) (фиг. 1C). Гистопатологическое исследование показало дозозависимые эффекты, причем концентрация Granexin® 200 мкМ была очень эффективной в уменьшении степени тяжести (изъязвления, инфильтрация нейтрофилами).

Пример 2: Лечение композицией с полипептидом ACT для предотвращения и сдерживания прогрессирования CRI после воздействия ионизирующего излучения - исследование раннего применения (начало лечения через 24 часа после облучения).

С целью оценки способности Granexin® к предотвращению прогрессирования CRI кожи, тяжести и изъязвления, облученные участки профилактически обрабатывали (до проявления симптомов CRI) носителем или гелем Granexin® 1000 мкМ. Granexin® применяли, начиная с 24 часов после воздействия, и продолжали один раз в день в течение 30 дней. Вкратце, в день 0 каждое животное анестезировали и подвергали воздействию отдельных фракций электронов низких энергий (6 МэВ) с использованием линейного ускорителя Varian CLINAC 21EX в целевой дозе 45 Гр. Granexin® или гель-носитель наносили один раз в день, начиная с 24 часов после радиоактивного облучения.

Облученные участки, обработанные гелем Granexin®, показали замедленное прогрессирование поражения и изъязвление и уменьшенную степень тяжести поражения CRI по сравнению с участками, обработанными гелем-носителем. Сравнения снимков, сделанных в день 21, показывают, что профилактическая обработка гелем Granexin® в концентрации 1000 мкМ предотвращает развитие радиационного поражения кожи по сравнению с контролем (фиг. 2).

Эти данные показали, что Granexin® оказывает благоприятный эффект в виде как предотвращения, так и лечения радиационного поражения кожи. Данные, кроме того, документируют кривую положительной зависимости ответа от дозы.

Пример 3. Лечение композицией с полипептидом ACT в модели частичного облучения тела мыши с нацеливанием на GI.

В этом исследовании мышей C557BL/6 (n=40; 20 самок и 20 самцов) подвергали частичному облучению тела одной дозой 15,6 при 50 сГр/мин с использованием источника гамма-излучения 60Co. Ионизационная камера типа Farmer использовалась для обеспечения количественного определения дозы облучения в режиме реального времени. Животных облучали в специально разработанном приспособлении для фиксации, в котором их левая тазовая конечность была вытянута и поддерживалась в таком положении, чтобы обеспечить экранирование с помощью структуры из Cerrobend®. Этот способ экранирования 5% костного мозга служит для спасения мышей от гемопоэтического синдрома. Начиная с 24 часов после воздействия, животным ежедневно вводили 0,9% хлорид натрия (носитель) или 10 мг/кг ACT11 (полипептида ACT1), доставляемого внутрибрюшинно вплоть до 21 дня. Половина животных (за вычетом тех, которые умерли в дни 1-7) были умерщвлены в день 8, чтобы сделать возможным гистологическое исследование органов GI (ожидаются результаты гистологии). Предварительные анализы выживаемости Каплана-Майера показывают, что системное лечение с помощью ACT11 оказывает ранний эффект на смертность животных (фиг. 4). Следовательно, результаты исследования показали, что полипептид ACT1 уменьшает радиационное поражение от облучения.

Понятно, что раскрытый способ и композиции не ограничиваются конкретной методологией, протоколами и реагентами, которые описаны, поскольку они могут варьировать. Также следует понимать, что используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.

Следует отметить, что используемые здесь и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа «a», «an» и «the» включают множественное число, если только контекст явно не указывает на иное. Таким образом, например, ссылка на «полипептид» включает множество таких полипептидов, ссылка на «полипептид» является ссылкой на один или более полипептидов и их эквивалентов, известных специалистам в данной области техники и т.д.

«Необязательный» или «необязательно» означает, что впоследствии описанное событие, обстоятельство или материал могут возникать или присутствовать или могут не возникать или не присутствовать, и что описание включает случаи, когда событие, обстоятельство или материал возникает или присутствует, и случаи, когда он не возникает или не присутствует.

Диапазоны могут быть представлены здесь как от «приблизительно» одного конкретного значения и/или до «приблизительно» другого конкретного значения. В случае представления такого диапазона также специально предусматривается и считается раскрытым диапазон от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения, если контекст специально не указывает на иное. Точно так же, когда значения представлены в виде приближенных значений с использованием предшествующего «приблизительно», будет понятно, что конкретное значение образует другой, специально предусмотренный вариант осуществления, который следует рассматривать как раскрытый, если контекст специально не указывает на иное. Далее будет понятно, что конечные точки каждого из диапазонов являются значимыми как по отношению к другой конечной точке, так и независимо от другой конечной точки, если контекст специально не указывает на иное. Наконец, следует понимать, что все отдельные значения и поддиапазоны значений, содержащиеся в явно раскрытом диапазоне, также специально предусмотрены и должны считаться раскрытыми, если контекст специально не указывает на иное. Вышеизложенное применяется независимо от того, раскрыты ли в конкретных случаях некоторые или все из этих вариантов осуществления явным образом.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют те же значения, в которых они обычно понимаются специалистом в области техники, к которой относятся раскрытый способ и композиции. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые здесь описаны, могут использоваться при практическом применении или проверке способа и композиций настоящего изобретения, особенно полезные способы, устройства и материалы являются такими, которые описаны. Приведенные здесь публикации и материал, ради которого они приведены, тем самым специально включены посредством ссылки. Ничто здесь не должно быть истолковано как признание того, что настоящее изобретение не имеет права предшествовать такому раскрытию в силу предшествующего изобретения. Не допускается, что любая ссылка представляет собой известный уровень техники. Обсуждение ссылок констатирует, что утверждают их авторы, и заявители сохраняют за собой право оспаривать точность и актуальность цитируемых документов. Будет понятно, что, хотя здесь упоминается ряд публикаций, такая ссылка не означает признание того, что любой из этих документов является частью общих знаний в данной области техники.

Во всем описании и формуле изобретения этого описания слово «включать (содержать)» и варианты этого слова, такие как «включающий (содержащий)» и «включает (содержит)», означает «включающий, но не ограничивающийся перечисленным», и, как предполагается, не исключает, например, другие добавки, компоненты, целые числа или шаги.

Специалисты в данной области техники распознают или смогут установить, используя не более чем обычные эксперименты, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления способа и композиций, описанных здесь. Такие эквиваленты, как предполагается, охватываются следующей формулой изобретения.

Список литературы

Alonso L, Fuchs E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Sep. 30; 100 Suppl 1:11830-5, 2003

Barker R J, Price R L, Gourdie R G. Increased association of ZO-1 with Connexin43 during remodeling of cardiac gap junctions. Circ Res. February 22; 90(3):317-24 (2002).

Bucci, M. et al. In vivo delivery of the caveolin-1 scaffolding domain inhibits nitric oxide synthesis and reduces inflammation. Nat. Med. 6, 1362-1367 (2000).

Chien K R. Stem cells: lost in translation. Nature. April 8; 428(6983):607-608 (2004).

Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G. & Prochiantz, A. The third helix of Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. 679-686 (2000).

Elmquist, A., Lindgren, M., Bartfai, T. & Langel, U. VE-cadherin-derived cell-penetrating peptide, pVEC, with carrier functions. Exp. Cell Res. 269, 237-244 (2001).

Elder D., Elenitsas R, Jawaorsky C, & Johnson B. Lever's histopathology of the skin. Lippincott-Raven Publishers, (1997).

Fawcett J W, Asher R A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49:377-391 (1999).

Fischer, P. M. et al. Structure-activity relationship of truncated and substituted analogues of the intracellular delivery vector Penetratin. J. Pept. Res. 55, 163-172 (2000).

Frankel, A. D. & Pabo, C. O. Cellular uptake of the Tat protein from human immunodeficiency virus. Cell 55, 1189-1193 (1988).

Fu C T, Bechberger J F, Ozog M A, Perbal B, Naus C. CCN3 (NOV) interacts with Connexin43 in C6 glioma cells: possible mechanism of Connexin-mediated growth suppression. J Biol. Chem. August 27; 279(35):36943-50 (2004).

Gao, C. et al. A cell-penetrating peptide from a novel pVII-pIX phage-displayed random peptide library. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-4065 (2002).

Giepmans B N. Gap junctions and Connexin-interacting proteins. Cardiovasc Res. May 1; 62(2):233-45 (2004).

Goodenough D A, Paul D L. Beyond the gap: functions of unpaired connexon channels. Nat Rev Mol Cell Biol. April; 4(4):285-94 (2003).

Green, M. & Loewenstein, P. M. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell 55, 1179-1188 (1988).

Hayashi T, Matesic D F, Nomata K, Kang K S, Chang C, Trosko J E. Stimulation of cell proliferation and inhibition of gap junctional intercellular communication by linoleic acid. Cancer Lett. 112:103-111 (1997).

Hayashi T, Nomata K, Chang C, Ruch R J, Trosko J E. Cooperative effects of v-myc and c-Ha-ras oncogenes on gap junctional intercellular communication and tumorigenicity in rat liver epithelial cells. Cancer Lett. 128:145-154 (1998).

Hayashi T, Trosko J E, Hamada K. Inhibition of gap junctional intercellular communication in rat liver epithelial cells with transforming RNA. FEBS Lett. 491:200-206 (2001).

Hong, F. D. & Clayman, G. L. Isolation of a peptide for targeted drug delivery into human head and neck solid tumors. Cancer Res. 60, 6551-6556 (2000).

Kajstura J, Rota M, Whang B, Cascapera S, Hosoda T, Bearzi C, Nurzynska D, Kasahara H, Zias E, Bonafe M, Nadal-Ginard B, Torella D, Nascimbene A, Quaini F, Urbanek K, Leri A, Anversa P. Bone marrow cells differentiate in cardiac cell lineages after infarction independently of cell fusion. Circ Res. January 7; 96(1):127-37 (2005).

Lin, Y. Z., Yao, S. Y., Veach, R. A., Torgerson, T. R. & Hawiger, J. Inhibition of nuclear translocation of transcription factor NF-KB by a synthetic peptide containing a cell membrane-permeable motif and nuclear localization sequence. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995).

Lundberg, P. et al. Cell membrane translocation of the N-terminal (1-28) part of the prion protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002).

Matsushita M, Noguchi H, Lu Y F, Tomizawa K, Michiue H, Li S T, Hirose K, Bonner-Weir S, Matsui H. Photo-acceleration of protein release from endosome in the protein transduction system. FEBS Lett. 13; 572(1-3):221-6. (2004).

Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F. & Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nature Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).

Norenberg M D. Astrocyte responses to CNS injury. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:213-220 (1994).

Oehlke, J. et al. Cellular uptake of an.alpha.-helical amphipathic model peptide with the potential to deliver polar compounds into the cell interior non-endocytically. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-139 (1998).

Park, C. B., Yi, K. S., Matsuzaki, K., Kim, M. S. & Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: the proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 8245-8250 (2000).

Paxinos G, Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 2nd ed. San Diego, Calif.: Academic; 1986.

Pich A, Chiusa L, Navone R. Prognostic relevance of cell proliferation in head and neck tumors Annals of Oncology 2004 15(9):1319-1329.

Pooga, M., Hallbrink, M., Zorko, M. & Langel, U. Cell penetration by transportan. FASEB J. 12, 67-77 (1998).

Poss K D, Wilson L G, Keating M T. Heart regeneration in zebrafish. Science. December 13; 298(5601):2188-90 (2002).

Rousselle, C. et al. New advances in the transport of doxorubicin through the blood-brain barrier by a peptide vector-mediated strategy. Mol. Pharmacol. 57(4):679-86 (2000).

Sawada, M., Hayes, P. & Matsuyama, S. Cytoprotective membrane-permeable peptides designed from the Bax-binding domain of Ku70. Nature Cell Biol. 5, 352-357 (2003).

Silver J, Miller J H. Regeneration beyond the glial scar. Nat Rev Neurosci. February; 5(2):146-56 (2004).

Songyang, Z. et al. Recognition of unique carboxyl-terminal motifs by distinct PDZ domains. Science 275, 73-77 (1997).

Tsao M S, Smith J D, Nelson K G, Grisham J W. A diploid epithelial cell line from normal adult rat liver with phenotypic properties of ‘oval’ cells. Exp. Cell Res. 154:38-52 (1984).

Vigneron, J. P. et al. Guanidinium-cholesterol cationic lipids: Efficient vectors for the transfection of eukaryotic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 9682-9686 (1998).

Wadia J S, Stan R V, Dowdy S F. Transducible TAT-HA fusogenic peptide enhances escape of TAT-fusion proteins after lipid raft macropinocytosis. Nat. Med. 10(3):310-5. (2004).

Ming Y. W. Chu^a, Milton H. Lipsky^a, Lorrin K. Yee^a,c, John Epstein^a, Katharine A. Whartenby^a, Scott Freeman^e, Tian M. Chen^a, Edward Chu^c,d, Edwin N. Forman^b, Paul Calabresi^a Predictive Sensitivity of Human Cancer Cells in vivo Using Semipermeable Polysulfone Fibers Pharmacology 1998; 56:318-326

Orlandini G C, Margaria R. Evaluation of the efficiency of a new hollow fiber plasmapheresis filter. Int J Artif Organs. 1983 July; 6 Suppl 1:103-6.

Wilgus T A, Vodovotz Y, Vittadini E, Clubbs E A, Oberysztn T M. Reduction of scar formation in full-thickness wounds with topical celecoxib treatment. Wound Rep Reg 2003; 11:25-34.

Последовательности

SEQ ID NO:1 (ACT2)

PSSRASSRASSRPRPDDLEI

SEQ ID NO:2 (ACT1)

RPRPDDLEI

SEQ ID NO:3 (ACT3)

RPRPDDLEV

SEQ ID NO:4 (ACT4)

RPRPDDVPV

SEQ ID NO:5 (ACT5)

KARSDDLSV

SEQ ID NO:6

aga cct cgg cct gat gac ctg gag att

SEQ ID NO:7 (Antp)

RQPKIWFPNRRKPWKK

SEQ ID NO:8 (Antp/ACT2)

RQPKIWFPNRRKPWKKPSSRASSRASSRPRPDDLEI

SEQ ID NO:9 (Antp/ACT1)

RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEI

SEQ ID NO:10 (Antp/ACT3)

RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEV

SEQ ID NO:11 (Antp/ACT4)

RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDVPV

SEQ ID NO:12 (Antp/ACT5)

RQPKIWFPNRRKPWKKKARSDDLSV

SEQ ID NO:13 (кодирует полипептид с SEQ ID NO:9)

cgg cag ccc aag atc tgg ttc ccc aac cgg aag ccc tgg aag cgg ccc ggc ccg acg acc tgg aga tc

SEQ ID NO:14 (HIV-Tat)

GRKKRRQRPPQ

SEQ ID NO:15 (Пенетратин)

RQIKIWFQNRRMKWKK

SEQ ID NO:16 (Antp-3A)

RQIAIWFQNRRMKWAA

SEQ ID NO:17 (Tat)

RKKRRQRRR

SEQ ID NO:18 (Буфорин II)

TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK

SEQ ID NO:19 (Транспортан)

GWTLNSAGYLLGKINKALAALAKKIL

SEQ ID NO:20 (модельный амфипатический пептид)

KLALKLALKALKAALKLA

SEQ ID NO:21 (K-FGF)

AAVALLPAVLLALLAP

SEQ ID NO:22 (Ku70)

VPMLK-PMLKE

SEQ ID NO:23 (Прион)

MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP

SEQ ID NO:24 (pVEC)

LLIILRRRIRKQAHAHSK

SEQ ID NO:25 (Pep-1)

KETWWETWWTEWSQPKKKRKV

SEQ ID NO:26 (SynB1)

RGGRLSYSRRRFSTSTGR

SEQ ID NO:27 (Pep-7)

SDLWEMMMVSLACQY

SEQ ID NO:28 (HN-1)

TSPLNIHNGQKL

SEQ ID NO:29 (Альфа Cx43 цыпленка)

PSRASSRASSRPRPDDLEI

SEQ ID NO:30 (Альфа Cx45 человека)

GSNKSTASSKSPDPKNSVWI

SEQ ID NO:31 (Альфа Cx45 цыпленка)

GSNKSSASSKSGDGKNSVWI

SEQ ID: 32 (Альфа Cx46 человека)

GRASKASRASSGRARPEDLAI

SEQ ID: 33 (Альфа Cx46.6 человека)

GSASSRDGKTVWI

SEQ ID NO:34 (Альфа Cx36 шимпанзе)

PRVSVPNFGRTQSSDSAYV

SEQ ID NO:35 (Альфа Cx36 цыпленка)

PRMSMPNFGRTQSSDSAYV

SEQ ID NO:36 (Альфа Cx47 человека)

PRAGSEKGSASSRDGKTTVWI

SEQ ID NO:37 (Альфа Cx40 человека)

GYHSDKRRLSKASSKARSDDLSV

SEQ ID NO:38 (Альфа Cx50 человека)

PLSRLSKASSRARSDDLTV

SEQ ID NO:39 (Альфа Cx59 человека)

PNHVVSLTNNLIGRRVPTDLQI

SEQ ID NO:40 (Альфа Cx33 крысы)

PSCVSSSAVLTTICSSDQVVPVGLSSFYM

SEQ ID NO:41 (Альфа Cx44 овцы)

GRSSKASKSSGGRARAADLAI

SEQ ID NO:42 (Бета Cx26 человека)

LCYLLIRYCSGKSKKPV

SEQ ID: 43 (Альфа Cx37 человека)

G QK PP SRP SSSAS K KQ*YV

SEQ ID 44: (консервативный вариант Cx43)

SSRASSRASSRPRPDDLEV

SEQ ID 45: (консервативный вариант Cx43)

RPKPDDLEI

SEQ ID 46: (консервативный вариант Cx43)

SSRASSRASSRPKPDDLEI

SEQ ID 47: (консервативный вариант Cx43)

RPKPDDLDI

SEQ ID 48: (консервативный вариант Cx43)

SSRASSRASSRPRPDDLDI

SEQ ID 49: (консервативный вариант Cx43)

SSRASTRASSRPRPDDLEI

SEQ ID 50: (консервативный вариант Cx43)

RPRPEDLEI

SEQ ID 51: (conservative Cx43 variant)

SSRASSRASSRPRPEDLEI,

SEQ ID 52: (консервативный вариант Cx45)

GDGKNSVWV

SEQ ID 53: (консервативный вариант Cx45)

SKAGSNKSTASSKSGDGKNSVWV

SEQ ID 54: (консервативный вариант Cx37)

GQKPPSRPSSSASKKLYV

SEQ ID NO: 55 (неактивный контрольный пептид)

RQPKIWFPNRRKPWKIELDDPRPR

SEQ ID NO:56 (HIV-Tat/ACT1)

GRKKRRQRPPQ RPRPDDLEI

SEQ ID NO:57 (Пенетратин/ACT 1)

RQIKIWFQNRRMKWKK RPRPDDLEI

SEQ ID NO:58 (Antp-3A/ACT1)

RQIAIWFQNRRMKWAA RPRPDDLEI

SEQ ID NO:59 (Tat/ACT 1)

RKKRRQRRR RPRPDDLEI

SEQ ID NO:60 (Буфорин II/ACT1)

TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK RPRPDDLEI

SEQ ID NO:61 (Транспортан/ACT1)

GWTLNSAGYLLGKINKALAALAKKIL RPRPDDLEI

SEQ ID NO:62 (MAP/ACT1)

KLALKLALKALKAALKLA RPRPDDLEI

SEQ ID NO:63 (K-FGF/ACT1)

AAVALLPAVLLALLAP RPRPDDLEI

SEQ ID NO:64 (Ku70/ACT1)

VPMLKPMLKE RPRPDDLEI

SEQ ID NO:65 (Прион/ACT1)

MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP RPRPDDLEI

SEQ ID NO:66 (pVEC/ACT1)

LLIILRRRIRKQAHAHSK RPRPDDLEI

SEQ ID NO:67 (Pep-1/ACT1)

KETWWETWWTEWSQPKKKRKV RPRPDDLEI

SEQ ID NO:68 (SynB1/ACT1)

RGGRLSYSRRRFSTSTGR RPRPDDLEI

SEQ ID NO:69 (Pep-7/ACT1)

SDLWEMMMVSLACQY RPRPDDLEI

SEQ ID NO:70 (HN-1/ACT1)

TSPLNIHNGQKL RPRPDDLEI

SEQ ID NO:72 (от 20 до 120 остатков, фланкирующих аминокислоту 363 Cx43 человека)

KGKSDPYHATSGALSPAKDCGSQKYAYFNGCSSPTAPLSPMSPPGYKLVTGDRNNSSCRNYNKQASEQNWANYSAEQNRMGQAGSTISNSHAQPFDFPDD NQNSKKLAAGHELQPLAIVD

SEQ ID NO:73 (от 20 до 120 остатков, фланкирующих аминокислоту 362 Cx43 цыпленка)

KTDPYSHSGTMSPSKDCGSPKYAYYNGCSSPTAPLSPMSPPGYKLVTGDRNNSSCRNYNKQASEQNWANYSAEQNRMGQAGSTISNSHAQPFDFADEHQN TKKLASGHELQPLTIVDQRP

SEQ ID NO:74 (от 20 до 120 остатков, фланкирующих аминокислоту 377 Cx45 человека)

LGFGTIRDSLNSKRRELEDPGAYNYPFTWNTPSAPPGYNIAVKPDQIQYTELSNAKIAYKQNKANTAQEQQYGSHEENLPADLEALQREIRMAQERLDLA VQAYSHQNNPHGPREKKAKV

SEQ ID NO:75 (от 20 до 120 остатков, фланкирующих аминокислоту 375 Cx45 цыпленка)

GFGTIRDTLNNKRKELEDSGTYNYPFTWNTPSAPPGYNIAVKPDQMQYTELSNAKMAYKQNKANIAQEQQYGSNEENIPADLENLQREIKVAQERLDMAIQAYNNQNNPGSSSREKKSKA.

SEQ ID NO:76 (от 20 до 120 остатков, фланкирующих аминокислоту 313 Cx37 человека)

PYLVDCFVSRPTEKTIFIIFMLVVGLISLVLNLLELVHLLCRCLSRGMRARQGQDAPPTQGTSSDPYTDQVFFYLPVGQGPSSPPCPTYNGLSSSEQNWA NLTTEERLASSRPPLFLDPP

SEQ ID NO:77 (от 20 до 120 остатков, фланкирующих аминокислоту 258 Cx33 крысы)

CGSKEHGNRKMRGRLLLTYMASIFFKSVFEVAFLLIQWYLYGFTLSAVYICEQSPCPHRVDCFLSRPTEKTIFILFMLVVSMVSFVLNVIELFYVLFKAI KNHLGNEKEEVYCNPVELQK.

SEQ ID NO:78 (усиленный зеленый флуоресцентный белок)

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNH YLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK

SEQ ID NO:78 (ACT2)

CCCTCCTCCCGGGCCTCCTCCCGGGCCTCCTCCCGGCCCCGGCCCGACGACCTGGAGATC

SEQ ID NO:79 (ACT 1)

CGGCCCCGGCCCGACGACCTGGAGATC

SEQ ID NO:80 (ACT3)

CGGCCCCGGCCCGACGACCTGGAGGTG

SEQ ID NO:81 (ACT4)

CGGCCCCGGCCCGACGACGTGCCCGTG

SEQ ID NO:82 (ACT5)

AAGGCCCGGTCCGACGACCTGTCCGTG

SEQ ID NO:83 (Antp)

CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAGAAG

SEQ ID NO:84 (Antp/ACT2)

CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAGAAGCCCTCCTCCCGGGCCTCCTCCCGGGCCTCCTCCCGGCCCCGGCCCGACGACCTGGAGATC

SEQ ID NO:85 (Antp/ACT1)

CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAGAAGCGGCCCCGGCCCGACGACCTGGAGATC

SEQ ID NO:86 (Antp/ACT3)

CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAGAAGCG GCCCCGGCCCGACGACCTGGAGGTG

SEQ ID NO:87 (Antp/ACT 4) CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAGAAGCG GCCCCGGCCCGACGACGTGCCCGTG

SEQ ID NO:88 (Antp/ACT5)

CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAGAAGAA GGCCCGGTCCGACGACCTGTCCGTG

SEQ ID NO:89 (Альфа Cx43 полосатого данио)

PCSRASSRMSSRARPDDLDV

SEQ ID NO:90 (Альфа Cx36 цыпленка)

PRVSVPNFGRTQSSDSAYV

SEQ ID NO:91 (Пептид 328967 (ACT 1))

Biotin-Ahx-Arg-Gln-Pro-Lys-Ile-Trp-Phe-Pro-Asn-Arg-Arg-Lys-Pro-Trp-Lys-Lys-Arg-Pro-Arg-Pro-Asp-Asp-Leu-Glu-Ile-OH

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> FirstString Research, Inc.

Ghatnekar, Gautam

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАДИАЦИОННОГО

ПОРАЖЕНИЯ И СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ ТКАНИ

<130> FIRS-007/01WO

<160> 91

<150> Заявка США 62/459924

<151> 2017-02-16

<170> FastSEQ для Windows версии 4.0

<210> 1

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 1

Pro Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp

1 5 10 15

Asp Leu Glu Ile

20

<210> 2

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 2

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 3

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Val

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 4

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Val Pro Val

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 5

Lys Ala Arg Ser Asp Asp Leu Ser Val

1 5

<210> 6

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 6

agacctcggc ctgatgacct ggagatt 27

<210> 7

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 7

Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 8

<211> 36

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 8

Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys

1 5 10 15

Pro Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp

20 25 30

Asp Leu Glu Ile

35

<210> 9

<211> 25

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 9

Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys

1 5 10 15

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile

20 25

<210> 10

<211> 25

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 10

Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys

1 5 10 15

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Val

20 25

<210> 11

<211> 25

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 11

Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys

1 5 10 15

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Val Pro Val

20 25

<210> 12

<211> 25

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 12

Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys

1 5 10 15

Lys Ala Arg Ser Asp Asp Leu Ser Val

20 25

<210> 13

<211> 74

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 13

cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gcccggcccg 60

acgacctgga gatc 74

<210> 14

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 14

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Pro Pro Gln

1 5 10

<210> 15

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 15

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 16

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 16

Arg Gln Ile Ala Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Ala Ala

1 5 10 15

<210> 17

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 17

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5

<210> 18

<211> 21

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 18

Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His

1 5 10 15

Arg Leu Leu Arg Lys

20

<210> 19

<211> 26

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 19

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Lys

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

20 25

<210> 20

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 20

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys

1 5 10 15

Leu Ala

<210> 21

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 21

Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

1 5 10 15

<210> 22

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 22

Val Pro Met Leu Lys Pro Met Leu Lys Glu

1 5 10

<210> 23

<211> 28

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 23

Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp

1 5 10 15

Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro

20 25

<210> 24

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 24

Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His

1 5 10 15

Ser Lys

<210> 25

<211> 21

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 25

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

1 5 10 15

Lys Lys Arg Lys Val

20

<210> 26

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 26

Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr

1 5 10 15

Gly Arg

<210> 27

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 27

Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr

1 5 10 15

<210> 28

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 28

Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu

1 5 10

<210> 29

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 29

Pro Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp Asp

1 5 10 15

Leu Glu Ile

<210> 30

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 30

Gly Ser Asn Lys Ser Thr Ala Ser Ser Lys Ser Pro Asp Pro Lys Asn

1 5 10 15

Ser Val Trp Ile

20

<210> 31

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 31

Gly Ser Asn Lys Ser Ser Ala Ser Ser Lys Ser Gly Asp Gly Lys Asn

1 5 10 15

Ser Val Trp Ile

20

<210> 32

<211> 21

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 32

Gly Arg Ala Ser Lys Ala Ser Arg Ala Ser Ser Gly Arg Ala Arg Pro

1 5 10 15

Glu Asp Leu Ala Ile

20

<210> 33

<211> 13

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 33

Gly Ser Ala Ser Ser Arg Asp Gly Lys Thr Val Trp Ile

1 5 10

<210> 34

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 34

Pro Arg Val Ser Val Pro Asn Phe Gly Arg Thr Gln Ser Ser Asp Ser

1 5 10 15

Ala Tyr Val

<210> 35

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 35

Pro Arg Met Ser Met Pro Asn Phe Gly Arg Thr Gln Ser Ser Asp Ser

1 5 10 15

Ala Tyr Val

<210> 36

<211> 21

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 36

Pro Arg Ala Gly Ser Glu Lys Gly Ser Ala Ser Ser Arg Asp Gly Lys

1 5 10 15

Thr Thr Val Trp Ile

20

<210> 37

<211> 23

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 37

Gly Tyr His Ser Asp Lys Arg Arg Leu Ser Lys Ala Ser Ser Lys Ala

1 5 10 15

Arg Ser Asp Asp Leu Ser Val

20

<210> 38

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 38

Pro Leu Ser Arg Leu Ser Lys Ala Ser Ser Arg Ala Arg Ser Asp Asp

1 5 10 15

Leu Thr Val

<210> 39

<211> 22

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 39

Pro Asn His Val Val Ser Leu Thr Asn Asn Leu Ile Gly Arg Arg Val

1 5 10 15

Pro Thr Asp Leu Gln Ile

20

<210> 40

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 40

Pro Ser Cys Val Ser Ser Ser Ala Val Leu Thr Thr Ile Cys Ser Ser

1 5 10 15

Asp Gln Val Val Pro Val Gly Leu Ser Ser Phe Tyr Met

20 25

<210> 41

<211> 21

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 41

Gly Arg Ser Ser Lys Ala Ser Lys Ser Ser Gly Gly Arg Ala Arg Ala

1 5 10 15

Ala Asp Leu Ala Ile

20

<210> 42

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 42

Leu Cys Tyr Leu Leu Ile Arg Tyr Cys Ser Gly Lys Ser Lys Lys Pro

1 5 10 15

Val

<210> 43

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 43

Gly Gln Lys Pro Pro Ser Arg Pro Ser Ser Ser Ala Ser Lys Lys Gln

1 5 10 15

Tyr Val

<210> 44

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 44

Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp Asp

1 5 10 15

Leu Glu Val

<210> 45

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 45

Arg Pro Lys Pro Asp Asp Leu Glu Ile

1 5

<210> 46

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 46

Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Lys Pro Asp Asp

1 5 10 15

Leu Glu Ile

<210> 47

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 47

Arg Pro Lys Pro Asp Asp Leu Asp Ile

1 5

<210> 48

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 48

Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp Asp

1 5 10 15

Leu Asp Ile

<210> 49

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 49

Ser Ser Arg Ala Ser Thr Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp Asp

1 5 10 15

Leu Glu Ile

<210> 50

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 50

Arg Pro Arg Pro Glu Asp Leu Glu Ile

1 5

<210> 51

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 51

Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Glu Asp

1 5 10 15

Leu Glu Ile

<210> 52

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 52

Gly Asp Gly Lys Asn Ser Val Trp Val

1 5

<210> 53

<211> 23

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 53

Ser Lys Ala Gly Ser Asn Lys Ser Thr Ala Ser Ser Lys Ser Gly Asp

1 5 10 15

Gly Lys Asn Ser Val Trp Val

20

<210> 54

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 54

Gly Gln Lys Pro Pro Ser Arg Pro Ser Ser Ser Ala Ser Lys Lys Leu

1 5 10 15

Tyr Val

<210> 55

<211> 24

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 55

Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Ile

1 5 10 15

Glu Leu Asp Asp Pro Arg Pro Arg

20

<210> 56

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 56

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Pro Pro Gln Arg Pro Arg Pro Asp

1 5 10 15

Asp Leu Glu Ile

20

<210> 57

<211> 25

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 57

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile

20 25

<210> 58

<211> 25

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 58

Arg Gln Ile Ala Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Ala Ala

1 5 10 15

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile

20 25

<210> 59

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 59

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu

1 5 10 15

Glu Ile

<210> 60

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 60

Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His

1 5 10 15

Arg Leu Leu Arg Lys Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile

20 25 30

<210> 61

<211> 35

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 61

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Lys

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu Arg Pro Arg Pro Asp Asp

20 25 30

Leu Glu Ile

35

<210> 62

<211> 27

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 62

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys

1 5 10 15

Leu Ala Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile

20 25

<210> 63

<211> 25

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 63

Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

1 5 10 15

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile

20 25

<210> 64

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 64

Val Pro Met Leu Lys Pro Met Leu Lys Glu Arg Pro Arg Pro Asp Asp

1 5 10 15

Leu Glu Ile

<210> 65

<211> 37

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 65

Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp

1 5 10 15

Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Arg Pro Arg Pro

20 25 30

Asp Asp Leu Glu Ile

35

<210> 66

<211> 27

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 66

Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His

1 5 10 15

Ser Lys Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile

20 25

<210> 67

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 67

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

1 5 10 15

Lys Lys Arg Lys Val Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile

20 25 30

<210> 68

<211> 27

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 68

Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr

1 5 10 15

Gly Arg Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile

20 25

<210> 69

<211> 24

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 69

Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr Arg

1 5 10 15

Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile

20

<210> 70

<211> 21

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 70

Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu Arg Pro Arg Pro

1 5 10 15

Asp Asp Leu Glu Ile

20

<210> 71

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 71

Lys Gly Lys Ser Asp Pro Tyr His Ala Thr Ser Gly Ala Leu Ser Pro

1 5 10 15

Ala Lys Asp Cys Gly Ser Gln Lys Tyr Ala Tyr Phe Asn Gly Cys Ser

20 25 30

Ser Pro Thr Ala Pro Leu Ser Pro Met Ser Pro Pro Gly Tyr Lys Leu

35 40 45

Val Thr Gly Asp Arg Asn Asn Ser Ser Cys Arg Asn Tyr Asn Lys Gln

50 55 60

Ala Ser Glu Gln Asn Trp Ala Asn Tyr Ser Ala Glu Gln Asn Arg Met

65 70 75 80

Gly Gln Ala Gly Ser Thr Ile Ser Asn Ser His Ala Gln Pro Phe Asp

85 90 95

Phe Pro Asp Asp Asn Gln Asn Ser Lys Lys Leu Ala Ala Gly His Glu

100 105 110

Leu Gln Pro Leu Ala Ile Val Asp

115 120

<210> 72

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 72

Lys Thr Asp Pro Tyr Ser His Ser Gly Thr Met Ser Pro Ser Lys Asp

1 5 10 15

Cys Gly Ser Pro Lys Tyr Ala Tyr Tyr Asn Gly Cys Ser Ser Pro Thr

20 25 30

Ala Pro Leu Ser Pro Met Ser Pro Pro Gly Tyr Lys Leu Val Thr Gly

35 40 45

Asp Arg Asn Asn Ser Ser Cys Arg Asn Tyr Asn Lys Gln Ala Ser Glu

50 55 60

Gln Asn Trp Ala Asn Tyr Ser Ala Glu Gln Asn Arg Met Gly Gln Ala

65 70 75 80

Gly Ser Thr Ile Ser Asn Ser His Ala Gln Pro Phe Asp Phe Ala Asp

85 90 95

Glu His Gln Asn Thr Lys Lys Leu Ala Ser Gly His Glu Leu Gln Pro

100 105 110

Leu Thr Ile Val Asp Gln Arg Pro

115 120

<210> 73

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 73

Leu Gly Phe Gly Thr Ile Arg Asp Ser Leu Asn Ser Lys Arg Arg Glu

1 5 10 15

Leu Glu Asp Pro Gly Ala Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Trp Asn Thr Pro

20 25 30

Ser Ala Pro Pro Gly Tyr Asn Ile Ala Val Lys Pro Asp Gln Ile Gln

35 40 45

Tyr Thr Glu Leu Ser Asn Ala Lys Ile Ala Tyr Lys Gln Asn Lys Ala

50 55 60

Asn Thr Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Gly Ser His Glu Glu Asn Leu Pro

65 70 75 80

Ala Asp Leu Glu Ala Leu Gln Arg Glu Ile Arg Met Ala Gln Glu Arg

85 90 95

Leu Asp Leu Ala Val Gln Ala Tyr Ser His Gln Asn Asn Pro His Gly

100 105 110

Pro Arg Glu Lys Lys Ala Lys Val

115 120

<210> 74

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 74

Gly Phe Gly Thr Ile Arg Asp Thr Leu Asn Asn Lys Arg Lys Glu Leu

1 5 10 15

Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Trp Asn Thr Pro Ser

20 25 30

Ala Pro Pro Gly Tyr Asn Ile Ala Val Lys Pro Asp Gln Met Gln Tyr

35 40 45

Thr Glu Leu Ser Asn Ala Lys Met Ala Tyr Lys Gln Asn Lys Ala Asn

50 55 60

Ile Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Gly Ser Asn Glu Glu Asn Ile Pro Ala

65 70 75 80

Asp Leu Glu Asn Leu Gln Arg Glu Ile Lys Val Ala Gln Glu Arg Leu

85 90 95

Asp Met Ala Ile Gln Ala Tyr Asn Asn Gln Asn Asn Pro Gly Ser Ser

100 105 110

Ser Arg Glu Lys Lys Ser Lys Ala

115 120

<210> 75

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 75

Pro Tyr Leu Val Asp Cys Phe Val Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile

1 5 10 15

Phe Ile Ile Phe Met Leu Val Val Gly Leu Ile Ser Leu Val Leu Asn

20 25 30

Leu Leu Glu Leu Val His Leu Leu Cys Arg Cys Leu Ser Arg Gly Met

35 40 45

Arg Ala Arg Gln Gly Gln Asp Ala Pro Pro Thr Gln Gly Thr Ser Ser

50 55 60

Asp Pro Tyr Thr Asp Gln Val Phe Phe Tyr Leu Pro Val Gly Gln Gly

65 70 75 80

Pro Ser Ser Pro Pro Cys Pro Thr Tyr Asn Gly Leu Ser Ser Ser Glu

85 90 95

Gln Asn Trp Ala Asn Leu Thr Thr Glu Glu Arg Leu Ala Ser Ser Arg

100 105 110

Pro Pro Leu Phe Leu Asp Pro Pro

115 120

<210> 76

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 76

Cys Gly Ser Lys Glu His Gly Asn Arg Lys Met Arg Gly Arg Leu Leu

1 5 10 15

Leu Thr Tyr Met Ala Ser Ile Phe Phe Lys Ser Val Phe Glu Val Ala

20 25 30

Phe Leu Leu Ile Gln Trp Tyr Leu Tyr Gly Phe Thr Leu Ser Ala Val

35 40 45

Tyr Ile Cys Glu Gln Ser Pro Cys Pro His Arg Val Asp Cys Phe Leu

50 55 60

Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ile Leu Phe Met Leu Val Val

65 70 75 80

Ser Met Val Ser Phe Val Leu Asn Val Ile Glu Leu Phe Tyr Val Leu

85 90 95

Phe Lys Ala Ile Lys Asn His Leu Gly Asn Glu Lys Glu Glu Val Tyr

100 105 110

Cys Asn Pro Val Glu Leu Gln Lys

115 120

<210> 77

<211> 239

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 77

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 78

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 78

ccctcctccc gggcctcctc ccgggcctcc tcccggcccc ggcccgacga cctggagatc 60

<210> 79

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 79

cggccccggc ccgacgacct ggagatc 27

<210> 80

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 80

cggccccggc ccgacgacct ggaggtg 27

<210> 81

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 81

cggccccggc ccgacgacgt gcccgtg 27

<210> 82

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 82

aaggcccggt ccgacgacct gtccgtg 27

<210> 83

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 83

cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaag 48

<210> 84

<211> 108

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 84

cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcc ctcctcccgg 60

gcctcctccc gggcctcctc ccggccccgg cccgacgacc tggagatc 108

<210> 85

<211> 75

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 85

cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gccccggccc 60

gacgacctgg agatc 75

<210> 86

<211> 75

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 86

cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gccccggccc 60

gacgacctgg aggtg 75

<210> 87

<211> 75

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 87

cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gccccggccc 60

gacgacgtgc ccgtg 75

<210> 88

<211> 75

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 88

cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagaa ggcccggtcc 60

gacgacctgt ccgtg 75

<210> 89

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 89

Pro Cys Ser Arg Ala Ser Ser Arg Met Ser Ser Arg Ala Arg Pro Asp

1 5 10 15

Asp Leu Asp Val

20

<210> 90

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<400> 90

Pro Arg Val Ser Val Pro Asn Phe Gly Arg Thr Gln Ser Ser Asp Ser

1 5 10 15

Ala Tyr Val

<210> 91

<211> 26

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственных последовательностей; примечание =

синтетическая конструкция

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(1)

<223> Xaa является биотинилированной

<220>

<221> прочий_признак

<222> (1)..(1)

<223> Xaa является L-2-аминокапроновой кислотой

<400> 91

Xaa Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys

1 5 10 15

Lys Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile

20 25

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к применению С-концевых фрагментов альфа–коннексина для защиты от радиационного поражения, и может быть использовано в медицине. Изобретение обеспечивает сдерживание прогрессирования радиационного поражения у субъекта, а также предотвращение радиационного поражения у субъекта, подверженного риску такого поражения. 26 з.п. ф-лы, 4 ил., 11 табл., 3 пр.

1. Способ сдерживания прогрессирования радиационного поражения у субъекта или предотвращения радиационного поражения у субъекта, подверженного риску такого поражения, включающий введение субъекту композиции, содержащей выделенный полипептид, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:91.

2. Способ по п. 1, в котором композицию вводят до радиоактивного облучения субъекта.

3. Способ по п. 1, в котором композицию вводят субъекту после радиоактивного облучения, до проявления радиационного поражения.

4. Способ по п. 3, в котором композицию вводят субъекту до проявления изъязвления в участке радиационного поражения.

5. Способ по п. 1, в котором композицию вводят субъекту местно.

6. Способ по п. 1, в котором композиция, кроме того, содержит гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы.

7. Способ по п. 6, в котором гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы присутствует в концентрации, составляющей от 0,5% (в весовом отношении) до 2,5% (в весовом отношении).

8. Способ по п. 6, в котором гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы присутствует в концентрации, составляющей 1,25% (в весовом отношении).

9. Способ по п. 1, в котором композицию вводят субъекту парентерально.

10. Способ по п. 9, в котором композицию вводят субъекту внутривенным, подкожным, внутрибрюшинным, внутримышечным путем.

11. Способ по п. 1, в котором композицию вводят субъекту путем аэрозольной доставки.

12. Способ по п. 1, в котором концентрация полипептида в композиции составляет от 10 мкМ до 2000 мкМ.

13. Способ по п. 1, в котором концентрация полипептида в композиции составляет от 100 мкМ до 200 мкМ.

14. Способ по п. 1, в котором композицию вводят субъекту в дозе от 1 мг/кг до 50 мг/кг.

15. Способ по п. 1, в котором субъекту вводят композицию, содержащую полипептид, местно и вводят композицию, содержащую полипептид, системно.

16. Способ по п. 1, в котором радиационное поражение выбрано из группы, состоящей из радиационного поражения кожи (CRI), острой лучевой болезни (ARS), комбинированного радиационного поражения, радиационных ожогов, радиационного дерматита, радиационного поражения нервной системы или головного мозга, радиационного пневмонита, индуцированного облучением энтерита и их комбинации.

17. Способ по п. 16, в котором радиационное поражение включает CRI и ARS.

18. Способ по п. 16, в котором радиационный дерматит является результатом медицинского вмешательства.

19. Способ по п. 18, в котором медицинское вмешательство представляет собой терапию рака.

20. Способ по п. 19, в котором терапия рака представляет собой лучевую терапию.

21. Способ по п. 1, в котором радиационное поражение происходит в результате воздействия источника излучения, выбираемого из группы, состоящей из оружия массового уничтожения (WMD), ядерных взрывов и «грязных» бомб.

22. Способ по п. 21, в котором радиационное поражение происходит в результате воздействия «грязной» бомбы.

23. Способ по п. 1, в котором радиационное поражение происходит в результате воздействия источника излучения, выбираемого из группы, состоящей из диагностического аппарата, солнца или солярия.

24. Способ по п. 1, в котором радиационное поражение возникает в ткани, выбираемой из группы, состоящей из кожи, сердца, кости, головного мозга, спинного мозга, роговицы, сетчатки и периферического нерва.

25. Способ по п. 24, в котором радиационное поражение возникает на коже.

26. Способ по п. 21, в котором средняя оценка поражения кожи является сниженной на по меньшей мере 30% в присутствии полипептида по сравнению с контролем.

27. Способ по п. 1, в котором полипептид предотвращает поглощение радионуклидов.