СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ШТАММОВ БЛЕДНЫХ ТРЕПОНЕМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КРИОКОНСЕРВАЦИИ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в исследованиях по изучению биологических свойств возбудителя сифилиса, при сохранении и поддержании культуральных штаммов бледных трепонем, а также в технологии производства лечебно-диагностических препаратов на их основе.

Возбудителем сифилиса является бледная трепонема (спирохета), открытая в 1905 г. F. Schaudinn и Е. Hoffman. По классификации Bergey она относится к отделу Gracillicutes, порядку Spirochaetales, семейству Spirochaetaceae, роду Treponema, виду Treponema pallidum, подвиду Treponema pallidum pallidum (Определитель бактерий Берджи. Справочное пособие в 2-х томах / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита / пер. с англ. под ред. Г.А. Заварзина. - М.: «Мир», 1997. - 800 с.).

Бледных трепонем, выделенных из патологического материала от человека, практически никогда не удавалось поддерживать в патогенном состоянии на искусственных средах. Однако попытки выращивания бледной трепонемы на питательных средах в анаэробных условиях привели к получению определенного количества культивируемых штаммов. Указанные штаммы трепонем, получившие название «культуральные» (в отличие от патогенных «тканевых» трепонем), являются авирулентными не только для человека, но и для чувствительных к сифилису лабораторных животных - кроликов и приматов.

Культуральные трепонемы несколько отличаются от тканевых по своим морфологическим, биохимическим и патогенным свойствам. Однако особенно значимо то, что антигенные свойства их очень близки к патогенным вариантам возбудителя сифилиса. Наибольшее количество культуральных штаммов бледных трепонем в нашей стране выделили В.М. Аристовский и Р.Р. Гельтцер. Данные «казанские» (I, II, IV, V) и «ставропольские» (VI, VII, VIII, IX) штаммы наряду со штаммом Рейтера применяют для приготовления антигенов для серодиагностики сифилиса (Овчинников Н.М. Экспериментальный сифилис / Н.М. Овчинников. - М.: Медгиз, 1955. - 387 с.).

Следует отметить, что возбудитель сифилиса является крайне прихотливым микроорганизмом. Культуральные трепонемы по сравнению с другими гетеротрофными микроорганизмами отличаются высокими питательными потребностями, не растут на обычных питательных средах, развиваются в узком температурном и кислотно-щелочном диапазоне, требуют тщательного соблюдения анаэробных условий, характеризуются очень медленным (до 7-10 сут) ростом и низким накоплением биомассы.

Бледные трепонемы хорошо развиваются на хорионаллантоисной ткани куриного зародыша в кроличьей сыворотке с добавлением кусочков мозговой ткани под слоем вазелинового масла. Наиболее распространенными питательными средами для выращивания культуральных трепонем являются среды, питательной основой которых является бульон из бычьих сердец с кусочками печени или бычьего сердца с добавлением пептона и ростовых факторов (Ю.А. Козлов. Питательные среды в медицинской микробиологии, М.: Медгиз, 1950, с. 203-206; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования под редакцией М.О. Биргера, М.: Медицина, 1973, с. 47-92). Были разработаны среды на основе смеси асцитической жидкости с печеночным бульоном (рН 7,4-7,6), в которых кусочки печени заменены кусочками агара или мелко нарезанного круто сваренного куриного желтка. Описано использование жидких питательных сред на основе белковых гидролизатов пищевого и непищевого сырья (RU 2198920 С1, 20.02.2003). На рынке предлагается сухая коммерческая среда для получения биомассы трепонем штамма Рейтера - «Бульон Омата для трепонем и фузобактерий» (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия).

Наиболее близким по существу и назначению к заявляемому способу поддержания культуральных штаммов трепонем является традиционный метод субкультивирования (Овчинников Н.М. Экспериментальный сифилис / Н.М. Овчинников. - М.: Медгиз, 1955. - 387 с.), основанный на регулярных и частых (1 раз в 2-4 недели) пересевах на жидких питательных средах. Для поддержания чистых культур наиболее часто применяют жидкие питательные среды на основе мясопептонного бульона с добавлением кусочков телячьей печени в количестве 0,25% от объема питательной среды с рН 8,0-8,4. Культивирование осуществляют при температуре 36-38°C в течение 5-7 сут в статических анаэробных условиях.

Необходимо учитывать, что метод субкультивирования характеризуется рядом существенных недостатков: трудоемкостью, высокой стоимостью питательных сред, приготовленных на основе высококачественного пищевого сырья, опасностью контаминации культур посторонней микрофлорой в процессе пересевов, угрозой изменения основных биологических свойств возбудителя. Указанные трудности сохранения штаммов приводят к необходимости систематического дублирования пересевов и поддержания связей с учреждениями, сохраняющими культуральные штаммы бледных трепонем.

Известно, что низкотемпературная консервация отличается небольшим повреждающим действием и расценивается многими авторами (Никитин Е.Е., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов / Е.Е. Никитин, И.В. Звягин. - М., 1979. - 337 с.; Пушкарь Н.С., Белоус A.M. Введение в криобиологию. - Киев: Наукова думка, 1975. - 175 с.) как один из перспективных методов хранения микробных культур, который на сегодняшний день широко используется в лабораторной практике. Эффективность данного метода определяется неукоснительным соблюдением режима хранения и диапазоном используемых температур (Эшвуд-Смит, М. Консервирование микроорганизмов замораживанием, сушкой из замороженного состояния и обезвоживанием в эксикаторе / М. Эшвуд-Смит / пер. с англ. - М., 1982. - 36 с.). Для повышения устойчивости микробов в процессе низкотемпературной консервации и последующего хранения необходимым является применение криозащитных сред (криопротекторов).

Следует отметить, что аналогичный подход используется для сохранения жизнеспособности патогенного штамма бледных трепонем (Treponema pallidum pallidum штамм Никольса), который не поддается выращиванию на искусственных питательных средах и поддерживается исключительно в организме восприимчивого лабораторного животного (кролика). Он включает в себя: тестикулярное заражение кролика культурой патогенной бледной трепонемы; получение из яичка взвеси микробов, содержащей экстракт нативных тканей; стабилизацию суспензии криопротектором (глицерином); разделение на небольшие аликвоты объемом 0,75-1,5 мл; замораживание и хранение при температуре минус 70-80°C (RU 2292388 C1, 27.01.2007).

Задачей изобретения является разработка способа, обеспечивающего сохранение жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем в течение продолжительного периода времени, при упрощении способа и снижении затрат, связанных с приобретением и/или приготовлением дорогостоящего пищевого сырья надлежащего качества (питательных сред), и устранении опасности контаминации культур посторонней микрофлорой в процессе осуществления регулярных пересевов.

Технический результат заключается в увеличении сроков сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем.

Поставленная задача решается тем, что способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации включает получение стабилизированных микробных суспензий из нативных концентрированных культур штаммов трепонем путем добавления криозащитной среды с последующим замораживанием и хранением стабилизированных микробных суспензий при температуре минус (38-42)°C. В частном варианте осуществления изобретения добавление криозащитной среды может быть осуществлено в объемном соотношении 2:1. Нативные концентрированные культуры штаммов трепонем получают из нативных глубинных культур с использованием метода естественного осаждения с последующим удалением надосадочной жидкости. Нативные глубинные культуры штаммов трепонем получают из посевного материала на коммерческом «Бульоне Омата для трепонем и фузобактерий», выращивание которого осуществляют в мясопептонном бульоне с добавлением кусочков печени. В заявляемом способе может быть использована криоконсервирующая среда любого состава, обеспечивающая жизнеспособность культуральных трепонем при замораживании и хранении. В частном варианте осуществления изобретения использована защитная среда включающая, мас.%: сахарозу - от 7 до 8, глицерин - от 28 до 32, калий фосфорнокислый двузамещенный - от 0,5 до 0,7.

Технический результат достигается за счет того, что осуществляют накопление биомассы трепонем в жидкой питательной среде, концентрирование методом естественной седиментации с последующим декантированием надосадочной жидкости и стабилизацию концентрированной микробной суспензии криозащитной сахарозо-глицериновой средой. Полученный препарат расфасовывают в отдельные герметичные укупорки, например по 5 мл, и немедленно подвергают замораживанию для последующего хранения при температуре минус 40±2°C.

Концентрирование биомассы трепонем обеспечивает создание необходимой посевной дозы для последующих пересевов, добавление криозащитной сахарозо-глицериновой среды обусловливает защитный эффект при замораживании и хранении, фасовка в отдельные герметичные укупорки позволяет достигать оптимальных темпов замораживания и размораживания полученного продукта, а последующее хранение при температуре минус 40±2°C обеспечивает сохранение жизнеспособности микроорганизмов не менее 18 мес (по данным экспериментальных исследований).

Совокупность перечисленных операций и условий их выполнения обеспечивает получение следующих преимуществ:

при бесперебойной работе холодильного оборудования гарантированно сохраняется жизнеспособность и ростовые свойства культуральных штаммов бледных трепонем не менее 18 мес;

криоконсервированные культуры штаммов трепонем после реактивации могут быть использованы для непосредственного засева жидких питательных сред из расчета содержимое одной укупорки на 0,25-0,5 л среды;

осуществление контроля на всех этапах приготовления криоконсервированных культур штаммов трепонем гарантирует отсутствие посторонней микрофлоры и снижение связанных с этим потерь, наблюдаемых в процессе многократных пересевов;

сроки культивирования штаммов трепонем в анаэробных условиях при температуре 37±1°C при использовании в качестве посевного материала криоконсервированных культур практически не отличаются от аналогичных при использовании в качестве посевного материала глубинных культур (7-10 сут);

хранение криоконсервированных культур в отдельных герметичных укупорках позволяет дробно использовать первоначально приготовленный препарат без ухудшения его свойств и многократно применять в качестве посевного материала;

при систематическом применении данного способа снижаются прямые материальные и трудовые затраты, связанные с приобретением и приготовлением питательных сред, осуществлением регулярных пересевов, в том числе при временном прекращении работ с культуральными штаммами бледных трепонем.

Способ осуществляют следующим образом:

получают посевной материал штаммов трепонем путем выращивания микробов, например, в мясопептонном бульоне с добавлением от 20 до 25% по объему кусочков вареной говяжьей печени в колбах в анаэробных условиях при температуре (37±1)°C в течение от 7 до 10 сут;

получают нативные глубинные культуры штаммов трепонем путем выращивания микробов, например, в коммерческой жидкой питательной среде «Бульон Омата для трепонем и фузобактерий» (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., Индия) с добавлением коммерческой сыворотки крупного рогатого скота в колбах в анаэробных условиях при температуре (37±1)°C в течение от 7 до 10 сут в шейкере-инкубаторе при частоте оборотов платформы 120±10 об/мин^-1;

получают нативные концентрированные суспензии штаммов трепонем с использованием метода естественной седиментации с последующим декантированием надосадочной жидкости, который включает отстаивание полученной на предыдущем этапе микробной культуры в течение суток при температуре (20±2)°C до получения оформленного осадка с последующим удалением в асептических условиях надосадочной жидкости в объеме от 60 до 80% от исходного объема культуральной жидкости;

готовят стабилизированные микробные суспензии штаммов трепонем путем добавления криозащитной среды, включающей следующие компоненты, мас.%: сахарозу - от 7 до 8, глицерин - от 28 до 32, калий фосфорнокислый двузамещенный - от 0,5 до 0,7;

в стабилизированных микробных суспензиях штаммов трепонем осуществляют контроль внешнего вида, типичности свойств микробов и отсутствие посторонней микрофлоры методом фазово-контрастной микроскопии в нативных препаратах типа «раздавленная капля»;

производят фасовку стабилизированных микробных суспензий штаммов трепонем в отдельные герметичные укупорки;

в течение 1 часа с момента приготовления стабилизированные микробные суспензии штаммов трепонем замораживают при температуре минус 40±2°С; хранение криоконсервированных микробных суспензии штаммов трепонем осуществляют при температуре минус 40±2°C сроком до 18 мес.

Осуществимость заявляемого способа с достижением технического результата подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Способ криоконсервации культуральных штаммов бледной трепонемы на примере штамма Treponema pallidum pallidum Рейтера

Для получения посевного материала трепонем в колбу вместимостью 0,5 л, заполненную на три четверти стерильным мясопептонным бульоном с кусочками печени под ватно-марлевой пробкой, асептически вносили культуру штамма Рейтера в количестве от 40 до 60 мл. Для создания анаэробных условий на поверхность засеянной среды осторожно наслаивали предварительно расплавленный на водяной бане стерильный медицинский вазелин, чтобы получилась герметичная пробка высотой 1,5-2,0 см. Содержимое засеянных колб тщательно перемешивали аккуратными вращательными движениями и помещали в термостат при температуре (37±1)°C на срок от 7 до 10 сут. Ежедневно несколько раз в день осуществляли перемешивание растущих культур аккуратными вращательными движениями для равномерного распределения микробов по всему объему среды.

Для получения нативной глубинной культуры в колбу вместимостью 0,5 или 1 л, заполненную на три четверти стерильным коммерческим бульоном Рейтера с добавлением 10% нативной сыворотки крупного рогатого скота, асептически вносили приготовленный на мясопептонном бульоне посевной материал в количестве около 10-20% по объему. Для создания анаэробных условий на поверхность засеянной среды осторожно наслаивали предварительно расплавленный на водяной бане стерильный медицинский вазелин, чтобы получилась герметичная пробка высотой 1,5-2,0 см. Содержимое засеянных колб тщательно перемешивали и помещали в шейкер-инкубатор при температуре (37±1)°С и частоте движения платформы 120±10 качаний·мин^-1 на срок 7-10 сут. Ежедневно несколько раз в день осуществляли визуальный контроль роста.

Для получения концентрированной нативной культуры по окончании выращивания колбы оставляли при комнатной температуре на 24 ч для уплотнения осадка. По истечении указанного срока из каждой колбы асептически с помощью стерильной стеклянной лопаточки удаляли вазелиновую пробку. Затем с помощью вакуума из каждой колбы очень осторожно удаляли надосадочную жидкость (от 60 до 80%) таким образом, чтобы не нарушить целостность осадка. Кондиционные осадки со всех колб асептически мерно объединяли в одну стерильную емкость. Культуру подобным образом сконцентрировали в 30 раз. После этого осуществляли контроль типичности морфологии и наличия посторонней микрофлоры с помощью микроскопии.

К концентрированной суспензии добавляли криозащитную среду в объемном соотношении 2:1. Содержимое емкости тщательно перемешивали. После этого осуществляли контроль типичности морфологии микробов и отсутствие посторонней микрофлоры в нативных препаратах типа «раздавленная капля» с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Стабилизированную микробную суспензию расфасовали по 5 мл в стерильные флаконы емкостью 10 мл, укупоривали резиновыми пробками, которые фиксировали металлическими колпачками. Расфасованные и промаркированные флаконы со стабилизированной концентрированной культурой трепонем немедленно помещали в низкотемпературный рефрижератор с температурой минус 40±2°С для замораживания и хранения.

Заявляемым методом были приготовлены три серии криоконсервированных культур. В процессе хранения регулярно проводили контроль сохранности жизнеспособности и ростовых свойств микробов (таблица 1). Для этого флаконы с криоконсервированной культурой штамма реактивировали в течение 30 мин при температуре (37±1)°С, а затем засевали в колбы емкостью 0,25 л, содержащие мясопептонный бульон с кусочками печени. Выращивание осуществляли от 7 до 10 сут при температуре (37±1)°С при ежедневном перемешивании, макро- и микроскопическом контроле роста.

Заявляемый способ был апробирован с использованием культуральных штаммов Treponema pallidum pallidum «Казань» V, «Ставрополь» VII, «Ставрополь» VIII, «Ставрополь» IX (см. примеры 2-5 таблицы 1).

Результаты проведенных исследований показывают, что после замораживания и хранения криоконсервированных культур культуральных штаммов трепонем в течение 18 мес при температуре минус (40±2)°С их ростовые свойства в жидкой питательной среде практически не отличаются от аналогичных показателей для микробов, хранившихся в течение 1-2 мес при комнатной температуре в мясопептонном бульоне с кусочками печени.

Изобретение относится к области микробиологии. Способ предусматривает накопление биомассы бледных трепонем в жидкой накопительной питательной среде. Проводят концентрирование методом естественной седиментации с последующим декантированием надосадочной жидкости. Затем проводят стабилизацию концентрированной микробной суспензии защитной сахарозо-глицериновой средой с получением препарата. Полученный препарат расфасовывают в отдельные герметичные укупорки и подвергают замораживанию при температуре минус 40±2°C с последующим хранением при этой же температуре. Изобретение позволяет сохранять жизнеспособность и ростовые свойства культуральных штаммов трепонем в течение 18 мес. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.

1. Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации, включающий получение стабилизированных микробных суспензий из нативных концентрированных культур штаммов трепонем путем добавления сахарозо-глицериновой криозащитной среды с последующим замораживанием и хранением стабилизированных микробных суспензий при температуре минус 40±2°С.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что добавление криозащитной среды осуществляют в объемном соотношении 2:1.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что нативные концентрированные культуры штаммов трепонем получают из нативных глубинных культур с использованием метода естественного осаждения с последующим удалением надосадочной жидкости.

4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что нативные глубинные культуры штаммов трепонем получают из посевного материала на коммерческом «Бульоне Омата для трепонем и фузобактерий», выращивание которого осуществляют в мясопептонном бульоне с добавлением кусочков печени.