ЗАМЕЩЕННЫЕ ГИДРАЗОНЫ 5-АРИЛФУРФУРОЛОВ - ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ИНГИБИТОРЫ БРУЦЕЛЛ Российский патент 2018 года по МПК A61K31/341 C07D307/52 A61P31/04 

Изобретение относится к применению замещенных гидразонов 5-арилфурфуролов, созданных на основе гидразидов ароматических кислот и замещенных 5-арилфурфуролов,

N'-((5-(2,4-дифторфенил)фуран-2-ил)метилен)-2-гидроксибензгидразид (CL-192)

N'-((5-(2-нитрофенил)фуран-2-ил)метилен)изоникотиногидразид (CL-193)

4-(5-((2-(2-гидроксибензоил)гидразоно)метил)фуран-2-ил)бензосульфонамид (CL-195)

Метил 4-(5-((2-изоникотиноилгидразоно)метил)фуран-2-ил)бензоат (CL-196)

Предлагаемые соединения могут найти применение в медицине и ветеринарии для создания лекарственных средств, обладающих ингибирующей активностью в отношении патогенных бактерий с системой секреции IV типа, конкретно бруцелл.

Известно, что бруцеллез - инфекционное, особо опасное зоонозное заболевание, вызываемое бактериями рода Brucella, которые передаются от животных к человеку и вызывают тяжелое, часто с хроническим течением, заболевание [1, 2], которое представляет актуальную проблему для здравоохранения во всем мире. По данным ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется более 500 тыс. впервые выявленных случаев бруцеллеза у людей [3], для России этот показатель составляет около 500 человек [4]. При этом в стране существует огромный контингент лиц, не охваченных официальным учетом, страдающих хроническим бруцеллезом, устойчивым к общепринятой терапии антибиотиками. Бруцеллез у людей протекает с рецидивами и в большинстве случаев переходит в хроническую форму [5]. До настоящего времени отсутствуют эффективные лекарственные препараты, включая антибиотики, которые оказывают выраженный терапевтический эффект на хроническую бруцеллезную инфекцию. Это связано с эволюционно выработанной адаптацией бруцелл к их внутриклеточной нише, направленной на длительное выживание в клетках макроорганизма с механизмами ускользания от иммунной системы и последующим развитием хронической инфекции. При этом снижается чувствительность бруцелл к антибактериальным препаратам, эффективным на острой стадии инфекционного процесса.

По современным представлениям, ведущая роль в реализации патогенных свойств ряда бактерий принадлежит системе секреции IV типа, которая обеспечивает транспорт и секрецию эффекторных белков через мембраны и межклеточное пространство непосредственно в цитоплазму клетки-хозяина, что изменяет ее физиологическое состояние, инактивирует иммунные реакции организма и способствует внутриклеточному размножению патогена. Система секреции IV типа реализует посредством эффекторных молекул различные адаптационные стратегии, направленные на длительное выживание в организме хозяина с развитием хронической инфекции.

Как известно, бруцеллы являются грамотрицательными, факультативными, внутриклеточными, бактериальными патогенами. Определяющим фактором вирулентности бруцелл является секреторная система IV типа, которая играет ведущую роль в развитии хронической бруцеллезной инфекции, необходима для размножения и персистенции бруцелл внутри макрофага [6, 7].

В настоящее время инновационное и приоритетное решение проблемы лечения и профилактики хронического бруцеллеза, которое может изменить существующие способы борьбы с этой инфекцией, заключается в использовании перспективных мишеней для разработки нового поколения препаратов: специфических безопасных и эффективных ингибиторов возбудителя бруцеллеза человека.

Одно из современных направлений - это мишеневое воздействие активных соединений на систему секреции IV типа, которая играет определяющую роль в развитии хронической бруцеллезной инфекции, являясь ключевым фактором вирулентности. Такой подход открывает новый уровень специфического, ингибирующего воздействия на инфекционный процесс при бруцеллезе. Для поиска и валидации новых химических соединений, эффективно блокирующих развитие хронической бруцеллезной инфекции и способных заменить антибиотики в процессе лечения, предложено использовать белки этой системы с известной кристаллографической структурой, например ключевой белок VirB8. Этот белок является перспективной мишенью для химических соединений, отбор которых базировался на их способности блокировать его функцию по димеризационному взаимодействию в формировании системы секреции IV типа [6]. Подход, направленный на поиск ингибиторов белка VirB8, позволил выявить соединение B8I-2, нарушающее его способность к димеризации, которая обеспечивает функционирование всего белкового комплекса секреторной системы IV типа, (формула приведена ниже)

По результатам этих исследований, молекулярная структура B8I-2 являлась наиболее перспективным ингибитором секреторной системы IV типа, который значительно снижал внутриклеточное размножение патогенного вида бруцелл в макрофагах хозяина [6]. В литературе имеются данные о применении гидразонов 5-арилфурфуролов как веществ, обладающих противоопухолевой активностью [13] и как веществ, обладающих туберкулостатическим действием [14]. Однако нет данных об использовании этих соединений в качестве ингибиторов бруцелл.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является применение соединений на основе замещенных гидразонов 5-арилфурфуролов, а именно:

N'-((5-(2,4-дифторфенил)фуран-2-ил)метилен)-2-гидроксибензгидразид (CL-192)

N'-((5-(2-нитрофенил)фуран-2-ил)метилен)изоникотиногидразид (CL-193)

4-(5-((2-(2-гидроксибензоил)гидразоно)метил)фуран-2-ил)бензосульфонамид (CL-195)

Метил 4-(5-((2-изоникотиноилгидразоно)метил)фуран-2-ил)бензоат (CL-196)

Технический результат изобретения заключается в получении биологически активных соединений, обладающих высокой ингибирующей активностью в отношении хронической бруцеллезной инфекции. При этом синтезированные соединения безопасны, нетоксичны для клеток человека, хорошо растворимы в органических растворителях, проявляют выраженную специфическую активность в условиях in vitro путем подавления внутриклеточного размножения бруцелл, и характеризуются отсутствием у возбудителя устойчивости к этим соединениям. Предлагаемые замещенные гидразоны 5-арилфурфуролов в виду их значительной активности и низкой цитотоксичности представляются перспективными в качестве кандидатов новых противобруцеллезных препаратов.

Краткое описание чертежей

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами графических изображений. В нижеуказанных фигурах в виде таблиц сравнения данных экспериментов проводили с референс-препаратом - CL-191, который служил положительным контролем, и DMSO (диметилсульфоксид), который использовали в качестве контроля растворителя.

На фиг. 1 в виде Таблицы 1 представлена цитотоксичность соединений CL-192, CL-193, CL-195, CL-196, по определению количества жизнеспособных клеток (в процентах (%) монослоя макрофагов B10.MLM в тесте с красителем метиленовым синим при инкубации в течение 48 ч с каждым соединением при разных концентрациях: 6 μМ, 12 μМ и 24 μМ.

Значительной цитотоксической активности соединений не выявлено, процент жизнеспособных клеток B10.MLM превышал 95% (не более 1-4% нежизнеспособных клеток).

На фиг. 2 в виде Таблицы 2 показана ингибирующая активность предлагаемых соединений CL-192, CL-193, CL-195, CL-196 на внутриклеточное размножение штамма Brucella melitensis 16М при одномоментном заражении макрофагов B10.MLM. Через 24 часа воздействия соединения в концентрациях 6 μМ и 12 μМ показали их различную и дозозависимую активность на размножение патогенного вида бруцелл в фагоцитах B10.MLM. Повышенной активностью в ингибировании внутриклеточного размножения бруцелл в макрофагах характеризовались соединения CL-195 и CL-196 и контрольное соединение CL-191, (до полного подавления внутриклеточного размножения бруцелл) в сравнении с CL-192 и CL-193. 0 - остановка размножения В. melitensis 16М в макрофагах B10.MLM.

На фиг. 3 в виде Таблицы 3 показано действие предлагаемых соединений CL-192, CL-193, CL-195, CL-196 в концентрации 12 μМ на внутриклеточное размножение штамма В. melitensis 16М через 24 ч воздействия при их добавлении после этапа инвазии. При этом активность соединений снижалась (оставались жизнеспособными от 11,63 до 40,69% внутриклеточных бруцелл) в сравнении с условиями их добавления одномоментно в процессе инфекции. Наиболее выраженный эффект отмечен у соединения CL-195 (11,63%).

На фиг. 4 в виде Таблицы 4 представлены результаты вегетативного роста штамма В. melitensis 16М в среде RPM1 с добавлением соединений CL-192, CL-193, CL-195, CL-196 в концентрации 25 μМ. Соединения не задерживали вегетативный рост бруцелл, не оказывая на них бактерицидного эффекта, что подтверждает их исключительно ингибирующую активность на внутриклеточное размножение бруцелл.

КОЕ, соответствующие средним титрам (кл./мл) живых бруцелл,

0 ч - средний титр (кл/мл) живых бруцелл при старте роста в среде RPM1 с химическими соединениями в растворителе DMSO,

24 ч - средний титр (кл./мл) живых бруцелл после суток роста в среде RPM1.

Для изучения существа заявленного изобретения, выведенного в формуле изобретения, и демонстрации преимуществ и особенностей далее приводятся примеры осуществления.

Синтез соединений

Замещенные гидразоны 5-арилфурфуролов получаются на основе 5-арилфурфуролов общей формулы (I), которые получают по модифицированной реакции Меервейна [8-10] из фурфурола и предварительно полученной диазониевой соли соответствующего анилина в присутствии каталитических количеств хлорида меди (CuCl₂).

Для получения целевых ингибиторов предложен следующий трехстадийный подход к их синтезу. Первая стадия включает в себя получение по модифицированной реакции Меервейна замещенных 5-арилфурфуролов из фурфурола и предварительно полученной диазониевой соли соответствующего анилина в присутствии каталитических количеств хлорида меди. Заключительная стадия сводится к конденсации 5-арилфурфуролов с соответствующими гидразидами бензойных и гетероароматических кислот, полученными на второй стадии процесса, с образованием целевых гидразонов 5-арилфурфуролов общей формулы (I):

1 стадия: Получение замещенных 5-арилфурфуролов по модифицированной реакции Меервейна

R=2-NO₂, 2,4-диF, 4-СООСН₃, 4-SO₂NH₂

2 стадия: Получение гидразидов кислот из сложных эфиров.

R₂=2-ОН-С₆Н₄, 4-Py

3 стадия: Конденсация замешенных 5-арилфурфуролов с гидразидами кислот.

R=2-NO₂, 2,4-диF, 4-COOCH₃, 4-SO₂NH₂

R₂=2-OH-C₆H₄, 4-Py

Общая методика получения 5-арилфурфуролов

К раствору (0,1 моль) соответствующего анилина в 100 мл 10% водного раствора соляной кислоты по каплям добавляли при охлаждении водный раствор (0,11 моль) нитрита натрия и выдерживали в течение 1 часа. Затем приливали одной партией раствор (0,1 моль) фурфурола в водно-ацетоновом растворе (1:1), перемешивали при комнатной температуре раствор 12 ч и отфильтровывали выпавший осадок. Промывали осадок на фильтре водой и сушили на воздухе.

Общая методика получения гидразонов 5-арилфурфуролов

Гидразоны 5-арилфурфуролов получены кипячением в этаноле смеси эквимолярных количеств, соответствующего 5-арилфурфурола и гидразида ароматической кислоты. После 2 часов кипячения реакционную смесь охлаждали, отфильтровывали выпавшие кристаллы, сушили на фильтре и перекристаллизовывали из этанола.

Характеристики физико-химических констант химических соединений CL-192, CL-193, CL-195, CL-196:

N'-((5-(2,4-дифторфенил)фуран-2-ил)метилен)-2-гидроксибензгидразид (CL-192)

(CL-192) Кристаллы светло-желтого цвета с Тпл.=246-247°С (из этанола). Лит.: 248-249°С [13]. ¹Н NMR (500 MHz, DMSO-d₆) 11.86 (уш. с., 2Н), 8.41 (с, 1Н), 7.86-7.92 (м, 2Н), 7.39-7.45 (м, 2Н), 7.22-7.25 (м, 1Н), 7.10-7.11 (м, 1Н), 6.93-6.98 (м, 3Н). Найдено (%): С 63.09, Н 3.54, N 8.07. Вычислено (%): С 63.16, Н 3.53, N 8.18. Масс-спектр, m/z: 342.

N'-((5-(2-нитрофенил)фуран-2-ил)метилен)изоникотиногидразид (CL-193)

(CL-193) Кристаллы желтого цвета с Тпл.=180-181°С (из этанола). ¹Н NMR (500 MHz, DMSO-d₆) 12.04 (уш. с., 1H), 8.78 (с, 2Н), 8.40 (с, 1Н), 7.94-7.96 (м, 1Н), 7.88-7.90 (м, 1Н), 7.76-7.81 (м, 3 Н), 7.62-7.65 (м, 1Н), 7.14-7.15 (м, 1Н), 7.03-7.06 (м, 1Н). Найдено (%): С 60.68, Н 3.58, N 16.57. Вычислено (%): С 60.71, Н 3.60, N 16.66. Масс-спектр, m/z: 336.

4-(5-((2-(2-гидроксибензоил)гидразоно)метил)фуран-2-ил)бензосульфонамид (CL-195)

(CL-195) Кристаллы коричневого цвета с Тпл.=303-305°С (из этанола). ¹Н NMR (500 MHz, DMSO-d₆) 11.86 (с, 1Н), 11.76 (с, 1Н), 8.42 (с, 1Н), 7.87-8.03 (м, 5Н), 7.40-7.44 (м, 3Н), 7.30-7.31 (м, 1Н), 7.12-7.13 (м, 1H), 6.94-6.99 (м, 2Н). Найдено (%): С 56.06, Н 3.89, N 10.85. Вычислено (%): С 56.10, Н 3.92, N 10.90. Масс-спектр, m/z: 385.

Метил 4-(5-((2-изоникотиноилгидразоно)метил)фуран-2-ил)бензоат (CL-196)

(CL-196) Кристаллы желтого цвета с Тпл.=243-245°С (из этанола).) ¹Н NMR (500 MHz, DMSO-d₆) 12.05 (с, 1Н), 8.78 (с, 2Н), 8.42 (с, 1H), 8.00-8.02 (м, 2Н), 7.89-7.91 (м, 2Н), 7.80-7.81 (м, 2Н), 7.30-7.31 (м, 1Н), 7.12-7.13 (м, 1H), 3.86 (с, 3Н). Найдено (%): С 65.29, Н 4.30, N 11.98. Вычислено (%): С 65.32, Н 4.33, N 12.03. Масс-спектр, m/z: 349.

Соединение B8I-2, обозначенное в настоящей разработке CL-191, является референс-препаратом и использовалось в качестве положительного контроля.

Характеристика физико-химических констант соединения N'-((5-(2-нитрофенил)фуран-2-ил)метилен)-2-гидроксибензгидразид (CL-191):

(CL-191) Кристаллы желто-коричневого цвета с Тпл.=176-178°С (из этанола) 1Н NMR (500 MHz, DMSO-d6) 11.82 (уш. с., 2Н), 8.39 (с, 1Н), 7.74-7.96 (м, 5Н), 7.63-7.66 (м, 1Н), 7.42-7.45 (м, 1Н), 7.03-7.11 (м, 1Н), 6.94-7.02 (м, 3Н). Найдено (%): С 61.51, Н 3.72, N 22.61. Вычислено (%): С 61.54, Н 3.73, N 22.77. Масс-спектр, m/z: 351.

В спектрах ЯМР ¹Н химических соединений CL-191, CL-192, CL-193, CL-195, CL-196 наблюдался удвоенный набор резонансных сигналов N=CH-фрагмента, а также сигналов протонов группы CONH. что свидетельствует о наличии в растворе двух конформеров искомых продуктов - Z и Е, что свидетельствует о проявлении характерной для гидразонов конформационной Е, Z-изомерии за счет заторможенного вращения вокруг связи С-N. Преобладающим является стерически более устойчивый Z-конформер, доля которого в смеси составляет 93-95%.

Соединения CL-191, CL-192, CL-193, CL-195, CL-196 характеризовались высокой степенью растворимости в диметилсульфоксиде (DMSO), при этом CL-196 обладал худшей растворимостью по сравнению с другими соединениями. Все соединения не образовывали осадка в процессе приготовления и при разведении в среде культивирования RPM1.

В работе использовали референтный штамм В. melitensis 16М, биовар 1, высоковирулентный для людей штамм, из Государственной коллекции микроорганизмов II группы патогенности ФГБУ ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России. Как известно, этот референтный штамм используется в мире для получения генетических мутаций, моделирования хронической бруцеллезной инфекции на культурах клеток и экспериментальных животных и для заражения животных при проверке защитных характеристик вакцинных штаммов. Работа со штаммом проводилась в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами [11]. Использовали триптозный бульон и агар (фирмы "Difco" США), в качестве среды роста применяли RPM1 ("ПанЭко", Россия). Эксперименты проводили на клетках B10.MLM, которые представляли собой легочные фагоциты (макрофаги), обладающие способностью формировать монослои на планшетах и для которых оптимизированы условия хронической инфекции без цитотоксической активности [12]. Макрофаги B10.MLM культивировали во флаконах 25 см² ("Costar", Англия) в среде RPM1 ("ПанЭко", Россия) с добавлением 5 мМ глютамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("HyClone" США, каталожный номер KO53 фирмы "ПанЭко") с 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина в течении 48 ч при 37°С под 5% CO₂ (инкубатор ("Sanyo" Япония).

Для определения цитотоксичности предлагаемых соединений использовали метод окрашивания клеток метиленовым синим с последующим спектрометрическим учетом результатов. Работу проводили в формате 96-луночных планшетов. Сравнения в экспериментах проводили с референс-препаратом - CL-191, который служил положительным контролем, также использовали DMSO в качестве контроля растворителя.

Пример 1. Определение цитотоксического действия полученных соединений.

С этой целью получали монослой клеток B10.MLM в 96 луночных планшетах ("Nunc" Дания) после 48 ч. роста в полной среде RPM1. Затем предлагаемые соединения растворяли в полной среде RPM1 и добавляли в лунки с монослоями клеток B10.MLM. Соединения, растворенные в DMSO и раститрованные в среде RPM1, добавляли в концентрации 6, 12 и 24 μМ, соответственно по 4 лунки на каждую концентрацию соединения. Через 48 ч. инкубации при 37°С удаляли среду роста. После фиксации клеток монослоя в лунки наносили по 40 мкл 0,5% раствора метиленового синего и инкубировали при 20°С в течение 20 мин. Неоднократно отмывали дистиллированной водой до отсутствия синевы в отмывочном растворе. Лизировали монослой клеток в 100 мкл 5% детергенте SDS (sodium dodecyl sulfate) на ФСБ (фосфатно-солевом буфере рН 7,2) и инкубировали при 20°С 90 мин. Измерение на фотометре проводили при фильтрах длин волн 620 нм и 540 нм. Количество жизнеспособных клеток оценивали в процентах значений измерений, произведенных в контрольных и опытных лунках после экстракции метиленового синего 5% раствором SDS.

В таблице 1 (фиг. 1) показаны результаты изучения цитотоксичности макрофагов B10.MLM (в процентах). Результаты опытов по оценке жизнеспособности клеток B10.MLM при 6 μМ, 12 μМ концентрации химических соединений с экспозицией 48 ч. не выявили выраженной цитотоксической активности. При концентрации этих соединений в 24 μМ процент жизнеспособных клеток B10.MLM превышал 95% (не более 1-4% гибели клеток), наименьший цитотоксический эффект был показан для соединений CL-192 и CL-195.

Пример 2. Ингибирующая активность соединений на размножение штамма В. melitensis 16М внутри макрофагов B10.MLM (внутриклеточное размножение бруцелл).

Исследование проводилось в соответствии с методикой инфекции эукариотических макрофагов бруцеллами, обозначенной как «гентамициновая проба» [6]. Соединения в конечной концентрации 6 и 12 μМ добавляли одномоментно с заражением (инфекция) в лунках монослоя макрофагов B10.MLM вирулентным штаммом В. melitensis 16М. В эксперименте можно выделить три этапа:

На первом этапе эксперимента для заражения штамм бруцелл В. melitensis 16М отмывали от триптозного бульона, стандартизировали и ресуспендировали в RPM1 среде до концентрации 10⁷ кл/мл. Клеточный монослой B10.MLM в 96-луночных планшетах отмывали от полной среды RPM1 с антибиотиками с помощью ФСБ.

На 2-ом этапе эксперимента в каждую лунку планшета добавляли 100 мкл бруцелл заданной концентрации в RPM1 среде. Одновременно вносили соединения CL-192, CL-193, CL-195, CL-196, предварительно растворенные в среде RPM1 до конечной концентрации 6, 12 μМ. Затем планшеты для синхронизации инфекции центрифугировали при 2500 об./мин 20 мин, и инкубировали в течение 1 ч при 37°С в атмосфере 5% CO₂, обеспечивая инвазию бруцелл в макрофаги.

На третьем этапе эксперимента зараженные клеточные слои 2-кратно отмывали от внеклеточных бактерий с помощью ФСБ в стерильных условиях и добавляли гентамицин 50 мкг/мл, который не проникал внутрь макрофагов, убивая бактерии на их поверхности, и повторно вносили химические соединения, предварительно растворенные в RPM1 до конечной концентрации 6 и 12 μМ.

Через 24 ч инкубации по 4 лунки для каждого опыта отмывали в ФСБ от среды с гентамицином и слои клеток лизировали, добавляя 0,1 мл 0,2% Тритон Х-100 в каждую лунку, с последующим высевом десятикратных разведений в 4-х повторах по 10 мкл на чашки с триптозным агаром. Через 4-5 сут инкубации подсчитывали количество колоний в разведениях, соответствующих бруцеллам, вышедшим из лизированных клеток B10.MLM, определяли средние величины колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) и анализировали влияние химических соединений на внутриклеточное размножение В. melitensis 16М.

В Таблице 2 (фиг. 2) приведены результаты активностей разных концентраций химических соединений на внутриклеточный рост штамма В. melitensis 16М в макрофагах B10.MLM, по сравнению с контролем растворителя DMSO и референс-соединением CL-191, при добавлении этих соединений одномоментно с заражением эукариотических клеток. У испытуемых соединений выявлена различная и дозозависимая активность на размножение бруцелл в макрофагах B10.MLM. Соединения CL-195 и CL-196, а также референс-препарат CL-191, показали повышенную активность ингибирования внутриклеточного размножения бруцелл в макрофагах (вплоть до полного подавления роста бруцелл внутри клеток) в сравнении c CL-192 и CL-193.

Пример 3. Влияние времени внесения соединений на размножение штамма В. melitensis 16М внутри макрофагов B10.MLM (внутриклеточное размножение бруцелл).

Эксперимент проводился в соответствии с методикой, примененной в примере 2, за исключением того, что соединения CL-192, CL-193, CL-195, CL-196 в конечной концентрации 12 μМ вносили в лунки с монослоями клеток B10.MLM после этапа инвазии, на 3 этапе заражения. В этом Примере химические соединения CL-195, CL-196 проявляли меньшую ингибирующую активность на внутриклеточное размножение патогена, количество жизнеспособных бруцелл при действии тестируемых соединений оставалось в пределах от 11,63 до 40,69% (фиг. 3).

Сравнение результатов эффективности соединений (фиг. 2 и 3) в зависимости от времени внесения (одномоментно с заражением и после этапа инвазии) ингибирования бруцеллезной инфекции в фагоцитах B10.MLM показывает, что внесение химических соединений после этапа инвазии приводило к снижению их эффекта в сравнении с условиями их добавления одномоментно в процессе инфекции.

Пример 4. Действие соединений на вегетативный рост Brucella melitensis 16М.

Для определения влияния на вегетативный рост бруцелл использовали соединения CL-192, CL-193, CL-195, CL-196 в концентрацию 25 μM. Этот эксперимент проводили для подтверждения «чистоты гентамициновой пробы» в примере 2, для доказательства, что предлагаемые соединения оказывали исключительно ингибирующую активность на внутриклеточное размножение бруцелл, и при одномоментном заражении не могли оказывать бактерицидного действия на бруцеллы.

В. melitensis 16М культивировали в триптозном бульоне при 37°С 48 ч. отмывали от бульона в среде RPM1, центрифугировали 1 мл при 11000 об./мин 4 мин и ресуспендировали в 1 мл среды RPM1. Определяли титр жизнеспособных клеток разведением в 4, 5 и 6 степенях и последующими высевами на чашки триптозного агара (начальный титр жизнеспособных клеток). В пробирки со средой RPM1 с одинаковой концентрацией бруцелл при старте роста добавляли соединения CL-192, CL-193, CL-195, CL-196) в концентрации 25 μМ, в контрольные пробирки добавляли референс-препарат, растворитель DMSO и инкубировали в термостате при 37°С. Через 24 ч. высевали десятикратные разведения на чашки с триптозным агаром для подсчета средних значений КОЕ/мл. Как видно из приведенных данных в таблице 4 (фиг. 4), предлагаемые соединения в концентрации 25 μМ не оказывали влияния на жизнеспособность бруцелл и не задерживали их вегетативный рост в среде RPM1.

Таким образом, соединения - замещенные гидразоны 5-арилфурфуролов, а именно:

N'-((5-(2,4-дифторфенил)фуран-2-ил)метилен)-2-гидроксибензгидразид (CL-192)

N'-((5-(2-нитрофенил)фуран-2-ил)метилен)изоникотиногидразид (CL-193)

4-(5-((2-(2-гидроксибензоил)гидразоно)метил)фуран-2-ил)бензосульфонамид (CL-195)

Метил 4-(5-((2-изоникотиноилгидразоно)метил)фуран-2-ил)бензоат (CL-196)

обладают специфической антибруцеллезной ингибирующей активностью на внутриклеточное размножение патогена в условиях экспериментальной внутриклеточной бруцеллезной инфекции за счет мишеневого воздействия на ключевой фактор вирулентности патогена - систему секреции IV типа, необходимую для размножения и персистенции внутри макрофага.

Предлагаемые соединения нетоксичны для клеток человека и растворимы в органических растворителях.

Ингибирующая активность предлагаемых соединений связана с блокирующим действием на систему секреции IV типа патогенам. Соединения могут быть использованы для создания альтернативных антибиотикам или комбинированных лекарственных или профилактических средств защиты против возбудителя бруцеллеза человека. Соединения обладают низким риском развития резистентности при их использовании.

Предлагаемые замещенные гидразоны 5-арилфурфуролов ввиду их значительной активности и низкой цитотоксичности представляются перспективными и могут найти применение в медицине и ветеринарии в качестве кандидатов антибактериальных ингибиторов, для создания в первую очередь новых противобруцеллезных лекарственных средств.

ЛИТЕРАТУРА

1. Здродовский П.Ф. Проблема бруцеллеза применительно к патологии человека. Москва: ВИЭМ; 1937.

2. Вершилова П.А., Голубева А.А. Бруцеллез в СССР и пути его профилактики. - Москва: Медицина; 1970

3. Pappas G, Papadimitriou Р, Akritidis N. et al. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 2006; №6(2) С 91-99.

4. Цирельсон Л.Е., Желудков M.M., Кулаков Ю.К., Хадарцев О.С., Скляров О.Д. К эпидемиологической и иммунологической оценке очагов бруцеллеза в России. Эпид. вакцинопроф. 2012, 5(66): 18-22.

5. Цирельсон Л.Е., Желудков М.М. Бруцеллез в России: профессиональные заболевания и трудовой прогноз. Эпид. инф. бол. 2011: 5: 43-47.

6. Paschos A., den Hartigh A., Smith М.А. et al. An in vivo high-throughput screening approach targeting the type IV secretion system component VirB8 identified inhibitors of Brucella abortus 2308 proliferation. Infect Immun. 2011; 79(3): 1033-1043.

7. Kulakov Yu. K. Molecular aspects of Brucella persistence. Molecular genetics, microbiology and virology, 2016, Vol. 31, No. 1, pp. 1-8.

8. Janda, L.; Voticky. Semisynthetic cephalosporins. I. An improved synthesis of 5-aryl-2-furancarboxylic acids, Z. Chem. Zvesti 38, (1984), p. 507-513.

9. Butin A.V. Furan as a 1,3-diketone equivalent: the second type furan recyclization applied to indole synthesis // Tetrahedron Lett. 2006. - Vol. 47. - P. 4113-4116.

10. Csaba Paizs, , Katri Lundell, , Florin-Dan Irimie, Liisa T Kanerva. Preparation of novel phenylfuran-based cyanohydrin esters: lipase-catalysed kinetic and dynamic resolution. Tetrahedron: Asymmetry 14, 2003., P. 1895-1904.

11. СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II группы патогенности (опасности)".

12. Кулаков Ю.К., Желудков М.М., Зигангирова Н.А. Моделирование персистенции бруцелл в макрофагоподобных клетках in vitro. Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2009, 4: 19-23.

13. Zining Cui, Ying Li, Yun Ling, Juan Huang, Jingrong Cui, Ruiqing Wang, Xinling Yang, Eur. J. Medicinal Chemistry, 2010, 45, p. 5576-5584.

14. Frimm R., Kovas S., Chem. Zvesti, 1969, 23, p. 606-610.

Изобретение относится к биотехнологии, медицине и ветеринарии. Предложено применение замещенных гидразонов 5-арилфурфуролов, выбранных из CL-192, CL-193, CL-195 или CL-196, приведенных в формуле, в качестве внутриклеточного ингибитора бруцеллезной инфекции. Соединения обладают ингибирующей активностью в отношении внутриклеточной бруцеллезной инфекции и не проявляют выраженной цитотоксической активности. Соединения могут быть использованы для создания альтернативных антибиотикам или комбинированных лекарственных и профилактических средств защиты против возбудителя бруцеллеза человека. 4 ил., 4 пр.

1. Применение замещенного гидразона 5-арилфурфурола, выбранного из:

N'-((5-(2,4-дифторфенил)фуран-2-ил)метилен)-2-гидроксибензгидразида (CL-192)

,

N'-((5-(2-нитрофенил)фуран-2-ил)метилен)изоникотиногидразида (CL-193)

,

4-(5-((2-(2-гидроксибензоил)гидразоно)метил)фуран-2-ил)бензосульфонамида (CL-195)

или

метил 4-(5-((2-изоникотиноилгидразоно)метил)фуран-2-ил)бензоата (CL-196)

,

в качестве внутриклеточного ингибитора бруцеллезной инфекции.