Способ автоматического отбора и упаковки микробиологических объектов Российский патент 2018 года по МПК G01N35/02 G01N1/28 G01N15/06 G01N15/10 G01N33/48 

Способ может быть использован для работы с классом биологических объектов размером от 0.1 мм до 0.5 мкм, находящихся в водной среде, таких, как хромосомы, сперматозоиды, бактерии, фрагменты растительных и животных тканей, споры грибов, пыльца и другие объекты, видимые в оптический микроскоп. Способ позволяет осуществлять автоматический отбор и упаковку микробиологических объектов с целью их транспортировки, реализации и хранения.

По заявляемой методике микробиологические объекты упаковываются в стеклянные или пластмассовые капилляры, внутренний диаметр которых соответствует размеру объекта. Прозрачная стенка капилляра в процессе поиска и идентификации позволяет рассмотреть в микроскоп целевой объект.

Сохраняемые биологические объекты находятся в свойственной для них по составу водной среде. Высушивание, а также любые консервирующие среды искажают и портят многие биологические объекты.

С целью остановки текущих биологических процессов, а также фиксации их положения объекты в процессе отбора, упаковки и хранения находятся в замороженном состоянии. Глубокая заморозка при транспортировке и хранении позволяет препаратам оставаться в пригодном для использования состоянии в течении длительного времени.

В процессе отбора раствор с микробиологическими объектами помещается в длинные капилляры, которые после их замораживания просматриваются под микроскопом с целью поиска и отбора нужных объектов. Пакет трубок опускается в целевой раствор, происходит их заполнение за счет гидрофильности внутренней поверхности капилляров, при необходимости возможно использование гидростатической, гидродинамической и электрокинетической методик заполнения. Таким образом, весь объем поглощенного раствора будет в дальнейшем просмотрен на предмет наличия подходящих объектов.

В процессе поиска и отбора объектов очередной капилляр в поле зрения микроскопа продвигается вдоль своей оси и при нахождении потенциального объекта поворачивается с целью его идентификации и оценки. Вместе с раствором в капилляры попадает мусор, посторонние включения, поврежденные и неполноценные объекты, - их в процессе поиска нужно исключить, а не нужные участки капилляров отбросить.

Ручной просмотр капилляров требует больших затрат времени, эту рутинную работу предполагается исключить. Идентификация и оценка микробиологического объекта производится автоматически компьютером путем сравнения видимого изображения с рядом хранимых в памяти компьютера графических образов.

В качестве таких графических образов могут использоваться несколько типовых изображений с микроскопа, отобранных оператором при ручном просмотре объектов данной партии.

В случае достаточного сходства изображения очередного объекта с эталонным образом компьютер запоминает изображение и линейную координату найденного объекта. В особых случаях окончательное решение о пригодности препарата принимает оператор после просмотра файла изображения.

После просмотра всего капилляра участки с выбранными объектами автоматически вырезаются, помещаются на упаковочную ленту и снабжаются идентификационной меткой. Не использованные отрезки капилляров выбрасываются.

Для особо ценных и редких объектов идентификационная метка сопровождается файлом с изображением конкретного запакованного объекта.

Обычно биологические микро-образцы рассматриваются в оптический микроскоп на предметном столике под покровным стеклом. Это удобно, но отбор таких образцов затруднен, особенно автоматический отбор. Между тем есть опыт просмотра мелких биологических объектов в тонких стеклянных капиллярах. Искажения, возникающие при просмотре объекта через цилиндрическую стенку капилляра носят закономерный характер и могут быть устранены программно при переносе изображения на монитор.

Кроме того, целью автоматического просмотра является не исследование, а лишь идентификация и оценка биологических объектов, и это упрощает задачу. При необходимости можно наладить производство плоских (сплюснутых) капилляров или капилляров из пластика. Известно, что температура замерзания воды в тонких капиллярах, изготовленных из гидрофильного материала, существенно ниже, чем в открытом сосуде. Это связано с физикой взаимодействия молекул воды со стеклянной стенкой трубки. Чем меньше внутренний диаметр капилляра, тем ниже температура замерзания воды в нем. Так из практики известно, что в порах и капиллярах хорошего бетонного камня вода не замерзает при самых сильных морозах, а в тонких стеклянных капиллярах удавалось сохранять воду жидкой при температуре минус 70 градусов по Цельсию. Кроме того, для сохранения механической прочности у капилляра с малым внутренним диаметром приходится наружный диаметр сохранять достаточно большим так, что соотношение диаметров увеличивается. А это значит, возникающее при замерзании воды относительное увеличение внутреннего диаметра не способно разрушить толстостенную трубку. Так сперматозоид в капилляре внутренним диаметром 10 мкм может сохраняться и при температуре жидкого азота.

Области применения методики.

Сперма. Наиболее выигрышным является использование описываемой технологии в области искусственного оплодотворения метода интрацитоплазматической инъекции спермы (ICSI).

- способ упаковки позволяет извлекать из банка спермы всего несколько образцов, необходимых для проведения процедуры, не размораживая основной массив биологического материала.

- размороженный образец оценивается на жизнеспособность и непосредственно переносится в рабочий инструмент (размеры капилляра и операционной иглы согласованы).

- заказчику изначально поставляются только полноценные здоровые клетки, оцененные по морфологическим признакам.

- в случае затрудненного получения спермы от пациента, все сперматозоиды могут быть сохранены и последовательно использованы для нескольких попыток оплодотворения.

- сперма от добровольных доноров, расфасованная по предлагаемой методике, может быть заложена на долговременное хранение. Проверка генетических достоинств биологического материала может быть проведена по результатам рождения и развития ребенка и удачный материал можно использовать в дальнейшем длительное время.

- в животноводстве при осеменении животных пока мало используется методика ICSI, обычный способ требует большого количества спермы, а высокая стоимость элитной спермы замедляет развитие отрасли. Прогрессивная методика на два - три порядка сокращает потребность в элитном материале, а возможность длительного хранения позволяет отслеживать особенности наследственных признаков производителей.

- коммерческий интерес представляет создание банка спермы знаменитостей и людей, достигших выдающихся результатов.

- сохранение спермы по редким и вымирающим видам животных.

Меристемы и протокормы. Заявляемая методика упаковки и хранения биологических микрообъектов может быть использована в области микроклонального размножения растений - вегетативного выращивания в условиях.

- автоматическая криоконсервация верхушечных меристем в пластмассовые капилляры соответствующего размера позволит сократить затраты ручного труда в подготовке элитного посадочного материала.

- появляется возможность создавать банки первичных недифференцированных растительных клеток растений многих видов для научных и практических целей.

Базы хранения ДНК. Для надежного хранения ДНК удобно использовать в качестве носителя небольшие кусочки ткани объекта, из клеток которой при необходимости извлекается наследственный материал.

Научные базы биологических образцов. Простота консервации и удобство хранения позволяют создавать единые базы биологических материалов разного назначения.

- в работах по сохранению редких и вымирающих видов животных.

- образцы тканей по ископаемым биологическим материалам.

- сайты отдельных генов и фрагменты ДНК, предназначенные для мультипликации методами ПРЦ (без просмотра в микроскоп).

- учебный процесс. Может быть создан мобильный парк микробиологических образцов по широкому спектру направлений - клеточные препараты, полученные центрифугированием фракции клеток, бактерии, насекомые, мелкая водная фауна.

На фиг. 1 показан капилляр, который просматривается под микроскопом с целью идентификации нужных биологических объектов. На фиг. 3 приводится логическая диаграмма, иллюстрирующая пример реализации предлагаемого способа.

1. Разбавление раствора, подкрашивание (если необходимо).

2. Заполнение капилляров раствором.

3. Загрузка партии капилляров в приемную кассету устройства.

4. Установка очередного капилляра на стол.

5. Продвижение капилляра до обнаружения очередного объекта.

6. Объект обнаружен?

7. Просмотр записей по текущему капилляру.

8. В капилляре есть найденные объекты?

9. Попытка идентификации найденного объекта.

10. Объект удовлетворяет заданным условиям?

11. Запись изображения и фиксация линейной координаты.

12. Перемещение капилляра в зону разделки.

13. Установка капилляра в позицию очередного объекта по ранее сохраненной линейной координате.

14. Отделение от капилляра фрагмента, содержащего объект.

15. Закрепление фрагмента на транспортной ленте, печать идентификационной метки.

16. Есть ли в оставшейся части капилляра еще объекты?

17. Удаление капилляра в мусорный контейнер.

18. Есть ли в приемной кассете еще капилляры?

19. Приведение установки в исходное состояние.

Пример устройства для реализации метода. (смотри фиг. 2)

1 - предметный столик микроскопа

2 - микроскоп

3 - подвижный стол

4 - исследуемый капилляр

5 - шаговый двигатель

6 - волновая передача

7 - ходовой винт

8 - гайка

9 - транспортная лента

10 - лазерный резак

11 - зона разделки.

На предметно столике микроскопа 1 закреплен подвижный стол 3. На этот стол устанавливается исследуемый капилляр 4. Стол может медленно или ускорено перемещаться под объективом микроскопа 2. Привод стола осуществляется от шагового двигателя 5 через волновую передачу 6. После анализа содержания капилляра подвижный стол перемещается в зону разделки 11. Здесь капилляр с помощью лазера 10 разрезается на отдельные микроконтейнеры, которые закрепляются на транспортной ленте 9.

На фиг. 3 представлена схема алгоритма работы устройства по описываемому методу. На блок-схеме обозначены отдельные операции по работе с объектами и указаны связи, характеризующие последовательность действий по реализации описываемого способа.

Изобретение относится к способу автоматического отбора и упаковки микробиологических объектов, который может быть использован для работы с биологическими объектами размером от 0.1 мм до 0.5 мкм, находящимися в водной среде, такими, как хромосомы, сперматозоиды, бактерии, фрагменты растительных и животных тканей, споры грибов, пыльца и другие объекты, видимые в оптический микроскоп. После разбавления микробиологического объекта свойственной для него по составу водной средой полученным раствором заполняют длинные капилляры путем погружения пакета капилляров в раствор и замораживают заполненные капилляры. После этого партию капилляров загружают в приемную кассету, из которой очередной капилляр располагают в поле зрения микроскопа и путем перемещения капилляра просматривают его содержание, при этом с помощью компьютера автоматически осуществляют поиск и отбор нужных объектов. При обнаружении компьютер запоминает изображение и линейную координату объекта. После просмотра всего капилляра фрагменты, содержащие выбранные объекты, автоматически отделяют, закрепляют на упаковочной ленте и снабжают идентификационной меткой. Способ позволяет формализовать и автоматизировать рутинную работу, связанную с анализом и разбором большого количества проб, а также упорядочить его учет и хранение. 6 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ автоматического отбора и упаковки микробиологических объектов, включающий разбавление микробиологического объекта свойственной для него по составу водной средой, заполнение длинных капилляров раствором путем погружения пакета капилляров в полученный раствор, замораживание заполненных капилляров и отбор объектов, отличающийся тем, что после замораживания партию капилляров загружают в приемную кассету, устанавливают очередной капилляр на подвижный стол, расположенный на предметном столике микроскопа, путем перемещения капилляра в поле зрения микроскопа вдоль оси капилляра просматривают его содержание и с помощью компьютера автоматически осуществляют поиск и отбор нужных объектов путем сравнения видимого изображения с рядом хранимых в памяти компьютера эталонных образов, при обнаружении нужного объекта компьютер запоминает изображение и линейную координату найденного объекта, после просмотра всего капилляра фрагменты, содержащие выбранные объекты, автоматически отделяют от капилляра, закрепляют на упаковочной ленте и снабжают идентификационной меткой, после чего процесс повторяется в отношении следующего капилляра.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют стеклянные или пластмассовые капилляры, внутренний диаметр которых соответствует размеру микробиологического объекта.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что размер микробиологического объекта составляет от 0.1 мм до 0.5 мкм.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для заполнения капилляров раствором используют гидростатический, гидродинамический или электрокинетический метод заполнения.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве эталонных образцов используют несколько типовых изображений с микроскопа, отобранных оператором при ручном просмотре данной партии.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для особо ценных и редких объектов идентификационная метка сопровождается файлом с изображением конкретного запакованного объекта.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что отделение от капилляра нужного фрагмента осуществляется с помощью лазера.