РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящему изобретению испрашивается приоритет по временной заявке США № 61/745707, поданной 24 декабря 2012 года, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка содержит список последовательностей, который предоставлен в электронной форме в формате ASCII и включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 26 февраля 2014 года, названа 117813-10320_SL.txt и имеет размер 210528 байт.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к белкам, связывающим рецептор пролактина (PRLR), и к их применению для предупреждения и/или лечения различных заболеваний, включая злокачественную опухоль.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Рецептор пролактина (PRLR) представляет собой трансмембранный рецептор, который взаимодействует с пептидным гормоном пролактином (PRL). PRLR содержит один трансмембранный домен и является гомологичным рецепторам цитокинов, таких как IL2, IL3, IL4, IL6, IL7, эритропоэтин и GM-CSF. PRLR присутствует в молочных железах, яичниках, гипофизе, сердце, легком, тимусе, селезенке, печени, поджелудочной железе, почке, надпочечнике, матке, скелетной мышце, коже и областях центральной нервной системы (Mancini, et al., Endocrinol Metab Clin North Am, 2008, 37(1):67-99). При активации пролактином PRLR димеризуется, что приводит к активации Janus-киназы 2 - тирозинкиназы, которая инициирует каскад JAK-STAT и также приводит к активации митоген-активируемых протеинкиназ и Src-киназы. Гормон роста также связывается с PRLR и активирует рецептор.
PRLR вовлечен в множество биологических функций, включая рост клеток, дифференцировку, развитие, лактацию и репродукцию. кДНК PRLR человека первоначально была выделена из библиотек гепатомы и рака молочной железы (Boutin et al., Molec. Endocr. 3: 1455-1461, 1989). Исходя из нуклеотидной последовательности, был предсказан зрелый белок из 598 аминокислот со значительно более длинным цитоплазматическим доменом, чем в PRLR печени крысы. Ген PRLR располагается в той же хромосомной области, что и ген рецептора гормона роста, который был картирован на 5p13-p14 (Arden, et al., Cytogenet. Cell Gene 53: 161-165, 1990).
Геномная организация гена PRLR человека была определена (Hu, Z.-Z. et al., J. Clin. Endocr. Metab. 84: 1153-1156, 1999). 5-штрих-нетранслируемая область гена PRLR содержит 2 альтернативных первых экзона: E13, человеческий аналог E13 крысы и мыши, и новый тип альтернативного первого экзона человека, названный E1N. 5-штрих-нетранслируемая область также содержит общий некодирующий экзон 2 и часть экзона 3, которая содержит кодон инициации трансляции. Экзоны E13 и E1N находятся в пределах 800 пар оснований друг от друга. Эти 2 экзона экспрессируются в ткани молочной железы человека, клетках рака молочной железы, половых железах и печени. В целом, в большинстве тканей преобладает транскрипт, содержащий E13. Продукт гена PRLR кодируется экзонами 3-10, среди которых экзон 10 кодирует основную часть внутриклеточного домена. Экзоны E13 и E1N транскрибируются с альтернативных промоторов PIII и PN, соответственно. Промотор PIII содержит элементы Sp1 и C/EBP, которые идентичны элементам в промоторе грызунов и на 81% сходны с областью -480/-106 у крысы и мыши. Промотор PN содержит предполагаемые участки связывания для белков семейства ETS и половинный участок для ядерных рецепторов.
PRLR существует в нескольких различных изоформах, которые отличаются длиной их цитоплазматических доменов. В подкожной брюшной жировой ткани и жировой ткани молочной железы было выявлено четыре изоформы мРНК PRLR (L, I, S1a и S1b) (Ling, C. et al., J. Clin. Endocr. Metab. 88: 1804-1808, 2003). Кроме того, с использованием иммуноблоттинга была обнаружена экспрессия как L-PRLR, так и I-PRLR, в подкожной брюшной жировой ткани человека и жировой ткани молочной железы. В недавних сообщениях было сделано предположение, что PRLR экспрессируется и активируется в тканях рака молочной железы и рака предстательной железы человека (Li et al., Cancer Res., 64:4774-4782, 2004; Gill et al., J Clin Pathol., 54:956-960, 2001; Touraine et al., J Clin Endocrinol Metab., 83:667-674, 1998). Сообщалось, что активация Stat5 и экспрессия PRLR ассоциированы с высокой гистологической степенью в 54% образцов рака предстательной железы (Li et al., выше). В других сообщениях утверждалось, что образцы первичного рака молочной железы ответственны за PRL в анализах колониеобразования и что концентрации PRL в плазме коррелируют с риском рака молочной железы (Tworoger et al., Cancer Res., 64:6814-6819, 2004; Tworoger et al., Cancer Res., 66:2476-2482, 2006). В другом сообщении указано, что у мышей с трансгенным PRL развиваются злокачественные карциномы молочной железы или гиперплазия предстательной железы (Wennbo et al., J Clin Invest., 100:2744-2751, 1997; Wennbo et al., Endocrinology, 138:4410-4415, 1997).
Было показано, что моноклональное антитело PRLR уменьшает встречаемость опухолей молочной железы у мышей (Sissom et al., Am. J. Pathol. 133:589-595, 1988). Кроме того, было показано, что антагонист PRL (мутант PRL S179D) ингибирует пролиферацию клеточной линии карциномы предстательной железы человека DU-145 in vitro и индуцируемых DU-145 опухолей in vivo (Xu et al., Cancer Res., 61:6098-6104, 2001).
Таким образом, остается потребность в связывающих PRLR белках, которые можно использовать для терапевтических целей для лечения злокачественной опухоли.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к связывающим PRLR белкам и их конъюгатам. Связывающие белки по изобретению включают, но не ограничиваются ими, антитела, антигенсвязывающие фрагменты и другие антигенсвязывающие белки, способные связывать PRLR человека. Кроме того, изобретение относится к способам получения и применения связывающих PRLR белков и их конъюгатов.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к связывающему белку, например, антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему антигенсвязывающий домен, причем указанный связывающий белок способен связывать рецептор пролактина (PRLR), указанный антигенсвязывающий домен содержит по меньшей мере одну CDR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 151 и 152. В одном варианте осуществления, по меньшей мере одна CDR содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40-42, 46, 47, 49-51, 56-58, 62, 63, 65-67, 71-73, 77, 79-81, 85-87, 92-94, 149 и 150. В другом варианте осуществления, связывающий белок, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит по меньшей мере 3 CDR. В другом варианте осуществления 3 CDR представляют собой набор CDR вариабельных доменов тяжелой цепи (CDR1, CDR2 и CDR3), выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, 41 и 42; SEQ ID NO: 46, 47 и 42; SEQ ID NO: 56, 57 и 58; SEQ ID NO: 62, 63 и 58; SEQ ID NO: 71, 72 и 73; SEQ ID NO: 71, 77 и 73; SEQ ID NO: 85, 86 и 87; SEQ ID NO: 149, 150 и 87. Альтернативно или в комбинации, 3 CDR представляют собой набор CDR вариабельных доменов легкой цепи (CDR1, CDR2 и CDR3), выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 49, 50 и 51; SEQ ID NO: 65, 66 и 67; SEQ ID NO: 79, 80 и 81; и SEQ ID NO: 92, 93 и 94.
В другом варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит по меньшей мере один набор CDR вариабельных доменов тяжелой цепи и по меньшей мере один набор CDR вариабельных доменов легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два набора CDR вариабельных доменов выбраны из группы, состоящей из:
(1) либо из наборов CDR вариабельных доменов тяжелой цепи SEQ ID NO: 40, 41 и 42 или SEQ ID NO: 46, 47 и 42, и набора CDR вариабельных доменов легкой цепи SEQ ID NO: 49, 50 и 51;
(2) либо из наборов CDR вариабельных доменов тяжелой цепи SEQ ID NO: 56, 57 и 58 или SEQ ID NO: 62, 63 и 58, и набора CDR вариабельных доменов легкой цепи SEQ ID NO: 65, 66 и 67;
(3) либо из наборов CDR вариабельных доменов тяжелой цепи SEQ ID NO: 71, 72 и 73 или SEQ ID NO: 71, 77 и 73, и набора CDR вариабельных доменов легкой цепи SEQ ID NO: 79, 80 и 81; и
(4) либо из набора CDR вариабельных доменов тяжелой цепи SEQ ID NO: 85, 86 и 87 или SEQ ID NO: 149, 150 и 87, и набора CDR вариабельных доменов легкой цепи SEQ ID NO: 92, 93 и 94.
В других вариантах осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, дополнительно содержит акцепторную каркасную область человека. В некоторых вариантах осуществления акцепторная каркасная область человека содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14-38 или 158. В других вариантах осуществления акцепторная каркасная область человека содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену каркасной области, где аминокислотная последовательность каркасной области по меньшей мере на 65% идентична последовательности указанной акцепторной каркасной области человека и содержит по меньшей мере 70 аминокислотных остатков, идентичных указанной акцепторной каркасной области человека. Альтернативно, акцепторная каркасная область человека содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену каркасной области в ключевом остатке, причем ключевой остаток выбран из группы, состоящей из:
остатка, соседнего с CDR;
остатка участка гликозилирования;
редкого остатка;
остатка, способного взаимодействовать с PRLR человека;
остатка, способного взаимодействовать с CDR;
канонического остатка;
контактного остатка между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи;
остатка в зоне Vernier; и
остатка в области, которая перекрывается между определенной по Chothia CDR1 вариабельной областью тяжелой цепи и определенной по Kabat каркасной областью первой тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления ключевой остаток выбран из группы, состоящей из 2L, 43L, 48L, 58L, 64L, 87L, 27H, 48H, 60H, 63H, 64H, 65H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 93H. В другом варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представляет собой консенсусный вариабельный домен человека.
В одном варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит по меньшей мере один вариабельный домен, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 121; SEQ ID NO: 122 и SEQ ID NO: 123. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит два вариабельных домена, где указанные два вариабельных домена имеют аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:
(1) одной из SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 45; и одной из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54;
(2) одной из SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60 или SEQ ID NO: 61; и одной из SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68 или SEQ ID NO: 69;
(3) одной из SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 75 или SEQ ID NO: 76; и одной из SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82 или SEQ ID NO: 83; и
(4) одной из SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 121; SEQ ID NO: 122 или SEQ ID NO: 123; и одной из SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95 или SEQ ID NO: 96.
В одном варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит по меньшей мере один вариабельный домен, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 82; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 95 и SEQ ID NO: 96.
В конкретном варианте осуществления связывающий белок содержит последовательность тяжелой цепи и последовательность легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из: (a) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125; (b) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126; (c) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127; (d) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128; (e) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125; (f) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126; (g) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127; (h) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128; (i) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125; (j) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126; (k) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127; (l) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128; (m) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132; (n) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133; (o) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134; (p) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132; (q) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133; (r) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134; (s) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132; (t) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133; (u) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134; (v) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138; (w) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139; (x) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140; (y) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138; (z) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139; (aa) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140; (bb) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138; (cc) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139; (dd) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140; (ee) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144; (ff) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145; (gg) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146; (hh) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144; (ii) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145; (jj) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146; (kk) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144; (ll) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145; (mm) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146; (nn) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 153; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139; (oo) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 154; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139; и (pp) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 155; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139.
В одном варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает PRLR. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способен модулировать биологическую функцию PRLR. В других вариантах осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способен нейтрализовать PRLR. В других вариантах осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеет константу скорости ассоциации (Kon) с PRLR, выбранную из группы, состоящей из: по меньшей мере приблизительно 102 M-1с-1; по меньшей мере приблизительно 103 M-1с-1; по меньшей мере приблизительно 104 M-1с-1; по меньшей мере приблизительно 105 M-1с-1; и по меньшей мере приблизительно 106 M-1c-1; при измерении с использованием поверхностного плазмонного резонанса. В других вариантах осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеет константу скорости диссоциации (Koff) в отношении PRLR, выбранную из группы, состоящей из: не более чем приблизительно 10-3 с-1; не более чем приблизительно 10-4 с-1; не более чем приблизительно 10-5 с-1; и не более чем приблизительно 10-6 с-1, при измерении с помощью поверхностного плазмонного резонанса. В другом варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеет константу диссоциации (KD) в отношении PRLR, выбранную из группы, состоящей из: не более чем приблизительно 10-7 M; не более чем приблизительно 10-8 M; не более чем приблизительно 10-9 M; не более чем приблизительно 10-10 M; не более чем приблизительно 10-11 M; не более чем приблизительно 10-12 M; и не более чем 10-13 M.
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, например, антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способным связывать PRLR, который конкурирует с антителом. В одном варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конкурирует с антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, выбранные из группы, состоящей из:
(1) вариабельной области тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 45; и вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54;
(2) вариабельной области тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 61; и вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 69;
(3) вариабельной области тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 121; SEQ ID NO: 122; и SEQ ID NO: 123; и вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95 и SEQ ID NO: 96;
(4) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 112, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 103;
(5) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 113, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 104;
(6) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 114, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 105;
(7) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 116, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 107;
(8) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 117, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 108;
(9) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 118, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 109;
(10) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 119, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 110; и
(11) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 120, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 111.
В другом варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конкурирует с антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, выбранные из группы, состоящей из:
(1) вариабельной области тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 45; и вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54;
(2) вариабельной области тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 61; и вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 69;
(3) вариабельной области тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 121; SEQ ID NO: 122; и SEQ ID NO: 123; и вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95 и SEQ ID NO: 96;
(4) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 112, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 103;
(5) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 113, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 104;
(6) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 114, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 105; и
(7) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 120, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 111.
В другом варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конкурирует с антителом, содержащим аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 119, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 110.
В другом варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конкурирует с антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из:
(1) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 115, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 106;
(2) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 116, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 107; и
(3) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 117, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 108.
В другом варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конкурирует с антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 45; и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54. В других вариантах осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конкурирует с антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 121; SEQ ID NO: 122; и SEQ ID NO: 123; и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95 и SEQ ID NO: 96.
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, способному связывать PRLR, который конкурирует с антителом, содержащим последовательность тяжелой цепи и последовательность легкой цепи, выбранные из группы, состоящей из (a) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125; (b) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126; (c) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127; (d) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128; (e) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125; (f) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126; (g) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127; (h) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128; (i) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125; (j) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126; (k) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127; (l) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128; (m) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132; (n) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133; (o) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134; (p) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132; (q) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133; (r) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134; (s) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132; (t) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133; (u) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134; (v) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138; (w) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139; (x) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140; (y) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138; (z) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139; (aa) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140; (bb) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138; (cc) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139; (dd) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140; (ee) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144; (ff) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145; (gg) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146; (hh) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144; (ii) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145; (jj) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146; (kk) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144; (ll) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145; (mm) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146; (nn) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 153; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139; (oo) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 154; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139; и (pp) тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 155; и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139.
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, например, антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способному связывать PRLR, который связывается с эпитопом в PRLR, содержащим три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или все из аминокислотных остатков E8, F10, C12, R25, E43, G44, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, Y99, I100, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 и W191 SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связывать PRLR, связывается с эпитопом, где эпитоп содержит по меньшей мере пять аминокислотных остатков. В другом варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связывать PRLR, связывается с эпитопом, где эпитоп содержит все из аминокислотных остатков E8, F10, C12, R25, E43, G44, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, Y99, I100, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 и W191 SEQ ID NO: 2. В конкретном варианте осуществления связывающий белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, выбранные из группы, состоящей из Ab1, Ab6, chAb6 и Ab14-Ab25.
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, например, к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способному связывать PRLR, который связывается с эпитопом в PRLR, содержащим три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или все из аминокислотных остатков E8, I9, F10, K11, C12, R25, E43, G44, W72, T74, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, T98, Y99, I100, W139, L143, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 и W191 SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связывать PRLR, связывается с эпитопом, где эпитоп содержит по меньшей мере пять аминокислотных остатков. В другом варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связывать PRLR, связывается с эпитопом, где эпитоп содержит все из аминокислотных остатков E8, I9, F10, K11, C12, R25, E43, G44, W72, T74, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, T98, Y99, I100, W139, L143, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 и W191 SEQ ID NO: 2. В конкретном варианте осуществления связывающий белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, выбранные из группы, состоящей из Ab4, Ab7, chAb7, Ab35-Ab43 и Ab53-Ab55.
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, например, антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способным связывать PRLR, который связывается с эпитопом в PRLR, содержащим 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или все из аминокислотных остатков R25, T141, L143, E145, R147, E155, W156, E157, I158, H159, F160, A161, G162, Q163, Q164, F167, S171, R183, K185, D187, H188, W191 и W194 SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связывать PRLR, связывается с эпитопом, где эпитоп содержит по меньшей мере 15 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связывать PRLR, связывается с эпитопом, где эпитоп содержит все из аминокислотных остатков R25, T141, L143, E145, R147, E155, W156, E157, I158, H159, F160, A161, G162, Q163, Q164, F167, S171, R183, K185, D187, H188, W191 и W194 SEQ ID NO: 2. В конкретном варианте осуществления связывающий белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, выбранные из группы, состоящей из Ab3, Ab8, chAb8 и Ab44-Ab52.
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, например, антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способным связывать PRLR, который связывается с эпитопом в PRLR, содержащим по меньшей мере один, два, три, четыре или все из аминокислотных остатков R25, K185, D187, H188 или W191 SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связывать PRLR, связывается с эпитопом, где эпитоп содержит все из аминокислотных остатков R25, K185, D187, H188 или W191 SEQ ID NO: 2. В конкретном варианте осуществления связывающий белок представляет собой антитело или его антигенсвязыващую часть, выбранные из группы, состоящей из Ab1, Ab3, Ab4, Ab6-Ab8, chAb6, chAb7, chAb8, Ab14-Ab25 и Ab35-Ab55.
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, например, к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способному связывать PRLR, который связывается с эпитопом в PRLR, содержащим аминокислоты 91-96 SEQ ID NO: 2. В конкретном варианте осуществления связывающий белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, выбранные из группы, состоящей из Ab1, Ab4, Ab6, Ab7, chAb6, chAb7, Ab14-Ab25, Ab35-Ab43 и Ab53-Ab55.
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, например, к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способному связывать PRLR, который связывается с эпитопом, имеющим остатки по меньшей мере в положениях аминокислот 8-100, 185-191, 8-143 или 183-194 SEQ ID NO: 2. В конкретном варианте осуществления связывающий белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, выбранные из группы, состоящей из Ab1, Ab3, Ab4, Ab6-Ab8, chAb6, chAb7, chAb8, Ab14-Ab25 и Ab35-Ab55.
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, например, к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способному связывать PRLR и имеющему ту же эпитопную специфичность, что и у антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, выбранных из группы, состоящей из Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, chAb5, Ab6, chAb6, Ab7, chAb7, Ab8, chAb8, Ab9, chAb9, Ab10, chAb10, Ab11, chAb11, Ab12, chAb12, Ab13, chAb13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52, Ab53, Ab54 и Ab55.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способен модулировать биологическую функцию PRLR. В других вариантах осуществления указанных выше аспектов, связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывается со связывающим лиганд доменом D1 PRLR. В других вариантах осуществления указанных выше аспектов связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывается с эпитопом PRLR, который не ингибирует димеризацию PRLR. В следующих вариантах осуществления указанных выше аспектов, связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, не связывает домен D2 PRLR. В следующих вариантах осуществления указанных выше аспектов связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывается со связывающей лиганд областью домена D1 PRLR. В дополнительных вариантах осуществления указанных выше аспектов, связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, не конкурирует с антителом LFA102 за связывание PRLR. В дополнительных вариантах осуществления указанных выше аспектов связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, блокирует связывание пролактина с PRLR.
В конкретных вариантах осуществления любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения связывающий белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть. В конкретных вариантах осуществления любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения связывающий белок представляет собой антитело человека или его антигенсвязывающую часть.
В другом аспекте связывающий белок согласно любому из указанных выше вариантов осуществления изобретения представляет собой кристаллизованный связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
В другом аспекте изобретение относится к конструкции антитела, содержащей связывающий белок, где конструкция антитела дополнительно содержит линкерный полипептид или константный домен иммуноглобулина. В одном варианте осуществления связывающий белок указанной конструкции антитела выбран из группы, состоящей из молекулы иммуноглобулина, Fv с дисульфидной связью, моноклонального антитела, scFv, химерного антитела, однодоменного антитела, антитела с пересаженной CDR, диантитела, гуманизированного антитела, полиспецифического антитела, Fab, антитела с двойной специфичностью, Fab', биспецифического антитела, F(ab')2 и Fv.
Альтернативно или дополнительно, связывающий белок указанной конструкции антитела может содержать константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, выбранный из группы, состоящей из константного домена IgM человека, константного домена IgG4 человека, константного домена IgG1 человека, константного домена IgE человека, константного домена IgG2 человека, и константного домена IgG3 человека, константного домена IgA человека.
В других вариантах осуществления конструкция антитела содержит константный домен иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10-13.
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату антитела, содержащему конструкцию антитела, как описано выше, где указанный конъюгат антитела дополнительно содержит средство, выбранное из группы, состоящей из: молекулы иммуноадгезии, средства визуализации, лекарственного средства и цитотоксического средства. В одном варианте осуществления конъюгат антитела содержит средство визуализации, выбранное из группы, состоящей из радиоактивной метки, фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, биолюминесцентной метки, магнитной метки и биотина. В другом варианте осуществления конъюгат антитела содержит радиоактивную метку, выбранную из группы, состоящей из: 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho и 153Sm. В других вариантах осуществления конъюгат антитела содержит терапевтическое или цитотоксическое средство, выбранное из группы, состоящей из: антиметаболита, алкилирующего средства, антибиотика, фактора роста, цитокина, антиангиогенного средства, антимитотического средства, антрациклина, токсина и апоптотического средства. Например, антимитотическое средство может быть выбрано из группы, состоящей из доластатина, ауристатина, майтанзиноида, растительного алкалоида, таксана и алкалоида барвинка. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок указанной конструкции антитела обладает профилем гликозилирования человека.
В определенных вариантах осуществления конструкция антитела представляет собой кристаллизованную конструкцию антитела. В некоторых вариантах осуществления кристаллизованная конструкция антитела представляет собой свободную от носителя конструкцию кристаллизованного антитела с контролируемым высвобождением. В другом варианте осуществления конструкция антитела имеет большее время полужизни in vivo, чем растворимый аналог указанной конструкции антитела. В некоторых вариантах осуществления конструкция антитела сохраняет биологическую активность.
В другом аспекте изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность связывающего белка, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В другом аспекте изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность конструкции антитела, как описано в настоящем описании, где указанная конструкция антитела дополнительно содержит линкерный полипептид или константный домен иммуноглобулина.
В другом аспекте изобретение относится к вектору, содержащему указанную выделенную нуклеиновую кислоту. В другом варианте осуществления указанный вектор выбран из группы, состоящей из pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV и pBJ.
В другом аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор. В другом варианте осуществления указанная клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку, в то время как в других вариантах осуществления указанная клетка-хозяин представляет собой E.сoli. В других вариантах осуществления указанная клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. В некоторых вариантах осуществления указанная эукариотическая клетка выбрана из группы, состоящей из клетки простейшего, клетки животного, растительной клетки и клетки гриба. В других вариантах осуществления эукариотическая клетка представляет собой клетку животного, выбранную из группы, состоящей из: клетки млекопитающего, клетки птицы и клетки насекомого, в то время как в других вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку CHO. В другом варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой COS, в то время как в других вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку. В некоторых вариантах осуществления указанная дрожжевая клетка представляет собой Saccharomyces cerevisiae. В других вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого Sf9.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения белка, способного связывать PRLR, включающему культивирование клетки-хозяина, как описано выше, например, содержащей вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность конструкции антитела, как описано выше, в культуральной среде в условиях, достаточных для продуцирования связывающего белка, способного связывать PRLR. В одном варианте осуществления изобретение относится к белку, продуцированному указанным способом.
В другом аспекте изобретение относится к композиции для высвобождения связывающего белка, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, причем указанная композиция содержит: (a) состав, где указанный состав содержит кристаллизованный связывающий белок, как описано в настоящем описании, и ингредиент; и (b) по меньшей мере один полимерный носитель. В одном варианте осуществления полимерный носитель представляет собой полимер, выбранный из одного или нескольких из группы, состоящей из: поли(акриловой кислоты), поли(цианоакрилатов), поли(аминокислот), поли(ангидридов), поли(депсипептида), поли(сложных эфиров), поли(молочной кислоты), сополимера молочной и гликолевой кислот или PLGA, поли(b-гидроксибутирата), поли(капролактона), поли(диоксанона); поли(этиленгликоля), поли((гидроксипропил)метакриламида, поли[(органо)фосфазена], поли(сложных ортоэфиров), поли(винилового спирта), поли(винилпирролидона), сополимеров малеиновая ангидрид-алкилвиниловый эфир, полиолов плюроника, альбумина, альгината, целлюлозы и производных целлюлозы, коллагена, фибрина, желатина, гиалуроновой кислоты, олигосахаридов, гликаминогликанов, сульфатированных полисахаридов, их смесей и их сополимеров. В другом варианте осуществления указанный ингредиент выбран из группы, состоящей из альбумина, сахарозы, трегалозы, лактита, желатина, гидроксипропил-β-циклодекстрина, метоксиполиэтиленгликоля и полиэтиленгликоля. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения млекопитающего, включающему стадию введения млекопитающему эффективного количества указанной композиции.
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте осуществления указанный фармацевтически приемлемый носитель функционирует в качестве адъюванта, пригодного для повышения всасывания или диспергирования связывающего белка, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В другом варианте осуществления указанным адъювантом является гиалуронидаза.
В другом аспекте фармацевтическая композиция, кроме того, содержит по меньшей мере одно дополнительное лекарственное средство для лечения нарушения, при котором активность PRLR является вредоносной. Например, дополнительное средство может быть выбрано из группы, состоящей из: лекарственного средства, средства визуализации, цитотоксического средства, ингибиторов ангиогенеза; ингибиторов киназы; блокаторов костимулирующих молекул; блокаторов молекул адгезии; антитела против цитокина или его функционального фрагмента; метотрексата; циклоспорина; рапамицина; FK506; поддающейся обнаружению метки или репортера; антагониста TNF; противоревматического вещества; мышечного релаксанта, наркотика, нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (NSAID), аналгезирующего средства, анестетика, седативного средства, местного анестетика, нервно-мышечного блокатора, противомикробного средства, антипсориатического средства, кортикостероида, анаболического стероида, эритропоэтина, иммунизирующего средства, иммуноглобулина, иммуносупрессивного средства, гормона роста, гормон-заместительного лекарственного средства, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, антипсихотического средства, стимулятора, лекарственного средства против астмы, бета-агониста, ингалируемого стероида, перорального стероида, адреналина или аналога, цитокина и антагониста цитокина.
В другом аспекте изобретение относится к способу уменьшения активности PRLR человека путем контактирования PRLR человека со связывающим белком по изобретению, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, так чтобы активность PRLR человека снижалась.
В другом аспекте изобретение относится к способу уменьшения активности PRLR у человека, страдающего нарушением, при котором активность PRLR является вредоносной, путем введения человеку связывающего белка по изобретению, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, так чтобы у человека снижалась активность PRLR человека.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения у индивидуума заболевания или нарушения, при котором активность PRLR является вредоносной, путем введения индивидууму связывающего белка по изобретению, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, так чтобы осуществлялось лечение. В одном варианте осуществления нарушение представляет собой злокачественную опухоль. В другом варианте осуществления злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из меланомы, рака эндометрия, лимфомы, рака молочной железы, рака яичника, карциномы почки, желудочно-кишечного рака, рака толстого кишечника, рака легкого, рака поджелудочной железы и рака предстательной железы. В другом варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы. В одном варианте осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вводят индивидууму по меньшей мере одним способом, выбранным из группы, состоящей из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, интрабронхиального, интраабдоминального, внутрикапсулярного, внутрихрящевого, внутриполосного, внутрибрюшнополостного, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного, внутрикишечного, внутришеечного, внутрижелудочного, внутрипеченочного, внутримиокардиального, внутрикостного, внутритазового, внутриперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального, внутрипростатического, внутрилегочного, внутриректального, внутрипочечного, интраретинального, внутрипозвоночного, интрасиновиального, внутригрудного, внутриматочного, внутрипузырного, болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального и трансдермального способов.
В другом аспекте изобретение относится к антителу против PRLR или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически конкурируют со связывающим PRLR белком, как описано в настоящем описании, где указанную конкуренцию можно обнаружить в конкурентном анализе связывания с использованием указанного антитела, полипептида PRLR человека и связывающего PRLR белка.
В другом аспекте изобретение относится к конъюгату антитело против PRLR-лекарственное средство (ADC), содержащему антитело против PRLR или его антигенсвязывающий фрагмент и по меньшей мере одно лекарственное средство, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере 3 CDR.
Например, изобретение относится к конъюгату антитело против PRLR-лекарственное средство (ADC), где антитело или его антигенсвязывающая часть содержит по меньшей мере 3 CDR, выбранных из набора CDR вариабельных доменов тяжелой цепи (CDR1, CDR2 и CDR3), состоящего из SEQ ID NO: 40, 41 и 42; SEQ ID NO: 46, 47 и 42; SEQ ID NO: 56, 57 и 58; SEQ ID NO: 62, 63 и 58; SEQ ID NO: 71, 72 и 73; SEQ ID NO: 71, 77 и 73; SEQ ID NO: 85, 86 и 87; SEQ ID NO: 149, 150 и 87. Альтернативно или в комбинации, изобретение относится к конъюгату антитело против PRLR-лекарственное средство (ADC), где антитело или его антигенсвязывающая часть содержит по меньшей мере 3 CDR, выбранных из набора CDR вариабельных доменов легкой цепи (CDR1, CDR2, и CDR3) состоящий из SEQ ID NO: 49, 50 и 51; SEQ ID NO: 65, 66 и 67; SEQ ID NO: 79, 80 и 81; и SEQ ID NO: 92, 93 и 94.
В другом варианте осуществления ADC, указанного выше, лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из ингибитора митоза, противоопухолевого антибиотика, иммуномодулирущего средства, вектора для генной терапии, алкилирующего средства, антиангиогенного средства, антиметаболита, борсодержащего средства, хемопротективного средства, гормона, антигормонального средства, кортикостероида, фотоактивного лекарственного средства, олигонуклеотида, радионуклидного средства, ингибитора топоизомеразы, ингибитора тирозинкиназы и радиосенсибилизирующего средства. В другом варианте осуществления изобретение относится к ADC, где лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из Икземпры, доластатина 10, доластатина 15, ауристатина E, ауристатина PE, монометилауристатина D (MMAD или производного ауристатина D), монометилауристатина E (MMAE или производного ауристатина E), монометилауристатина F (MMAF или производного ауристатина F), ауристатина F фенилендиамина (AFP), ауристатина EB (AEB), ауристатина EFP (AEFP), 5-бензоилвалериановой кислоты-сложного эфира AE (AEVB), метотрексата, даунорубицина, винкристина, майтанзина, майтанзинола, C-3 сложных эфиров майтанзинола, ансамитоцина P1, ансамитоцина P2, ансамитоцина P3, ансамитоцина P4, доцетаксела, паклитаксела, наночастиц паклитаксела, виндезина сульфата, винкристина, винбластина, винорелбина, актиномицинов, пирроло[2,1-c][1,4]бензодиазепинов, димеров пирролобензодиазепинов (PBD), актиномицина D, антрамицина, чикамицина A, DC-18, DC-81, мазетрамицина, неотрамицина A, неотрамицина B, поротрамицина, протракарцина B, SG2285, сибаномицина, сибиромицина, томаймицина, антрациклинов, даунорубицина, доксорубицина, эпирубицина, идарубицина, калихеамицинов, γ1I, α2I, α3I, N-ацетил-γ1I, PSAG, θI1, дуокармицинов, адозелезина, бизелезина и карзелезина, блеомицина, митомицина, пликамицина, бациллы Кальметта-Герена (BCG), левамизола, вакцин против злокачественной опухоли, рекомбинантной двухвалентной вакцины против вируса папилломы человека (HPV) 16 и 18 типов, рекомбинантной четырехвалентной вакцины против вируса папилломы человека (HPV) типов 6, 11, 16 и 18, сипулейцела-T, цитокинов, паратиреоидного гормона; тироксина; инсулина; проинсулина; релаксина; прорелаксина; гликопротеиновых гормонов, таких как фолликулостимулирущий гормон (FSH), тиреостимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH), фактор роста печени; фибробластного фактора роста, пролактина, плацентарного лактогена, фактора некроза опухоли, мюллерова ингибирующего вещества, ассоциированного с гонадотропином мыши пептида, ингибина, активина, сосудисто-эндотелиального фактора роста, интегрина, тромбопоэтина (TPO), факторов роста нервов, таких как NGF, тромбоцитарного фактора роста, трансформирующих факторов роста (TGF), инсулиноподобного фактора роста-I и -II, эритропоэтина (EPO), остеоиндуктивных факторов, интерферонов, таких как интерферон α, β и γ, колониестимулирующих факторов (CSF), гранулоцитарно-макрофагального-C-SF (GM-CSF) и гранулоцитарного CSF (G-CSF), интерлейкинов (IL), таких как IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, фактора некроза опухоли и других полипептидных факторов, включающих LIF и kit-лиганд (KL), колониестимулирующих факторов, эритропоэтина (эпоэтина), филграстима, сарграмостима, промегапоэтина, Опрелвекина, иммуномодулирующих генных терапевтических средств, нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный терапевтический ген, который используют для замены мутантного или иным образом нефункционального (например, укороченного) гена, ассоциированного со злокачественной опухоли, нуклеиновой кислот. которая кодирует или иным образом обеспечивает продукцию терапевтического белка для лечения злокачественной опухоли, алкилсульфонатов, бусульфана, азотистых ипритов, хлорамбуцила, циклофосфамида, эстрамустина, ифосфамида, мехлорэтамина и мелфалана, нитрозомочевины, кармустина, фотемустина, ломустина, нимустина, стрептозоцина, триазинов и гидразинов, дакарбазина, прокарбазина, темозоломида, этилениминов, тиотепы, диазиквона, митомицина C, производных метиламина, эпоксидов, алтретамина, диангидрогалактита, дибромдульцита, ангиостатина, ABX EFG, C1-1033, PKI-166, вакцины против EGF, EKB-569, GW2016, ICR-62, EMD 55900, CP358, PD153035, AG1478, IMC-C225, OSI-774, Эрлотиниба, ангиостатина, аррестина, эндостатина, BAY 12-9566 и с фторурацилом или доксорубицином, канстатина, карбоксиамидотриозола и с паклитакселом, EMD121974, S-24, витаксина, диметилксантенон уксусной кислоты, IM862, интерлейкина-12, интерлейкина-2, NM-3, HuMV833, PTK787, RhuMab, ангиозима, IMC-1C11, Неовастата, маримастата, приномастат, BMS-275291, COL-3, MM1270, SU101, SU6668, SU11248, SU5416, с паклитакселом, с гемцитабином и цисплатином, и с иринотеканом и цисплатином и с облучением, текогалана, темозоломида и PEG-интерферона α2b, тетратиомолибдата, TNP-470, талидомида, CC-5013 и с таксотером, тумстатина, 2-метоксиэстрадиола, ловушки VEGF, ингибиторов mTOR (дефоролимус, эверолимус и темсиролимус), ингибиторов тирозинкиназы (например, иматиниб, гефитиниб, дасатиниб, сунитиниб, нилотиниб, лапатиниб, сорафениб, фосфоинозитид 3-киназы (PI3K), антагонистов фолиевой кислоты, метотрексата, 4-аминофолиевой кислоты, лометрексола, пеметрекседа, триметрексата, антагонистов пиримидина, азацитидина, капецитабина, цитарабина, децитабина, 5-фторурацила, 5-фтор-2'-дезоксиуридина 5'-фосфата, 5-фторуридина трифосфата, гемцитабина, фоксиуридина, антагониста пуринов азатиоприна, кладрибина, меркаптопурина, флударабина, пентостатина, 6-тиогуанина, ингибиторов аденозиндезаминазы, Кладрибина, Флударабина, Неларабина, Пентостатина, борофицина, бортезомиба, хемопротективных средств, амифостина, дексразоксана, месны, андрогенов, эстрогенов, медроксипрогестерона ацетата, прогестинов, аминоглутетимида, анастрозола, бикалутамида, хлортриазинов, ципротерона ацетата, дегареликса, экземестана, флутамида, фулвестранта, гозерелина, лектрозола, леупролида, люпрона, медроксипрогестерона ацетата, Магестрола ацетата, тамоксифена, трипторелина, аспарагиназы, дакарбазина, гидроксимочевины, левамизола, митотана, прокарбазана, третиноина, глюкокортикоидов, преднизона, хромагенов, красителей, антисмысловых олигонуклеотидов, как встречающихся в природе, так и синтезированных с использованием стандартных и/или нестандартных нуклеотидов (включая РНК-интерференцию (РНК-i)), двухцепочечную РНК (дцРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК), микроРНК (mi-РНК), аптамеров, CpG-олигонуклеотидов, рибозимов, ангиозима, 111In, 177Lu, 212Bi, 213Bi, 211At, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 90Y, 125I, 131I, 32P, 33P, 47Sc, 111Ag, 67Ga, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 59Fe, 75Se, 77As, 89Sr, 99Mo, 105Rh, 109Pd, 143Pr, 149Pm, 169Er, 194Ir, 198Au, 199Au, 211'Pb, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111 1, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m, Ir-192, Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-21 1, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213, Fm-255, 11C, 13N, 15О, 75Br, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113mIn, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 121mTe, 122mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 197Pt, 109Pd, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 166Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201Tl, 225Ac, 76Br, 169Yb, таксана, цисплатина, метронидазола, мизонидазола, десметилмизонидазола, пимонидазола, этанидозола, ниморазола, митомицина C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, никотинамида, 5-бромдезоксиуридина (BUdR), 5-йоддезоксиуридина (IUdR), бромдезоксицитидина, фтордезоксиуридина (FUdR), гидроксимочевины, производных гематопорфирина, фотофрина(r), производных бензопорфирина, NPe6, олово-этиопорфирина (SnET2), феоборбида a, бактериохлорофилла a, нафталоцианинов, фталоцианинов, цинк-фталоцианина, камптотецинов, иринотекана, топотекана, амсакрина, даунорубицина, доксорубицина, эпиподофиллотоксинов, эллиптицинов, эпирубицина, этопозида, разоксана, тенипозида, акситиниба, босутиниба, цедираниба, дасатиниба, эрлотиниба, гефитиниба, иматиниба, лапатиниба, лестауртиниба, нилотиниба, семаксаниба, сунитиниб, вандетаниба, абрина, A-цепи абрина, альфа-токсина, белков Aleurites fordii, аматоксина, кротина, курцина, диантиновых белков, дифтерийного токсина, A-цепи дифтерийного токсина, несвязывающих активных фрагментов дифтерийного токсина, дезоксирибонуклеазы (ДНКазы), гелонина, митогеллина, A-цепи модеццина, ингибитора momordica charantia, неомицина, онконазы, феномицина, белков Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), антивирусного белка лаконоса, эндотоксина Pseudomonas, экзотоксина Pseudomonas, A-цепи экзотоксина из Pseudomonas aeruginosa, рестриктоцина, рицина, A-цепи рицина, рибонуклеазы (РНКазы), ингибитора sapaonaria officinalis, сапорина, альфа-сарцина, стафилкоккового энтеротоксина A, столбнячного токсина, цисплатина, карбоплатина и оксалиплатина (Элоксатин, Sanofi Aventis), ингибиторов протеасом, PS-341, ингибиторов HDAC, вориностаста, белиностата, этиностата, моцетиностата, панобиностата, ингибиторов COX-2, замещенных соединений мочевины, ингибиторов белков теплового шока, Гелданамицина, адренокортикальных супрессоров, трикотеценов, A12, 19D12, Cp751-871, H7C10, alphaIR3, ScFV/FC, EM/164, Матузумаба, Эрбитукса, Вектибикса, mAb 806, Нимотуксумаба, AVEO, AMG102, 5D5 (OA-5d5), H244G11, Ab #14 (MM 121-14), Герцептина, 1B4C3; 2D1D12, NVP-AEW541-A, BMS-536,924 (1H-бензоимидазол-2-ил)-1H-пиридин-2-она), BMS-554,417, Циклолигана, TAE226, PQ401, Ирессы, CI-1033 (PD 183805), Лапатиниба (GW-572016), Тайкерба, Тарцевы, PKI-166, PD-158780, EKB-569, тирфостина AG 1478 (4-(3-хоранилин)-6,7-диметоксихиназолин), PHA665752, ARQ 197, Капецитабина, 5-трифторметил-2'-дезоксиуридина, Метотрексата натрия, Ралтитрекседа, Пеметрекседа, Тегафура, Цитозина арабинозида (Цитарабин), 5-азацитидина, 6-меркаптопурина (Меркаптопурин, 6-MP), азатиоприна, 6-тиогуанина, пентостатин, флударабина фосфата, Кладрибина (2-CdA, 2-хлордезоксиаденозин), ингибитора рибонуклеотидредуктазы, Циклофосфамида, Неосара, ифосфамида, Тиотепы, BCNU→ 1,3-бис(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевины, CCNU→ 1-(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозомочевины (метил CCNU), нexaметилмеламина, бусульфана, Прокарбазина HCL, Дакарбазина (DTIC), хлорамбуцила, мелфалана, карбоплатина, оксалиплатина, доксорубицина HCL, даунорубицина цитрата, митоксантрона HCL, актиномицина D, этопозида, топотекана HCl, тенипозида, иринотекана HCL(CPT-11), винкристина, винбластина сульфата, винорелбина тартрата, виндезина сульфата, паклитаксела, доцетаксела, абраксана, иксабепилона, иматиниба мезилата, сунитиниба малата, сорафениба тозилата, нилотиниба гидрохлорида моногидрата, L-аспарагиназы, альфа-интерферона, авастина, IL-2, Альдеслейкина, Пролейкина, IL-12, Торемифена цитрата, фулвестранта, ралоксифена HCL, анастразола, лектрозола, Фадрозола (CGS 16949A), экземестана, леупролида ацетата, люпрона, гозерелина ацетата, трипторелина памоата, бузерелина, нафарелина, цетрореликса, бикалутамида, нилутамида, магестрола ацетата, аналогов соматостатина, преднизолона, дексаметазона, кетоконазола, сиролимуса, темсиролимуса (CCI-779), дефоролимуса (AP23573) и эверолимуса (RAD00I).
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей ADC, как описано выше.
В другом аспекте, изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение ADC, как описано выше, так что осуществляется лечение индивидуума.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение ADC, как описано выше, чтобы осуществлялось лечение индивидуума, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из меланомы, рака эндометрия, лимфомы, рака молочной железы, рака яичника, карциномы почки, желудочно-кишечного рака, рака толстого кишечника, рака легкого, рака поджелудочной железы и рака предстательной железы. В других вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение ADC, как описано выше, так чтобы осуществлялось лечение индивидуума, где злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы. В других вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение ADC, как описано выше, так чтобы осуществлялось лечение индивидуума, где ADC вводят индивидууму способом, выбранным выбранный из группы, состоящей из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, внутрибрюшного, внутрикапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутрибрюшнополостного, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного, внутрикишечного, внутришеечного, внутрижелудочного, внутрипеченочного, внутримиокардиального, внутрикостного, внутритазового, внутриперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального, внутрипростатического, внутрилегочного, внутриректального, внутрипочечного, интраретинального, внутрипозвоночного, интрасиновиального, внутригрудного, внутриматочного, внутрипузырного, болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального и трансдермального способов.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Выравнивание последовательностей вариабельной области тяжелой цепи для антител мыши Ab5 (SEQ ID NO: 112), Ab6 (SEQ ID NO: 113), Ab7 (SEQ ID NO: 114), Ab8 (SEQ ID NO: 115), Ab9 (SEQ ID NO: 116), Ab10 (SEQ ID NO: 117), Ab11 (SEQ ID NO: 118), Ab12 (SEQ ID NO: 119) и Ab13 (SEQ ID NO: 120).
Фигура 2. Выравнивание последовательностей вариабельной области легкой цепи для антител мыши Ab5 (SEQ ID NO: 103), Ab6 (SEQ ID NO: 104), Ab7 (SEQ ID NO: 105), Ab8 (SEQ ID NO: 106), Ab9 (SEQ ID NO: 107), Ab10 (SEQ ID NO: 108), Ab11 (SEQ ID NO: 109), Ab12 (SEQ ID NO: 110) и Ab13 (SEQ ID NO: 111).
Фигура 3. Выравнивание последовательностей вариабельной области тяжелой цепи для антител мыши Ab5 (SEQ ID NO: 112), Ab6 (SEQ ID NO: 113), Ab7 (SEQ ID NO: 114) и Ab8 (SEQ ID NO: 115); и гуманизированных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи, происходящих из них, т.е. Ab1 VH.1z (SEQ ID NO: 39), Ab1 VH.1 (SEQ ID NO: 43), Ab1 VH.1a (SEQ ID NO: 44), Ab1 VH.1b (SEQ ID NO: 45), Ab2 VH.1z (SEQ ID NO: 55), Ab2 VH.1 (SEQ ID NO: 59), Ab2 VH.1a (SEQ ID NO: 60), Ab2 VH.1b (SEQ ID NO: 61), Ab3 VH.1z (SEQ ID NO: 70), Ab3 VH.1 (SEQ ID NO: 74), Ab3 VH.1a (SEQ ID NO: 75), Ab3 VH.1b (SEQ ID NO: 76), Ab4 VH.1z (SEQ ID NO: 84), Ab4 VH.1 (SEQ ID NO: 88), Ab4 VH.1a (SEQ ID NO: 89), Ab4 VH.1a.2 (SEQ ID NO: 121), Ab4 VH.1a.3 (SEQ ID NO: 122), Ab4 VH.1b (SEQ ID NO: 123) и Ab4 VH.1b.2 (SEQ ID NO: 90).
Фигура 4. Выравнивание последовательностей вариабельной области легкой цепи для антител мыши Ab5 (SEQ ID NO: 103), Ab6 (SEQ ID NO: 104), Ab7 (SEQ ID NO: 105) и Ab8 (SEQ ID NO: 106); и гуманизированных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи, происходящих из них, т.е. Ab1 VL.1 (SEQ ID NO: 48), Ab1 VL.1a (SEQ ID NO: 52), Ab1 VL.2 (SEQ ID NO: 53), Ab1 VL.2a (SEQ ID NO: 54), Ab2 VL.1 (SEQ ID NO: 64), Ab2 VL.1a (SEQ ID NO: 68), Ab2 VL.1b (SEQ ID NO: 69), Ab3 VL.1 (SEQ ID NO: 78), Ab3 VL.1a (SEQ ID NO: 82), Ab3 VL.1b (SEQ ID NO: 83), Ab4 VL.1 (SEQ ID NO: 91), Ab4 VL.1a (SEQ ID NO: 95) и Ab4 VL.1b (SEQ ID NO: 96).
Фигура 5. Эффект антител против PRLR на рост клеток Nb2-11, имплантированных мышам SCID-beige. Антитела вводили в указанный день исследования (сутки 7, 14 и 21). Планки погрешности указывают на стандартную ошибку среднего значения (см. пример 3).
Фигура 6. Обобщение группирования эпитопов антител против PRLR для антител мыши Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11 и Ab12, и для антитела LFA102 (см. пример 4).
Фигура 7. Результаты анализа одновременного связывания для химерных и гуманизированных антител chAb7, Ab39, Ab40, chAb5, Ab30, chAb6, Ab19, Ab21, chAb8, Ab48 и Ab49 и для антитела LFA102 демонстрируют, что гуманизация химерных антител не изменяла значительно центральный эпитоп для каждого среднеквадратического антитела (см. пример 4).
Фигура 8. Обобщение группирования эпитопов антитела против PRLR для химерных и гуманизированных антител chAb7, Ab39, Ab40, chAb5, Ab30, chAb6, Ab19, Ab21, chAb8, Ab48 и Ab49, и для антитела LFA102 (см. пример 4).
Фигура 9. Изображение поверхностей эпитопов для Ab6 и LFA102, картированных на структуре тройного комплекса PRL-PRLR (см. пример 5).
Фигура 10. Сравнение связывания определенных антител против PRLR с huPRLR, cyPRLR и muPRLR (см. пример 10).
Фигура 11. Сравнение связывания определенных антител против PRLR при гуманизации химерного антитела.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к связывающим PRLR человека белкам, в частности, к антителам против PRLR или их антигенсвязывающим частям, которые связывают PRLR, и к их применениям. Различные аспекты изобретения относятся к антителам и фрагментам антител, их конъюгатам и фармацевтическим композициям, а также к нуклеиновым кислотам, рекомбинантным экспрессирующим векторам и клеткам-хозяевам для получения таких антител и фрагментов. Также изобретение охватывает способы применения антител по изобретению для обнаружения PRLR человека, для ингибирования активности PRLR человека, либо in vitro, либо in vivo; и для предупреждения или лечения нарушений, таких как рак молочной железы.
Если в настоящем описании не определено иначе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь те же значения, которые обычно подразумевают специалисты в данной области. Значение и объем терминов должны быть очевидны, однако в случае какой-либо скрытой неопределенности, определения, представленные в настоящем описании, имеют преимущество над любым словарем или посторонним определением. Кроме того, если контекстом не требуется иное, термины в единственном числе включают множественное число, и термины во множественном числе включают единственное число. В этой заявке, применение "или" означает "и/или", если нет иных указаний. Более того, применение термина "включающий", а также других форм, таких как "включает" и "включенный", является неограничивающим. Также термины, такие как "элемент" или "компонент", охватывают как элементы и компоненты, содержащие одну единицу, так и элементы и компоненты, которые включают более одной субъединицы, если нет иных конкретных указаний.
Как правило, используемые номенклатура и способы, связанные с культивированием клеток и тканей, молекулярной биологией, иммунологией, микробиологией, генетикой и химией белков и нуклеиновых кислот и гибридизацией, описанные в настоящем описании, представляют собой номенклатуру и способы, хорошо известные и обычно используемые в данной области. Способы и технологии по настоящему изобретению, как правило, проводят в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в данной области и описанными в различных общих и более научных ссылках, которые цитированы и рассмотрены на протяжении настоящего описания, если нет иных указаний. Ферментативные реакции и способы очистки проводят в соответствии с указаниями изготовителя, как обычно выполняют в данной области или как описано в настоящем описании. Используемые номенклатура и лабораторные процессы, и способы аналитической химии, синтетической органической химии, и медицинской и фармацевтической химии, описанные в настоящем описании, представляют собой номенклатуру и лабораторные процессы и способы, хорошо известные и обычно используемые в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, получения, изготовления и доставки фармацевтических средств, и лечения пациентов используют стандартные способы.
Для того чтобы настоящее изобретение могло быть более понятным, ниже определены избранные термины.
Термин "полипептид", как используют в настоящем описании, относится к любой полимерной цепи аминокислот. Термины "пептид" и "белок" используют взаимозаменяемо с термином полипептид, и они также относятся к полимерной цепи аминокислот. Термин "полипептид" относится к нативным или искусственным белкам, фрагментам белков и полипептидным аналогам белковой последовательности. Полипептид может быть мономерным или полимерным.
Термин "выделенный белок" или "выделенный полипептид" представляет собой белок или полипептид, который, исходя из его происхождения или источника, не ассоциирован с ассоциированными с ним в природе компонентами, которые сопровождают его в его нативном состоянии; по существу не содержит других белков того же вида; экспрессируется клеткой отличающегося вида; или не встречается в природе. Таким образом, полипептид, который является химически синтезированным или синтезированным в клеточной системе, отличной от клетки, которая является его природным источником, является "выделенным" из ассоциированных с ним в природе компонентов. Также можно сделать так, чтобы белок по существу не содержал ассоциированных с ним в природе компонентов, выделением с использованием способов очистки белка, хорошо известных в данной области.
Термин "извлечение", как используют в настоящем описании, относится к процессу обеспечения того, чтобы химическая молекула, такая как полипептид, по существу не содержала ассоциированных с ней в природе компонентов, посредством выделения, например, с использованием способов очистки белков, хорошо известных в данной области.
Термины "PRLR человека" и "PRLR человека дикого типа" (сокращенно обозначаемые в настоящем описании как hPRLR, hPRLRwt), как используют в рамках изобретения, относятся к однократно проходящему через мембрану рецептору цитокинов 1 класса. PRLR человека включает внеклеточную область, которая связывает пролактин, трансмембранную область цитоплазматическую область. Термин PRLR человека включает рекомбинантный PRLR человека (rhPRLR), который можно получать стандартными способами рекомбинантной экспрессии. В таблице 1 предоставлена аминокислотная последовательность PRLR человека (т.е. SEQ ID NO: 1) и его внеклеточного домена (т.е. SEQ ID NO: 2), которые известны в данной области. Кроме того, различные изоформы hPRLR известны в данной области и указаны в таблице 1 ниже.
Последовательность PRLR человека
"Биологическая активность", как используют в рамках изобретения, относится ко всем имманентным биологическим свойствам рецептора пролактина. Биологические свойства PRLR включают, но не ограничиваются ими, связывание пролактина, связывание гормона роста, связывание плацентарного лактогена, активацию киназной активности JAK2, активацию тирозинкиназной активности трансмембранного рецепторного белка, антиапоптотическую активность, передачу сигнала рецептора клеточной поверхности, опосредуемую цитокинами передачу сигнала, вовлечение в имплантацию эмбриона, активность каскада JAK-STAT, активность каскада JAK STAT, вовлеченную в передачу сигнала гормонов роста, вовлечение в лактацию, вовлечение в развитие альвеол молочной железы, вовлечение в дифференцировку эпителиальных клеток молочной железы, вовлечение в развитие эпителия молочной железы, вовлечение в рост предстательной железы, регуляцию клеточной адгезии, регуляцию дифференцировки эпителиальных клеток, биосинтетическую активность стероидов и активацию T-клеток.
Термины "специфическое связывание" или "специфически связывающийся", как используют в рамках изобретения в отношении взаимодействия антитела, белка или пептида со второй химической молекулой, означают, что взаимодействие зависит от наличия конкретной структуры (например, антигенной детерминанты или эпитопа) на химической молекуле; например, антитело распознает и связывает конкретную белковую структуру, а не белки в целом. Если антитело является специфичным к эпитопу "A", наличие молекулы, содержащей эпитоп A (или свободного немеченого A), в реакционной смеси, содержащей меченный "A" и антитело, будет снижать количество меченного A, связавшегося с антителом.
Термин "антитело", как используют в рамках настоящего изобретения, в широком значении относится к любой молекуле иммуноглобулина (Ig), содержащей четыре полипептидных цепи: две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, или к любому ее функциональному фрагменту, мутанту, варианту или производному, которые сохраняют существенные признаки связывания эпитопа молекулой Ig. Такие формы мутантов, вариантов или производных антител известны в данной области. Их неограничивающие варианты осуществления рассмотрены ниже.
В полноразмерном антителе каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначаемую в настоящем описании как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно обозначаемую в настоящем описании как LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен CL. Области VH и VL далее могут быть подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), расположенные между областями, являющимися более консервативными, которые называются каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Молекулы иммуноглобулинов могут относиться к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу.
Термин "антигенсвязывающая часть" антитела (или просто "часть антитела") относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном (например, hPRLR). Было показано, что антигенсвязывающую функцию антитела может выполнять один или несколько фрагментов полноразмерного антитела. Такие варианты осуществления антител также могут быть биспецифическими, обладающими двойной специфичностью или полиспецифическими, специфично связывающимися с двумя или более различными антигенами. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающая часть" антитела, включают (i) Fab-фрагмент - одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')2-фрагмент - двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидной связью в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, Winter et al., публикация PCT WO 90/05144 A1, включенная в настоящее описание в качестве ссылки), который содержит один вариабельный домен; и (vi) отдельную определяющую комплементарность область (CDR). Более того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, их можно связывать с использованием рекомбинантных способов синтетическим линкером, который позволяет получение их в качестве единой белковой цепи, в которой области VL и VH образуют пары, формируя одновалентные молекулы (известные как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином "антигенсвязывающая часть" антитела. Также охватываются другие формы одноцепочечных антител, такие как диантитела. Диантитела представляют собой двухвалентные биспецифические антитела, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы обеспечивать образование пар между двумя доменами на одной цепи, тем самым вынуждая домены образовывать пары с комплементарными доменами другой цепи и формировать два антигенсвязывающих участка (см. например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123) Такие связывающие участки антитела известны в данной области (Kontermann и Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)).
Термин "конструкция антитела", как используют в рамках изобретения, относится к полипептиду, содержащему одну или несколько антигенсвязывающих частей по изобретению, связанных с линкерным полипептидом или константным доменом иммуноглобулина. Линкерные полипептиды содержат два или более аминокислотных остатков, связанных пептидными связями, и их используют для связывания одной или нескольких антигенсвязывающих частей. Такие линкерные полипептиды хорошо известны в данной области (см. например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Константный домен иммуноглобулина относится к константному домену тяжелой или легкой цепи. Аминокислотные последовательности константного домена тяжелой и легкой цепей IgG человека известны в данной области и представлены в таблице 2.
Последовательность константного домена тяжелой цепи и константного домена легкой цепи IgG человека
Более того, антитело или его антигенсвязывающая часть, может быть частью более крупных молекул иммуноадгезии, образованных путем ковалентного или нековалентного связывания антитела или части антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами. Примеры таких молекул иммуноадгезии включают применение центральной области стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) и применение остатка цистеина, маркерного пептида и C-концевой полигистидиновой метки для получения двухвалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Части антител, такие как Fab- и F(ab')2-фрагменты, можно получать из целых антител с использованием общепринятых способов, таких как расщепление папаином или пепсином, соответственно, целых антител. Более того, антитела или части антител и молекулы иммуноадгезии можно получать с использованием стандартных способов рекомбинантных ДНК, как описано в настоящем описании.
"Выделенное антитело", как используют в рамках настоящего изобретения, относится к антителу, которое по существу свободно от других антител, имеющих отличающуюся специфичность связывания (например, выделенное антитело, которое специфично связывает hPRLR, по существу свободно от антител, которые специфично связывают антигены, отличные от hPRLR). Однако выделенное антитело, которое специфично связывает hPRLR, может обладать перекрестной реактивностью к другим антигенам, таким как молекулы PRLR из других видов. Более того, выделенное антитело может быть по существу свободно от другого клеточного материала и/или химических веществ.
Термин "антитело человека", как используют в рамках настоящего изобретения, включает антитела, имеющие вариабельные и константные области из последовательностей иммуноглобулинов эмбрионального типа человека. Антитела человека по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов эмбрионального типа человека (например, мутации, внесенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или посредством соматической мутации in vivo), например в CDR и, в частности, в CDR3. Однако термин "антитело человека", как используют в рамках настоящего изобретения, не включает антитела, в которых последовательности CDR, образованные из последовательностей эмбрионального типа других видов млекопитающих, таких как мышь, пересажены в каркасные последовательности человека.
Термин "рекомбинантное антитело человека", как используют в рамках настоящего изобретения, включает все антитела человека, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными способами, такие как антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфицированного в клетку-хозяина (дополнительно описанную в разделе II, ниже), антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека (Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., and Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V., и Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., и Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным по генам иммуноглобулинов человека (см. например, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., и Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al (2000) Immunology Today 21:364-370) или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, который вовлекает сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, образованные из последовательностей иммуноглобулинов эмбрионального типа. Однако в определенных вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергают мутагенезу in vitro (или, когда используют животное, трансгенное по последовательностям Ig человека, они подвергаются соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, когда они образованы из последовательностей VH и VL эмбрионального типа человека или когда они являются родственными им, могут не существовать в природе в наборе антител эмбрионального типа человека in vivo.
Один вариант осуществления относится к полностью человеческим антителам, способным связываться с PRLR человека, которые можно получать с использованием способов, хорошо известных в данной области, таких как, но не ограничиваясь ими, использование фаговых библиотек Ig человека, таких как библиотеки, описанные в Jermutus et al., публикация PCT №. WO 2005/007699 A2.
Термин "химерное антитело" относится к антителам, которые содержат последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей из одного вида и последовательности константных областей из другого вида, таким как антитела, имеющие вариабельные области тяжелой и легкой цепей мыши, связанные с константными областями человека.
Термин "антитело с пересаженной CDR" относится к антителам, которые содержат последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей одного вида, но в которых последовательности одной или нескольких из областей CDR VH и/или VL заменены последовательностями CDR другого вида, таким как антитела, имеющие вариабельные области тяжелой и легкой цепей мыши, в которых одна или несколько из CDR мыши (например, CDR3) заменены последовательностями CDR человека.
Термины "нумерация по Kabat", "определения по Kabat" и "обозначение по Kabat" используют в настоящем описании взаимозаменяемо. Эти термины, которые являются известными в данной области, относятся к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е. гипервариабельными), чем другие аминокислотные остатки в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей антитела или его антигенсвязывающей части (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 и Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Для вариабельной области тяжелой цепи, гипервариабельная область находится в диапазоне аминокислотных положений с 31 по 35 для CDR1, аминокислотных положений с 50 по 65 для CDR2, и аминокислотных положений с 95 по 102 для CDR3. Для вариабельной области легкой цепи, гипервариабельная область находится в диапазоне аминокислотных положений с 24 по 34 для CDR1, аминокислотных положений с 50 по 56 для CDR2 и аминокислотных положений с 89 по 97 для CDR3.
Как используют в рамках изобретения, термины "акцептор" и "акцепторное антитело" относятся к антителу или последовательности нуклеиновой кислоты, обеспечивающим или кодирующим по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или 100% аминокислотных последовательностей одной или нескольких из каркасных областей. В некоторых вариантах осуществления термин "акцептор" относится к аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты антитела, обеспечивающим или кодирующим константную область(и). В другом варианте осуществления термин "акцептор" относится к аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновых кислот антитела, обеспечивающим или кодирующим одну или несколько из каркасных областей и константную область(и). В конкретном варианте осуществления термин "акцептор" относится к аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновых кислот антитела человека, которые обеспечивают или кодируют по меньшей мере 80%, предпочтительно, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или 100% аминокислотных последовательностей одной или нескольких из каркасных областей. В соответствии с этим вариантом осуществления акцептор может содержать по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, которые не встречаются в одном или нескольких конкретных положениях антитела человека. Акцепторная каркасная область и/или акцепторная константная область(и) может быть образована или получена, например, из гена антитела эмбрионального типа, зрелого гена антитела, функционального антитела (например, антител, хорошо известных в данной области, разрабатываемых антител или коммерчески доступных антител).
Как используют в рамках настоящего изобретения, термин "CDR" относится к определяющей комплементарность области в вариабельных последовательностях антитела. В каждой из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи имеется три CDR, которые обозначают как CDR1, CDR2 и CDR3, для каждой из вариабельных областей. Термин "набор CDR", как используют в настоящем описании, относится к группе из трех CDR, которые встречаются в одной вариабельной области, способной связывать антиген. Точные границы этих CDR определяются по-разному в соответствии с различными системами. Система, описанная Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987) и (1991)) не только обеспечивает однозначную систему нумерации остатков, применимую к любой вариабельной области антитела, но также предоставляет точные границы остатков, определяющих три CDR. Эти CDR могут быть обозначены как CDR по Kabat. Chothia и коллеги (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) и Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)) обнаружили, что определенные участки в CDR по Kabat принимают практически идентичные конформации пептидного остова, несмотря на наличие большого разнообразия на уровне аминокислотной последовательности. Эти участки были обозначены как L1, L2 и L3 или H1, H2 и H3, где "L" и "H" обозначают области легкой цепи и тяжелой цепи, соответственно. Эти области могут быть обозначены как CDR по Chothia, которые имеют границы, которые перекрывают CDR по Kabat. Другие границы, определяющие CDR, перекрывающиеся с CDR по Kabat, были описаны Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) и MacCallum (J Mol. Biol 262 (5): 732-45 (1996)). Другие определения границ CDR могут не точно соответствовать одной из систем, но тем не менее, они перекрывают CDR по Kabat, хотя они могут иметь большую или меньшую длину с учетом предсказания или экспериментальных данных о том, что конкретные остатки или группы остатки или даже целые CDR не оказывают значительного влияния на связывание антигена. В способах, используемых в рамках изобретения, могут быть использованы CDR, определенные согласно любой из этих систем, хотя в предпочтительных вариантах осуществления используются CDR, определенные по Kabat или Chothia.
Как используют в рамках изобретения, термин "канонический" остаток относится к остатку в CDR или каркасной области, который определяет конкретную каноническую структуру CDR, при определении по Chothia et al. (J. Mol. Biol., 196 901-907 (1987)); и Chothia et al. (J. Mol. Biol., 227: 799 (1992), оба из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок). Согласно Chothia et al., критические положения CDR многих антител имеют практически идентичные конформации пептидного остова, несмотря на большое разнообразие на уровне аминокислотной последовательности. Каждая каноническая структура определяет, главным образом, набор углов поворота пептидного остова для непрерывного сегмента из аминокислотных остатков, образующих петлю.
Как используют в рамках изобретения, термины "донор" и "донорное антитело" относятся к антителу, предоставляющему одну или несколько CDR. В предпочтительном варианте осуществления донорное антитело представляет собой антитело из вида, отличающегося от антитела, из которого получены или происходят каркасные области. В контексте гуманизированного антитела термин "донорное антитело" относится к не являющемуся человеческим антителу, предоставляющему одну или несколько CDR.
Как используют в рамках изобретения, термин "каркасная область" или "последовательность каркасной области" относится к остальным последовательностям вариабельной области без CDR. Поскольку точное определение последовательности CDR можно проводить с помощью различных систем, значение каркасной последовательности подвергают соответственно различным интерпретациям. Шесть CDR (CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 легкой цепи и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 тяжелой цепи) также делят каркасные области легкой цепи и тяжелой цепи на подобласти (FR1, FR2, FR3 и FR4) на каждой цепи, в которых CDR1 расположена между FR1 и FR2, CDR2 расположена между FR2 и FR3, и CDR3 расположена между FR3 и FR4. Без указания конкретных подобластей в качестве FR1, FR2, FR3 или FR4, каркасная область, согласно другим источникам, представляет собой объединенные FR в вариабельной области одной встречающейся в природе цепи иммуноглобулина. Как используют в рамках изобретения, FR, указанная в единственном числе, представляет собой одну из четырех подобластей, и FR, указанные во множественном числе, представляют собой две или более из четырех подобластей, составляющих каркасную область.
Акцепторные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи человека известны в данной области. В одном из вариантов осуществления изобретения акцепторные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи человека выбраны из последовательностей, описанных в таблице 3 и таблице 4.
Как используют в рамках изобретения, термин "ген антитела эмбрионального типа" или "фрагмент гена" относится к последовательности иммуноглобулина, кодируемой нелимфоидными клетками, которая не подвергалась процессу созревания, который приводит к генетической реаранжировке и мутации для экспрессии конкретного иммуноглобулина. (См., например, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)). Одно из преимуществ, обеспечиваемых различными вариантами осуществления настоящего изобретения, является следствием признания, что гены антитела эмбрионального типа с большей вероятностью, чем гены зрелых антител, сохраняют основные структуры аминокислотной последовательности, характерные для индивидуумов в виде, таким образом, они с меньшей вероятностью будут распознаваться как последовательности из чужеродного источника при их терапевтическом применении у этого вида.
Как используют в рамках изобретения, термин "ключевые" остатки относится к определенным остаткам в вариабельной области, которые оказывают большее влияние на специфичность связывания и/или аффинность антитела, в частности гуманизированного антитела. Ключевой остаток включает, но не ограничивается ими, один или несколько из следующих: остаток, соседний с CDR, потенциальный участок гликозилирования (может представлять собой участок либо N-, либо O-гликозилирования), редкий остаток, остаток, способный взаимодействовать с антигеном, остаток, способный взаимодействовать с CDR, канонический остаток, контактный остаток между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи, остаток в зоне Vernier и остаток в области, которая перерывает вариабельную область тяжелой цепи CDR1, определенную по Chothia, и первую каркасную область тяжелой цепи, определенную по Kabat.
Как используют в рамках настоящего изобретения, "гуманизированное антитело" представляет собой антитело или его вариант, производное, аналог или фрагмент, которые иммуноспецифически связываются с представляющим интерес антигеном и которые содержат каркасную (FR) область, по существу имеющую аминокислотную последовательность антитела человека, и определяющую комплементарность область (CDR), по существу имеющую аминокислотную последовательность не являющегося человеческим антитела. Как используют в рамках изобретения, термин "по существу" в контексте CDR относится к CDR, имеющей аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности CDR антитела, не являющегося человеческим. Гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного, и как правило, двух, вариабельных доменов (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv), в которых все или по существу все из CDR-областей соответствуют CDR-областям не являющегося человеческим иммуноглобулина (т.е., донорного антитела) и все или по существу все из каркасных областей представляют собой каркасные области консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. В одном из вариантов осуществления гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, константной области иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит как легкую цепь, так и по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи. Антитело также может включать CH1-область, шарнирную область, CH2-, CH3- и CH4-области тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированную легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированную тяжелую цепь. Предпочтительно гуманизированное антитело содержит только гуманизированный вариабельный домен легкой цепи и/или гуманизированную тяжелую цепь.
Гуманизированное антитело может быть выбрано из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, включая, но не ограничиваясь ими, IgG1, IgG2, IgG и IgG4. Гуманизированное антитело может содержать последовательности из более чем одного класса или изотипа и конкретные константные домены могут быть выбраны, чтобы оптимизировать желаемые эффекторные функции с использованием способов, хорошо известных в данной области.
Каркасные области и CDR гуманизированного антитела не обязательно должны точно соответствовать исходным последовательностям, например, CDR донорного антитела или консенсусную каркасную область можно подвергать мутагенезу замещением, вставкой и/или делецией по меньшей мере одного аминокислотного остатка, так чтобы остаток CDR или каркасной области в этом участке не соответствовал ни донорному антителу, ни консенсусной каркасной области. В предпочтительном варианте осуществления такие мутации, однако, не являются обширными. Как правило, по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% остатков гуманизированного антитела будут соответствовать остаткам исходных последовательностей FR и CDR. Как используют в рамках изобретения, термин "консенсусная каркасная область" относится к каркасной области в консенсусной последовательности иммуноглобулина. Как используют в рамках изобретения, термин "консенсусная последовательность иммуноглобулина" относится к последовательности, образованной наиболее часто встречающимися аминокислотами (или нуклеотидами) в семействе родственных последовательностей иммуноглобулинов (см. например, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)). В семействе иммуноглобулинов каждое положение в консенсусной последовательности занимает аминокислота, встречающаяся наиболее часто в этом положении в семействе. Если две аминокислоты встречаются с равной частотой, любая из них может быть включена в консенсусную последовательность.
Как используют в рамках изобретения, зона "Vernier" относится к подгруппе каркасных остатков, которые могут корректировать структуру CDR и регулировать соответствие антигену, как описано Foote and Winter (1992, J. Mol. Biol. 224:487-499, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки). Остатки зоны Vernier образуют слой, лежащий под CDR, и они могут влиять на структуру CDR и аффинность антитела.
Термин "поливалентный связывающий белок" используют в настоящем описании для обозначения связывающего белка, содержащего два или более антигенсвязывающих центра. Поливалентный связывающий белок предпочтительно конструируют так, чтобы он имел три или более антигенсвязывающих центра и, как правило, он не является встречающимся в природе антителом. Термин "полиспецифический связывающий белок" относится к связывающему белку, способному связывать две или более родственных или неродственных мишени. Связывающие белки с двойным вариабельным доменом (DVD), как используют в рамках изобретения, представляют собой связывающие белки, которые содержат два или более антигенсвязывающих центра и представляют собой четырехвалентные или поливалентные связывающие белки. Такие DVD могут быть моноспецифическими, т.е. способными связывать один антиген, или полиспецифическими, т.е. способными связывать два или более антигенов. Связывающие белки с DVD, содержащие два полипептида DVD тяжелой цепи и два полипептида DVD легкой цепи, обозначают как DVD Ig. Каждая половина DVD Ig содержит полипептид DVD тяжелой цепи, и полипептид DVD легкой цепи, и два антигенсвязывающих центра. Каждый связывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем всего 6 CDR вовлечены в связывание антигена на антигенсвязывающий центр.
Как используют в рамках изобретения, термин "нейтрализующий" относится к нейтрализации биологической активности рецептора цитокинов, когда связывающий белок специфически связывается с рецептором цитокина. Предпочтительно, нейтрализующий связывающий белок представляет собой нейтрализующее антитело, связывание которого с hPRLR приводит к ингибированию биологической активности hPRLR. Предпочтительно нейтрализующий связывающий белок связывает hPRLR и снижает биологическую активность hPRLR по меньшей мере приблизительно на 20%, 40%, 60%, 80%, 85% или более. Ингибирование биологической активности hPRLR нейтрализующим связывающим белком можно оценивать путем измерения одного или нескольких индикаторов биологической активности PRLR, хорошо известных в данной области. Например, можно измерять ингибирование фосфорилирования PRLR, pSTAT5 или ERK1/2 в клеточной линии, экспрессирующей PRLR, например, клеточной линии карциномы молочной железы человека T47D. Альтернативно можно измерять ингибирование пролиферации экспрессирующих PRLR клеточных линий, например, про-B лимфоидных клеток Baf3, трансфицированных PRLR, клеток лимфомы крысы Nb2-11, клеток карциномы молочной железы человека MDA-MB-231-PRLR, трансфицированных PRLR или клеток рака молочной железы человека BT474.
Термин "активность" включает виды активности, такие как специфичность/аффинность связывания антитела с антигеном, например, антитела против hPRLR, которое связывается с антигеном hPRLR, и/или эффективность нейтрализации у антитела, например, антитела против hPRLR, связывание которого с hPRLR ингибирует биологическую активность hPRLR, например, ингибирует фосфорилирование PRLR, pSTAT5 или ERK1/2 в экспрессирующей PRLR клеточной линии, например, клеточной линии карциномы молочной железы человека T47D, или ингибирует пролиферацию экспрессирующих PRLR клеточных линий, например, про-B лимфоидных клеток Ba/F3, трансфицированных PRLR человека, клеток лимфомы крысы Nb2-11, клеток карциномы молочной железы человека MDA-MB-231-PRLR, трансфицированных PRLR или клеток рака молочной железы человека BT474е.
Термин "эпитоп" включает любую полипептидную детерминанту, способную специфически связывать белок, например, антитело или его антигенсвязывающую часть. В определенных вариантах осуществления эпитопные детерминанты включают химически активные поверхностные группы молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорил или сульфонил, и в определенных вариантах осуществления они могут иметь определенные трехмерные структурные характеристики и/или определенные зарядовые характеристики. В различных вариантах осуществления эпитоп может представлять собой линейный или последовательный эпитоп, т.е. линейную последовательность аминокислот первичной структуры антигена, т.е. PRLR. Альтернативно в других вариантах осуществления эпитоп может представлять собой конформационный эпитоп, имеющий определенную трехмерную форму, когда антиген принимает свою вторичную структуру. Например, конформационный эпитоп может содержать нелинейные, т.е. непоследовательные аминокислоты антигена.
В конкретном варианте осуществления эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается связывающим белком, например, антителом или его антигенсвязывающим участком. В определенных вариантах осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающая часть, называют специфически связывающимся с антигеном, когда он предпочтительно распознает свой антиген-мишень в комплексной смеси белков и/или макромолекул. В конкретном варианте осуществления эпитоп антигена, т.е. PRLR, включает аминокислотные остатки, находящиеся в пределах 4 ангстрем (Å) от связывающего белка, например, антитела или его антигенсвязывающего участка, когда связывающий белок связан с антигеном.
Термин "поверхностный плазмонный резонанс", как используют в рамках изобретения, относится к оптическому явлению, который позволяет анализ биоспецифических взаимодействий в реальном времени путем обнаружения изменений концентраций белка на биосенсорной матрице, например с использованием системы BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ). Для дальнейшего описания см. Jönsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jönsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; и Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.
Термин "Kon" (также "Kon", "kon"), как используют в рамках изобретения, относится к константе скорости ассоциации для ассоциации антитела с антигеном с образованием комплекса антитело/антиген, как известно в данной области.
Термин "koff", как используют в рамках изобретения, относится к константе скорости диссоциации для диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген, как известно в данной области.
Термин "KD", как используют в рамках изобретения, относится к константе диссоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген, как известно в данной области.
Термин "меченый связывающий белок", как используют в рамках изобретения, относится к белку с включенной меткой, которая обеспечивает идентификацию связывающего белка. Предпочтительно, метка представляет собой поддающийся обнаружению маркер, как например, включение радиоактивно меченной аминокислоты или присоединение к полипептиду биотинильных частей, которые можно обнаруживать меченым авидином (например, стрептавидин, содержащий флуоресцентный маркер или обладающий ферментативной активностью, которая может быть обнаружена оптическими или колориметрическими способами). Примеры меток полипептидов включают, но не ограничиваются ими, следующие: радиоизотопы или радионуклиды (например, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho или 153Sm); флуоресцентные метки (например, FITC, родамин, лантаноидные люминофоры), ферментные метки (например, пероксидаза хрена, люцифераза, щелочная фосфатаза); хемилюминесцентные маркеры; биотинильные группы; определенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности "лейциновых молний", участки связывания для вторичных антител, связывающие металл домены, эпитопные метки); и магнитные средства, такие как хелаты гадолиния.
Термин "конъюгат антитело-лекарственное средство" или "ADC" относится к связывающему белку, такому как антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, химически связанный с одним или несколькими химическим средством(ами), которое необязательно может представлять собой терапевтическое или цитотоксическое средство. Примеры средств, которые можно использовать в ADC по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы митоза, противоопухолевые антибиотики, иммуномодулирующие средства, векторы для генной терапии, алкилирующие средства, антиангиогенные средства, антиметаболиты, борсодержащие средства, хемопротективные средства, гормоны, антигормональные средства, кортикостероиды, фотоактивные лекарственные средства, олигонуклеотиды, радионуклидные средства, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы тирозинкиназы и радиосенсибилизирующие средства.
Термин "средство" или "лекарственное средство" используют в настоящем описании для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта, полученного из биологических материалов.
Термин "цитотоксин" или "цитотоксическое средство" включает любое средство, которое является вредоносным для (например, уничтожает) клеток. В одном варианте осуществления изобретения антитело, описанное в настоящем описании, конъюгировано с цитотоксическим средством.
Термины "кристалл" и "кристаллизованный", как используют в рамках изобретения, относятся к антителу или его антигенсвязывающей части, которые существуют в форме кристалла. Кристаллы представляют собой одну из форм твердого состояния вещества, которая отличается от других форм, таких как аморфное твердое состояние или жидкокристаллическое состояние. Кристаллы состоят из регулярных, повторяющихся, трехмерных структур из атомов, ионов, молекул (например, белков, таких как антитела), или молекулярных агрегатов (например, комплексов антиген/антитело). Эти трехмерные структуры упорядочены в соответствии с определенной математической зависимостью, которая хорошо понятна в данной области. Основное звено, или структурный блок, который повторяется в кристалле, называют асимметричным элементом. Повторение асимметричного элемента в порядке, который придает данную четко определенную кристаллографическую симметрию, обеспечивает "элементарную ячейку" кристалла. Повторение элементарной ячейки посредством правильного сдвига во всех трех измерениях приводит к кристаллу. См. Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999).
Термин "полинуклеотид", как используют в рамках настоящего изобретения, означает полимерную форму из двух или более нуклеотидов: либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов, или модифицированную форму нуклеотидов любого типа. Термин включает одноцепочечную и двухцепочечную формы ДНК, но предпочтительно он представляет собой двухцепочечную ДНК.
Термин "выделенный полинуклеотид", как используют в рамках настоящего изобретения, означает полинуклеотид (например, геномного происхождения, из кДНК, или синтетического происхождения, или некоторые их комбинации) который, исходя из его происхождения, не ассоциирован со всем полинуклеотидом, или частью, с которыми "выделенный полинуклеотид" встречается в природе; функционально связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе; или не встречается в природе в качестве части более крупной последовательности.
Как используют в рамках изобретения, термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним из типов вектора является "плазмида", которая относится к кольцевой двухцепочечной петле ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где в вирусный геном могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Некоторые векторы способны к аутосомной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут встраиваться в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и, тем самым, реплицироваться вместе с геномом хозяина. Более того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы обозначают в настоящем описании как "рекомбинантные экспрессирующие векторы" (или просто, "экспрессирующие векторы"). Как правило, экспрессирующие векторы, применимые в способах рекомбинантных ДНК, часто имеют форму плазмид. В настоящем описании, термины "плазмида" и "вектор" могут быть использованы взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако подразумевают, что изобретение включает другие формы экспрессирующих векторов, такие как вирусные векторы (например, ретровирусы с дефектом репликации, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.
Термин "функционально связанный" относится к смежному расположению, где описываемые компоненты имеют взаимосвязь, позволяющую им функционировать предполагаемым для них образом. Последовательность контроля, "функционально связанную" с кодирующей последовательностью, лигируют таким образом, чтобы достигать экспрессии кодирующей последовательности в условиях, совместимых с последовательностями контроля. "Функционально связанные" последовательности включают как последовательности контроля экспрессии, которые являются смежными с представляющим интерес геном, так и последовательности контроля экспрессии, которые осуществляют транс-регуляцию, или действуют на расстоянии для регуляции представляющего интерес гена. Термин "последовательность контроля экспрессии", как используют в рамках изобретения, относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Последовательности контроля экспрессии включают соответствующие последовательности инициации, терминации транскрипции, промоторные и энхансерные последовательности; сигналы эффективного процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые усиливают эффективность трансляции (т.е., консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые усиливают стабильность белка; и если желательно, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Тип таких последовательностей контроля отличается, в зависимости от организма хозяина; в прокариотах такие последовательности контроля, как правило, включают промотор, участок связывания рибосом и последовательность терминации транскрипции; у эукариот, как правило, такие последовательности контроля включают промоторы и последовательность терминатора транскрипции. Термин "последовательности контроля" включает компоненты, наличие которых необходимо для экспрессии и процессинга, и также он может включать дополнительные компоненты, наличие которых является преимущественным, например, лидерные последовательности и последовательности партнера по слиянию. Белковые конструкции по настоящему изобретению можно экспрессировать и очищать с использованием экспрессирующих векторов и клеток-хозяев, известных в данной области, включая экспрессирующие кассеты, векторы, рекомбинантные клетки-хозяева и способы рекомбинантной экспрессии и протеолитического процессинга рекомбинантных полибелков и пребелков с одной открытой рамки считывания (например, WO 2007/014162, включенная в настоящее описание в качестве ссылки).
"Трансформация", как определяют в рамках изобретения, относится к любому процессу, посредством которого ДНК проникает в клетку-хозяина. Трансформация может происходить в природных или искусственных условиях с использованием различных способов, хорошо известных в данной области. Трансформация может быть основана на любом способе встраивания последовательностей чужеродных нуклеиновых кислот в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина. Способ выбирают, исходя из трансформируемой клетки-хозяина, и он может включать, но не ограничиваться ими, вирусную инфекцию, электропорацию, липофекцию и бомбардировку частицами. Такие "трансформированные" клетки включают стабильно трансформированные клетки, в которых встроенная ДНК способна реплицироваться либо в качестве аутосомно реплицирующейся плазмиды, либо в качестве части хромосомы хозяина. Также они включают клетки, которые временно экспрессируют встроенную ДНК или РНК в течение ограниченных периодов времени.
Термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин"), как используют в рамках настоящего изобретения, относится к клетке, в которую вводят экзогенную ДНК. Должно быть понятно, что такие термины относятся не только к конкретной рассматриваемой клетке, но и к потомкам такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут происходить определенные модификации вследствие либо мутации, либо влияний окружающей среды, такие потомки, в действительности, могут не быть идентичными родительской клетке, однако они, тем не менее, включены в объем термина "клетка-хозяин", как используют в рамках изобретения. Предпочтительно клетки-хозяева включают прокариотические и эукариотические клетки, выбранные из любого из царств живых организмов. Предпочтительные эукариотические клетки включают одноклеточные организмы, клетки грибов, растений и животных. Наиболее предпочтительные клетки-хозяева включают, но не ограничиваются ими, линию прокариотических клеток E.coli; клеточные линии млекопитающих CHO, HEK 293 и COS; клеточную линию насекомых Sf9; и клетки грибов Saccharomyces cerevisiae.
Для получения рекомбинантных ДНК, синтеза олигонуклеотидов и культивирования тканей и трансформации (например, электропорация, липофекция) можно использовать стандартные способы. Ферментативные реакции и способы очистки можно проводить в соответствии с указаниями изготовителя или как обычно проводят в данной области, или как описано в настоящем описании. Указанные выше способы и процессы можно выполнять, главным образом, в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в данной области, и как описано в различных общих и более конкретных ссылках, которые цитированы и рассмотрены на протяжении настоящего описания. См. например, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), которая включена в настоящее описание в качестве ссылки для любых целей).
"Трансгенный организм", как известно в данной области и как используют в рамках настоящего изобретения, относится к организму, имеющему клетки, которые содержат трансген, где трансген, введенный в организм (или родительский организм) экспрессирует полипептид, не экспрессирующийся в организме в природе. "Трансген" представляет собой конструкцию ДНК, которая стабильно и функционально встроена в геном клетки, из которой развивается трансгенный организм, направляющую экспрессию кодируемого продукта гена в одном или нескольких типах клеток или тканей трансгенного организма.
Термины "регулирует" и "модулирует" используют взаимозаменяемо, и, как используют в рамках изобретения, они относятся к переключению или изменению активности представляющей интерес молекулы (например, биологической активности hPRLR). Модулирование может представлять собой повышение или снижение интенсивности определенной активности или функции представляющей интерес молекулы. Иллюстративные виды активности и функции молекулы включают, но не ограничиваются ими, характеристики связывания, ферментативную активность, активацию клеточного рецептора и передачу сигнала.
Соответственно, термин "модулятор", как используют в рамках изобретения, представляет собой соединение, способное переключать или изменять активность или функцию представляющей интерес молекулы (например, биологическую активность hPRLR). Например, модулятор может вызывать повышение или снижение интенсивности определенной активности или функции молекулы по сравнению с интенсивностью активности или функции, наблюдаемой в отсутствии модулятора. В определенных вариантах осуществления модулятор представляет собой ингибитор, который снижает интенсивность по меньшей мере одного вида активности или функции молекулы. Иллюстративные ингибиторы включают, но не ограничиваются ими, белки, пептиды, антитела, пептидные антитела, углеводы или низкомолекулярные органические соединения. Пептидные антитела описаны, например, в WO 01/83525.
Термин "агонист", как используют в рамках изобретения, относится к модулятору, который при контактировании с представляющей интерес молекулой вызывает повышение интенсивности определенного вида активности или функции молекулы по сравнению с интенсивностью вида активности или функции, наблюдаемой в отсутствие агониста. Конкретные представляющие интерес агонисты могут включать, но не ограничиваться ими, полипептиды hPRLR, или полипептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, или любые другие молекулы, которые связываются с hPRLR.
Термины "антагонист" или "ингибитор", как используют в рамках изобретения, относятся к модулятору, который при контактировании с представляющей интерес молекулой вызывает снижение интенсивности определенного вида активности или функции молекулы по сравнению с интенсивностью вида активности или функции, наблюдаемой в отсутствие антагониста. Конкретные представляющие интерес антагонисты включают антагонисты, которые блокируют или модулируют биологическую или иммунологическую активность hPRLR. Антагонисты и ингибиторы hPRLR человека могут включать, но не ограничиваться ими, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы или любые другие молекулы, которые связываются с hPRLR.
Термин "ингибирует связывание с пролактином" относится к способности связывающего белка препятствовать связыванию пролактина ("PRL") с hPRLR. Такое ингибирование связывания с пролактином может привести к уменьшению или устранению биологической активности, опосредуемой связыванием пролактина с hPRLR.
Как используют в рамках изобретения, термин "эффективное количество" относится к количеству лекарственного средства, которое является достаточным для снижения или смягчения тяжести и/или уменьшения длительности нарушения или одного или нескольких его симптомов, предотвращения прогрессирования нарушения, обеспечения регрессии нарушения, предотвращения рецидива, развития, возникновения или прогрессирования одного или нескольких симптомов, ассоциированных с нарушением, детекции нарушения, или усиления или улучшения профилактического или терапевтического эффекта(ов) другой терапии (например, профилактического или терапевтического средства).
Термин "образец", как используют в рамках изобретения, применяют в его наиболее широком значении. "Биологический образец", как используют в рамках изобретения, включает, но не ограничивается ими, любое количество материала из живого существа или ранее живого существа. Такие живые существа включают, но не ограничиваются ими, людей, мышей, крыс, обезьян, собак, кроликов и других животных. Такие материалы включают, но не ограничиваются ими, кровь сыворотку, мочу, синовиальную жидкость, клетки, органы, ткани, костный мозг, лимфатические узлы и селезенку.
Как используют в рамках изобретения, термин "LFA102" относится к гуманизированному антителу против PRLR подтипа IgG1-каппа, описанному в WO 2008022295 A2 (Novartis) и содержащему тяжелую цепь, указанную в SEQ ID NO: 156, и легкую цепь, указанную в SEQ ID NO: 157. LFA102 связывается с предполагаемой областью димеризации PRLR не конкурирующим с лигандом образом и ингибирует индуцируемую PRL передачу сигнала. LFA102 связывается с мембранным проксимальным D2-доменом PRLR, который, как полагают, содержит димеризующуюся поверхность рецептора. PRLR не связывается с доменом D1 (см., например, Damiano et al., 2013, Molec.Cancer. Therapeuics, 12:295-305). По существу, хотя LFA102 способно ингибировать димеризацию PRLR, поскольку LFA102 не проявляет прямого контактирования с D1-доменом PRLR, который содержит основную часть лиганд-связывающего кармана, LFA102, по-видимому, обеспечивает одновременное связывание пролактина с PRLR (см., например, Damiano et al., 2013, Molec.Cancer. Therapeuics, 12:295-305 и van et al., 2010, J. Mol. Biol., 404:112-26).
I. Антитела, которые связывают hPRLR человека
Один аспект настоящего изобретения относится к выделенным моноклональным антителам мыши, или к их антигенсвязывающим частям, которые связываются с PRLR с высокой аффинностью, медленной скоростью диссоциации и высокой нейтрализующей способностью. Второй аспект изобретения относится к химерным антителам, которые связывают PRLR. Третий аспект изобретения относится к гуманизированным антителам или их антигенсвязывающим частям, которые связывают PRLR. Предпочтительно, антитела или их части представляют собой выделенные антитела. Предпочтительно, антитела по изобретению представляют собой нейтрализующие антитела против PRLR человека.
A. Способ получения антител против PRLR
Антитела по настоящему изобретению можно получать любым из ряда способов, известных в данной области.
1. Моноклональные антитела против PRLR с использованием технологии гибридом
Моноклональные антитела можно получать с использованием широкого множества способов, известных в данной области, включая применение гибридом, рекомбинантные технологии и технологии фагового дисплея или их сочетание. Например, моноклональные антитела можно получать с использованием способов гибридом, включающих способы, известные в данной области и описанные, например, в Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (указанные ссылки включены в качестве ссылки в полном объеме). Термин "моноклональное антитело", как используют в рамках изобретения, не ограничивается антителами, продуцируемыми технологией гибридом. Термин "моноклональные антитело" относится к антителу, которое получено из одного клона, включающего любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не к способу, посредством которого оно получено.
Способы продуцирования и скрининга специфических антител с использованием технологии гибридом являются общепринятыми и хорошо известны в данной области. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам получения моноклональных антител, а также к антителам, продуцируемым способом, включающим культивирование клетки гибридомы, секретирующей антитело по изобретению, где, предпочтительно, гибридома получена слиянием спленоцитов, выделенных из мыши, иммунизированной антигеном по изобретению, с клетками миеломы, а затем скрининг гибридом, полученных слиянием, в отношении клонов гибридомы, которые секретируют антитело, способное связывать полипептид по изобретению. (См. пример 1). В кратком изложении, мышей можно иммунизировать антигеном PRLR. В предпочтительном варианте осуществления для стимуляции иммунного ответа антиген PRLR вводят с адъювантом. Такие адъюванты включают полный или неполный адъювант Фрейнда, RIBI (мурамилдипептиды) или ISCOM (иммуностимулирующие комплексы). Такие адъюванты могут защищать полипептид от быстрого распространения путем изоляции в локальном депо, или они могут содержать вещества, которые стимулируют секрецию хозяином фактов, которые являются хемотаксическими факторами для макрофагов и других компонентов иммунной системы. Предпочтительно, если вводят полипептид, схема иммунизации включает два или более введений полипептида, рассредоточенных на нескольких недель.
После иммунизации животного антигеном PRLR, из животного можно получать антитела и/или антителопродуцирующие клетки. Сыворотку, содержащую антитело против PRLR, получают из животного путем забора крови или умерщвления животного. Сыворотку можно использовать в таком виде, как ее получают из животного, из сыворотки можно получать фракцию иммуноглобулинов или из сыворотки можно очищать антитела против PRLR. Сыворотка или иммуноглобулины, полученные таким образом, являются поликлональными, таким образом, имеющими гетерогенный набор свойств.
После выявления иммунного ответа в сыворотке мыши выявляют, например, антитела, специфичные к антигену PRLR, селезенку мышей извлекают и выделяют спленоциты. Затем спленоциты подергают слиянию хорошо известными способами с любыми пригодными клетками миеломы, например, клетками из клеточной линии SP20, доступной от ATCC. Гибридомы подвергают селекции и клонируют способом лимитирующих разведений. Затем клоны гибридомы оценивают способами, известными в данной области, в отношении клеток, которые секретируют антитела, способные связывать PRLR. Асцитную жидкость, которая, как правило, содержит высокие уровни антител, можно получать иммунизацией мышей положительными клонами гибридом.
В другом варианте осуществления из иммунизированного животного можно получать антителопродуцирующие иммортализованные гибридомы. После иммунизации животного умерщвляют и B-клетки селезенки подвергают слиянию с иммортализованными клетками миеломы, как хорошо известно в данной области. См., например, Harlow and Lane, выше. В предпочтительном варианте осуществления клетки миеломы не секретируют полипептиды иммуноглобулинов (не секретирующая клеточная линия). После слияния и селекции на антибиотике, гибридомы подвергают скринингу с использованием PRLR, или его части, или клетки, экспрессирующей PRLR. В предпочтительном варианте осуществления исходный скрининг проводят с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или радиоиммунного анализа (RIA), предпочтительно ELISA. Пример скрининга с помощью ELISA предоставлен в WO 00/37504, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
Гибридомы, продуцирующие антитело против PRLR, подвергают селекции, клонируют и далее подвергают скринингу в отношении требуемых признаков, включая активный рост гибридомы, высокую продукцию антител и требуемые характеристики антитела, как дополнительно рассмотрено ниже. Гибридомы можно культивировать и размножать in vivo у сингенных животных, у животных, которые лишены иммунной системы, например, у мышей nude, или в клеточной культуре in vitro. Способы селекции, клонирования и размножения гибридом хорошо известны специалистам в данной области.
В предпочтительном варианте осуществления гибридомы представляют собой гибридомы мыши, как описано выше. В другом предпочтительном варианте осуществления получают гибридомы видов не человека и не мыши, таких как крысы, овцы, свиньи, козы, крупный рогатый скот или лошади. В другом варианте осуществления, гибридомы представляют собой гибридомы человека, в которых несекретирующую миелому человека подвергают слиянию с клеткой человека, экспрессирующей антитело против PRLR.
Фрагменты антител, которые распознают определенные эпитопы, можно получать известными способами. Например, Fab- и F(ab')2-фрагменты по изобретению можно получать протеолитическим расщеплением молекул иммуноглобулинов с использованием ферментов, таких как папаин (для получения Fab-фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')2-фрагментов). F(ab')2-фрагменты содержат вариабельную область, константную область легкой цепи и CH1-домен тяжелой цепи.
2. Моноклональные антитела против PRLR с использованием SLAM
В другом аспекте изобретения получают рекомбинантные антитела из единичных выделенных лимфоцитов с использованием способа, называемого в данной области способом антител из подвергнутых селекции лимфоцитов (SLAM), как описано в патенте США № 5627052, публикации PCT WO 92/02551 и Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848. В этом способе отдельные клетки, секретирующие представляющие интерес антитела, например, лимфоциты, полученные из любого из иммунизированных животных, описанных в разделе 1, подвергают скринингу с использованием анализа антиген-специфических гемолитических бляшек, где антиген PRLR, субъединицу PRLR, или его фрагмент, связывают с эритроцитами овцы с использованием линкера, такого как биотин, и используют для идентификации отдельных клеток, которые секретируют антитела со специфичностью к PRLR. После идентификации представляющих интерес секретирующих антитело клеток из этих клеток получают кДНК вариабельных областей тяжелой и легкой цепей посредством ПЦР с обратной транскриптазой, и эти вариабельные участки затем можно экспрессировать связанными соответствующими константными участками иммуноглобулинов (например, константными участками человека) в клетках-хозяевах млекопитающих, таких как клетки COS или CHO. Затем клетки-хозяева, трансфицированные амплифицированными последовательностями иммуноглобулинов, полученных из подвергнутых селекции in vivo лимфоцитов, можно подвергать дальнейшему анализу и селекции in vitro, например, с использованием пэннинга трансфицированных клеток для выделения клеток, экспрессирующих антитела к PRLR. Амплифицированные последовательности иммуноглобулинов можно далее подвергать манипулированию in vitro, например, способами созревания аффинности in vitro, такими как способы, описанные в публикации PCT WO 97/29131 и публикации PCT WO 00/56772.
3. Получение моноклональных антител против PRLR с использованием трансгенных животных
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитела получают иммунизацией не являющегося человеком животного, содержащего часть, или весь, локуса иммуноглобулинов человека, антигеном PRLR. В предпочтительном варианте осуществления не являющееся человеком животное представляет собой трансгенную мышь XENOMOUSE, полученную способами инженерии линию мышей, которая содержит крупные фрагменты локусов иммуноглобулинов человека и является дефицитной по продукции антител мыши. См., например, Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) и патенты США № 5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598 и 6130364. Также см. WO 91/10741, опубликованную 25 июля 1991 года, WO 94/02602, опубликованную 3 февраля 1994 года, WO 96/34096 и WO 96/33735, обе из которых опубликованы 31 октября 1996 года, WO 98/16654, опубликованную 23 апреля 1998 года, WO 98/24893, опубликованную 11 июня 1998 года, WO 98/50433, опубликованную 12 ноября 1998 года, WO 99/45031, опубликованную 10 сентября 1999 года, WO 99/53049, опубликованную 21 октября 1999 года, WO 00/09560, опубликованную 24 февраля 2000 года и WO 00/037504, опубликованную 29 июня 2000 года. У трансгенной мыши XENOMOUSE продуцируется набор полностью человеческих антител, подобный набору взрослого человека, и образуются антигенспецифические Mab человека. Трансгенная мышь XENOMOUSE содержит приблизительно 80% набора антител человека вследствие введения фрагментов YAC, размером, составляющим миллионы пар оснований, с зародышевой конфигурацией локусов тяжелой цепи человека и локусов легкой цепи человека. См. Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), описания которых включены в настоящее описание в качестве ссылок.
4. Получение моноклональных антител против PRLR с использованием библиотек рекомбинантных антител
Также для получения антител по изобретению можно использовать способы in vitro, где библиотеку антител подвергают скринингу для идентификации антитела, имеющего требуемую специфичность связывания. Способы такого скрининга библиотек рекомбинантных антител хорошо известны в данной области и включают способы, описанные, например, в Ladner et al., патент США № 5223409; Kang et al., публикация PCT № WO 92/18619; Dower et al., публикация PCT № WO 91/17271; Winter et al., публикация PCT № WO 92/20791; Markland et al., публикация PCT № WO 92/15679; Breitling et al., публикация PCT № WO 93/01288; McCafferty et al., публикация PCT № WO 92/01047; Garrard et al., публикация PCT № WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; и Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982, публикации патентной заявки США 20030186374, и публикации PCT № WO 97/29131, содержание каждого из которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Библиотека рекомбинантных антител может быть из любого индивидуума, иммунизированного PRLR или частью PRLR, такой как внеклеточный домен. Альтернативно, библиотека рекомбинантных антител может быть из наивного индивидуума, т.е. индивидуума, которого не иммунизировали PRLR, такая как библиотека из человека, которого не иммунизировали PRLR человека. Антитела по изобретению отбирают скринингом библиотеки рекомбинантных антител с помощью пептида, содержащего PRLR человека, для селекции тем самым антител, которые распознают PRLR. Способы проведения такого скрининга и селекции хорошо известны в данной области, как описано в ссылках в предыдущем абзаце. Для отбора антител по изобретению, имеющих конкретную аффинность связывания в отношении hPRLR, таких как антитела, которые диссоциируют от PRLR человека с конкретной константой скорости Koff, можно использовать известный в данной области способ поверхностного плазмонного резонанса для отбора антител, имеющих желаемую константу скорости Koff. Для отбора антител по изобретению, имеющих конкретную нейтрализующую активность в отношении hPRLR, таких как антитела с конкретной IC50, можно использовать стандартные известные в данной области способы оценки ингибирования активности hPRLR.
В одном аспекте изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающей части, которые связывают PRLR человека. Предпочтительно, антитело представляет собой нейтрализующее антитело. В различных вариантах осуществления антитело представляет собой рекомбинантное антитело или моноклональное антитело.
Например, антитела по настоящему изобретению также можно получать с использованием различных способов фагового дисплея, известных в данной области. В способах фагового дисплея функциональные домены антитела экспонируют на поверхности фаговых частиц, которые обладают полинуклеотидными последовательностями, кодирующими их. В частности, такой фаг можно использовать для экспонирования антигенсвязывающих доменов, экспрессированных из библиотеки набора антител или комбинаторной библиотеки антител (например, человека или мыши). Фаг, экспрессирующий антигенсвязывающий домен, который связывает представляющий интерес антиген, можно подвергать селекции и идентифицировать с помощью антигена, например, с использованием меченого антигена или антигена, связанного или фиксированного на твердой поверхности или гранулах. Фаг, используемый в этих способах, как правило, представляет собой нитевидный фаг, включающий fd и M13, связывающий домены, экспрессируемые из фага, с доменами антитела Fab, Fv или стабилизированного дисульфидом Fv, рекомбинантно слитыми с фаговым белком гена III или гена VIII. Примеры способов фагового дисплея, которые можно использовать для получения антител по настоящему изобретению, включают способы, описанные в Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); заявке PCT № PCT/GB91/01134; публикациях PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; и патентах США № 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 и 5969108, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Как описано в указанных выше ссылках, после селекции фага, кодирующие области антитела из фага можно выделять и использовать для получения целых антител, включая антитела человека, или любого другого желаемого антигенсвязывающего фрагмента, и экспрессировать в любом желательном хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжи и бактерии, например, как подробно описано ниже. Например, также можно использовать технологии рекомбинантной продукции Fab-, Fab'- и F(ab')2-фрагментов с использованием способов, известных в данной области, таких как способы, описанные в публикации PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); и Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); и Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (указанные ссылки включены в качестве ссылок в полном объеме). Примеры технологий, которые можно использовать для получения одноцепочечных Fv и антител, включают способы, описанные в патентах США 4946778 и 5258498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); и Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).
Альтернативно скринингу библиотек рекомбинантных антител посредством фагового дисплея для идентификации антител с двойной специфичностью по изобретению можно использовать другие известные в данной области способы скрининга больших комбинаторных библиотек. Одним типом альтернативной экспрессирующей системы является система, в которой библиотека рекомбинантных антител экспрессируется в качестве слитых конструкций РНК-белок, как описано в публикации международной заявки № WO 98/31700, Szostak and Roberts, и Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302. В этой системе, проводят ковалентное слияние между мРНК и пептидом или белком, который кодируется посредством трансляции in vitro синтетических мРНК, которые имеют пуромицин, пептидильный акцепторный антибиотик, на их 3'-конце. Таким образом, комплексную смесь мРНК (например, комбинаторную библиотеку) можно обогащать конкретной мРНК, исходя из свойств конкретного пептида или белка, например, антитела или его части, таких как связывание антитела или его части, с антигеном с двойной специфичностью. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или их части, выделенные путем скрининга таких библиотек, можно экспрессировать рекомбинантными способами, как описано выше (например, в клетках-хозяевах млекопитающих) и, более того, их можно подвергать дальнейшему созреванию аффинности либо посредством дополнительных раундов скрининга слитых конструкций мРНК-пептид, в которых в исходно отобранную последовательность(и) были внесены мутации, либо другими способами созревания аффинности in vitro для рекомбинантных антител, как описано выше.
В другом подходе антитела по настоящему изобретению также можно получать с использованием способов дрожжевого дисплея, известных в данной области. В способах дрожжевого дисплея используют способы генетики для связывания доменов антител с клеточной стенкой дрожжей и экспонирования их на поверхности дрожжей. В частности, такие дрожжи можно использовать для дисплея антигенсвязывающих доменов, экспрессируемых из библиотек наборов антител или комбинаторных библиотек антител (например, человека или мыши). Примеры способов дрожжевого дисплея, которые можно использовать для получения антител по настоящему изобретению, включают способы, описанные Wittrup, et al. (патент США № 6699658, включенный в настоящее описание в качестве ссылки).
B. Продуцирование рекомбинантных антител против PRLR
Антитела по настоящему изобретению можно получать любым из множества способов, известных в данной области, например, экспрессией из клеток-хозяев, где экспрессирующий вектор(ы), кодирующий тяжелую и легкую цепи, трансфицирован(ы) в клетку-хозяина стандартными способами. Подразумевают, что различные формы термина "трансфекция" включают широкое множество способов, обычно используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорацию, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию DEAE-декстраном и т.п. Хотя можно экспрессировать антитела по изобретению как в прокариотических, так и в эукариотических клетках-хозяевах, экспрессия антител эукариотических клетках является предпочтительной, и наиболее предпочтительной в клетках-хозяевах млекопитающих, поскольку в таких эукариотических клетках (и, в частности, клетках млекопитающих) с большей вероятностью, чем в прокариотических клетках, соберется и будет секретироваться надлежащим образом свернутое и иммунологически активное антитело.
Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают клетки яичника китайского хомяка (клетки CHO) (включая клетки dhfr- CHO, описанные в Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, используемые с селективным маркером DHFR, например, как описано в R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела получают культивированием клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для обеспечения экспрессии антитела в клетках-хозяевах, или, более предпочтительно, секреции антитела в культуральную среду, в которой клетки-хозяева выращивают. Антитела можно выделять из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белка.
Также клетки-хозяева можно использовать для получения функциональных фрагментов антитела, таких как Fab-фрагменты или молекулы scFv. Понятно, что варианты указанного выше способа находятся в объеме настоящего изобретения. Например, может быть желательной трансфекция клетки-хозяина ДНК, кодирующей функциональные фрагменты либо легкой цепи и/либо тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению. Также можно использовать технологию рекомбинантных ДНК для удаления некоторой части или всей ДНК, кодирующей любую или обе из легкой цепи и тяжелой цепи, которая не является необходимой для связывания представляющих интерес антигенов. Молекулы, экспрессированные с таких укороченных молекул ДНК, также охватываются антителами по изобретению. Кроме того, можно получать бифункциональные антитела, в которых одна тяжелая и одна легкая цепь представляет собой антитело по изобретению, а другая тяжелая и легкая цепь является специфичной к антигену, отличному от представляющих интерес антигенов, путем сшивания антитела по изобретению со вторым антителом стандартными способами химического сшивания.
В предпочтительной системе для рекомбинантной экспрессии антитела или его антигенсвязывающей части по изобретению, рекомбинантный экспрессирующий вектор, кодирующий как тяжелую цепь антитела, так и легкую цепь антитела, вводят в клетки dhfr-CHO опосредуемой фосфатом кальция трансфекцией. В рекомбинантном экспрессирующем векторе каждый из генов тяжелой и легкой цепей антитела функционально связывают с регуляторными элементами энхансер CMV/промотор AdMLP для запуска высоких уровней транскрипции генов. Рекомбинантный экспрессирующий вектор также содержит ген DHFR, который позволяет селекцию клеток CHO, трансфицированных вектором, с использованием селекции с метотрексатом/амплификации. Отобранные трансформированные клетки-хозяева культивируют для обеспечения экспрессии тяжелой и легкой цепей антитела и интактное антитело выделяют из культуральной среды. Для получения рекомбинантного экспрессирущего вектора, трансфекции клеток-хозяев, селекции трансформантов, культивирования клеток-хозяев и выделения антитела из культуральной среды используют стандартные способы молекулярной биологии. Кроме того, изобретение относится к способу синтеза рекомбинантного антитела по изобретению путем культивирования клетки-хозяина по изобретению в подходящей культуральной среде до тех пор, пока не синтезируется рекомбинантное антитело по изобретению. Кроме того, способ может включать выделение рекомбинантного антитела из культуральной среды.
1. Гуманизированные антитела против PRLR
В таблице 5 приведен перечень аминокислотных последовательностей областей VH и VL предпочтительных гуманизированных антител против hPRLR по изобретению.
Перечень аминокислотных последовательностей областей VH и VL
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-L1
CDR-L2
CDR-L3
CDR-L1
CDR-L2
CDR-L3
CDR-L1
CDR-L2
CDR-L3
CDR-L1
CDR-L2
CDR-L3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-L1
CDR-L2
CDR-L3
CDR-L1
CDR-L2
CDR-L3
CDR-L1
CDR-L2
CDR-L3
ID NО:
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-L1
CDR-L2
CDR-L3
CDR-L1
CDR-L2
CDR-L3
CDR-L1
CDR-L2
CDR-L3
ID NО:
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
Как используют в рамках изобретения, термин "Ab1" относится к антителу, содержащему (i) одну вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 45; и (ii) одну вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54.
Как используют в рамках изобретения, термин "Ab2" относится к антителу, содержащему (i) одну вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 61; и (ii) одну вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 69.
Как используют в рамках изобретения, термин "Ab3" относится к антителу, содержащему (i) одну вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 76; и (ii) одну вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82 и SEQ ID NO: 83.
Как используют в рамках изобретения, термин "Ab4" относится к антителу, содержащему (i) одну вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 и SEQ ID NO: 123; и (ii) одну вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95 и SEQ ID NO: 96.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52, Ab53, Ab54 и Ab55, имеющим последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, как указано в таблице 6 ниже:
Гуманизированные антитела против PRLR и их последовательности
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab14, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab15, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab16, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab17, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab18, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab19, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab20, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab21, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab22, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab23, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab24, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab25, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab26, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab27, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab28, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab29, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab30, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab31, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab32, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab33, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab34, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab35, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab36, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab37, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab38, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab39, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab40, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab41, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab42, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab43, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab44, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab45, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab46, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab47, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab48, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab49, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab50, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab51, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab52, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab53, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 153; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab54, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 154; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу Ab55, содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 155; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139.
Указанные выше выделенные последовательности CDR антитела против PRLR служат основой нового семейства связывающих PRLR белков, выделенных в соответствии с настоящим изобретением и содержащих полипептиды, которые включают последовательности CDR, приведенные в таблице 7a или 7b ниже. Для получения и отбора CDR по изобретению, имеющих предпочтительную активность связывания и/или нейтрализации PRLR в отношении hPRLR, можно использовать стандартные способы, известные в данной области, чтобы получить связывающие белки настоящему изобретению и оценить характеристики этих связывающих белков в отношении связывания и/или нейтрализации PRLR, включая, но не ограничиваясь ими, белки, конкретно описанные в настоящем описании.
Консенсусные аффинные CDR-лиганды PRLR на основе антител мыши (альтернативные остатки приведены ниже каждого положения аминокислоты; - указывает на то, что остаток может отсутствовать)
Консенсусные аффинные CDR-лиганды PRLR на антителах мыши и гуманизированных антителах (альтернативные остатки приведены ниже каждого положения аминокислоты; - указывает на то, что остаток может отсутствовать)
2. Химерные антитела против PRLR
Химерное антитело представляет собой молекулу антитела, в которой различные части происходят из различных видов животных, такую как антитела, имеющие вариабельную область, происходящую из моноклонального антитела мыши, и константную область иммуноглобулина человека. Способы получения химерных антител известны в данной области. См. например, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; патенты США № 5807715; 4816567 и 4816397, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. Кроме того, можно использовать способы, разработанные для получения "химерных антител" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454, каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме) путем сплайсинга генов из молекулы антитела мыши с соответствующей антигенной специфичностью с генами из молекулы антитела человека с соответствующей биологической активностью.
В конкретном варианте осуществления химерное антитело по изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 113; SEQ ID NO: 114; SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO: 117; SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119 или SEQ ID NO: 120, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 104; SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107; SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; SEQ ID NO: 110 или SEQ ID NO: 111, указанные в таблице 8 ниже.
Последовательности вариабельной области антитела мыши против PRLR
Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи для антител мыши Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12 и Ab13 представлено на фиг.1 и 3. Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой цепи для антител мыши Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12 и Ab13 представлено на фиг.2 и 4.
Как используют в рамках изобретения, термин "Ab5" относится к антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 112, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 103. Как используют в рамках изобретения, термин "chAb5" относится к химерному антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 112, аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 103,, и аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 12.
Как используют в рамках изобретения, термин "Ab6" относится к антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 113, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 104. Как используют в рамках изобретения, термин "chAb6" относится к химерному антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 113, аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 104, и аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 12.
Как используют в рамках изобретения, термин "Ab7" относится к антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 114, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 105. Как используют в рамках изобретения, термин "chAb7" относится к химерному антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 114, аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 105, и аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 12.
Как используют в рамках изобретения, термин "Ab8" относится к антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 115, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 106. Как используют в рамках изобретения, термин "chAb8" относится к химерному антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 115, аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 106, и аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 12.
Как используют в рамках изобретения, термин "Ab9" относится к антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 116, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 107. Как используют в рамках изобретения, термин "chAb9" относится к химерному антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 116, аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 107, и аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 12.
Как используют в рамках изобретения, термин "Ab10" относится к антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 117, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 108. Как используют в рамках изобретения, термин "chAb10" относится к химерному антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 117, аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 108, и аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 12.
Как используют в рамках изобретения, термин "Ab11" относится к антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 118, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 109. Как используют в рамках изобретения, термин "chAb11" относится к химерному антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 118, аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 109, и аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 12.
Как используют в рамках изобретения, термин "Ab12" относится к антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 119, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 110. Как используют в рамках изобретения, термин "chAb12" относится к химерному антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 119, аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 110, и аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 12.
Как используют в рамках изобретения, термин "Ab13" относится к антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 120, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 111. Как используют в рамках изобретения, термин "chAb13" относится к химерному антителу, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 120, аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 111, и аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 12.
3. Получение гуманизированных антител против PRLR
Гуманизированные антитела представляют собой молекулы антител из антител не являющегося человеком вида, которые связывают желаемый антиген, имеющие одну или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) из не являющегося человеком вида и каркасные области из молекулы иммуноглобулина человека. Известные последовательности Ig человека описаны, например, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html;
www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology. html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehimeu.acjp/.about.yasuhito/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isacnet.org/sites_geo.html; aximtl.imt.unimarburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.unihd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Такие импортированные последовательности можно использовать для уменьшения иммуногенности или снижения, усиления или модификации связывания, аффинности, скорости ассоциации, скорости диссоциации, авидности, специфичности, времени полужизни или любой другой подходящей характеристики, как известно в данной области.
Каркасные остатки в каркасных областях человека можно заменять соответствующим остатком из антитела, являющегося донором CDR, для изменения, предпочтительно повышения, связывания антигена. Эти замены в каркасной области идентифицируют способами, хорошо известными в данной области, например, посредством моделирования взаимодействий остатков CDR и каркасной области для идентификации остатков каркасной области, важных для связывания антигена, и сравнения последовательностей для идентификации необычных остатков каркасной области в конкретных положениях. (См., например, Queen et al., патент США № 5585089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), которые включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме). Трехмерные модели иммуноглобулинов широко доступны и известны специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и выводят на экран возможные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей иммуноглобулинов-кандидатов. Исследование этих выведенных на экран структур позволяет анализ возможной роли остатков в функционировании последовательности иммуноглобулина-кандидата, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связывать его антиген. Таким образом, можно отбирать и комбинировать остатки FR из консенсусной и импортной последовательностей, чтобы достигать желательных характеристик антитела, таких как повышенная аффинность к антигену(ам)-мишени. Как правило, остатки CDR прямо и наиболее существенно вовлечены во влияние на связывание антигена. Антитела можно гуманизировать с использованием различных способов, известных в данной области, таких как, но не ограничиваясь ими, способы, описанные в Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994); публикации PCT WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592106; EP 519596, EP 239400, патенты США № 5565332, 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки, включая ссылки, цитированные в них.
Примеры гуманизированных антител против PRLR представлены в разделе 1 выше.
4. Дополнительные конкурирующие антитела
Термин "конкурирующие антитела" в рамках настоящего изобретения относится к любому количеству антител, нацеленных на одну и ту же молекулярную или стабильную, но не связанную ковалентно, надмолекулярную структуру, предпочтительно одну и ту же молекулу, т.е. PRLR, где по меньшей мере одно из них способно специфически снижать поддающееся измерению связывание другой, предпочтительно, путем пространственного препятствования доступа другого антитела к его эпитопу-мишени или путем индукции и/или стабилизации конформации в структуре мишени, которая снижает аффинность мишени к другому антителу, более предпочтительно, путем прямого блокирования доступа к другому эпитопу-мишени путем связывания с эпитопом, находящимся достаточно близко к эпитопу первого антитела, перекрывающемуся с эпитопом первого антитела или идентичному эпитопу первого антитела, наиболее предпочтительно, перекрывающемуся или идентичному, в частности, идентичному. Два эпитопа в рамках настоящего изобретения называют "перекрывающимися", если они обладают общей частью их химических структур, предпочтительно их аминокислотными последовательностями, и называют "идентичными", если их химические структуры, предпочтительно их аминокислотные последовательности, являются идентичными.
В конкретных вариантах осуществления конкурирующее антитело или его антигенсвязывающая часть представляют собой антитело или его антигенсвязывающую часть, которые конкурируют с Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, chAb5, Ab6, chAb6, Ab7, chAb7, Ab8, chAb8, Ab9, chAb9, Ab10, chAb10, Ab11, chAb11, Ab12, chAb12, Ab13, chAb13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52, Ab53, Ab54 или Ab55. В различных вариантах осуществления связывание можно анализировать в соответствии с протоколом, указанным в примере 4.
В одном варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab1, т.е. содержащему (i) одну вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 45; и (ii) одну вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab2, т.е. содержащему (i) одну вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 61; и (ii) одну вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 69.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab3, т.е. содержащему (i) одну вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 76; и (ii) одну вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82 и SEQ ID NO: 83.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab4, т.е. содержащему (i) одну вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 и SEQ ID NO: 123; и (ii) одну вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95 и SEQ ID NO: 96.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab5, т.е. содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 112, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 103.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab6, т.е. содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 113, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 104.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab7, т.е. содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 114, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 105.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab8, т.е. содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 115, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 106.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab9, т.е. содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 116, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 107.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab10, т.е. содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 117, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 108.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab11, т.е. содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 118, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 109.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab12, т.е. содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 119, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 110.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab13, т.е. содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 120, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 111.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab14, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab15, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab16, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab17, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab18, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab19, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab20, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab21, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab22, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab23, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab24, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab25, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab26, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab27, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab28, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab29, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab30, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab31, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab32, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab33, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab34, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab35, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab36, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab37, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab38, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab39, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab40, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab41, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab42, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab43, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab44, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab45, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab46, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab47, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab48, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab49, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab50, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab51, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab52, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab53, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 153; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab54, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 154; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139.
В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, которое конкурирует с Ab55, т.е. содержащему тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 155; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139.
В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который конкурирует с антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из:
(1) вариабельной области тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 45; и вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54;
(2) вариабельной области тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 61; и вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 69;
(3) вариабельной области тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 121; SEQ ID NO: 122; и SEQ ID NO: 123; и вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95 и SEQ ID NO: 96;
(4) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 112, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 103;
(5) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 113, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 104;
(6) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 114, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 105; и
(7) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 120, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 111.
В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающему белку, например антителу, которое конкурирует с антителом, содержащим аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 119, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 110.
5. Эпитопы PRLR
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, например антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способным связывать PRLR, которые связываются с эпитопом в PRLR, содержащим три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или все из аминокислотных остатков E8, F10, C12, R25, E43, G44, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, Y99, I100, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 и W191 SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления связывающий белок, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связывать PRLR, связываются с эпитопом, где эпитоп содержит по меньшей мере пять аминокислотных остатков. В другом варианте осуществления связывающий белок, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связывать PRLR, связываются с эпитопом, где эпитоп содержит все из аминокислотных остатков E8, F10, C12, R25, E43, G44, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, Y99, I100, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 и W191 SEQ ID NO: 2.
В конкретном варианте осуществления связывающий белок, который связывается с указанным эпитопом, представляет собой антитело или его антигенсвязывающий центр, выбранные из группы, состоящей из Ab1, Ab6, chAb6, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, и Ab25.
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, например антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способным связывать PRLR, который связывается с эпитопом в PRLR, содержащим три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или все из аминокислотных остатков E8, I9, F10, K11, C12, R25, E43, G44, W72, T74, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, T98, Y99, I100, W139, L143, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 и W191 SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления связывающий белок, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связывать PRLR, связываются с эпитопом, где эпитоп содержит по меньшей мере пять из этих аминокислотных остатков. В другом варианте осуществления связывающий белок, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связывать PRLR, связываются с эпитопом, где эпитоп содержит все из аминокислотных остатков E8, I9, F10, K11, C12, R25, E43, G44, W72, T74, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, T98, Y99, I100, W139, L143, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 и W191 SEQ ID NO: 2.
В конкретном варианте осуществления связывающий белок, который связывается с указанным эпитопом, представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, выбранные из группы, состоящей из Ab4, Ab7, chAb7, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab53, Ab54 и Ab55. В другом варианте осуществления связывающий белок, который связывается с указанным эпитопом, представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, выбранные из группы, состоящей из Ab2, Ab5, chAb5, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33 и Ab34.
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, например антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способным связывать PRLR, который связывается с эпитопом в PRLR, содержащим 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или все из аминокислотных остатков R25, T141, L143, E145, R147, E155, W156, E157, I158, H159, F160, A161, G162, Q163, Q164, F167, S171, R183, K185, D187, H188, W191 и W194 SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления связывающий белок, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связывать PRLR, связывается с эпитопом, где эпитоп содержит по меньшей мере 15 из этих аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связывать PRLR, связываются с эпитопом, где эпитоп содержит все из аминокислотных остатков R25, T141, L143, E145, R147, E155, W156, E157, I158, H159, F160, A161, G162, Q163, Q164, F167, S171, R183, K185, D187, H188, W191 и W194 SEQ ID NO: 2.
В конкретном варианте осуществления связывающий белок, который связывается с указанным эпитопом, представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, выбранные из группы, состоящей из Ab3, Ab8, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51 и Ab52.
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, например антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способным связывать PRLR, который связывается с эпитопом в PRLR, содержащим по меньшей мере один, два, три, четыре или все из аминокислотных остатков R25, K185, D187, H188 или W191 SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связывать PRLR, связываются с эпитопом, где эпитоп содержит все из аминокислотных остатков R25, K185, D187, H188 или W191 SEQ ID NO: 2.
В конкретном варианте осуществления связывающий белок, который связывается с указанным эпитопом, представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, выбранные из группы, состоящей из Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, chAb5, Ab6, chAb6, Ab7, chAb7, Ab8, chAb8, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52, Ab53, Ab54 и Ab55.
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, например антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способным связывать PRLR, который связывается с эпитопом в PRLR, содержащим аминокислоты 91-96 SEQ ID NO: 2.
В конкретном варианте осуществления связывающий белок, который связывается с указанным эпитопом, представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, выбранные из группы, состоящей из Ab1, Ab4, Ab6, Ab7, chAb6, chAb7, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab53, Ab54 и Ab55. В другом варианте осуществления связывающий белок, который связывается с указанным эпитопом, представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, выбранные из группы, состоящей из Ab2, Ab5, chAb5, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33 и Ab34.
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, например антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способным связывать PRLR, который связывается с эпитопом, имеющим остатки в пределах по меньшей мере положений аминокислот 8-100, 185-191, 8-143 или 183-194 SEQ ID NO: 2. В конкретном варианте осуществления связывающий белок, который связывается с указанным эпитопом, представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, выбранные из группы, состоящей из Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, chAb5, Ab6, chAb6, Ab7, chAb7, Ab8, chAb8, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52, Ab53, Ab54 и Ab55.
В другом аспекте изобретение относится к связывающему белку, например антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способным связывать PRLR и имеющим ту же эпитопную специфичность, что и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, выбранные из группы, состоящей из Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, chAb5, Ab6, chAb6, Ab7, chAb7, Ab8, chAb8, Ab9, chAb9, Ab10, chAb10, Ab11, chAb11, Ab12, chAb12, Ab13, chAb13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52, Ab53, Ab54 и Ab55.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов, связывающий белок, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способны модулировать биологическую функцию PRLR. В других вариантах осуществления указанных выше аспектов связывающий белок, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способны нейтрализовывать PRLR. В других вариантах осуществления указанных выше аспектов связывающий белок, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывают эпитоп PRLR, который не ингибирует димеризацию PRLR. В следующих вариантах осуществления указанных выше аспектов связывающий белок, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, не связывают домен D2 в PRLR. В следующих вариантах осуществления указанных выше аспектов связывающий белок, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывают связывающую лиганд область домена D1 PRLR. В дополнительных вариантах осуществления указанных выше аспектов связывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, не конкурируют с антителом LFA102 за связывание PRLR. В дополнительных вариантах осуществления указанных выше аспектов связывающий белок, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, блокируют связывание пролактина с PRLR.
C. Продуцирование антител и продуцирующих антитела клеточных линий
Предпочтительно, антитела против PRLR по настоящему изобретению проявляют высокую способность снижать или нейтрализовывать активность PRLR, например, при оценке с помощью любого из нескольких анализов in vitro и in vivo, известных в данной области. Например, можно измерять ингибирование фосфорилирования PRLR, pSTAT5 или ERK1/2 в экспрессирующей PRLR клеточной линии, например, клеточной линии карциномы молочной железы человека T47D. Альтернативно, можно измерять ингибирование пролиферации экспрессирующих PRLR клеточных линий, например, про-B лимфоидных клеток Baf3, трансфицированных PRLR человека, или клеток лимфомы крысы Nb2-11. В предпочтительных вариантах осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает PRLR человека, где антитело или его антигенсвязывающая часть диссоциируют от PRLR человека с константой скорости koff приблизительно 0,1 с-1 или менее, при определении с использованием поверхностного плазмонного резонанса, или ингибируют активность PRLR человека с IC50 приблизительно 1×10-6 M или менее. Альтернативно, антитело или его антигенсвязывающая часть могут диссоциировать от PRLR человека с константой скорости koff приблизительно 1×10-2 с-1 или менее, при определении с помощью поверхностного плазмонного резонанса, или могут ингибировать активность PRLR человека с IC50 приблизительно 1×10-7 M или менее. Альтернативно, антитело или его антигенсвязывающая часть могут диссоциировать от PRLR человека с константой скорости koff приблизительно 1×10-3 c-1 или менее, при определении с использованием поверхностного плазмонного резонанса, или могут ингибировать PRLR человека с IC50 приблизительно 1×10-8 M или менее. Альтернативно, антитело или его антигенсвязывающая часть могут диссоциировать от PRLR человека с константой скорости koff приблизительно 1×10-4 с-1 или менее, при определении с использованием поверхностного плазмонного резонанса, или могут ингибировать активность PRLR с IC50 приблизительно 1×10-9 M или менее. Альтернативно, антитело или его антигенсвязывающая часть могут диссоциировать от PRLR человека с константой скорости koff приблизительно 1×10-5 с-1 или менее при определении с использованием поверхностного плазмонного резонанса, или могут ингибировать PRLR с IC50 приблизительно 1×10-10 M или менее. Альтернативно, антитело или его антигенсвязывающая часть могут диссоциировать от PRLR человека с константой скорости koff приблизительно 1×10-5 с-1 или менее, при определении с использованием поверхностного плазмонного резонанса, или могут ингибировать активность PRLR с IC50 приблизительно 1×10-11 M или менее.
Пролактин связывается с PRLR и индуцирует гомодимеризацию. PRLR не обладает собственной киназной активностью, однако он ассоциирован с протеинкиназами, такими как FYN и JAK2 (Kline, J.B., et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:35461-35468). Связывание пролактина активирует трансдуктор сигнала и активатор транскрипции 5 (STAT5) через JAK2 и регулируемую внеклеточными сигналами киназу-1 и -2 (ERK1 и ERK2) (Huang, Y., et al., (2006) Oncogene 25:7565-7576). Фосфорилированные посредством JAK2 STAT5A и STAT5B образуют гомо- и гетеродимеры и модулируют экспрессию генов, влияющих на рост и дифференцировку клеток (Hennighausen, L., and Robinson, G.W. (2001) Develop. Cell 1:467-475). Активация PRLR пролактином отдельно стимулирует пролиферацию клеток и в комбинации с дексаметазоном стимулирует экспрессию специфических для молочной железы генов в клеточных линиях, например, гена γ-казеина (Sasaki, M., et al. (1996) Endocrine J. 43:45-52). Более того, было обнаружено, что PRLR сверхэкспрессируется в тканях рака молочной железы и рака предстательной железы человека (Li et al., Cancer Res., 64:4774-4782, 2004; Gill et al., J Clin Pathol., 54:956-960, 2001; Touraine et al., J Clin Endocrinol Metab., 83:667-674, 1998). Анализы фосфорилирования и пролиферации продемонстрировали, что антитела, описанные в настоящем описании, ингибировали опосредуемое пролактином фосфорилирование и пролиферацию. Например, как указано в примере 2 и в таблицах 13 и 14, было показано, что антитела PRLR ингибируют фосфорилирование PRLR. Кроме того, как указано в примере 2 и в таблицах 13 и 14, было показано, что антитела против PRLR ингибируют пролиферацию экспрессирующих PRLR клеточных линий, например, про-B лимфоидных клеток Baf3, трансфицированных PRLR человека, и клеток лимфомы крысы Nb2-11. Более того, как указано в примере 3, было показано, что антитела против PRLR, в частности AB5, снижают рост опухоли в исследованиях in vivo. Было показано, что одно конкретное антитело, описанное в настоящем описании, т.е. Ab12, проявляет активность агониста PRLR.
Антитела гуманизировали, как описано в примере 1. Обратные мутации каркасной области вносили в последовательности антител с пересаженными CDR посредством синтеза de novo вариабельного домена или с помощью мутагенных олигонуклеотидных праймеров и полимеразной цепной реакции, или с помощью обоих из них, обеспечивая различные комбинации обратных мутаций и других мутаций для каждого из антител с пересаженными CDR. Гуманизированные вариабельные области моноклональных антител мыши против PRLR клонировали в экспрессирующие IgG векторы для функциональной охарактеризации.
В определенных вариантах осуществления антитело содержит константную область тяжелой цепи, такую как константная область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD. Предпочтительно, константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1 или константную область тяжелой цепи IgG4. Более того, антитело может содержать константную область легкой цепи, либо константную область легкой цепи каппа, либо константную область легкой цепи лямбда. Предпочтительно, антитело содержит константную область легкой цепи каппа. Альтернативно, часть антитела может представлять собой, например, Fab-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент.
Замена аминокислотных остатков в Fc-участке для изменения эффекторной функции антитела известна в данной области (Winter, et al. патенты США № 5648260 и 5624821). Fc-участок антитела опосредует несколько важных эффекторных функций, например, индукцию цитокинов, ADCC, фагоцитоз, комплементзависимую цитотоксичность (CDC) и время полужизни/скорость выведения антитела и комплексов антиген-антитело. В некоторых случаях, эти эффекторные функции являются желательными для терапевтического антитела, но в других случаях они могут быть необязательными или нежелательными, в зависимости от терапевтических целей. Определенные изотипы IgG человека, в частности IgG1 и IgG3, опосредуют ADCC и CDC через связывание с FcγR и компонентом комплемента C1q, соответственно. Неонатальные Fc-рецепторы (FcRn) являются основными компонентами, определяющими время полужизни антител в кровотоке. В другом варианте осуществления в константной области антитела, например, Fc-области антитела, заменен по меньшей мере один аминокислотный остаток, для изменения эффекторных функций.
Один из вариантов осуществления относится к меченому связывающему белку, где антитело или часть антитела по изобретению преобразованы в производное или связаны с одной или несколькими функциональной молекулой(ами) (например, другим пептидом или белком). Например, меченый связывающий белок по изобретению может быть получен функциональным связыванием антитела или части антитела по изобретению (путем химического связывания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным образом) с одной или несколькими другими молекулярными группами, такими как другое антитело (например, биспецифическое антитело или диантитело), поддающееся обнаружению средство, фармацевтическое средство, белок или пептид, который может опосредовать связывание связывающего белка с другой молекулой (такой как центральная область стрептавидина или полигистидиновая метка) и/или цитотоксическое средство или лекарственное средство, выбранные из группы, состоящей из ингибитора митоза, противоопухолевого антибиотика, иммуномодулирующего средства, вектора для генной терапии, алкилирующего средства, антиангиогенного средства, антиметаболита, борсодержащего средства, хемопротективного средства, гормона, антигормонального средства, кортикостероида, фотоактивного лекарственного средства, олигонуклеотида, радионуклидного средства, ингибитора топоизомеразы, ингибитора тирозинкиназы, радиосенсибилизирующего средства и их комбинации.
Пригодные поддающиеся обнаружению средства, посредством которых может быть преобразовано антитело или антигенсвязывающая часть по изобретению, включают флуоресцентные соединения. Иллюстративные флуоресцентные поддающиеся обнаружению средства включают флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталинсульфонилхлорид, фикоэритрин и т. п. Также антитело может быть преобразовано в производное с поддающимися обнаружению ферментами, такими как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, глюкозооксидаза и т.п. Когда антитело преобразовано в производное поддающимся обнаружению ферментом, его обнаружение проводят добавлением дополнительных реагентов, которые фермент использует для образования поддающегося обнаружению продукта реакции. Например, когда имеется поддающееся обнаружению средство - пероксидаза хрена, добавление пероксида водорода и диаминобензидина приводит к окрашенному продукту реакции, который является поддающимся обнаружению. Также антитело может быть преобразовано в производное биотином и подвергнуто обнаружению посредством непрямого измерения связывания авидина или стрептавидина.
Другой вариант осуществления изобретения относится к кристаллизованному связывающему белку. Предпочтительно, изобретение относится к кристаллам целых антител против PRLR и их фрагментов, как описано в настоящем описании, и к составам и композициям, содержащим такие кристаллы. В одном из вариантов осуществления кристаллизованный связывающий белок имеет время полужизни in vivo, превышающее время полужизни in vivo растворимого аналога связывающего белка. В другом варианте осуществления связывающий белок сохраняет биологическую активность после кристаллизации.
Кристаллизованный связывающий белок по изобретению можно получать способами, известными в данной области, и как описано в публикации WO 02/072636, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
Другой вариант осуществления изобретения относится к гликозилированному связывающему белку, где антитело или его антигенсвязывающая часть содержит один или несколько углеводных остатков. Образующийся in vivo белковый продукт может подвергаться дальнейшему процессингу, известному как посттрансляционная модификация. В частности, могут быть ферментативно добавлены остатки сахара (гликозильные остатки), посредством процесса, известного как гликозилирование. Образованные белки, имеющие ковалентно связанные с ними олигосахаридные боковые цепи, известны как гликозилированные белки или гликопротеины. Антитела представляют собой гликопротеины с одним или несколькими углеводными остатками в Fc-домене, а также в вариабельном домене. Углеводные остатки в Fc-домене имеют значительный эффект на эффекторную функцию Fc-домена, и минимальный эффект на связывание антигена или время полужизни антитела (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16). В противоположность этому, гликозилирование вариабельного домена может оказывать эффект на активность связывания антигена антителом. Гликозилирование в вариабельном домене может оказывать отрицательный эффект на аффинность связывания антитела, вероятно вследствие пространственного препятствия (Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367), или приводить к повышенной аффинности к антигену (Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717-2723).
Один из аспектов настоящего изобретения относится к получению мутантов по участку гликозилирования, в которых участок O- или N-связанного гликозилирования связывающего белка подвергнут мутации. Специалист в данной области может получить такие мутанты с использованием стандартных хорошо известных способов. Создание мутантов по участкам гликозилирования, которые сохраняют биологическую активность, но обладают повышенной или сниженной активностью связывания, является другой задачей настоящего изобретения.
В другом варианте осуществления гликозилирование антитела или его антигенсвязывающей части является модифицированным. Например, можно получать агликозилированное антитело (т.е., антитело, лишенное гликозилирования). Гликозилирование можно изменять, например, для повышения аффинности антитела к антигену. Такие модификации углеводов можно проводить, например, посредством изменения одного или нескольких участков гликозилирования в последовательности антитела. Например, можно вносить одну или несколько аминокислотных замен, которые приводят к устранению одного или нескольких участков гликозилирования вариабельной области, устраняя тем самым гликозилирование в этом участке. Такое агликозилирование может повысить аффинность антитела к антигену. Такой подход более подробно описан в публикации PCT WO2003016466A2, и в патентах США № 5714350 и 6350861, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Дополнительно или альтернативно, можно получать модифицированное антитело по изобретению, которое имеет измененный тип гликозилирования, такой как гипофукозилированное антитело, имеющее сниженные количества фукозильных остатков, или антитело, имеющее увеличенное количество биссекторных структур GlcNAc. Было показано, что такой измененный характер гликозилирования повышает способность антител к ADCC. Такие модификации углеводов можно проводить, например, путем экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным аппаратом гликозилирования. Клетки с измененным аппаратом гликозилирования описаны в данной области и их можно использовать в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению с получением, тем самым, антитела с измененным гликозилированием. См., например, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, а также патент Европы № EP 1176195; публикации PCT WO 03/035835; WO 99/54342 80, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Гликозилирование белков зависит от аминокислотной последовательности представляющего интерес белка, а также от клетки-хозяина, в которой экспрессируется белок. Различные организмы могут продуцировать различные ферменты гликозилирования (например, гликозилтрансферазы и гликозидазы), и имеют различные доступные субстраты (сахара нуклеотидов). Вследствие таких факторов, характер гликозилирования белка и состав гликозильных остатков могут отличаться, в зависимости от системы хозяина, в которой экспрессируется конкретный белок. Гликозильные остатки, пригодные для изобретения, могут включать, но не ограничиваться ими, глюкозу, галактозу, маннозу, фукозу, н-ацетилглюкозамин и сиаловую кислоту. В одном из вариантов осуществления гликозилированный связывающий белок содержит гликозильные остатки, так что характер гликозилирования является человеческим.
Специалистам в данной области известно, что различное гликозилирование белка может приводить к различным характеристикам белка. Например, эффективность терапевтического белка, продуцируемого в микроорганизме-хозяине, таком как дрожжи, и гликозилированного с использованием эндогенного каскада дрожжей, может быть снижена по сравнению с гликозилированием того же белка, экспрессируемого в клетке млекопитающего, такой как клеточная линия CHO. Такие гликопротеины также могут быть иммуногенными у человека и могут демонстрировать сниженное время полужизни in vivo после введения. Определенные рецепторы у человека и других животных могут распознавать определенные гликозильные остатки и обеспечивать быстрое выведение белка из кровотока. Другие неблагоприятные эффекты могут включать изменение сворачивания белка, его растворимости, чувствительности к протеазам, кругооборота, транспорта, компартментализации, секреции, распознавания другими белками или факторами, антигенности или аллергенности. Таким образом, практикующий специалист может предпочесть терапевтический белок с определенным составом и характером гликозилирования, например составом и характером гликозилирования, идентичными, или по меньшей мере сходными, с составом и характером гликозилирования в клетках человека или в видоспецифичных клетках предполагаемого животного.
Экспрессии гликозилированных белков, отличных от белков клетки-хозяина, можно достигать генетической модификацией клетки-хозяина для экспрессии гетерологичных ферментов гликозилирования. С использованием способов, известных в данной области, практикующий специалист может получить антитела или их антигенсвязывающие части, проявляющие гликозилирование белков человека. Например, штаммы дрожжей генетически модифицировали для экспрессии не встречающихся в природе ферментов гликозилирования, так чтобы гликозилированные белки (гликопротеины), продуцированные в этих штаммах дрожжей, проявляли гликозилирование белка, идентичное гликозилированию клеток животных, особенно клеток человека (публикации патентов США № 20040018590 и 20020137134 и публикация PCT WO2005100584 A2).
В дополнение к связывающим белкам, настоящее изобретение также относится к антиидиотипическим (анти-Id) антителам, специфичным к таким связывающим белкам по изобретению. Анти-Id антитело представляет собой антитело, которое распознает уникальные детерминанты, главным образом, ассоциированные с антигенсвязывающей областью другого антитела. Анти-Id можно получать иммунизацией животного связывающим белком или его областью, содержащей CDR. Иммунизированное животное будет распознавать идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела и отвечать на них и продуцировать анти-Id антитело.
Кроме того, специалисту в данной области будет понятно, что представляющий интерес белок может быть экспрессирован с использованием библиотеки клеток-хозяев, созданных способами генетической инженерии для экспрессии различных ферментов гликозилирования, так что клетки-хозяева, являющиеся членами библиотеки, продуцируют представляющий интерес белок с вариантами характера гликозилирования. Затем практикующий специалист может проводить селекцию и выделение представляющего интерес белка с конкретным новым характером гликозилирования. В одном из вариантов осуществления белок, имеющий конкретный выбранный новый характер гликозилирования, проявляет улучшенные или измененные биологические свойства.
II. Конъюгаты антитело против PRLR-лекарственное средство (ADC)
Антитела против PRLR, описанные в настоящем описании, можно конъюгировать со средством для получения конъюгата антитело против PRLR-лекарственное средство (ADC). Конъгаты антитело-лекарственное средство (ADC) могут повышать терапевтическую эффективность антител при лечении заболевания, например, злокачественной опухоли, вследствие способности ADC селективно доставлять одно или несколько средство(средств) в ткани-мишени, такие как опухоли, экспрессирующие ассоциированный с опухолью антиген, например PRLR. Таким образом, изобретение относится к ADC против PRLR для терапевтического применения, например, для лечения злокачественной опухоли.
ADC против PRLR по настоящему изобретению содержит антитело против PRLR, т.е. антитело, которое специфически связывается с PRLR, связанное с одной или несколькими частями лекарственного средства. Специфичность ADC по изобретению определяется специфичностью антитела, т.е. антитела против PRLR. В одном варианте осуществления антитело против PRLR связана с одним или несколькими цитотоксином(ами), которые доставляются внутрь трансформированной злокачественной клетки, эксперессирующей PRLR. Примеры лекарственных средств, которые можно использовать в ADC против PRLR по изобретению, представлены ниже, также как и примеры линкеров, которые можно использовать для конъюгации антитела и одного или нескольких лекарственного средства(лекарственных средств). Термины "лекарственное средство" и "средство" используют в настоящем описании взаимозаменяемо. Термины "связанный" и "конъюгированный" также используют в настоящем описании взаимозаменяемо.
A. Лекарственные средства для конъюгации
Антитела против PRLR по изобретению можно использовать в ADC для нацеливания одного или нескольких лекарственного средства(средств) на представляющую интерес клетку, например, трансформированную злокачественную клетку, экспрессирующую PRLR. ADC против PRLR по изобретению обеспечивает направленную терапию, которая может, например, снижать побочные эффекты, часто наблюдаемые в случае способов терапии злокачественной опухоли, поскольку одно или несколько лекарственное средство(средств) доставляется в конкретную клетку. Примеры лекарственных средств, которые можно использовать в ADC по изобретению, т.е. лекарственных средств, которые могут быть конъюгированы с антителами против PRLR по изобретению, представлены ниже, и они включают ингибиторы митоза, противоопухолевые антибиотики, иммуномодулирущие средства, векторы для генной терапии, алкилирующие средства, антиангиогенные средства, антиметаболиты, борсодержащие средства, хемопротективные средства, гормональные средства, глюкокортикоиды, фотоактивные лекарственные средства, олигонуклеотиды, радиоактивные изотопы, радиосенсибилизирующие средства, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы тирозинкиназы и их комбинации.
1. Ингибиторы митоза
Антитела против PRLR по изобретению можно конъюгировать с одним или несколькими ингибитором(ами) митоза для лечения злокачественной опухоли. Термин "ингибитор митоза", как используют в рамках изобретения, относится к цитотоксическому и/или лекарственному средству, которое блокирует митоз или деление клеток - биологический процесс, особенно важный для злокачественных клеток. Ингибитор митоза разрушает микротрубочки, так что деление клеток предотвращается, часто посредством воздействия на полимеризацию микротрубочек или деполимеризацию микротрубочек. Таким образом, в одном варианте осуществления антитело против PRLR по изобретению конъюгируют с одним или несколькими ингибитором(ами) митоза, который нарушает образование микротрубочек путем ингибирования полимеризации тубулина. В одном варианте осуществления ингибитором митоза, используемым в ADC по изобретению, является Икземпра (иксабепилон). Примеры ингибиторов митоза, которые можно использовать в ADC против PRLR по изобретению, представлены ниже.
a. Доластатины
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним доластатином. Доластатины представляют собой короткие пептидные соединения, выделенные из морского зайца Индийского океана Dolabella auricularia (см. Pettit et al., J. Am. Chem. Soc., 1976, 98, 4677). Примеры доластатинов включают доластатин 10 и доластатин 15. Доластатин 15, депсипептид из семи субъединиц, происходящий из Dolabella auricularia, представляет собой сильнодействующее антимитотическое средство, структурно родственное антитубулиновому средству доластатину 10, являющемуся пептидом из пяти субъединиц, полученным из того же организма. Таким образом, в одном варианте осуществления ADC против PRLR по изобретению содержит антитело против PRLR, как описано в настоящем описании, и по меньшей мере один доластатин. Ауристатины, описанные ниже, представляют собой синтетические производные доластатина 10.
b. Ауристатины
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним ауристатином. Ауристатины представляют собой группу аналогов доластатина, для которых показано, что они в общем обладают активностью против злокачественной опухоли, препятствуя динамике микротрубочек и гидролизу GTP, тем самым ингибируя деление клеток. Например, ауристатин E (патент США № 5635483) представляет собой синтетический аналог морского натурального продукта доластатина 10, являющегося соединением, которое ингибирует полимеризацию тубулина путем связывания с тем же участком на тубулине, с которым связывается лекарственное средство против злокачественной опухоли винкристин (G. R. Pettit, Prog. Chem. Org. Nat. Prod, 70: 1-79 (1997)). Доластатин 10, ауристатин PE и ауристатин E представляют собой линейные пептиды, имеющие четыре аминокислоты, три из которых являются уникальными для класса соединений-доластатинов. Иллюстративные варианты осуществления подкласса ауристатиновых ингибиторов митоза включают, но не ограничиваются ими, монометилауристатин D (MMAD или производное ауристатина D), монометилауаристатин E (MMAE или производное ауристатина E), монометилауристатин F (MMAF или производное ауристатина F), ауристатин F фенилендиамин (AFP), ауристатин EB (AEB), ауристатин EFP (AEFP) и сложный эфир 5-бензоилвалериановая кислота-AE (AEVB). Синтез и структура производных ауристатина описаны в публикациях патентных заявок США № 2003-0083263, 2005-0238649 и 2005-0009751; международной публикации патента № WO 04/010957, международной публикации патента № WO 02/088172, и в патентах США № 6323315; 6239104; 6034065; 5780588; 5665860; 5663149; 5635483; 5599902; 5554725; 5530097; 5521284; 5504191; 5410024; 5138036; 5076973; 4986988; 4978744; 4879278; 4816444; и 4486414, все из которых включены в настоящем описании в качестве ссылок.
В одном варианте осуществления антитело против PRLR по изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним MMAF (монометилауристатин F). Монометилауристатин F (MMAF) ингибирует деление клеток путем блокирования полимеризации тубулина. Он имеет заряженный C-концевой остаток фенилаланина, который ослабляет его цитотоксическую активность по сравнению с незаряженным аналогом MMAE. Вследствие его более высокой токсичности, его нельзя непосредственно использовать в качестве лекарственного средства, но можно связывать с моноклональным антителом (mAb), которое направляет его в злокачественные клетки. В одном варианте осуществления линкер с антителом против PRLR является стабильным во внеклеточной жидкости, однако расщепляется катепсином после вхождения конъюгата в опухолевую клетку, таким образом, активируя антимитотический механизм.
В одном варианте осуществления антитело против PRLR по изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним MMAE (монометилауристатин E). Монометилауристатин E (MMAE, ведотин) ингибирует деление клеток, блокируя полимеризацию тубулина. Вследствие его высокой токсичности, его нельзя непосредственно использовать в качестве лекарственного средства. В последних разработках лекарственных средств, его связывают с моноклональным антителом (mAb), которое распознает экспрессию конкретного маркера в злокачественных клетках и направляет MMAE в злокачественные клетки. В одном варианте осуществления линкер, связывающий MMAE с антителом против PRLR, является стабильным во внеклеточной жидкости (т.е. среде или окружающих условиях, которые являются внешними для клеток), но расщепляется катепсином после связывания ADC со специфическим антигеном злокачественных клеток и проникновения в злокачественную клетку, таким образом, высвобождая токсический MMAE и активируя мощный антимитотический механизм. Структуры MMAF и MMAE представлены ниже.
c. Майтанзиноиды
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним майтанзиноидом. Майтанзиноиды представляют собой сильнодействующие противоопухолевые средства, которые первоначально были выделены из представителей семейств высших растений Celastraceae, Rhamnaceae и Euphorbiaceae, а также некоторых видов мхов (Kupchan et al, J. Am. Chem. Soc. 94:1354-1356 [1972]; Wani et al, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 390: [1973]; Powell et al, J. Nat. Prod. 46:660-666 [1983]; Sakai et al, J. Nat. Prod. 51:845-850 [1988]; и Suwanborirux et al, Experientia 46:117-120 [1990]). Данные указывают на то, что майтанзиноиды ингибируют митоз путем ингибирования полимеризации белка микротрубочек тубулина, тем самым, препятствуя образованию микротрубочек (см., например, патент США № 6441163 и Remillard et al., Science, 189, 1002-1005 (1975)). Было показано, что майтанзиноиды ингибируют рост опухолевых клеток in vitro с использованием моделей на культурах клеток, и in vivo с использованием систем с лабораторными животными. Более того, цитотоксичность майтанзиноидов в 1000 раз превышает цитотоксичность общепринятых химиотерапевтических средства, например, таких как метотрексат, даунорубицин и винкристин (см., например, патент США № 5208020).
В данной области известно, что майтанзиноиды включают майтанзин, майтанзинол, C-3 сложные эфиры майтанзинола и другие аналоги и производные майтанзинола (см., например, патенты США № 5208020 и 6441163, все из которых включены в настоящее описании в качестве ссылки). C-3 сложные эфиры майтанзинола могут быть встречающимися в природе или могут иметь синтетическое происхождение. Более того, как встречающиеся в природе, так и синтетические сложные эфиры C-3 майтанзинола, могут быть подразделены на C-3 сложный эфир с простыми карбоновыми кислотами или C-3 сложный эфир с производным N-метил-L-аланина, причем последний из них является более цитотоксичным, чем первый. Синтетические аналоги майтанзиноидов также известны в данной области и описаны, например, в Kupchan et al., J. Med. Chem., 21, 31-37 (1978).
Пригодные майтанзиноиды для применения в ADC по изобретению могут быть выделены из природных источников, продуцированы синтетически или продуцированы полусинтетическим путем с использованием способов, известных в данной области. Более того, майтанзиноид может быть модифицирован любым подходящим способом при условии, что в конечной молекуле конъюгата сохраняется достаточная цитотоксичность. В этом отношении, майтанзиноиды лишены подходящих функциональных групп, с которым антитела могут быть связаны. Для связывания майтанзиноида с антителом желательно использовать линкерную часть для образования конъюгата, и она более подробно описана в разделе IIB. Структура иллюстративного майтанзиноида мертансина (DM1), предоставлена ниже.
Репрезентативные примеры майтанзиноидов включают, но не ограничиваются ими, DM1 (N2'-дeацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)майтанзин; также обозначаемый как мертансин, лекарственное средство майтанзиноид 1; ImmunoGen, Inc.; также см. Chari et al. (1992) Cancer Res 52:127), DM2, DM3 (N2'-деацетил-N2'-(4-меркапто-1-оксопентил)майтанзин), DM4 (4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)майтанзин) и майтанзинол (синтетический аналог майтанзиноидов). Другие примеры майтанзиноидов описаны в патенте США № 8142784, включенном в настоящее описание в качестве ссылки.
Ансамитоцины представляют собой группу майтанзиноидных антибиотиков, которые были выделены из различных бактериальных источников. Эти соединения обладают мощной противоопухолевой активностью. Репрезентативные примеры включают, но не ограничиваются ими, ансамитоцин P1, ансамитоцин P2, ансамитоцин P3 и ансамитоцин P4.
В одном варианте осуществления антитело против PRLR по изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним DM1. В одном варианте осуществления антитело против PRLR по изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним DM2. В одном варианте осуществления антитело против PRLR по изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним DM3. В одном варианте осуществления антитело против PRLR антитело по изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним DM4.
d. Алкалоиды растений
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним алкалоидом растений, например, таксаном или алкалоидом барвинка. Алкалоиды растений представляют собой химиотерапевтические средства, происходящие из определенных типов растений. Алкалоиды барвинка получают из растений барвинка (catharanthus rosea), в то время как таксаны получают из коры тиса тихого (taxus). Как алкалоиды барвинка, так и таксаны также известны как средства против микротрубочек и они более подробно описаны ниже.
Таксаны
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним таксаном. Термин "таксан", как используют в рамках изобретения, относится к классу антинеопластических средств, имеющих механизм воздействия на микротрубочки и обладающих структурой, которая включает структуру таксанового кольца и стереоспецифическую боковую цепь, которая требуется для цитостатической активности. Также в термин "таксан" включены различные известные производные, включая как гидрофильные производные, так и гидрофобные производные. Производные таксанов включают, но не ограничиваясь ими, производные галактозы и маннозы, описанные в международной патентной заявке № WO 99/18113; пиперазино- и другие производные, описанные в WO 99/14209; производные таксанов, описанные в WO 99/09021, WO 98/22451, и патенте США № 5869680; 6-тиопроизводные, описанные в WO 98/28288; сульфенамидные производные, описанные в патенте США № 5821263; и таксоловое производное, описанное в патенте США № 5415869, все из которых включены в настоящем описании в качестве ссылки. Таксановые соединения ранее были описаны в патентах США № 5641803, 5665671, 5380751, 5728687, 5415869, 5407683, 5399363, 5424073, 5157049, 5773464, 5821263, 5840929, 4814470, 5438072, 5403858, 4960790, 5433364, 4942184, 5362831, 5705503 и 5278324, все из которых полностью включены в качестве ссылок. Следующие примеры таксанов включают, но не ограничиваются ими, доцетаксел (таксотер; Sanofi Aventis), паклитаксел (абраксан или таксол; Abraxis Oncology), и паклитаксел в форме наночастиц (ABI-007/Abraxene; Abraxis Bioscience).
В одном варианте осуществления антитело против PRLR по изобретению конъгировано по меньшей мере с одной молекулой доксетаксела. В одном варианте осуществления антитело против PRLR по изобретению конъюгировано по меньшей мере с одной молекулой паклитаксела.
Алкалоиды барвинка
В одном варианте осуществления антитело против PRLR по изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним алкалоидом барвинка. Алкалоиды барвинка представляют собой класс специфичных к клеточному циклу лекарственных средств, которые действуют путем ингибирования способности злокачественных клеток делиться путем воздействия на тубулин и предупреждения образования микротрубочек. Примеры алкалоидов барвинка, которые можно использовать в ADC по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, виндезин сульфат, винкристин, винбластин и винорелбин.
2. Противоопухолевые антибиотики
Антитела против PRLR по изобретению можно конъюгировать с одним или несколькими противоопухолевым антибиотиком(ами) для лечения злокачественной опухоли. Как используют в рамках изобретения, термин "противоопухолевый антибиотик" означает антинеопластическое лекарственное средство, которое блокирует рост клеток, вмешиваясь в ДНК, и которое получают из микроорганизмов. Часто противоопухолевые антибиотики либо разрушают нити ДНК, либо замедляют или останавливают синтез ДНК. Примеры противоопухолевых антибиотиков, которые могут быть включены в ADC против PRLR по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, актиномицины (например, пирроло[2,1-c][1,4]бензодиазепины), антрациклины, калихеамицины и дуокармицины, более подробно описанные ниже.
a. Актиномицины
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним актиномицином. Актиномицины представляют собой подкласс противоопухолевых антибиотиков, выделенных из бактерий рода Streptomyces. Репрезентативные примеры актиномицинов включают, но не ограничиваются ими, актиномицин D (Космеген [также известный как актиномицин, дактиномицин, актиномицин IV, актиномицин C1], Lundbeck, Inc.), антрамицин, чикамицин A, DC-18, мазетрамицин, неотрамицин A, неотрамицин B, поротрамицин, протракарцин B, SG2285, сибаномицин, сибиромицин и томаймицин. В одном варианте осуществления антитело против PRLR по изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним пирроло[2,1-c][1,4]бензодиазепином (PBD). Примеры PDB включают, но не ограничиваются ими, антрамицин, чикамицин A, DC-81, мазетрамицин, неотрамицин A, неотрамицин B, поротрамицин, протракарцин B, SG2285, сибмномицин, сибиромицин и томаймицин. Таким образом, в одном варианте осуществления антитело против PRLR по изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним актиномицином, например актиномицином D, или по меньшей мере одним PBD, например, димером пирролобензодиазепина (PBD).
b. Антрациклины
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним антрациклином. Антрациклины представляют собой подкласс противоопухолевых антибиотиков, выделенных из бактерий рода Streptomyces. Репрезентативные примеры включают, но не ограничиваются ими, даунорубицин (Церубидин, Bedford Laboratories), доксорубицин (Адриамицин, Bedford Laboratories; также обозначаемый как доксорубицин гидрохлорид, гидроксидаунорубицин, и Рубекс), эпирубицин (Элленс, Pfizer) и идарубицин (Идамицин; Pfizer Inc.). Таким образом, в одном варианте осуществления антитело против PRLR по изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним антрациклином, например доксорубицином.
c. Калихеамицины
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним калихеамицином. Калихеамицины представляют собой семейство эндииновых антибиотиков, происходящих из почевенного организма Micromonospora echinospora. Калихеамицины связывают малую бороздку ДНК и индуцируют двухцепочечные разрывы ДНК, что приводит к гибели клеток, в 100 раз большей, чем в случае других химиотерапевтических средств (Damle et al. (2003) Curr Opin Pharmacol 3:386). Получение калихеамицинов, которые можно использовать в качестве конъюгатов лекарственных средств в рамках изобретения, известно в данной области, см. патенты США № 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 и 5877296. Структурные аналоги калихеамицина, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, γ1I, α2I, α3I, N-ацетил-γ1I, PSAG и θI1 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) и упомянутые выше патенты США № 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 и 5877296). Таким образом, в одном варианте осуществления антитело против PRLR по изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним калихеамицином.
d. Дуокармицины
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним дуокармицином. Дуокармицины представляют собой подкласс противоопухолевых антибиотиков, выделенных из бактерий рода Streptomyces. (см. Nagamura and Saito (1998) Chemistry of Heterocyclic Compounds, Vol. 34, No. 12). Дуокармицины связываются с малой бороздкой ДНК и алкилируют нуклеотидное основание аденин в положении N3 (Boger (1993) Pure and Appl Chem 65(6):1123; и Boger and Johnson (1995) PNAS USA 92:3642). Синтетические аналоги дуокармицинов включают, но не ограничиваются ими, адозелезин, бизелезин и карзелезин. Таким образом, в одном варианте осуществления антитело против PRLR по изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним дуокармицином.
e. Другие противоопухолевые антибиотики
В дополнение к вышеуказанному, дополнительные противоопухолевые антибиотики, которые можно использовать в ADC против PRLR по изобретению, включают блеомицин (Blenoxane, Bristol-Myers Squibb), митомицин и пликамицин (также известный как митрамицин).
3. Иммуномодулирующие средства
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним иммуномодулирующим средством. Как используют в рамках изобретения, термин "иммуномодулирующее средство" относится к средству, которое может стимулировать или модифицировать иммунный ответ. В одном варианте осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой иммуностимулятор, который усиливает иммунный ответ у индивидуума. В другом варианте осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой иммунодепрессант, который предотвращает или снижает иммунный ответ у индивидуума. Иммуномодулирующее средство может модулировать миелоидные клетки (моноциты, макрофаги, дендритные клетки, мегакариоциты и гранулоциты) или лимфоидные клетки (T-клетки, B-клетки и натуральные киллерные (NK) клетки) и любую далее дифференцированную их клетку. Репрезентативные примеры включают, но не ограничиваются ими, бациллу Кальметта-Герена (BCG) и левамизол (Эргамизол). Другие примеры иммуномодулирующих средств, которые можно использовать в ADC по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, вакцины против злокачественной опухоли, цитокины и иммуномодулирующую генную терапию.
a. Вакцины против злокачественной опухоли
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано с вакциной против злокачественной опухоли. Как используют в рамках изобретения, термин "вакцина против злокачественной опухоли" относится к композиции (например, опухолевому антигену и цитокину), которая индуцирует опухолеспецифический иммунный ответ. Ответ индуцируется собственной иммунной системой индивидуума при введении вакцины против злокачественной опухоли, или, в случае настоящего изобретения, при введении ADC, содержащего антитело против PRLR и вакцину против злокачественной опухоли. В предпочтительных вариантах осуществления иммунный ответ приводит к устранению опухолевых клеток в организме (например, первичные или метастатические опухолевые клетки). Применение вакцин против злокачественной опухоли, как правило, вовлекает введение конкретного антигена или группы антигенов, которые, например, присутствуют на поверхности конкретной злокачественной клетки или присутствуют на поверхности конкретного инфекционного агента, для которого показано, что он способствует образованию злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления применение вакцин против злокачественной опухоли предназначено для профилактических целей, в то время как в других вариантах осуществления применение предназначено для терапевтических целей. Неограничивающие примеры вакцин против злокачественной опухоли, которые можно использовать в ADC против PRLR по изобретению, включают рекомбинантную двухвалентную вакцину против вируса папилломы человека (HPV) 16 и 18 типов (Cervarix, GlaxoSmithKline), рекомбинантную четырехвалентную вакцину против вируса папилломы человека (HPV) 6, 11, 16 и 18 типов (Gardasil, Merck & Company), и сипулейцел-T (Provenge, Dendreon). Таким образом, в одном варианте осуществления антитело против PRLR по изобретению конъюгировано по меньшей мере с одной вакциной против злокачественной опухоли, которая является либо иммуностимулятором, либо иммунодепрессантом.
b. Цитокины
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним цитокином. Термин "цитокин", как правило, относится к белкам, высвобождаемым одной популяций клеток, которые действуют на другую клетку в качестве межклеточных медиаторов. Цитокины прямо стимулируют иммунные эффекторные клетки и стромальные клетки в области опухоли и усиливают распознавание опухолевых клеток цитотоксическими эффекторными клетками (Lee and Margolin (2011) Cancers 3:3856). Многочисленные исследования в моделях опухоли на животных продемонстрировали, что цитокины имеют широкую противоопухолевую активность, и это обусловило ряд подходов терапии злокачественной опухоли на основе цитокинов (Lee and Margoli, выше). В последние годы начались клинические испытания ряда цитокинов, включая GM-CSF, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 и IL-21, для пациентов с развернутой злокачественной опухолью (Lee and Margoli, выше).
Примеры цитокинов, которые можно использовать в ADC по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреостимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); фактор роста печени; фибробластный фактор роста; пролактин; плацентарный лактоген; фактор некроза опухоли; мюллерово ингибирующее вещество; ассоциированный с гонадотропином мыши пептид; ингибин; активин; сосудисто-эндотелиальный фактор роста; интегрин; тромбопоэтин (TPO); факторы роста нервов, такие как NGF; тромбоцитарный фактор роста; трансформирующие факторы роста (TGF); инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (EPO); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон α, β и γ, колониестимулирующин факторы (CSF); гранулоцитарно-макрофагальный C-SF (GM-CSF); и гранулоцитарный CSF (G-CSF); интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; фактор некроза опухоли; и другие полипептидные факторы, включая LIF и kit-лиганд (KL). Как используют в рамках изобретения, термин "цитокин" включает белки из природных источников или из рекомбинантной культуры клеток и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретение относится к ADC, содержащему антитело против PRLR, описанное в настоящем описании, и цитокин.
c. Колониестимулирующие факторы (CSF)
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним колониестимулирующим фактором (CSF). Колониестимулирующие факторы (CSF) представляют собой факторы роста, которые способствуют образованию в костном мозге эритроцитов. Поскольку некоторые способы лечения злокачественной опухоли (например, химиотерапия) могут влиять на лейкоциты (которые помогают бороться с инфекцией), колониестимулирующие факторы можно вводить для поддержания уровней лейкоцитов и усиления иммунной системы. Колониестимулирующие факторы также можно использовать после трансплантации костного мозга, чтобы способствовать началу продуцирования новым костным мозгом лейкоцитов. Репрезентативные примеры CSF, которые можно использовать в ADC против PRLR по изобретению, включают, но не ограничиваются ими эритропоэтин (эпоэтин), филграстим (Неопоген (также известный как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF); Amgen, Inc.), сарграмостим (лейкин (гранулолцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и GM-CSF); Genzyme Corporation), промегапоэтин и Опрелвекин (рекомбинантный IL-11; Pfizer, Inc.). Таким образом, в одном варианте осуществления изобретение относится к ADC, содержащему антитело против PRLR, описанное в настоящем описании, и CSF.
4. Генная терапия
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одной нуклеиновой кислотой (прямо или непрямо через носитель) для генной терапии. Генная терапия, главным образом, относится к введению генетического материала в клетку, причем генетический материал предназначен для лечения заболевания. Поскольку она относится к иммуномодулирующим средствам, генную терапию используют для стимуляции естественной способности индивидуума ингибировать пролиферацию злокачественных клеток или уничтожать злокачественные клетки. В одном варианте осуществления ADC против PRLR по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный терапевтический ген, который используют для замены мутантного или иным образом нефункционального (например, укороченного) гена, ассоциированного со злокачественной опухолью. В других вариантах осуществления ADC против PRLR по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует или иным образом обеспечивает продукцию терапевтического белка для лечения злокачественной опухоли. Нуклеиновую кислоту, которая кодирует терапевтический ген, можно прямо конъюгировать с антителом против PRLR, или альтернативно ее можно конъюгировать с антителом против PRLR через носитель. Примеры носителей, которые можно использовать для доставки нуклеиновой кислоты для генной терапии, включают, но не ограничиваются ими, вирусные векторы или липосомы.
5. Алкилирующие средства
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано с одним или несколькими алкилирующим средством(ами). Алкилирующие средства представляют собой класс антинеопластических соединений, которые связывают алкильную группу с ДНК. Примеры алкилирующих средств, которые можно использовать в ADC по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, алкилсульфонаты, этиленимины, производные метиламина, эпоксиды, азотистые иприты, нитрозомочевину, триазины и гидразины.
a. Алкилсульфонаты
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним алкилсульфонатом. Алкилсульфонаты представляют собой подкласс алкилирующих средств общей формулы: R-SO2-O-R1, где R и R1, как правило, представляют собой алкильные или арильные группы. Репрезентативный пример алкилсульфонатов включает, но не ограничивается ими, бусульфан (Мирелан, GlaxoSmithKline; Бусулфекс IV, PDL BioPharma, Inc.).
b. Азотистые иприты
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним азотистым ипритом. Репрезентативные примеры этого подкласса соединений против злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими, хлорамбуцил (Лейкеран, GlaxoSmithKline), циклофосфамид (Цитоксан, Bristol-Myers Squibb; Неосар, Pfizer, Inc.), эстрамустин (эстрамустин фосфат натрий или Эстрацит), Pfizer, Inc.), ифосфамид (Batrc, Bristol-Myers Squibb), мехлорэтамин (Мустарген, Lundbeck Inc.) и мелфалан (Алкеран или L-Pam или фенилаланин иприт; GlaxoSmithKline).
c. Нитрозомочевина
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним соединением нитрозомочевины. Соединения нитрозомочевины представляют собой подкласс алкилирующих средств, которые являются жирорастворимыми. Репрезентативные примеры включают, но не ограничиваются ими, кармустин (BCNU [также известный как BiCNU, N,N-бис(2-хлорэтил)-N-нитрозомочевина, или 1,3-бис(2-хлорэтил)-l-нитрозомочевина], Bristol-Myers Squibb), фотемустин (также известный как Муфоран), ломустин (CCNU или 1-(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозомочевина, Bristol-Myers Squibb), нимустин (также известный как ACNU) и стрептозоцин (Zanosar, Teva Pharmaceuticals).
d. Триазины и гидразины
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним триазином или гидразином. Триазины и гидразины представляют собой подкласс азотсодержащих алкилирующих средств. В некоторых вариантах осуществления эти соединения самопроизвольно разлагаются или могут метаболизироваться с образованием алкилдиазониевых промежуточных соединений, которые способствуют переносу алкильной группы на нуклеиновые кислоты, пептиды и/или полипептиды, тем самым, вызывая мутагенные, канцерогенные или цитотоксические эффекты. Репрезентативные примеры включают, но не ограничиваются ими дакарбазин (DTIC-Dome, Bayer Healthcare Pharmaceuticals Inc.), прокарбазин (Муталан, Sigma-Tau Pharmaceuticals, Inc.), и темозоломид (Темодар, Schering Plough).
e. Другие алкилирующие средства
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним этиленимином, производным метиламина или эпоксидом. Этиленимины представляют собой подкласс алкилирующих средств, которые, правило, содержат по меньшей мере одно азиридиновое кольцо. Эпоксиды представляют собой подкласс алкилирующих средств, которые охарактеризованы как циклические простые эфиры только с тремя атомами кольца.
Репрезентативные примеры этилениминов включают, но не ограничиваются ими тиотепу (Тиоплекс, Amgen), диазиквон (также известный как азиридинилбензохинон (AZQ)) и митомицин C. Митомицин C представляет собой природный продукт, который содержит азиридиновое кольцо и, по-видимому, индуцирует цитотоксичность посредством перекрестного сшивания ДНК (Dorr RT, et al. Cancer Res. 1985;45:3510; Kennedy KA, et al Cancer Res. 1985;45:3541). Репрезентативные примеры производных метиламина и их аналогов включают, но не ограничиваются ими, алтретамин (Гексален, MGI Pharma, Inc.), который также известен как гексаметиламин и гексастат. Репрезентативные примеры эпоксидов этого класса соединений против злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими, диангидрогалактит. Диангидрогалактит (1,2:5,6-диангидродульцит) является химически родственным азиридинам и, как правило, способствует переносу алкильной группы посредством сходного механизма, как описано выше. Дибромдульцит гидролизуется до диангидролактита и, таким образом, представляет собой пролекарство эпоксида (Sellei C, et al. Cancer Chemother Rep. 1969;53:377).
6. Антиангиогенные средства
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним антиангиогенным средством. Антиангиогенные средства ингибируют рост новых кровеносных сосудов. Антиангиогенные средства проявляют их эффекты различными путями. В некоторых вариантах осуществления эти средства препятствуют способности фактора роста достигать своей мишени. Например, сосудисто-эндотелиальный фактор роста (VEGF) представляет собой один из основных белков, вовлеченных в инициацию ангиогенеза путем связывания с конкретными рецепторами на клеточной поверхности. Таким образом, определенные антиангиогенные средства, которые препятствуют взаимодействию VEGF с распознаваемым им рецептором, препятствуют инициации ангиогенеза посредством VEGF. В других вариантах осуществления эти средства препятствуют каскадам внутриклеточной передачи сигнала. Например, после запуска конкретного рецептора на поверхности клетки инициируется каскад других химических сигналов, обеспечивающих рост кровеносных сосудов. Таким образом, определенные ферменты, например, некоторые тирозинкиназы, о которых известно, что они способствуют каскадам внутриклеточной передачи сигнала, которые участвуют, например, в пролиферации клеток, являются мишенями для лечения злокачественной опухоли. В других вариантах осуществления эти средства препятствуют каскадам межклеточной передачи сигнала. Кроме того, в других вариантах осуществления эти средства блокируют конкретные мишени, которые активируют и стимулируют рост клеток или прямо препятствуют росту клеток кровеносных сосудов. Свойства ингибирования ангиогенеза были выявлены более чем у 300 веществ с многочисленными прямыми и непрямыми ингибиторными эффектами.
Репрезентативные примеры антиангиогенных средств, которые можно использовать в ADC по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, ангиостатин, ABX EFG, C1-1033, PKI-166, вакцину против EGF, EKB-569, GW2016, ICR-62, EMD 55900, CP358, PD153035, AG1478, IMC-C225 (Эрбитукс, ZD1839 (Иресса), OSI-774, Эрлотиниб (тарцева), ангиостатин, аррестин, эндостатин, BAY 12-9566 и с фторурацилом или доксорубицином, канстатин, карбоксиамидотриозол и с паклитакселом, EMD121974, S-24, витаксин, диметилксантенон уксусную кислоту, IM862, интерлейкин-12, интерлейкин-2, NM-3, HuMV833, PTK787, RhuMab, ангиозим (рибозим), IMC-1C11, Неовастат, маримастат, приномастат, BMS-275291, COL-3, MM1270, SU101, SU6668, SU11248, SU5416, с паклитакселом, с гемцитабином и цисплатином, и с иринотеканом и цисплатином и лючевой терапией, текогалан, темозоломид и PEG-интерферон α2b, тетратиомолибдат, TNP-470, талидомид, CC-5013 и с таксотером, темстатин, 2-метоксиэстрадиол, ловушку VEGF, ингибиторы mTOR (дефоролимус, эверолимус (Афинитор, Novartis Pharmaceutical Corporation) и темсиролимус (Торисел, Pfizer, Inc.)), ингибиторы тирозинкиназы (например, эрлотиниб (Тарцева, Genentech, Inc.), иматиниб (Гливек, Novartis Pharmaceutical Corporation), гефитиниб (Иресса, AstraZeneca Pharmaceuticals), дасатиниб (Sprycel, Brystol-Myers Squibb), сунитиниб (Сутент, Pfizer, Inc.), нилотиниб (Тасигна, Novartis Pharmaceutical Corporation), лапатиниб (Тайкерб, GlaxoSmithKline Pharmaceuticals), сорафениб (Нексавар, Bayer and Onyx), фосфоинозитид-3-киназы (PI3K).
7. Антиметаболиты
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним антиметаболитом. Антиметаболиты представляют собой типы химиотерапевтических средств, которые очень сходны с нормальными веществами в клетке. Когда клетки включают антиметаболит в клеточный метаболизм, результат является отрицательным для клетки, например, клетка становится неспособной делиться. Антиметаболиты классифицируют в зависимости от веществ, которым они противодействуют. Примеры антиметаболитов, которые можно использовать в ADC по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, антагонист фолиевой кислоты (например, метотрексат), антагонист пиримидина (например, 5-фторурацил, фоксуридин, цитарабин, капецитабин и гемцитабин), антагонист пурина (например, 6-меркаптопурин и 6-тиогуанин) и ингибитор аденозиндезаминазы (например, кладрибин, флударабин, неларабин и пентостатин), как более подробно описано ниже.
a. Антифолаты
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним антифолатом. Антифолаты представляют собой подкласс антиметаболитов, которые являются структурно сходными с фолатом. Репрезентативные примеры включают, но не ограничиваются ими, метотрексат, 4-амино-фолиевую кислоту (также известную как аминоптерин и 4-аминоптероевая кислота), лометрексол (LMTX), пеметрексед (Алимпта, Eli Lilly and Company) и триметрексат (Нейтрексин, Ben Venue Laboratories, Inc.)
b. Антагонисты пуринов
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним антагонистом пуринов. Аналоги пуринов представляют собой подкласс антиметаболитов, которые структурно сходны с группой соединений, известных как пурины. Репрезентативные примеры антагонистов пуринов включают, но не ограничиваются ими, азатиоприн (Азасан, Salix; Imuran, GlaxoSmithKline), кладрибин (Лейстатин [также известный как 2-CdA], Janssen Biotech, Inc.), меркаптопурин (Пуринтол [также известный как 6-меркаптоэтанол], GlaxoSmithKline), флударабин (Флудара, Genzyme Corporation), пентостатин (Нипент, также известный как 2'-дезоксикоформицин (DCF)), 6-тиогуанин (Ланвис [также известный как тиогуанин], GlaxoSmithKline).
c. Антагонисты пиримидинов
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним антагонистом пиримидинов. Антагонисты пиримидинов представляют собой подкласс антиметаболитов, которые структурно сходны с группой соединений, известных как пурины. Репрезентативные примеры антагонистов пиримидинов включают, но не ограничиваются ими, азацитидин (Видаза, Celgene Corporation), капецитабин (Кселода, Roche Laboratories), Цитарабин (также известный как цитозин арабинозид и арабинозилцитозин, Bedford Laboratories), децитабин (Дакоген, Eisai Pharmaceuticals), 5-фторурацил (Адруцил, Teva Pharmaceuticals; Эфудекс, Valeant Pharmaceuticals, Inc), 5-фтор-2'-дезоксиуридин 5'-фосфат (FdUMP), 5-фторуридин трифосфат и гемцитабин (Гемзар, Eli Lilly and Company).
8. Борсодержащие средства
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним борсодержащим средством. Борсодержащие средства включают класс терапевтических соединений против злокачественной опухоли, которые препятствуют клеточной пролиферации. Репрезентативные примеры борсодержащих средств включают, но не ограничиваются ими, борфицин и бортезомиб (Велкада, Millenium Pharmaceuticals).
9. Хемопротективные средства
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним хемопротективным средством. Хемопротективные лекарственные средства представляют собой класс соединений, которые помогают защитить организм от конкретных токсических эффектов химиотерапии. Хемопротективные средства можно вводить с проведением различных способов химиотерапии, чтобы защитить здоровые клетки от токсических эффектов химиотерапевтических лекарственных средств, одновременно позволяя обработку злокачественных клеток введенным химиотерапевтическим средством. Репрезентативные хемопротективные средства включают, но не ограничиваются ими, амифостин (Этиол, Medimmune, Inc.), который используют для уменьшения почечной токсичности, ассоциированной с совокупными дозами цисплатина, дексразоксан (Тотект, Apricus Pharma; Зинекард), для лечения экстравазации, вызываемой введением антрациклина (Тотект), и для лечения сердечных осложнений, вызываемых введением противоопухолевого антибиотика доксорубицина (Зинекард) и месны (Меснекс, Bristol-Myers Squibb), которые используют для предупреждения геморрагического цистита в ходе химиотерапевтического лечения ифосфамидом.
10. Гормональные средства
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним гормональным средством. Гормональное средство (включающее синтетические гормоны) представляет собой соединение, которое препятствует продуцированию или активности эндогенно продуцируемых гормонов эндокринной системы. В некоторых вариантах осуществления эти соединения препятствуют росту клеток или вызывают цитотоксический эффект. Неограничивающие примеры включают андрогены, эстрогены, медроксипрогестерон ацетат (Провера, Pfizer, Inc.) и прогестины.
11. Антигормональные средства
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним антигормональным средством. "Антигормональное" средство представляет собой средство, которое подавляет продуцирование и/или препятствует функции определенных эндогенных гормонов. В одном варианте осуществления антигормональное средство препятствует активности гормона, выбранного из группы, включающей андрогены, эстрогены, прогестерон и рилизинг-фактор гонадотропина, тем самым, препятствуя росту различных злокачественных клеток. Репрезентативные примеры антигормональных средств включают, но не ограничиваются ими, аминоглутетимид, анастрозол (Аримидекс, AstraZeneca Pharmaceuticals), бикалутамид (Касодекс, AstraZeneca Pharmaceuticals), ципротерон ацетат (Ципростат, Bayer PLC), дегареликс (Фирмагон, Ferring Pharmaceuticals), экземестан (Аромазин, Pfizer Inc.), флутамид (Дрогенил, Schering-Plough Ltd), фулвестрант (Фаслодекс, AstraZeneca Pharmaceuticals), гозерелин (Золодекс, AstraZeneca Pharmaceuticals), лектрозол (Фемара, Novartis Pharmaceuticals Corporation), леупролид (Простап), люпрон, медроксипрогестерон ацетат (Провера, Pfizer Inc.), Магестрола ацетат (Мегейс, Bristol-Myers Squibb Company), тамоксифен (Нолвадекс, AstraZeneca Pharmaceuticals) и трипторелин (Декапетил, Ferring).
12. Кортикостероиды
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним кортикостероидом. Кортикостероиды можно использовать в ADC по изобретению для снижения воспаления. Пример кортикостероида включает, но не ограничивается ими, глюкокортикоид, например, преднизон (Дельтазон, Pharmacia & Upjohn Company, отделение Pfizer, Inc.).
13. Фотоактивные лекарственные средства
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним фотоактивным лекарственным средством. Фотоактивные лекарственные средства включают соединения, которые можно доставлять для уничтожения обработанных клеток под действием электромагнитного излучения с конкретной длиной волны. Терапевтически значимые соединения поглощают электромагнитное излучение при длинах волн, которые проникают в ткань. В предпочтительных вариантах осуществления соединение вводят в нетоксичной форме, которая способна вызывать фотохимический эффект, который является токсичным для клеток или ткани при достаточной активации. В других предпочтительных вариантах осуществления эти соединения задерживаются злокачественной тканью и без труда выводятся из нормальных тканей. Неограничивающие примеры включают различные хромогены и красители.
14. Олигонуклеотиды
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним олигонуклеотидом. Олигонуклеотиды состоят из коротких цепей нуклеиновых кислот, которые действуют, препятствуя переработке генетической информации. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды для применения в ADC представляют собой немодифицированные одноцепочечные и/или двухцепочечные молекулы ДНК или РНК, в то время как в других вариантах осуществления эти терапевтические олигонуклеотиды представляют собой химически модифицированные одноцепочечные и/или двухцепочечные молекулы ДНК или РНК. В одном варианте осуществления олигонуклеотиды, используемые в ADC, являются относительно короткими (19-25 нуклеотидов) и гибридизуются с уникальной последовательностью нуклеиновой кислоты в общей совокупности нуклеиновых кислот-мишеней, присутствующих в клетках. Некоторые из важных олигонуклеотидных технологий включают антисмысловые олигонуклеотиды (включая РНК-интерференцию (РНК-i)), аптамеры, CpG-олигонуклеотиды и рибозимы.
a. Антисмысловые олигонуклеотиды
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом. Антисмысловые олигонуклеотиды конструируют для связывания с РНК посредством гибридизации по принципу Уотсона-Крика. В некоторых вариантах осуществления антисмысловой олигонуклеотид комплементарен нуклеотиду, кодирующему область, домен, часть или сегмент PRLR. В некоторых вариантах осуществления антисмысловой олигонуклеотид содержит от приблизительно 5 до приблизительно 100 нуклеотидов, от приблизительно 10 до приблизительно 50 нуклеотидов, от приблизительно 12 до приблизительно 35, и от приблизительно 18 до приблизительно 25 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 100% гомологичен области, части, домену или сегменту гена PRLR. В некоторых вариантах осуществления существует существенная гомология последовательностей на протяжении по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, или 100 последовательно расположенных нуклеотидов гена PRLR. В предпочтительных вариантах осуществления размер этих антисмысловых олигонуклеотидов находится в диапазоне от 12 до 25 нуклеотидов в длину, причем длина большинства антисмысловых олигонуклеотидов составляет от 18 до 21 нуклеотидов. Существует множество механизмов, которые можно использовать для ингибирования функции РНК после связывания олигонуклеотида с РНК-мишенью (Crooke ST. (1999). Biochim. Biophys. Acta, 1489, 30-42). Наилучшим образом охарактеризованный антисмысловой механизм приводит к расщеплению РНК-мишени эндогенными клеточными нуклеазами, такими как РНК-аза H или нуклеаза, ассоциированная с механизмом РНК-интерференции. Однако олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию гена-мишени посредством некаталитических механизмов, таких как модулирование сплайсинга или остановка трансляции, также могут быть мощными и селективными модуляторами функции генов.
Другим зависимым от РНКаз антисмысловым механизмом, который недавно привлек существенное внимание, является РНК-i (Fire et al. (1998). Nature, 391, 806-811.; Zamore PD. (2002). Science, 296, 1265-1269.). РНК-интерференция (РНК-i) представляет собой посттранскрипционный процесс, в котором двухцепочечная РНК ингибирует экспрессию генов специфическим для последовательности образом. В некоторых вариантах осуществления эффекта РНК-i достигают путем введения относительно более длинной двухцепочечной РНК (дцРНК (dsRNA)), в то время как в предпочтительных вариантах осуществления этого эффекта РНК-i достигают путем введения более коротких двухцепочечных РНК, например, малых интерферирующих РНК (миРНК (siRNA)) и/или микроРНК (miRNA). В другом варианте осуществления РНК-i также можно достигать путем введения плазмиды, которая продуцирует дцРНК, комплементарную гену-мишени. В каждом из указанных выше вариантов осуществления двухцепочечная РНК предназначена для препятствования экспрессии гена с конкретной последовательностью-мишенью в клетках. Как правило, механизм вовлекает преобразование дцРНК в короткие РНК, которые направляют рибонуклеазы к гомологичным мРНК-мишеням (обобщенно, Ruvkun, Science 2294:797 (2001)), которые затем разрушают соответствующую эндогенную мРНК, тем самым обеспечивая модулирование экспрессии гена. Примечательно, было описано, что дцРНК обладают антипролиферативными свойствами, что дает возможность также предусматривать терапевтические применения (Aubel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:906 (1991)). Например, было показано, что синтетическая дцРНК ингибирует рост опухоли у мышей (Levy et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 62:357-361 (1969)), является активной при лечении лейкоза у мышей (Zeleznick et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 130:126-128 (1969)) и ингибирует химически индуцированное образование опухоли в кожи мыши (Gelboin et al., Science 167:205-207 (1970)). Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к применению антисмысловых олигонуклеотидов в ADC для лечения рака молочной железы. В других вариантах осуществления изобретение относится к композициям и способам для начала инициации лечения антисмысловым олигонуклеотидом, где дцРНК препятствует экспрессии в клетке-мишени PRLR на уровне мРНК. Как используют выше, дцРНК относится к встречающейся в природе РНК, частично очищенной РНК, рекомбинантно продуцированной РНК, синтетической РНК, а также измененной РНК, которая отличается от встречающейся в природе РНК включением нестандартных нуклеотидов, ненуклеотидного материала, аналогов нуклеотидов (например, замкнутая нуклеиновая кислота (LNA)), дезоксирибонуклеотидов и любой их комбинации. РНК по настоящему изобретению должна быть только достаточно сходной с природной РНК, чтобы она обладала способностью опосредовать модулирование на основе антисмыслового олигонуклеотида, описанного в настоящем описании.
b. Аптамеры
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним аптамером. Аптамер представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая выбрана из случайных совокупностей молекул, исходя из ее способности связывать другие молекулы. Подобно антителам, аптамеры могут связывать молекулы-мишени с чрезвычайной аффинностью и специфичностью. Во многих вариантах осуществления аптамеры принимают комплексные, зависимые от последовательности, трехмерные формы, которые позволяют им взаимодействовать с белком-мишенью, что приводит к прочно связанному комплексу, аналогичному взаимодействию антитело-антиген, тем самым, препятствуя функции указанного белка. Конкретная способность аптамеров прочно и специфично связываться с их белком-мишенью лежит в основе их потенциала в качестве направленных молекулярных терапевтических средств.
c. CpG-олигонуклеотиды
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним CpG-олигонуклеотидом. Известно, что бактериальная и вирусная ДНК являются мощными активаторами как врожденного, так и специфического иммунитета у человека. Эти иммунологические характеристики ассоциированы с неметилированными CpG-динуклеотидными мотивами, встречающимися в бактериальной ДНК. Благодаря тому факту, что эти мотивы являются редкими у человека, в иммунной системе человека развилась способность распознавать эти мотивы в качестве раннего признака инфекции, а затем инициировать иммунные ответы. Таким образом, олигонуклеотиды, содержащие этот CpG-мотив, можно использовать для инициации противоопухолевого иммунного ответа.
d. Рибозимы
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним рибозимом. Рибозимы представляют собой каталитические молекулы РНК, имеющие длину в диапазоне приблизительно от 40 до 155 нуклеотидов. Способность рибозимов распознавать и расщеплять определенные молекулы РНК делает их потенциальными кандидатами для терапевтических средств. Репрезентативный пример включает ангиозим.
15. Радионуклидные средства (радиоактивные изотопы)
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним радионуклидным средством. Радионуклидные средства включают средства, которые характеризуются нестабильным ядром, которое способно претерпевать радиоактивный распад. Основа для успешного лечения радионуклидом зависит от достаточной концентрации и длительного удержания радионуклида злокачественной клетки. Другие учитываемые факторы включают время полужизни радионуклида, энергию испускаемых частиц и максимальный диапазон, на который испускаемая частица может проходить. В предпочтительных вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой радионуклид, выбранный из группы, состоящей из 111In, 177Lu, 212Bi, 213Bi, 211At, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 90Y, 125I, 131I, 32P, 33P, 47Sc, 111Ag, 67Ga, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 59Fe, 75Se, 77As, 89Sr, 99Mo, 105Rh, 109Pd, 143Pr, 149Pm, 169Er, 194Ir, 198Au, 199Au и 211Pb. Также предпочтительными являются радионуклиды, которые по существу распадаются с частицами Оже. Например, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111 1, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m и Ir-192. Полезные испускающие бета-частицы нуклиды с энергией распада предпочтительно представляют собой Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-21 1, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213 и Fm-255. Энергия распада полезных испускающих альфа-частицы радионуклидов предпочтительно равна 2000-10000 кэВ, более предпочтительно 3000-8000 кэВ, и наиболее предпочтительно 4000-7000 кэВ. Дополнительные потенциальные радиоизотопы для применения включают 11C, 13N, 15О, 75Br, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113mIn, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 121mTe, 122mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 197Pt, 109Pd, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 166Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201Tl, 225Ac, 76Br, I69Yb и т.п.
16. Радиосенсибилизирующие средства
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним радиосенсибилизирующим средством. Термин "радиосенсибилизирущее средство", как используют в рамках изобретения, определяют как молекулу, предпочтительно низкомолекулярную молекулу, вводимую животным в терапевтически эффективных количествах для увеличения чувствительности клеток, чтобы они стали радиосенсибилизированными к электромагнитному излучению и/или обеспечения лечения заболеваний, которые поддаются лечению электромагнитным излучением. Радиосенсибилизаторы представляют собой средства, которые делают злокачественные клетки более чувствительными к лучевой терапии, одновременно, как правило, имея значительно меньший эффект на нормальные клетки. Таким образом, радиосенсибилизирующее средство можно использовать в комбинации с радиоактивно меченным антителом или ADC. Добавление радиосенсибилизирующего средства может приводить к увеличенной эффективности по сравнению с обработкой радиоактивно меченным антителом или фрагментом антитела отдельно. Радиосенсибилизирующие средства описаны в D. M. Goldberg (ed.), Cancer Therapy with Radiolabeled Antibodies, CRC Press (1995). Примеры радиосенсибилизирующих средств включают гемцитабин, 5-фторурацил, таксан и цисплатин.
Радиосенсибилизирующие средства могут активироваться электромагнитным облучением рентгеновскими лучами. Репрезентативные примеры активированных рентгеновскими лучами радиосенсибилизирующих средств включают, но не ограничиваются ими, следующие средства: метронидазол, мизонидазол, десметилмизонидазол, пимонидазол, этанидозол, ниморазол, митомицин C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, никотинамид, 5-бромдезоксиуридин (BUdR), 5-йоддезоксиуридин (IUdR), бромдезоксицитидин, фтордезоксиуридин (FUdR), гидроксимочевину, цисплатин и терапевтически эффективные аналоги и их производные. Альтернативно, радиосенсибилизирующие средства могут активироваться с использованием фотодинамической терапии (PDT). Репрезентативные примеры фотодинамических радиосенсибилизирующих средств включают, но не ограничиваются ими, производные гематопорфирина, фотофрин(r), производные бензопорфирина, NPe6, олово-этиопорфирин (SnET2), феоборбид a, бактериохлорофилл a, нафталоцианины, фталоцианины, цинк-фталоцианин и их терапевтически эффективные аналоги и производные.
17. Ингибиторы топоизомеразы
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним ингибитором топоизомеразы. Ингибиторы топоизомеразы представляют собой химиотерапевтические средства, предназначенные для препятствования действию ферментов топоизомераз (топоизомераза I и II), которые представляют собой ферменты, которые контролируют изменения структуры ДНК путем катализа, а затем разрушения и повторного соединения фосфодиэфирного остова цепей ДНК в ходе нормального клеточного цикла. Репрезентативные примеры ингибиторов ДНК-топоизомеразы I включают, но не ограничиваются ими, камптотецины и их производные иринотекан (CPT-11, Камптосар, Pfizer, Inc.) и топотекан (Гикамтин, GlaxoSmithKline Pharmaceuticals). Репрезентативные примеры ингибиторов ДНК-топоизомеразы II включают, но не ограничиваются ими, амсакрин, даунорубицин, доксорубицин, эпиподофиллотоксины, эллиптицины, эпирубицин, этопозид, разоксан и тенипозид.
18. Ингибиторы тирозинкиназы
Антитело против PRLR по изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одним ингибитором тирозинкиназы. Тирозинкиназы представляют собой ферменты в клетке, которые функционируют, связывая фосфатные группы с аминокислотой тирозином. Путем блокирования способности тирозинкиназ белков функционировать, может ингибироваться рост опухоли. Примеры тирозинкиназ, которые можно использовать в ADC по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, акситиниб, босутиниб, цедираниб, дасатиниб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, лестауртиниб, нилотиниб, семаксаниб, сунитиниб и вандетаниб.
19. Другие средства
Примеры других средств, которые можно использовать в ADC по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, абрин (например, A-цепь абрина), альфа-токсин, белки Aleurites fordii, аматоксин, кротин, курцин, диантиновые белки, дифтерийный токсин (например, A-цепь дифтерийного токсина и несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина), дезоксирибонуклеазу (ДНК-азу), гелонин, митогеллин, A-цепь модецина, ингибитор momordica charantia, неомицин, онконазу, феномицин, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), антивирусный белок лаконоса, эндотоксин Pseudomonas, экзотоксин Pseudomonas (например, A-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa)), рестриктоцин, A-цепь рицина, рибонуклеазу (РНК-азу), ингибитор sapaonaria officinalis, сапорин, альфа-сарцин, стафилококковый энтеротоксин-A, столбнячный токсин, цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин (Элоксатин, Sanofi Aventis), ингибиторы протеасом (например, PS-341 [бортезомиб или Велкейд]), ингибиторы HDAC (вориностат (Золинза, Merck & Company, Inc.)), белиностат, энтиностат, моцетиностат и панобиностат), ингибиторы COX-2, замещенные соединения мочевины, ингибиторы белков теплового шока (например, гелданамицин и его многочисленные аналоги), адренокортикальные супрессоры и трикотецены. (См., например, WO 93/21232). Другие средства также включают аспарагиназу (Эспар, Lundbeck Inc.), гидроксимочевину, левамизол, митотан (Лизодрен, Bristol-Myers Squibb) и третиноин (Ренова, Valeant Pharmaceuticals Inc.).
Следует отметить, что упомянутые выше группы частей лекарственного средства, которые можно использовать в ADC против PRLR по изобретению, не являются исключительными, поскольку определенные примеры лекарственных средств могут быть найдены более чем в одной категории, например, ансамитоцины являются как ингибиторами митоза, так и противоопухолевыми антибиотиками.
Для соединений по изобретению предусматриваются все стереоизомеры указанных выше частей лекарственного средства, т.е. любая комбинация конфигураций R и S в хиральных атомах углерода D.
Описанные выше средства (т.е. средства в чистом виде, не конъюгированные с антителом) также можно использовать в комбинированных способах терапии с антителами против PRLR, описанными в настоящем описании. В одном варианте осуществления антитела против PRLR по изобретению используют с любыми из указанных выше средств в комбинированной терапии для лечения злокачественной опухоли, где средство вводят до, во время или после введения антитела против PRLR индивидууму.
B. Линкеры
Настоящее изобретение относится к ADC против PRLR для направленной доставки лекарственных средств. ADC против PRLR по изобретению содержит антитело против PRLR и лекарственное средство, при этом антитело и лекарственное средство могут быть связаны через линкер. Таким образом, в одном варианте осуществления конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) содержит линкер, цитотоксическое лекарственное средство и антитело против PRLR. Термин "линкер", как используют в рамках изобретения, относится к химической части, содержащей ковалентную связь или цепь атомов, которая ковалентно связывает антитело с частью лекарственного средства. ADC получают с использованием линкера, имеющего реакционноспособную функциональную группу для связывания с антителом и лекарственным средством. Например, тиол цистеина или амин, например, N-конец или боковой цепи аминокислоты, такой как лизин, антитела может образовывать связь с функциональной группой линкера.
Линкеры предпочтительно являются внеклеточно стабильными. До транспорта или доставки в клетку ADC предпочтительно является стабильным и остается интактным, т.е. антитело остается связанным с частью лекарственного средства. Линкеры являются стабильными вне клетки-мишени и могут расщепляться с некоторой эффективной скоростью внутри клетки. Эффективный линкер: (i) сохраняет свойства специфического связывания антитела; (ii) позволяет доставку, например внутриклеточную доставку, конъюгата или части лекарственного средства; и (iii) сохраняет цитотоксический эффект, эффект уничтожения клеток, цитостатический эффект или иной терапевтический эффект части лекарственного средства. Стабильность ADC можно измерять стандартными аналитическими способами, такими как спектроскопия, ВЭЖХ и способ разделения/анализа LC/MS.
Как правило, ADC содержат антитело, ковалентно связанное по меньшей мере с одним элементом лекарственного средства. Элемент(ы) лекарственного средства может быть ковалентно связан прямо или через линкер. Ковалентное связывание антитела и лекарственного средства требует, чтобы линкер имел две реакционноспособных функциональных группы, т.е. был двухвалентным в отношении реакционной способности. Двухвалентные линкерные реагенты, которые пригодны для связывания двух или более функциональных или биологически активных частей, таких как пептиды, нуклеиновые кислоты, лекарственные средства, токсины, антитела, гаптены и репортерные группы, известны, и способы получения их конъюгатов описаны (Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p234-242).
В некоторых вариантах осуществления ADC имеет следующую формулу (формула I):
L-(LU-D)p (I)
или формулу его фармацевтически приемлемой соли или сольвата; где:
L представляет собой антитело, например, антитело против PRLR по настоящему изобретению, и
(LU-D) представляет собой линкер-часть лекарственного средства, где:
LU- представляет собой линкерный элемент (также обозначаемый как линкер), и
-D представляет собой часть лекарственного средства, обладающую, например, цитостатической, цитотоксической или иной терапевтической активностью против клетки-мишени, например, клетки, экспрессирующей PRLR; и
p представляет собой целое число от 1 до 20.
В некоторых вариантах осуществления p находится в диапазоне от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, или от 1 до 2. В некоторых вариантах осуществления p находится в диапазоне от 2 до 10, от 2 до 9, от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4 или от 2 до 3. В других вариантах осуществления p равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В некоторых вариантах осуществления p равно 2, 4, 6 или 8.
В некоторых вариантах осуществления части -D являются одинаковыми. В другом варианте осуществления части -D различаются.
В некоторых вариантах осуществления ADC имеет следующую формулу (II):
L-(Aa-Ww-Yy-D)p (II)
или формулу его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, где:
L представляет собой антитело, например, антитело против PRLR, и
-Aa-Ww-Yy- представляет собой линкерный элемент (LU), где:
-A- представляет собой необязательный удлиняющий элемент,
a равно 0 или 1,
каждый -W- независимо представляет собой аминокислотный элемент (или в некоторых вариантах осуществления глюкуронидный элемент, также см. публикацию США № 2012/0107332 A1),
w представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 12,
-Y- представляет собой саморасщепляющийся спейсерный элемент,
y равно 0, 1 или 2;
-D представляет собой элемент лекарственного средства, обладающий, например, цитостатической, цитотоксической или иной терапевтической активностью против клетки-мишени, например, клетки, экспрессирующей PRLR; и
p представляет собой целое число от 1 до 20.
В некоторых вариантах осуществления a равно 0 или 1, w равно 0 или 1, и y равно 0, 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления a равно 0 или 1, w равно 0 или 1, и y равно 0 или 1. В некоторых вариантах осуществления p находится в диапазоне от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, или от 1 до 2. В некоторых вариантах осуществления p находится в диапазоне от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4 или от 2 до 3. В других вариантах осуществления p равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В некоторых вариантах осуществления p равно 2 или 4. В некоторых вариантах осуществления, когда w не равно нулю, y равно 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления, когда w равно 1-12, y равно 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления w равно 2-12 и y равно 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления a равно 1, и w и y равны 0.
Для композиций, содержащих множество антител, нагрузка лекарственным средством обозначается как p, среднее количество молекул лекарственного средства на антитело. Нагрузка лекарственным средством может находиться в диапазоне от 1 до 20 лекарственных средств (D) на антитело. Среднее количество лекарственных средств на антитело при получении реакционных смесей для конъюгации может быть охарактеризовано общепринятыми способами, такими как масс-спектроскопия, анализ ELISA и ВЭЖХ. Также можно определять количественное распределение ADC в значениях p. В некоторых случаях разделение, очистку и охарактеризацию гомогенных ADC, где p представляет собой определенную величину, из ADC с нагрузкой другими средствами можно осуществлять посредством обращено-фазовой ВЭЖХ или электрофореза. В иллюстративных вариантах осуществления p равно от 2 до 8.
Получение ADC можно осуществлять любым способом, известным квалифицированному специалисту. ADC по изобретению включают антитела против PRLR, описанные в настоящем описании, лекарственное средство и необязательно линкер, который связывает лекарственное средство и антитело. В одном варианте осуществления антитело представляет собой антитело против PRLR, содержащее по меньшей мере одну вариабельную область, указанную в SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 82; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 104; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; SEQ ID NO: 107; SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; SEQ ID NO: 110; SEQ ID NO: 111; SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 113; SEQ ID NO: 114; SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO: 117; SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121; SEQ ID NO: 122 и SEQ ID NO: 123. Для ковалентного связывания лекарственных средств и линкеров с антителами доступен ряд различных реакций. Это можно осуществлять посредством реакции аминокислотных остатков антитела, включающих аминогруппы лизина, свободные группы карбоновых кислот глутаминовой и аспарагиновой кислоты, сульфгидрильные группы цистеина и различные части ароматических аминокислот. Одним из наиболее широко используемых неспецифических способов ковалентного ввязывания является карбодиимидная реакция для связывания карбокси (или амино) группы соединения с амино (или карбокси) группами антитела. Кроме того, бифункциональные средства, такие как диальдегиды или сложные имидоэфиры используют для связывания аминогруппы соединения с аминогруппами антитела. Также доступна для присоединения лекарственных средств к антителам реакция с основанием Шиффа. Этот способ вовлекает окисление перйодатом лекарственного средства, которое содержит группы гликоля или гидроксигруппы, таким образом, образуя альдегид, который затем подвергают реакции со связывающим соединением. Присоединение происходит через образование основания Шиффа с аминогруппами антитела. Также в качестве средств для присоединения для ковалентного связывания лекарственных средств с антителами можно использовать изотиоцианат. Другие способы известны в данной области и входят в объем настоящего изобретения.
В определенных вариантах осуществления промежуточное соединение, которое является предшественником линкера, подвергают реакции с лекарственным средством в подходящих условиях. В определенных вариантах осуществления используют реакционноспособные группы на лекарственном средстве или промежуточном соединении. Затем продукт реакции между лекарственным средством и промежуточным соединением, или дериватизированное лекарственное средство, подвергают реакции с антителом против PRLR в соответствующих условиях. Синтез и структура иллюстративных линкеров, удлиняющих элементов, аминокислотных элементов, саморасщепляющихся спейсерных элементов описаны в публикациях патентных заявок США № 20030083263, 20050238649 и 20050009751, каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Примеры линкеров предоставлены ниже.
В предпочтительном варианте осуществления линкер по существу не является чувствительным к внеклеточной среде. Как используют в рамках изобретения, "по существу не является чувствительным к внеклеточной среде" в контексте линкера означает, что не более чем приблизительно 20%, как правило, не более чем приблизительно 15%, более конкретно, не более чем приблизительно 10%, и еще более конкретно не более чем приблизительно 5%, не более чем приблизительно 3%, или не более чем приблизительно 1% линкеров в образце конъюгата антитело-лекарственное средство расщепляются, когда ADC присутствует во внеклеточной среде (например, в плазме). То, является ли линкер по существу нечувствительным к внеклеточной среде, можно определять, например, путем инкубации с плазмой конъюгата антитело-лекарственное средство в течение заданного периода времени (например, 2, 4, 8, 16 или 24 часов), а затем количественного определения свободного лекарственного средства, присутствующего в плазме.
В некоторых вариантах осуществления линкер является расщепляющимся во внутриклеточных условиях, так что расщепление линкера высвобождает элемент-лекарственное средство из антитела во внутриклеточную среду. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер является чувствительным к pH, т.е. является чувствительным к гидролизу при определенных значениях pH. Как правило, pH-чувствительный линкер является гидролизующимся в кислотных условиях. Например, можно использовать неустойчивый к действию кислот линкер, который гидролизуется в лизосоме (например, гидразон, семикарбазон, тиосемикарбазон, цис-аконитовый амид, сложный отроэфир, ацеталь, кеталь и т.п.) (см., например, патенты США № 5122368; 5824805; 5622929; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661.) Такие линкеры являются относительно стабильными в условиях нейтральных значениях pH, таких как значения pH в крови, но являются нестабильными при значениях pH ниже 5,5 или 5,0, являющихся приблизительными значениями pH в лизосоме. В определенных вариантах осуществления гидролизущийся линкер представляет собой простой тиоэфирный линкер (например, такой как простой тиоэфир, связанный с лекарственным средством через ацилгидразоновую связь (см., например, патент США № 5622929).
В других вариантах осуществления линкер является расщепляемым в восстанавливающих условиях (например, дисульфидный линкер). Множество дисульфидных линкеров известно в данной области, включая, например, линкеры, которые могут быть образованы с использованием SATA (N-сукцинимидил-5-ацетилтиоацетат), SPDP (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат), SPDB (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)бутират) и SMPT (N-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)толуол), SPDB и SMPT. (См., например, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Также см. патент США № 4880935.).
В некоторых вариантах осуществления линкер расщепляется расщепляющим средством, например, ферментом, который присутствует во внутриклеточной среде (например, в лизосоме, или эндосоме, или кавеоле). Линкер может представлять собой, например, пептидильный линкер, который расщепляется внутриклеточным пептидазным или протеазным ферментом, включая, но не ограничиваясь ими, лизосомальную или эндосомальную протеазу. В некоторых вариантах осуществления пептидильный линкер имеет длину по меньшей мере две аминокислоты или по меньшей мере три аминокислоты. Расщепляющие средства могут включать катепсины B и D и плазмин, обо всех из которых известно, что они гидролизуют дипептидные производные лекарственного средства, что приводит к высвобождению активного лекарственного средства внутри клеток-мишеней (см., например, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Наиболее типичными являются пептидильные линкеры, которые расщепляются ферментами, которые присутствуют в экспрессирующих PRLR клетках. Примеры таких линкеров описаны, например, в патенте США № 6214345, включенном в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме и для всех целей. В конкретном варианте осуществления пептидильный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, представляет собой линкер Val-Cit или линкер Phe-Lys (см., например, патент США № 6214345, в котором описан синтез доксорубицина с линкером val-cit). Одним преимуществом использования внутриклеточного протеолитического высвобождения лекарственного средства является то, что средство, как правило, ослабляется, когда оно конъюгировано, и стабильность конъюгатов в сыворотке, как правило, является высокой.
В других вариантах осуществления линкер ADC по изобретению представляет собой малонатный линкер (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), малеимидобензоильный линкер (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), или 3'-N-амидный аналог (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1305-12).
В других вариантах осуществления линкерный элемент не является расщепляемым и лекарственное средство высвобождается, например, при деградации антитела. См. публикацию США № 20050238649, включенную в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. ADC, содержащий нерасщепляющийся линкер, может быть сконструирован так, чтобы ADC оставался по существу снаружи клетки и взаимодействовал с определенными рецепторами на поверхности клетки-мишени, чтобы связывание ADC инициировало (или препятствовало) конкретный каскад клеточной передачи сигнала.
В некоторых вариантах осуществления линкерный элемент представляет собой по существу гидрофильный линкер (например, PEG4Mal и сульфо-SPDB). Гидрофильный линкер можно использовать для предупреждения выкачивания лекарственного средства из устойчивых злокачественных клеток посредством MDR (множественная устойчивость к лекарственным средствам) или функционально сходных переносчиков.
В других вариантах осуществления при расщеплении линкер функционирует, прямо или непрямо ингибируя рост клеток и/или пролиферацию клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления линкер при расщеплении может функционировать в качестве интеркалирующего средства, тем самым, ингибируя биосинтез макромолекул (например, репликация ДНК, транскрипций РНК и/или синтез белка).
В других вариантах осуществления линкер сконструирован для способствования неспецифическому цитолизу (уничтожения соседних клеток) посредством диффузии линкера-элемента лекарственного средства и/или лекарственного средства отдельно в соседние клетки. В других вариантах осуществления линкер обеспечивает интернализацию в клетки.
Присутствие пространственно скрытого дисульфида может повышать стабильность конкретной дисульфидной связи, увеличивая эффективность ADC. Таким образом, в одном варианте осуществления линкер включает пространственно скрытую дисульфидную связь. Пространственно скрытый дисульфид относится к дисульфидной связи, присутствующей в конкретном молекулярном окружении, где окружение характеризуется конкретным пространственным расположением или ориентацией атомов, как правило, в одной и той же молекуле или соединении, которое предотвращает или по меньшей мере частично ингибирует восстановление дисульфидной связи. Таким образом, присутствие объемных х (или пространственно скрывающих) химических частей и/или объемных боковых цепей аминокислот проксимально дисульфидной связи предотвращает или по меньшей мере частично ингибирует потенциальные взаимодействия дисульфидной связи, которые могут привести к восстановлению дисульфидной связи.
Примечательно, что упомянутые выше типы линкеров не являются взаимоисключающими. Например, в одном варианте осуществления линкер, используемый в ADC по изобретению, представляет собой не расщепляющийся линкер, который усиливает интернализацию в клетки.
Как описано в формуле II выше, в некоторых вариантах осуществления ADC против PRLR по изобретению включает удлиняющий элемент. Удлиняющий элемент (A), когда он присутствует, способен связывать антитело с аминокислотным элементом (-W-), если он присутствует, со спейсерным элементом (-Y-), если он присутствует; или с лекарственным средством (-D) (см. формулу II). Пригодные функциональные группы, которые могут присутствовать на антителах против PRLR, описанных в настоящем описании, либо естественным образом, либо посредством химической манипуляции, включают, но не ограничиваются ими, сульфгидрил, амино, гидроксил, аномерную гидроксильную группу углевода и карбоксил. Пригодными функциональными группами являются сульфгидрил и амино. В одном примере сульфгидрильные группы можно получать путем восстановления внутримолекулярных дисульфидных связей антитела против PRLR. В другом варианте осуществления сульфгидрильные группы можно получать путем реакции аминогруппы лизиновой части в антителе против PRLR с 2-иминотиоланом (реагент Трота) или другими образующими сульфгидрил реагентами. В определенных вариантах осуществления антитело против PRLR представляет собой рекомбинантное антитело и его конструируют, чтобы оно имело одну или несколько лизиновых частей. В некоторых других вариантах осуществления рекомбинантное антитело против PRLR конструируют, чтобы оно содержало дополнительные сульфгидрильные группы, например, дополнительные остатки цистеина.
В одном варианте осуществления удлиняющий элемент образует связь с атомом серы антитела. Атом серы может происходить из сульфгидрильной группы антитела. Репрезентативные удлиняющие элементы согласно этому варианту осуществления представлены в квадратных скобках формул IIIa и IIIb, как показано ниже,
,
где L-, -W-, -Y-, -D, w и y являются такими, как определено выше, и R17 выбран из -C1-C10 алкилена-, -C1-C10 алкенилена-, -C1-C10 алкинилена-, карбоцикло-, -O-(C1-C8 алкилена)-, O-(C1-C8 алкенилена)-, -O-(C1-C8 алкинилена)-, -арилена-, -C1-C10 алкиленарилена-, -C2-C10 алкениленарилена, -C2-C10 алкиниленарилена, арилен-C1-C10 алкилена-, -арилен-C2-C10 алкенилена-, -арилен-C2-C10 алкинилена-, -C1-C10 алкилен-(карбоцикло)-, -C2-C10 алкенилен-(карбоцикло)-, C2-C10 алкинилен-(карбоцикло)-, -(карбоцикло)-C1-C10 алкилен-, -(карбоцикло)-C2-C10 алкенилен-, -(карбоцикло)-C2-C10 алкинилен, -гетероцикло-, -C1-C10 алкилен(гетероцикло)-, -C2-C10 алкенил-(гетероцикло)-, -C2-C10 алкинилен(гетероцикло)-, -(гетероцикло)-C1-C10 алкилена-, -(гетероцикло)-C2-C10 алкенилена-, -(гетероцикло)-C1-C10 алкинилена-, -(CH2CH2O)r- или -(CH2CH2O)r-CH2-, и r представляет собой целое число в диапазоне 1-10, где указанные радикалы алкила, алкенила, алкинила, алкилена, алкенилена, алкинилена, арила, карбоцикла, карбоцикло, гетероцикло и арилена, как отдельно, так и в качестве части другой группы, являются необязательно замещенными. В некоторых вариантах осуществления указанные радикалы алкила, алкенила, алкинила, алкилена, алкенилена, алкинилена, арила, карбоцикла, карбоцикло, гетероцикло и арилена, как отдельно, так и в качестве другой части, являются незамещенными. В некоторых вариантах осуществления R17 выбран из -C1-C10 алкилена-, -карбоцикло-, -O-(C1-C8 алкилена)-, -арилена-, -C1-C10 алкилен-арилена-, -арилен-C1-C10 алкилен-, -C1-C10 алкилен(карбоцикло)-, -(карбоцикло)-C1-C10 алкилена-, -C3-C8 гетероцикло-, -C1-C10 алкилен(гетероцикло)-, -(гетероцикло)-C1-C10 алкилена-, -(CH2CH2O)r- и -(CH2CH2O)r-CH2-; и r представляет собой целое число в диапазоне 1-10, где указанные алкиленовые группы являются незамещенными, а остальные группы являются необязательно замещенными.
Иллюстративный удлиняющий элемент имеет формулу IIIa, где R17 представляет собой -(CH2)5-, как представлено ниже (также см. U.S. 8309093).
.
Другой иллюстративный удлиняющий элемент имеет формулу IIIa, где R17 представляет собой -(CH2CH2O)r-CH2-; и r равно 2, как представлено ниже (также см. U.S. 8309093).
.
Другой иллюстративный удлиняющий элемент имеет формулу IIIa, где R17 представляет собой арилен- или арилен-C1-C10 алкилен-. В некоторых вариантах осуществления арильная группа представляет собой незамещенную фенильную группу. Кроме того, другой иллюстративный удлиняющий элемент имеет формулу IIIb, где R17 представляет собой -(CH2)5-, как представлено ниже (также см. U.S. 8309093).
.
В определенных вариантах осуществления удлиняющий элемент связан с антителом против PRLR через дисульфидную связь между атомом серы элемента антитела против PRLR и атомом серы удлиняющего элемента. Репрезентативный удлиняющий элемент согласно этому варианту осуществления представлен в квадратных скобках формулы IV (см. ниже и также см. U.S. 8309093), где R17, L-, -W-, -Y-, -D, w и y являются такими, как определено выше.
.
Следует отметить, что часть S в формуле, представленной ниже (также см. U.S. 8309093) относится к атому серы антитела, если нет иных указаний по контексту.
.
В других вариантах осуществления удлиняющий элемент содержит реакционноспособный центр, который может образовывать связь с первичной или вторичной аминогруппой антитела. Примеры этих реакционноспособных участков включают, но не ограничиваются ими, активированные сложные эфиры, такие как сукцинимидные сложные эфиры, 4 нитрофениловые сложные эфиры, пентафторфениловые сложные эфиры, тетрафторфениловые сложные эфиры, ангидриды, хлорангидриды, сульфонилхлориды, изоцианаты и изотиоцианаты. Репрезентативные удлиняющие элементы согласно этому варианту осуществления представлены в квадратных скобках формул Va и Vb (См. ниже (также см. U.S. 8309093)), где R17, L-, -W-, -Y-, -D, w, и y являются такими, как определено выше.
В некоторых вариантах осуществления удлиняющий элемент содержит реакционноспособный участок, который является реакционноспособным в отношении модифицированной углеводной группы (-CHO), которая может присутствовать в антителе. Например, углевод может быть мягко окислен с использованием реагента, такого как перйодат натрия, и полученный элемент (-CHO) окисленного углевода может быть конденсирован с удлиняющим элементом, который содержит функциональную группу, такую как гидразид, оксим, первичный или вторичный амин, гидразин, тиосемикарбазон, карбоксилат гидразина и арилгидразид, такие как группы, описанные Kaneko et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2:133-41. Репрезентативные удлиняющие элементы согласно этому варианту осуществления представлены в квадратных скобках формул VIa, VIb и VIc (см. ниже (также см. U.S. 8309093), где -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w и y являются такими, как определено выше.
Аминокислотный элемент (-W-), когда он присутствует, связывает удлиняющий элемент со спейсерным элементом, если спейсерный элемент присутствует, связывает удлиняющий элемент с частью-лекарственным средством, если спейсерный элемент отсутствует, и связывает антительный элемент с элементом-лекарственным средством, если удлиняющий элемент и спейсерный элемент отсутствуют. Ww- может представлять собой, например, монопептидный, дипептидный, трипептидный, тетрапептидный, пентапептидный, гексапептидный, гептапептидный, октапептидный, нонапептидный, декапептидный, ундекапептидный или додекапептидный элемент. Каждый элемент -W- независимо имеет формулу, указанную ниже (также см. U.S. 8309093) в квадратных скобках, и w представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 12,
,
где R19 представляет собой водород, метил, изопропил, изобутил, втор-бутил, бензил, п-гидроксибензил, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-пиридилметил-, 3-пиридилметил-, 4-пиридилметил-, фенил, циклогексил, и другие неограничивающие репрезентативные группы R19, как представлено ниже.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотный элемент может ферментативно расщепляться одним или несколькими ферментами, включая ассоциированную со злокачественной опухолью или опухолеассоциированную протеазу, высвобождая лекарственное средство (-D), которое в одном варианте осуществления протонируется in vivo при высвобождении, с образованием лекарственного средства.
В определенных вариантах осуществления аминокислотный элемент может содержать природные аминокислоты. В других вариантах осуществления аминокислотный элемент может содержать неприродные аминокислоты. Иллюстративные элементы Ww соответствуют формуле (VII) (как изображено ниже (также см. U.S. 8309093),
,
где R20 и R21 являются такими, как представлено ниже;
формуле (VIII) (как представлено ниже (также см. U.S. 8309093),
,
где R20, R21 и R22 являются такими, как представлено ниже;
и формуле (IX) (как представлено ниже (также см. U.S. 8309093),
,
где R20, R21, R22 и R23 являются такими, как представлено ниже:
Иллюстративные аминокислотные элементы включают, но не ограничиваются ими, элементы формулы VII, где: R20 представляет собой бензил и R21 представляет собой -(CH2)4NH2; R20 представляет собой изопропил и R21 представляет собой -(CH2)4NH2; или R20 представляет собой изопропил и R21 представляет собой -(CH2)3NHCONH2. Другой иллюстративный аминокислотный элемент представляет собой элемент формулы VIII, где R20 представляет собой бензил, R21 представляет собой бензил, и R22 представляет собой -(CH2)4NH2.
Пригодные элементы -WW- можно конструировать и оптимизировать в отношении селективности их ферментативного расщепления конкретным ферментом, например, опухолеассоциированной протеазой. В одном варианте осуществления элемент -WW- представляет собой элемент, расщепление которого катализируется катепсином B, C и D, или протеазой плазмином. В одном варианте осуществления -WW- представляет собой дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид. Когда R19, R20, R21, R22 или R23 отличны от водорода, атом углерода, с которым связаны R19, R20, R21, R22 или R23, является хиральным. Каждый атом углерода, с которым связаны R19, R20, R21, R22 или R23, независимо находится в конфигурации (S) или (R).
В одном варианте осуществления аминокислотного элемента аминокислотный элемент представляет собой валин-цитруллин (vc или val-cit). В другом аспекте аминокислотный элемент представляет собой фенилаланин-лизин (т.е. fk). В другом аспекте аминокислотного элемента, аминокислотный элемент представляет собой N-метилвалин-цитруллин. В другом аспекте аминокислотный элемент представляет собой 5-аминовалериановую кислоту, гомофенилаланин лизин, тетраизохинолинкарбоксилат лизин, циклогексилаланин лизин, изонипекотовую кислоту лизин, бета-аланин лизин, глицин серин валин глутамин и изонипекотовую кислоту.
Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления -W- представляет собой глюкуронидный элемент, который связывает удлиняющий элемент со спейсерным элементом, если удлиняющий и спейсерный элементы присутствуют, связывает удлиняющий элемент с частью лекарственного средства, если спейсерный элемент отсутствует, и связывает линкерный элемент с лекарственным средством, если удлиняющий и спейсерный элементы отсутствуют. Глюкуронидный элемент включает участок, который может расщепляться ферментом β-глюкуронидазой (Также см. US 2012/0107332 A1). В некоторых вариантах осуществления глюкуронидный элемент содержит часть сахара (Su), связанную через гликозидную связь (-O'-) с саморасщепляющейся группой (Z) формулы, представленной ниже (Также см. US 2012/0107332, включенный в настоящее описание в качестве ссылки).
.
Гликозидная связь (-O'-), как правило, представляет собой участок расщепления β-глюкуронидазой, такой как связь, расщеплемая лизосомальной β-глюкуронидазой человека. В контексте глюкуронидного элемента, термин "саморасщепляющаяся группа" относится к ди- или три-функциональной химической части, которая способна ковалентно связывать две или три находящихся на расстоянии химических части (т.е. сахарная часть (через гликозидную связь), элемент лекарственного средства (прямо или непрямо через спейсерный элемент), и в некоторых вариантах осуществления линкер (прямо или непрямо через удлиняющий элемент)) в стабильную молекулу. Саморасщепляющаяся группа самопроизвольно отделяется от первой химической части (например, спейсерный элемент или элемент-лекарственное средство), если связь с частью сахара расщепляется.
В некоторых вариантах осуществления сахарная часть (Su) представляет собой циклическую гексозу, такую как пираноза, или циклическую пентозу, такую как фураноза. В некоторых вариантах осуществления пираноза представляет собой глюкуронид или гексозу. Часть сахара, как правило, находится в конформации β-D. В конкретном варианте осуществления пираноза представляет собой β-D-глюкуронидную часть (т.е. β-D-глюкуроновая кислота, связанная с саморасщепляющейся группой -Z- через гликозидную связь, которая расщепляется β-глюкуронидазой). В некоторых вариантах осуществления сахарная часть является незамещенной (например, встречающаяся в природе циклическая гексоза или циклическая пентоза). В других вариантах осуществления сахарная часть может представлять собой замещенный β-D-глюкуронид (т.е. глюкуроновая кислота, замещенная одной или несколькими группами, такими как водород, гидроксил, галоген, сера, азот или низший алкил).
В некоторых вариантах осуществления саморасщепляющаяся группа Z представляет собой элемент п-аминобензилового спирта (PAB), как дополнительно описано в настоящем описании. Другие подходящие саморасщепляющиеся группы известны в данной области.
В некоторых вариантах осуществления глюкуронидный элемент имеет одну из формул, представленных ниже (также см. US 2012/0107332 A1),
,
где Su представляет собой сахарную часть, гликозидная связь содержит кислородную связь между Su и саморасщепляющейся группой Z, и каждый R независимо представляет собой водород, галоген (например, хлор, бром, фтор и т.д.), -CN, -NO2, или другую электроноакцепторную или электронодонорную группу, при условии, что глюкуронидный лемент (и, в частности, Z) претерпевает саморасщепление при расщеплении гликозидной связи. В некоторых вариантах осуществления каждый R независимо представляет собой водород, галоген (например, хлор, бром, фтор и т.д.), -CN или -NO2.
В некоторых вариантах осуществления глюкуронидный элемент имеет одну из формул, представленных ниже (Также см. US 2012/0107332 A1),
,
где Su представляет собой сахарную часть, гликозидная связь (-O'-) содержит кислородную связь между Su и саморасщепляющейся группой Z, и каждый R независимо представляет собой водород.
В некоторых вариантах осуществления саморасщепляющаяся группа (Z) ковалентно связана с сахарной частью, с лекарственным средством (прямо или непрямо через спейсерный элемент(ы)), и с линкером (прямо или непрямо через удлиняющий элемент(ы)). В некоторых вариантах осуществления конъюгат лекарственное средство-линкер имеет формулу, представленную ниже (Также см. US 2012/0107332 A1),
,
где Su, O', Z, Y, y, D, A и a определены в настоящем описании. Как правило, от 1 до 20 таких конъюгатов лекарственное средство-линкер могут быть связаны с линкером.
В некоторых вариантах осуществления ADC, содержащий глюкуронидный элемент, имеет одну из формул, представленных ниже (Также см. US 2012/0107332 A1), где Su, Y, y, D, A, a и L определены, как описано в настоящем описании.
.
В некоторых вариантах осуществления ADC, содержащий глюкуронидный элемент, имеет формулу, как представлено ниже (также см. US 2012/0107332 A1), где Y, y, D, A, a и L определены в настоящем описании.
.
В некоторых вариантах осуществления ADC, содержащий глюкуронидный элемент, имеет формулу, представленную ниже (Также см. US 2012/0107332 A1), где Y, y, D и L определены, как описано в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления ADC, содержащий глюкуронидный элемент, имеет формулу, как представлено ниже (также см. US 2012/0107332 A1), где Y, y, D и L определены, как описано в настоящем описании.
.
В некоторых вариантах осуществления ADC, содержащий глюкуронидный элемент, имеет формулу, как представлено ниже (Также см. US 2012/0107332 A1), где D является таким, как описано в настоящем описании, и mAb представляет собой моноклональное антитело.
В другой группе вариантов осуществления, линкер связан (прямо или непрямо) с сахарной частью (Su), которая связана с саморасщепляющейся группой (Z), которая связана (прямо или непрямо) с лекарственным средством, в соответствии с формулой, представленной ниже (также см. US 2012/0107332 A1), где A, a, Su, O', Z, w, Y, y, D и L определены, как описано в настоящем описании.
.
Например, сахарная часть (Su) может быть связана прямо с антителом или непрямо через удлиняющий элемент. Саморасщепляющаяся группа (Z) может быть связана прямо с лекарственным средством или непрямо через спейсерный элемент.
В родственных вариантах осуществления соединение лекарственное средство-линкер имеет следующую формулу, как представлено ниже (также см. US 2012/0107332 A1), где A, a, Su, O', Z, w, Y, y и D определены в настоящем описании.
.
Как правило, с антителом могут быть связаны от 1 до 20 таких соединений лекарственное средство-линкер.
Спейсерный элемент (-Y-), когда он присутствует, связывает аминокислотный элемент (или глюкуронидный элемент, также см. US 2012/0107332 A1) с элементом лекарственного средства, когда аминокислота присутствует. Альтернативно, спейсерный элемент связывает удлиняющий элемент с элементом лекарственного средства, когда аминокислотный элемент отсутствует. Спейсерный элемент также связывает элемент лекарственного средства с элементом антитела, когда как аминокислотный элемент, так и удлиняющий элемент, отсутствуют.
Спейсерные элементы имеют два основных типа: не саморасщепляющиеся и саморасщепляющиеся. Не саморасщепляющийся спейсерный элемент представляет собой элемент, в котором часть или весь спейсерный элемент остается связанным с частью лекарственного средства после отщепления, в частности ферментативного, аминокислотного элемента (или глюкуронидного элемента) от конъюгата антитело-лекарственное средство. Примеры не саморасщепляющегося спейсера включают, но не ограничиваются ими спейсерный элемент (глицин-глицин) и глициновый спейсерный элемент (оба представлены на схеме 1 ниже (также см. U.S. 8309093)).
Схема 1
Когда конъюгат, содержащий глицин-глициновый спейсерный элемент или глициновый спейсерный элемент претерпевает ферментативное расщепление посредством фермента (например, ассоциированная с опухолевыми клетками протеаза, ассоциированная со злокачественными клетками протеаза или ассоциированная с лимфоцитами протеаза), глицин-глицин-часть лекарственного средства или глицин-часть лекарственного средства отщепляется от L-Aa-Ww-. В одном варианте осуществления в клетке-мишени происходит независимая реакция гидролиза, расщепляющая часть глицин-лекарственное средство и высвобождающая лекарственное средство.
В некоторых вариантах осуществления не саморасщепляющийся спейсерный элемент (-Y-) представляет собой -Gly-. В некоторых вариантах осуществления не саморасщепляющийся спейсерный элемент (-Y-) представляет собой -Gly-Gly-.
В одном варианте осуществления предусматривается конъюгат лекарственное средство-линкер, в котором спейсерный элемент отсутствует (y=0), или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.
Альтернативно, конъгат, содержащий саморасщепляющийся спейсерный элемент, может высвобождать -D. Как используют в рамках изобретения, термин "саморасщепляющийся спейсер" относится к бифункциональной химической части, которая способна ковалентно связывать две находящиеся на расстоянии химические части в стабильную молекулу из трех частей. Она самопроизвольно отделяется от второй химической части, если ее связь с первой частью расщепляется.
В некоторых вариантах осуществления -Yy- представляет собой элемент п-аминобензилового спирта (PAB), фениленовая часть которого замещена посредством Qm, где Q представляет собой -C1-C8 алкил, -C1-C8 алкенил, -C1-C8 алкинил, -O-(C1-C8 алкил), -O-(C1-C8 алкенил), -O-(C1-C8 алкинил), -галоген, -нитро или -циано; и m представляет собой целое число в диапазоне 0-4. Алкильная, алкенильная и алкинильная группы, как отдельно, так и в качестве части другой группы, могут быть необязательно замещены.
В некоторых вариантах осуществления -Y- представляет собой группу PAB, которая связана с -Ww- через атом азота аминогруппы в группе PAB, и соединена прямо с -D через карбонатную, карбаматную или простую эфирную группу. Без связи с какой-либо конкретной теорией или механизмом, на схеме 2 ниже (также см. U.S. 8309093) представлен возможный механизм высвобождения лекарственного средства из группы PAB, которая связана прямо с -D через карбаматную или карбонатную группу, как описано Toki et al., 2002, J. Org. Chem. 67:1866-1872.
Схема 2
На схеме 2, Q представляет собой -C1-C8 алкил, -C1-C8 алкенил, -C1-C8 алкинил, -O-(C1-C8 алкил), -O-(C1-C8 алкенил), -O-(C1-C8 алкинил), -галоген, -нитро или -циано; m представляет собой целое число в диапазоне 0-4; и p находится в диапазоне от 1 до приблизительно 20. Алкильная, алкенильная и алкинильная группы, как отдельно, так и в качестве части другой группы, могут быть необязательно замещенными.
Без связи с какой-либо конкретной теорией или механизмом, на схеме 3 ниже (также см. U.S. 8309093) представлен возможный механизм высвобождения лекарственного средства из группы PAB, которая связана прямо с -D через простую эфирную связь или связь через амин, где D включает кислородную или азотную группу, которая является частью лекарственного средства.
Схема 3
На схеме 3, Q представляет собой -C1-C8 алкил, -C1-C8 алкенил, -C1-C8 алкинил, -O-(C1-C8 алкил), -O-(C1-C8 алкенил), -O-(C1-C8 алкинил), -галоген, -нитро или -циано; m представляет собой целое число в диапазоне 0-4; и p находится в диапазоне от 1 до приблизительно 20. Алкильная, алкенильная и алкинильная группа, как отдельно, так и в качестве части другой группы, могут быть необязательно замещенными.
Другие примеры саморасщепляющихся спейсеров включают, но не ограничиваются ими, ароматические соединения, которые электронно сходны с группой PAB, такие как производные 2-аминоимидазол-5-метанола (Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) и орто- или пара-аминобензилацетали. Можно использовать спейсеры, которые претерпевают циклизацию при гидролизе амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты (Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), соответствующим образом замещенные бицикло[2.2.1] и бицикло[2.2.2] кольцевые системы (Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты (Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). Отщепление содержащих амин лекарственных средств, которые замещены в α-положении глицина (Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447), также является примером саморасщепляющихся спейсеров.
В одном варианте осуществления спейсерный элемент представляет собой разветвленный бис(гидроксиметил)стирольный (BHMS) элемент, как представлено на схеме 4 ниже (также см. U.S. 8309093), который можно использовать для включения и высвобождения множества лекарственных средств.
Схема 4
На схеме 4 выше, Q представляет собой -C1-C8 алкил, -C1-C8 алкенил, -C1-C8 алкинил, -O-(C1-C8 алкил), -O-(C1-C8 алкенил), -O-(C1-C8 алкинил), -галоген, -нитро или -циано; m представляет собой целое число в диапазоне 0-4; n равно 0 или 1; и p находится в диапазоне от 1 до приблизительно 20. Алкильная, алкенильная и алкинильная группы, как отдельно, так и в качестве части другой группы, могут быть необязательно замещенными.
В одном аспекте спейсерные элементы (-Yy-) соответствуют формулам (X)-(XII) (см. ниже (также см. U.S. 8309093), где Q представляет собой -C1-C8 алкил, -C1-C8 алкенил, -C1-C8 алкинил, -O-(C1-C8 алкил), -O-(C1-C8 алкенил), -O-(C1-C8 алкинил), -галоген, -нитро или -циано; и m представляет собой целое число в диапазоне 0-4.
Алкильная, алкенильная и алкинильная группы, как отдельно, так и являющиеся частью другой группы, могут быть необязательно замещенными.
Варианты осуществления ADC, имеющих формулы I и II, также могут включать соединение со структурой, представленной ниже (также см. U.S. 8309093),
,
где каждый из w и y равен 0, 1 или 2, и соединение со структурой, представленной ниже (также см. U.S. 8309093),
,
где каждый из w и y равен 0, и соединения, представленные ниже (также см. U.S. 8309093).
.
В других вариантах осуществления спейсерный элемент (-Y-), когда он присутствует, связывает глюкуронидный элемент, когда он присутствует, с частью лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления спейсерный элемент(ы) согласно этим вариантам осуществления представляют собой саморасщепляющиеся спейсеры. В этом контексте термин "саморасщепляющийся спейсер" относится к бифункциональной химической части, которая способна ковалентно связывать две разделенных в пространстве химических части в нормальную стабильную молекулу из трех частей. Она самопроизвольно отделяется от второй химической части, если связь с первой частью расщепляется.
В некоторых вариантах осуществления -Y- связан с -Ww- через атом углерода саморасщепляющейся группы, и линкер связан прямо с -D через карбонатную, карбаматную или простую эфирную группу.
В некоторых вариантах осуществления -Yy- представляет собой элемент п-аминобензилового спирта (PAB), фениленовая часть которого замещена Qm, где Q является таким, как определено в настоящем описании, и m представляет собой целое число в диапазоне 0-4. В другом варианте осуществления -Yy- может представлять собой карбонатную группу.
Другие примеры саморасщеплящихся спейсеров включают, но не ограничиваются ими, ароматические соединения, которые электронно сходны с группой PAB, такие как производные 2-аминоимидазол-5-метанола (см., например, Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) и орто- или пара-аминобензилацетали. Можно использовать спейсеры, которые претерпевают циклизацию при гидролизе амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты (см., например, Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), соответствующим образом замещенные бицикло[2.2.1] и бицикло[2.2.2] кольцевые системы (см., например, Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты (см., например, Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). Отщепление содержащих амин лекарственных средств, которые замещены в a-положении глицина (см., например, Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447), также является примером саморасщепляющихся спейсеров.
Другие подходящие спейсерные элементы описаны в опубликованной патентной заявке США № 2005-0238649, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Другой подход для получения ADC вовлекает применение гетеробифункциональных сшивающих линкеров, которые связывают антитело против PRLR с представляющим интерес лекарственным средством. Предпочтительно, сшивающие линкеры представляют собой N-сукцинимидил 4-(5-нитро-2-пиридилдитио)пентаноат или высоко растворимый в воде аналог N-сульфосукцинимидил 4-(5-нитро-2-пиридилдитио)пентаноата, N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутират (SPDB), N-сукцинимидил-4-(5-нитро-2-пиридилдитио)бутират (SNPB) и N-сульфосукцинимидил-4-(5-нитро-2-пиридилдитио)бутират (SSNPB), N-сукцинимидил-4-метил-4-(5-нитро-2-пиридилдитио)пентаноат (SMNP), N-сукцинимидил-4-(5-N,N-диметилкарбоксамидо-2-пиридилдитио)бутират (SCPB) или N-сульфосукцинимидил-4-(5-N,N-диметилкарбоксамидо-2-пиридилдитио)бутират (SSCPB)). Антитела по настоящему изобретению, модифицированные сшивающими линкерами N-сукцинимидил-4-(5-нитро-2-пиридилдитио)пентаноатом, N-сульфосукцинимидил-4-(5-нитро-2-пиридилдитио)пентаноатом, SPDB, SNPB, SSNPB, SMNP, SCPB или SSCPB затем можно подвергать реакции с небольшим избытком конкретного лекарственного средства, которое содержит тиольную часть с высоким выходом ADC. Предпочтительно, сшивающие линкеры представляют собой соединения формулы, представленной ниже (также см. патент США № 6913748),
,
где R, R1, R2 и R3 являются одинаковыми или различаются и представляют собой H, метил, этил или линейный, разветвленный или циклический алкил, имеющий от 3 до 6 атомов углерода, n равно 0 или представляет собой целое число от 1 до 4, X и Y являются одинаковыми или различаются и представляют собой H, CONR4R5 или NO2, при условии, что оба из X и Y не являются H одновременно, R4 и R5 являются одинаковыми или различаются и каждый из них представляет собой H, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, изобутил или трет-бутил, и Z представляет собой SO3-M+ или H, где M+ обозначает ион металла или ион тетра-алкиламмония при условии, что когда X и/или Y представляет собой NO2, Z не является H. Дополнительные гетеробифункциональные сшивающие линкеры и способы получения ADC с использованием их описаны в патенте США № 6913748, который включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
В одном варианте осуществления используют заряженные линкеры (также обозначаемые как прозаряженные линкеры) для конъюгации антител против PRLR с лекарственными средствами для получения ADC. Заряженные линкеры включают линкеры, которые становятся заряженными после процессинга в клетке. Присутствие заряженной группы(групп) в линкере конкретного ADC или на лекарственном средстве после процессинга в клетке обеспечивает несколько преимуществ, таких как (i) более высокая растворимость ADC в воде, (ii) способность функционировать при более высокой концентрации в водных растворах, (iii) способность связывать большее количество молекул лекарственного средства на антитело, потенциально приводящее к более высокой эффективности, (iv) потенциал к удержанию заряженных структур конъюгатов внутри клетки, что приводит к более высокой эффективности, и (v) увеличение чувствительности клеток с множественной устойчивостью к лекарственным средствам, которые неспособны выводить заряженные структуры лекарственных средств из клетки. Примеры некоторых подходящих или прозаряженных сшивающих линкеров и их синтеза представлены на фиг.1-10 патента США № 8236319, и они включены в настоящее описание в качестве ссылок. Предпочтительно, заряженные или прозаряженные сшивающие линкеры представляют собой линкеры, которые содержат сульфонатные, фосфатные, карбоксильные заместители или заместители в виде четвертичных аминов, которые значительно увеличивают растворимость ADC, особенно для ADC с 2-20 конъюгированными лекарственными средствами. Конъюгаты, полученные из линкеров, содержащих прозаряженную часть, могут продуцировать одну или несколько заряженных частей после метаболизма конъюгата в клетке.
В следующем варианте осуществления ADC по изобретению содержит линкер, имеющий формулу, представленную ниже (также см. патент США № 8236319)
,
где Y' представляет собой функциональную группу, которая обеспечивает реакцию с антителом; Q представляет собой функциональную группу, которая обеспечивает присоединение лекарственного средства через дисульфидную, простую тиоэфирную, сложную тиоэфирную, пептидную, гидразоновую, сложноэфирную, простую эфирную, карбаматную или амидную связь; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, и R10 являются одинаковыми или различаются и представляют собой H, линейный алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил, имеющий от 3 до 6 атомов углерода, линейный, разветвленный или циклический алкенил или алкинил, имеющий от 2 до 6 атомов углерода, анионы, такие как, но не ограничиваясь ими, SO3-, X-SO3-, OPO32-, X-OPO32-, PO32-, X-PO32-, CO2-, катионы, такие как, но не ограничиваясь ими, азотсодержащий гетероцикл, N+R11R12R13, или X-N+R11R12R13, или фенил, где: R11, R12 и R13 являются одинаковыми или различаются и представляют собой H, линейный алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, или разветвленный или циклический алкил, имеющий от 3 до 6 атомов углерода, и X обозначает фенил или линейный алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, или разветвленный или циклический алкил, имеющий от 3 до 6 атомов углерода; l, m и n равны 0 или представляют собой целое число от 1 до 4; A представляет собой фенил или замещенный фенил, где заместитель представляет собой линейный алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, или разветвленный или циклический алкил, имеющий от 3 до 6 атомов углерода, или заряженный заместитель, выбранный из анионов, таких как, но не ограничиваясь ими, SO3-, X-SO3-, OPO32-, X-OPO32-, PO32-, X-PO32-, CO2-, и катионов, таких как, но не ограничиваясь ими, азотсодержащий гетероцикл, N+R11R12R13 или X-N+R11R12R13, где X имеет то же определение, что и выше, и где g равно 0 или 1; Z представляет собой необязательный элемент полиэтиленокси формулы (OCH2CH2)p, где p равно 0 или представляет собой целое число от 2 до приблизительно 1000, или элемент F1-E1-P-E2-F2, в котором E1 и E2 являются одинаковыми или различаются и представляют собой C=O, O, или NR14, где R14 представляет собой H, линейный алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил, имеющий от 3 до 6 атомов углерода, линейный, разветвленный или циклический алкенил или алкинил, имеющий от 2 до 6 атомов углерода; P представляет собой пептидный элемент длиной от 2 до 20 аминокислот, где E1 или E2 могут быть связаны с пептидом через концевой азот, концевой углерод или через боковую цепь аминокислот пептида; и F1 и F2 являются одинаковыми или различаются и представляют собой необязательный элемент полиэтиленокси формулы (OCH2CH2)p, где p равно 0 или представляет собой целое число от 2 до приблизительно 1000, при условии, что, когда Z не является F1-E1-P-E2-F2, по меньшей мере один из R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 и R10 представляет собой заряженный заместитель, или, когда g равно 1, по меньшей мере один из A, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 и R10 представляет собой заряженный заместитель.
Примеры функциональной группы Y', которая обеспечивает реакцию с антителом, включают реагирующие с аминами агенты, такие как, но не ограничиваясь ими, N-гидроксисукцинимидные сложные эфиры, п-нитрофениловые сложные эфиры, динитрофениловые сложные эфиры, пентафторфениловые сложные эфиры; реакционноспособные в отношении тиола агенты, такие как, но не ограничиваясь ими, пиридилдисульфиды, нитропиридилдисульфиды, малеинимиды, галоацетаты и хлориды карбоновых кислот.
Примеры функциональной группы Q, которая обеспечивает присоединение лекарственного средства, включают группы, которые обеспечивают присоединение через дисульфидную, простую тиоэфирную, сложную тиоэфирную, пептидную, гидразоновую, сложную эфирную, карбаматную или амидную связь. Такие функциональные группы включают, но не ограничиваются ими, тиол, дисульфид, амино, карбокси, альдегиды, малеимидо, галоацетил, гидразины и гидрокси.
Примеры линейных алкилов включают метил, этил, пропил, бутил, пентил и гексил. Примеры разветвленных или циклических алкилов, имеющих 3-6 атомов углерода, включают изопропил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, пентил, гексил, циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил.
Примеры линейных алкенилов, имеющих 2-6 атомов углерода, включают этенил, пропенил, бутенил, пентенил, гексенил. Примеры разветвленных или циклических алкенилов, имеющих 2-6 атомов углерода, включают изобутенил, изопентенил, 2-метил-1-пентенил, 2-метил-2-пентенил.
Примеры линейных алкинилов, имеющих 2-6 атомов углерода, включают этинил, пропинил, бутинил, пентинил, гексинил. Примеры разветвленных или циклических алкинилов, имеющих вплоть до 6 атомов углерода, включают 3-метил-1-бутинил, 3-метил-1-пентинил, 4-метил-2-гексинил.
В одном варианте осуществления один из R1, R2, R3, R4, R9 или R10 представляет собой заряженный заместитель, выбранный из сульфоната, фосфата или триалкиламмония, и остальные представляют собой H, каждый из l, g и m равен 0, n=1, каждый из Q и Y' независимо представляет собой дисульфидный заместитель, малеимидо, галоацетильную группу или N-гидроксисукцинимидный сложный эфир. В другом более предпочтительном варианте осуществления один из R1, R2, R3, R4, R9 или R10 представляет собой сульфонат, и остальные представляют собой H, каждый из l, g и m равен 0, n=1, Q представляет собой дисульфидную, малеимидо или галоацетильную часть, и Y' представляет собой часть малеимидо или N-гидроксисукцинимидный сложный эфир. В следующем более предпочтительном варианте осуществления один из R1, R2, R3, R4, R9 или R10 представляет собой сульфонат, а остальные представляют собой H, каждый из l, g и m равен 0, n=1, Q представляет собой группу пиридилдитио или нитропиридилдитио, часть малеимидо или галоацетильную часть, и Y' представляет собой N-гидроксисукцинимидный сложный эфир.
Дополнительные примеры линкеров, которые можно использовать с настоящими композициями и способами, включают валин-цитруллин; малеимидокапроил; аминобензойные кислоты; п-аминобензилкарбамоил (PAB); расщепляемые лизосомальными ферментами линкеры; малеимидокапроил-полиэтиленгликоль (MC(PEG)6-OH); N-метил-валин цитруллин; N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC); N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноат (SPDB); и N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP) (также см. US 2011/0076232). Другой линкер для применения в рамках настоящего изобретения включает связь авидин-биотин для обеспечения ADC, содержащего авидин-биотин (также см. патент США № 4676980, публикации PCT № WO1992/022332A2, WO1994/016729A1, WO1995/015770A1, WO1997/031655A2, WO1998/035704A1, WO1999/019500A1, WO2001/09785A2, WO2001/090198A1, WO2003/093793A2, WO2004/050016A2, WO2005/081898A2, WO2006/083562A2, WO2006/089668A1, WO2007/150020A1, WO2008/135237A1, WO2010/111198A1, WO2011/057216A1, WO2011/058321A1, WO2012/027494A1 и EP77671B1), где некоторые такие линкеры являются устойчивыми к расщеплению биотинидазой. Дополнительные линкеры для применения в рамках настоящего изобретения могут содержать пару когезин/докерин для обеспечения ADC, содержащего когезин-докерин (см. публикации PCT № WO2008/097866A2, WO2008/097870A2, WO2008/103947A2 и WO2008/103953A2).
Дополнительные линкеры для применения в рамках настоящего изобретения могут содержат непептидные полимеры (примеры включают, но не ограничиваются ими, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, полиоксиэтилированные полиолы, поливиниловый спирт, полисахариды, декстран, поливинил-этиловый эфир, PLA (поли(молочная кислота)), PLGA (сополимер молочная кислота-гликолевая кислота) и их комбинации, где предпочтительным полимером является полиэтиленгликоль) (также см. публикацию PCT № WO2011/000370). Дополнительные линкеры также описаны в WO 2004-010957, публикации США № 20060074008, публикации США № 20050238649 и публикации США № 20060024317 (все из которых включены в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме и для всех целей).
Для ADC по изобретению, содержащего майтанзиноид, множество положений на майтанзиноидах могут служить в качестве положения для химического присоединения линкерной части. В одном варианте осуществления майтанзиноиды, содержащие линкерную часть, которая содержит реакционноспособную химическую группу, представляют собой C-3 сложные эфиры майтанзинола и их аналоги, где линкерная часть содержит дисульфидную связь, и химическая реакционноспособная группа содержит N-сукцинимидильный или N-сульфосукцинимидильный сложный эфир. Например, являются пригодными все из положения C-3, имеющего гидроксильную группу, положения C-14, модифицированного гидроксиметилом, положения C-15, модифицированного гидрокси, и положения C-20, имеющего гидроксигруппу. Наиболее предпочтительно, линкерная часть связана с положением C-3 майтанзинола.
III. Применения антител против PRLR
Учитывая их способность связываться с PRLR человека, антитела против PRLR человека или их части по изобретению можно использовать для обнаружения PRLR человека (например, в биологическом образце, таком как сыворотка или плазма) с использованием общепринятого иммуноанализа, такого как твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), радиоиммунный анализ (RIA) или иммуногистохимия тканей. Изобретение относится к способу обнаружения PRLR человека в биологическом образце, включающему контактирование биологического образца с антителом или частью антитела по изобретению и обнаружение либо антитела (или части антител), связанного с PRLR человека, либо несвязанного антитела (или части антитела), чтобы тем самым выявить PRLR человека в биологическом образце. Антитело прямо или непрямо метят поддающимся обнаружению веществом, чтобы облегчить обнаружение связанного или несвязанного антитела. Пригодные поддающиеся обнаружению вещества включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры пригодных ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, или ацетилхолинэстеразу; примеры пригодных комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры пригодных флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; и примеры пригодного радиоактивного материала включают 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho или 153Sm.
Альтернативно мечению антитела, PRLR человека можно анализировать в биологических жидкостях с помощью конкурентного иммуноанализа с использованием стандартов rhPRLR, меченных поддающимся обнаружению веществом, и немеченого антитела против PRLR человека. В этом анализе биологический образец, меченые стандарты rhPRLR и антитело против PRLR объединяют и определяют количество меченого стандарта rhPRLR, связанного с немеченым антителом. Количество PRLR человека в биологическом образце обратно пропорционально количеству меченого стандарта rhPRLR, связанного с антителом против PRLR. Аналогично, PRLR человека также можно анализировать в биологических жидкостях с помощью конкурентного иммуноанализа с использованием стандартов rhPRLR, меченых поддающимся обнаружению веществом, и немеченого антитела против PRLR человека.
Антитела и части антител по изобретению предпочтительно способны нейтрализовывать активность PRLR человека как in vitro, так и in vivo. Таким образом, такие антитела и части антител по изобретению можно использовать для ингибирования активности hPRLR, например, в клеточной культуре, содержащей hPRLR, у человека или у других млекопитающих, имеющих PRLR, с которым антитело по изобретению перекрестно реагирует. В одном варианте осуществления изобретение относится к способу ингибирования активности hPRLR, включающему контактирование hPRLR с антителом или частью антитела по изобретению, так чтобы активность hPRLR ингибировалась. Например, в клеточной культуре, содержащей или предположительно содержащей hPRLR, антитело или часть антитела можно добавлять в культуральную среду для ингибирования активности hPRLR в культуре.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу снижения активности hPRLR у индивидуума, преимущественно у индивидуума, страдающего заболеванием или нарушением, при котором активность PRLR является вредоносной. Изобретение относится к способам снижения активности PRLR у индивидуума, страдающего таким заболеванием или нарушением, причем этот способ включает введение индивидууму антитела или части антитела по изобретению, так чтобы активность PRLR у индивидуума снижалась. Предпочтительно, PRLR представляет собой PRLR человека и индивидуум представляет собой человека. Альтернативно, индивидуум может представлять собой млекопитающее, у которого экспрессируется PRLR, с которым антитело по изобретению способно связываться. Более того, индивидуум может представлять собой млекопитающего, которому введен PRLR (например, путем введения PRLR или путем экспрессии трансгена PRLR). Антитело по изобретению можно вводить человеку для терапевтических целей. Более того, антитело по изобретению можно вводить не являющемуся человеком млекопитающему, у которого экспрессируется PRLR, с которым антитело способно связываться, для ветеринарных целей или в качестве модели заболевания человека на животных. Что касается последнего, такие модели на животных могут быть полезными для оценки терапевтической эффективности антител по изобретению (например, исследование дозировок и расписания введения).
Как используют в рамках изобретения, термин "нарушение, при котором активность PRLR является вредоносной," включает заболевания и другие нарушения, при которых показано, что присутствие PRLR у индивидуума, страдающего нарушением, является или предположительно является ответственным за патофизиологию нарушения или фактор, который вносит вклад в ухудшение при нарушении. Таким образом, нарушение, при котором активность PRLR является вредоносной, представляет собой нарушение, при котором ожидается, что активность PRLR смягчит симптомы и/или прогрессирование нарушения. О таких нарушениях может свидетельствовать, например, увеличение концентрации PRLR в биологической жидкости индивидуума, страдающего нарушением (например, увеличение концентрации PRLR в сыворотке, плазме, синовиальной жидкости и т.д. индивидуума), которое может быть обнаружено, например, с использованием антитела против PRLR, как описано выше. Неограничивающие примеры нарушений, которые можно лечить антителами по изобретению, например, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, chAb5, Ab6, chAb6, Ab7, chAb7, Ab8, chAb8, Ab9, chAb9, Ab10, chAb10, Ab11, chAb11, Ab13, chAb13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52, Ab53, Ab54 или Ab55, их вариантами или их антигенсвязывающими фрагментами, включают нарушения, рассмотренные в разделе ниже, относящиеся к фармацевтическим композициям антител по изобретению. Например, пригодные нарушения включают, но не ограничиваются ими, различные злокачественные опухоли, включая, но не ограничиваясь ими, меланому, лимфому, рак молочной железы, рак яичника, карциному почки, желудочно-кишечный рак, рак толстого кишечника, рак легкого, рак поджелудочной железы, рак эндометрия и рак предстательной железы. В конкретных вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак яичника, рак эндометрия или рак легкого. В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы. В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой рак предстательной железы.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к лечению "нарушения, ассоциированного со сниженной экспрессией или сниженной активностью PRLR". Как используют в рамках изобретения термин "нарушение, ассоциированное со сниженной экспрессией или сниженной активностью PRLR" включает заболевания и другие нарушения, при которых было показано, что сниженная экспрессия или сниженная активность PRLR является или предположительно является ответственной за патофизиологию нарушения или фактор, который приводит к ухудшению при нарушении. Таким образом, ожидается, что увеличение активности PRLR будет смягчать симптомы и/или прогрессирование этих нарушений. О таких нарушениях может свидетельствовать, например, снижение концентрации PRLR в биологической жидкости индивидуума, страдающего нарушением (например, снижение концентрации PRLR в сыворотке, плазме, синовиальной жидкости и т.д. индивидуума), которое можно обнаруживать, например, с использованием антитела против PRLR,акак описано выше. Неограничивающие примеры нарушений, которые можно лечить антителами по изобретению, например, Ab12, chAb12, их вариантами или их антигенсвязывающими фрагментами, включают усиление развития молочной железы или увеличение лактации.
IV. Фармацевтические композиции
Также изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитело или его антигенсвязывающую часть по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции, содержащие антитела по изобретению, предназначены для применения, но не ограничиваясь этим, в диагностике, обнаружении или мониторинге нарушения, в профилактике, лечении, управлении течением или смягчении нарушения или одного или нескольких его симптомов, и/или в исследованиях. В конкретном варианте осуществления композиция содержит одно или несколько антител по изобретению. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит одно или несколько антител по изобретению и одно или несколько профилактических или терапевтических средств, отличных от антител по изобретению, для лечения нарушения, при котором активность PRLR является вредоносной. Предпочтительно профилактические или терапевтические средства представляют собой средства, которые известны в качестве пригодных или которые ранее использовали или в настоящее время используют для профилактики, лечения, управления течением или смягчения нарушения или одного или нескольких его симптомов. В соответствии с этими вариантами осуществления композиция может дополнительно содержать носитель, разбавитель или эксципиент.
Антитела и части антител по изобретению можно включать в фармацевтические композиции, пригодные для введения индивидууму. Как правило, фармацевтическая композиция содержит антитело или часть анититела по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Как используют в рамках изобретения, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все растворители, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие всасывание средства и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают одно или несколько из воды, физиологического раствора, фосфатно-солевого буфера, декстрозы, глицерина, этанола и т.п., а также их комбинации. Во многих случаях в композицию предпочтительно включают изотонические средства, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Кроме того, фармацевтически приемлемые носители могут содержать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие средства или эмульгаторы, консерванты или буферы, которые повышают срок хранения или эффективность антитела или части антитела.
Известны различные системы для доставки, и их можно использовать для доставки одного или нескольких антител по изобретению или комбинации одного или нескольких антител по изобретению и профилактического средства или терапевтического средства, пригодного для профилактики, управления течением, лечения или смягчения нарушения или одного или нескольких его симптомов, например, инкапсулирование в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать антитело или фрагмент антитела, опосредуемый рецептором эндоцитоз (см., например, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), конструирование нуклеиновой кислоты в качестве части ретровирусного или другого вектора, и т.д. Способы введения профилактического или терапевтического средства по изобретению включают, но не ограничиваются ими, парентеральное введение (например, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное), эпидуральное введение, внутриопухолевое введение и введение на слизистую оболочку (например, интраназальный и пероральный путь). Кроме того, можно использовать легочное введение, например, с использованием ингалятора или распылителя, и состава с образующим аэрозоль средством. См., например, патенты США № 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 4880078; и публикации PCT № WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 и WO 99/66903, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки. В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению, комбинированную терапию, или композицию по изобретению вводят с использованием технологии для легочной доставки лекарственного средства Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.). В конкретном варианте осуществления профилактические или терапевтические средства по изобретению вводят внутримышечно, внутривенно, внутрь опухоли, перорально, интраназально, через легкие или подкожно. Профилактические или терапевтические средства можно вводить любым удобным способом, например инфузией или болюсной инъекцией, посредством всасывания через эпителиальные или кожно-слизистые выстилки (например, слизистые оболочки полости рта, прямой кишки, кишечника и т.д.), и их можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или местным.
В конкретном варианте осуществления может быть желательным введение профилактических или терапевтических средств по изобретению локально в область, нуждающуюся в лечении; этого можно достигать, например, и не ограничиваясь этим, локальной инфузией, инъекцией или с помощью имплантата, причем указанный имплантат представляет собой пористый или непористый материал, включающий мембраны и матрицы, такие как силастиковые мембраны, полимеры, фиброзные матрицы (например, Tissuel®) или коллагеновые матрицы. В одном из вариантов осуществления эффективное количество одного или нескольких антител-антагонистов по изобретению вводят локально в пораженную область индивидууму для профилактики, лечения, управления течением и/или смягчения нарушения или его симптома. В другом варианте осуществления эффективное количество одного или нескольких антител по изобретению вводят локально в пораженную область индивидуума в комбинации с эффективным количеством одного или нескольких лекарственных средств (например, одного или нескольких профилактических или терапевтических средств), отличных от антитела по изобретению для профилактики, лечения, управления течением и/или смягчения нарушения или одного или нескольких его симптомов.
В другом варианте осуществления профилактическое или терапевтическое средство по изобретению можно доставлять в системе для контролируемого высвобождения или замедленного высвобождения. В одном из вариантов осуществления для достижения контролируемого или замедленного высвобождения можно использовать насос (см. Langer, выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). В другом варианте осуществления для достижения контролируемого или замедленного высвобождения лекарственных средств по изобретению можно использовать полимерные материалы (см., например, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; также см. Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); патент США № 5679377; патент США № 5916597; патент США № 5912015; патент США № 5989463; патент США № 5128326; публикацию PCT № WO 99/15154 и публикацию PCT № WO 99/20253. Примеры полимеров, используемых для составов с замедленным высвобождением, включают, но не ограничиваются ими, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), полиметилметакрилат, полиакриловую кислоту, сополимер этилена и винилацетата, полиметакриловую кислоту, полигликолиды (PLG), полиангидриды, поли(N-винилпирролидон), поливиниловый спирт, полиакриламид, полиэтиленгликоль, полилактиды (PLA), сополимер лактидов и гликолидов (PLGA) и сложные полиортоэфиры. В предпочтительном варианте осуществления полимер, используемый в составе с замедленным высвобождением, является инертным, не содержащим вымываемых примесей, стабильным при хранении, стерильным и биодеградируемым. В другом варианте осуществления вблизи профилактической или терапевтической мишени можно помещать систему с контролируемым или замедленным высвобождением, что, таким образом, делает необходимой только часть системной дозы (см., например, Goodson, Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
Системы с контролируемым высвобождением рассмотрены в обзоре Langer (1990, Science 249:1527-1533). Для получения составов с замедленным высвобождением, включающих одно или несколько лекарственных средств по изобретению, можно использовать любой способ, известный специалисту в данной области. См., например, патент США № 4526938, публикацию PCT WO 91/05548, публикацию PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel", Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, и Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery", Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
В конкретном варианте осуществления, где композиция по изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую профилактическое или терапевтическое средство, нуклеиновую кислоту можно вводить in vivo для обеспечения экспрессии кодируемого ей профилактического или терапевтического средства, посредством конструирования ее в качестве части соответствующего экспрессирующего нуклеиновую кислоту вектора и введения его так, чтобы он стал внутриклеточным, например, с использованием ретровирусного вектора (см. патент США № 4980286), или посредством прямой инъекции, или с использованием бомбардировки микрочастицами (например, генная пушка; Biolistic®, DuPont), или покрытия липидами или рецепторами клеточной поверхности или трансфицирующими агентами, или введения его в форме, связанной с гомеобокс-подобным пептидом, который, как известно, проникает в ядро (см., например, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). Альтернативно, нуклеиновую кислоту для экспрессии можно вводить внутрь клетки и встраивать с помощью гомологичной рекомбинации в ДНК клетки-хозяина.
Фармацевтическую композицию по изобретению изготавливают так, чтобы она была совместима с предполагаемым путем введения. Примеры способов введения включают, но не ограничиваются ими, парентеральное, например, внутривенное, внутрикожное, подкожное, пероральное, интраназальное (например, ингаляционное), трансдермальное (например, местное), трансмукозальное и ректальное введение. В конкретном варианте осуществления композицию изготавливают в соответствии с общепринятыми способами в качестве фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного, подкожного, внутримышечного, перорального, интраназального или местного введения человеку. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. Когда необходимо, композиция может включать солюбилизирующее вещество и местный анестетик, такой как лидокаин, для смягчения боли в области инъекции.
Если композиции по изобретению предназначены для местного введения, композиции можно изготавливать в форме мази, крема, чрескожного пластыря, лосьона, геля, шампуня, спрея, аэрозоля, раствора, эмульсии или другой формы, хорошо известной специалисту в данной области. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Для нераспыляемых местных дозированных форм, как правило, используют формы от вязких до полутвердых или твердых, содержащие носитель или один или несколько эксципиентов, совместимых с местным применением и имеющих динамическую вязкость, предпочтительно превышающую вязкость воды. Пригодные составы включают, но не ограничиваются ими, растворы, суспензии, эмульсии, кремы, мази, порошки, линименты, бальзамы и т.п., которые, если желательно, являются стерилизованными или смешанными с вспомогательными средствами (например, консервантами, стабилизаторами, смачивающими средствами, буферами или солями) для влияния на различные свойства, например, такие как осмотическое давление. Другие пригодные местные дозированные формы включают распыляемые аэрозольные препараты, где активный ингредиент предпочтительно в комбинации с твердым или жидким инертным носителем, упакован в смеси с находящимся под давлением летучим веществом (например, газообразным пропеллентом, таким как freon®) или в сдавливаемой бутыли. Также, если желательно, в фармацевтические композиции и дозированные формы можно добавлять увлажнители или смачивающие вещества. Примеры таких дополнительных ингредиентов хорошо известны в данной области.
Если способ по изобретению включает интраназальное введение композиции, композицию можно изготавливать в форме аэрозоля, спрея, жидкости для распыления или в форме капель. В частности, профилактические или терапевтические средства для применения в соответствии с настоящим изобретением можно удобным образом доставлять в форме аэрозольного спрея из находящихся под давлением пакетов или устройства для распыления, с использованием пригодного пропеллента (например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого пригодного газа). В случае находящегося под давлением аэрозоля, дозированную единицу можно определять посредством предоставления клапана для доставки дозированного количества. Можно изготавливать капсулы и кассеты (состоящие, например, из желатина) для применения в ингаляторе или инсуффляторе, содержащие порошковую смесь соединения и пригодной порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.
Если способ по изобретению включает пероральное введение, пероральные композиции можно изготавливать в форме таблеток, капсул, крахмальных капсул, желатиновых капсул, растворов, суспензий и т.п. Таблетки или капсулы можно получать общепринятыми способами с использованием фармацевтически приемлемых эксципиентов, таких как связующие вещества (например, прежелатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк или диоксид кремния); дезинтегрирующие вещества (например, картофельный крахмал или натрия крахмала гликолят); или смачивающие вещества (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки можно покрывать способами, хорошо известными в данной области. Жидкие препараты для перорального введения могут иметь форму, но не ограничиваясь ими, растворов, сиропов или суспензий, или они могут быть представлены в качестве сухого продукта для растворения водой или другим пригодным носителем перед применением. Такие жидкие препараты можно получать общепринятыми способами с использованием фармацевтически приемлемых добавок, таких как суспендирующие вещества (например, сироп сорбита, производные целлюлозы, или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгаторы (например, лецитин или гуммиарабик); неводные носители (например, миндальное масло, масляные сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла); и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоат или сорбиновая кислота). Также препараты могут содержать буферные соли, вкусовые добавки, красители и подсластители, в соответствующих случаях. Препараты для перорального введения могут быть пригодным образом изготовлены для медленного высвобождения, контролируемого высвобождения или непрерывного высвобождения профилактического или терапевтического средства(средств).
Способ по изобретению может включать легочное введение, например, с использованием ингалятора или устройства для распыления, композиции, изготовленной с образующим аэрозоль средством. См., например, патенты США № 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 и 4880078; и публикации PCT № WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 и WO 99/66903, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. В конкретном варианте осуществления антитело по изобретению, комбинированное лекарственное средство и/или композицию по изобретению вводят с использованием технологии легочной доставки лекарственного средства Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).
Способ по изобретению может включать введение композиции, изготовленной для парентерального введения, посредством инъекции (например, посредством болюсной инъекции или непрерывной инфузии). Составы для инъекции могут быть предоставлены в единичной дозированной форме (например, в ампулах или контейнерах для многократного дозирования) с добавлением консерванта. Композиции могут иметь такие формы, как формы суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях, и они могут содержать средства для изготовления состава, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно, активный ингредиент может находиться в форме порошка для растворения пригодным носителем (например, стерильной не содержащей пирогенов водой) перед применением.
Кроме того, способы по изобретению могут включать введение композиций, изготовленных в качестве депо-препаратов. Такие составы длительного действия можно вводить посредством имплантации (например, подкожной или внутримышечной) или посредством внутримышечной инъекции. Таким образом, например, композиции можно изготавливать с использованием пригодных полимерных или гидрофобных материалов (например, таких как эмульсия в приемлемом масле) или ионообменных смол, или в качестве малорастворимых производных (например, малорастворимой соли).
Способы по изобретению включают введение композиций, изготовленных в качестве нейтральной формы или формы соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные с анионами, такими как анионы хлористоводородной, фосфорной, уксусной, щавелевой, виннокаменной кислот, и т.д., и соли, образованные с катионами, такими как катионы натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т. д.
Как правило, ингредиенты композиций предоставляют либо по отдельности, либо в смеси друг с другом в единичной дозированной форме, например, в качестве сухого лиофилизированного порошка или не содержащего воды концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного вещества. Когда способом введения является инфузия, композицию можно дозировать с помощью бутыли для инфузии, содержащей стерильную воду для фармацевтического применения или физиологический раствор. Когда способом введения является инъекция, может быть предоставлена ампула со стерильной водой для инъекции или физиологическим раствором, так чтобы ингредиенты можно было смешать перед введением.
В частности, изобретение также предусматривает, что одно или несколько профилактических или терапевтических средств, или фармацевтических композиций по изобретению упакованы в герметично закрытый контейнер, такой как ампула или саше, с указанием количества активного вещества. В одном из вариантов осуществления одно или несколько из профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по изобретению предоставляют в качестве сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или не содержащего воды концентрата в герметично закрытом контейнере, и их можно восстанавливать (например, водой или физиологическим раствором) до концентрации, пригодной для введения индивидууму. Предпочтительно одно или несколько из профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по изобретению предоставляют в качестве сухого стерильного лиофилизированного порошка в герметично закрытом контейнере в единичной дозировке, составляющей по меньшей мере 5 мг, более предпочтительно по меньшей мере 10 мг, по меньшей мере 15 мг, по меньшей мере 25 мг, по меньшей мере 35 мг, по меньшей мере 45 мг, по меньшей мере 50 мг, по меньшей мере 75 мг, или по меньшей мере 100 мг. Лиофилизированные профилактические или терапевтические средства или фармацевтические композиции по изобретению следует хранить при температуре от 2°C до 8°C в их исходном контейнере, и профилактические или терапевтические средства, или фармацевтические композиции по изобретению должны быть введены в пределах 1 недели, предпочтительно в пределах 5 суток, в пределах 72 часов, в пределах 48 часов, в пределах 24 часов, в пределах 12 часов, в пределах 6 часов, в пределах 5 часов, в пределах 3 часов или в пределах 1 часа после восстановления. В альтернативном варианте осуществления одно или несколько из профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по изобретению предоставляют в жидкой форме в герметично закрытом контейнере, на котором указаны количество и концентрация вещества. Предпочтительно жидкую форму вводимой композиции предоставляют в герметично закрытом контейнере в концентрации по меньшей мере 0,25 мг/мл, более предпочтительно по меньшей мере 0,5 мг/мл, по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 2,5 мг/мл, по меньшей мере 5 мг/мл, по меньшей мере 8 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 15 мг/кг, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 75 мг/мл или по меньшей мере 100 мг/мл. Жидкую форму следует хранить при температуре от 2°C до 8°C в ее исходном контейнере.
Антитела и части антител по изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию, пригодную для парентерального введения. Предпочтительно антитело или части антитела получают в качестве инъецируемого раствора, содержащего 0,1-250 мг/мл антитела. Инъецируемый раствор может состоять либо из жидкой, либо из лиофилизированной дозированной формы в бесцветном или янтарном флаконе, ампуле или предварительно заполненном шприце. Буфер может представлять собой L-гистидин (1-50 мМ), оптимально 5-10 мМ, при pH от 5,0 до 7,0 (оптимально pH 6,0). Другие пригодные буферы включают, но не ограничиваются ими, сукцинат натрия, цитрат натрия, фосфат натрия или фосфат калия. Для модификации токсичности раствора можно использовать хлорид натрия в концентрации 0-300 мМ (оптимально 150 мМ для жидкой дозированной формы). Для лиофилизированной дозированной формы можно добавлять криопротектор, главным образом, 0-10% сахарозу (оптимально 0,5-1,0%). Другие пригодные криопротекторы включают трегалозу и лактозу. Для лиофилизированной дозированной формы можно добавлять наполнители, главным образом, 1-10% маннит (оптимально 2-4%). Как в жидких, так и с лиофилизированных дозированных формах можно использовать стабилизаторы, главным образом, 1-50 мМ L-метионин (оптимально 5-10 мМ). Другие пригодные наполнители включают глицин, аргинин, и можно добавлять 0-0,05% полисорбат-80 (оптимально 0,005-0,01%). Дополнительные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются ими, полисорбат 20 и поверхностно-активные вещества BRIJ. Фармацевтическая композиция, содержащая антитела и части антител по изобретению, полученная в качестве инъецируемого раствора для парентерального введения, может дополнительно содержать средство, пригодное в качестве адъюванта, такое как средства, используемые для повышения всасывания или диспергирования терапевтического белка (например, антитело). Особенно пригодным адъювантом является гиалуронидаза, такая как Hylenex® (рекомбинантная гиалуронидаза человека). Добавление гиалуронидазы в инъецируемый раствор повышает биодоступность у человека после парентерального введения, в частности подкожного введения. Также оно позволяет вводить большие объемы на область инъекции (т.е. более 1 мл) при снижении боли и неприятных ощущений и минимальной встречаемости реакций области инъекции. (см. WO 2004/078140, US № 2006/104968, включенные в настоящее описание в качестве ссылок).
Композиции по настоящему изобретению могут иметь различные формы. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые дозированные формы, такие как жидкие растворы (например, инъецируемые и инфузируемые растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого пути введения и терапевтического применения. Типичные предпочтительные композиции имеют форму инъецируемых или инфузируемых растворов, таких как композиции, сходные с композициями, используемыми для пассивной иммунизации человека другими антителами. Предпочтительным способом введения является парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, внутримышечный). В предпочтительном варианте осуществления антитело вводят посредством внутривенной инфузии или инъекции. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело вводят посредством внутримышечной или подкожной инъекции.
Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях изготовления и хранения. Композицию можно изготавливать в качестве раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или другой упорядоченной структуры, пригодной для высокой концентрации лекарственного средства. Стерильные инъецируемые растворы можно получать включением активного соединения (т.е., антитела или части антитела) в требуемом количестве в соответствующий растворитель с одним или с комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрацией. Как правило, дисперсии получают добавлением активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из тех, что перечислены выше. В случае стерильных лиофилизированных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов, предпочтительными способами изготовления являются вакуумная сушка и распылительная сушка, которые приводят к порошку активного ингредиента с любыми дополнительными желательными ингредиентами из их предварительно стерилизованного фильтрацией раствора. Надлежащую текучесть раствора можно поддерживать, например, с использованием покрытия, такого как лецитин, подержанием требуемого размера частиц в случае дисперсии, и с использованием поверхностно-активных веществ. Пролонгированного всасывания инъецируемых композиций можно достигать включением в композицию средства, которое замедляет всасывание, например, солей моностеарата и желатина.
Антитела и части антител по настоящему изобретению можно вводить множеством способов, известных в данной области, хотя для многих терапевтических применений предпочтительным путем/способом введения является подкожная инъекция, внутривенная инъекция или инфузия. Как будет понятно специалисту в данной области, путь и/или способ введения может варьировать, в зависимости от желаемых результатов. В определенных вариантах осуществления активное соединение можно изготавливать с носителем, который предотвращает быстрое высвобождение соединения, таким как состав с контролируемым высвобождением, включающий имплантаты, чрескожные пластыри и микроинкапсулированные системы для доставки. Можно использовать биодеградируемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Для получения таких составов запатентовано или, главным образом, известно специалистам в данной области множество способов. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, (J. R. Robinson, ed.) (Marcel Dekker, Inc., New York, 1978).
В определенных вариантах осуществления антитело или часть антитела по изобретению можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или усваиваемым пищевым носителем. Соединение (и другие ингредиенты, если желательно) также можно заключать в желатиновую капсулу с твердой или мягкой оболочкой, прессовать в таблетки, или включать непосредственно в рацион индивидуума. Для перорального терапевтического введения соединения можно включать с эксципиентами и использовать в форме проглатываемых таблеток, таблеток для трансбуккального введения, лепешек, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, пластинок и т.п. Для введения соединения по изобретению способом, отличным от парентерального введения, может быть необходимым покрытие соединения материалом для предотвращения его инактивации, или введение соединения совместно с ним.
В других вариантах осуществления антитело или часть антитела по изобретению могут быть конъюгированы с полимерной структурой, так что указанная полимерная структура может сообщать достаточный размер указанному антителу или части антитела по изобретению, чтобы указанное антитело или часть антитело по изобретению имели преимущество увеличенной проницаемости и эффекта удержания (эффект EPR) (также см. публикацию PCT № WO2006/042146A2 и публикации США № 2004/0028687A1, 2009/0285757A1 и 2011/0217363A1, и патент США № 7695719 (все из которых включены в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме и для всех целей).
Также в композиции можно включать дополнительные активные соединения. В определенных вариантах осуществления связывающий белок по изобретению составляют и/или совместно вводят с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, которые пригодны для лечения нарушений, при которых активность PRLR является вредоносной. Например, антитело против hPRLR или часть антитела по изобретению можно составлять и/или совместно вводить с одним или несколькими дополнительными антителами, которые связывают другие мишени (например, антитела, которые связывают цитокины или которые связывают молекулы клеточной поверхности). Более того, одно или несколько антител по изобретению можно использовать в комбинации с двумя или более из указанных выше лекарственных средств. Такие комбинированные лекарственные средства можно преимущественно использовать с более низкими дозировками вводимых лекарственных средств, таким образом, избегая возможной токсичности или осложнений, ассоциированных с различными способами монотерапии.
В определенных вариантах осуществления антитело против PRLR или его фрагмент связаны с носителем, удлиняющим время полужизни, известным в данной области. Такие носители включают, но не ограничиваются ими, Fc-домен, полиэтиленгликоль и декстран. Такие носители описаны, например, в заявке США с серийным номером № 09/428082 и опубликованной заявке PCT № WO 99/25044, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки для любых целей.
В конкретном варианте осуществления последовательности нуклеиновых кислот, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело по изобретению или другое профилактическое или терапевтическое средство по изобретению, вводят для лечения, профилактики, управления течением или смягчения нарушения или одного или нескольких его симптомов с помощью генной терапии. Генная терапия относится к терапии, проводимой путем введения индивидууму экспрессированной или экспрессируемой нуклеиновой кислоты. В этом варианте осуществления изобретения, нуклеиновые кислоты продуцируют кодируемое ими антитело или профилактическое или терапевтическое средство по изобретению, которое опосредует профилактический или терапевтический эффект.
В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любые способы генной терапии, доступные в данной области. Для основных обзоров способов генной терапии, см. Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926-932 (1993); и Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215. Широко известные в данной области способы технологии рекомбинантных ДНК, которые можно использовать, описаны в Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); и Kriegler, Gene Transfer и Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Подробное описание различных способов генной терапии представлено в публикации US20050042664 A1, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.
В другом аспекте настоящее заявка относится к способу лечения (например, излечения, подавления, смягчения, замедления или предупреждения возникновения или предупреждения рецидива или обострения) или предупреждения ассоциированного с PRLR нарушения у индивидуума. Способ включает: введение индивидууму связывающего PRLR соединения (в частности, антагониста), например, антитела против PRLR или его фрагмента, как описано в настоящем описании, в количестве, достаточном для лечения или предупреждения ассоциированного с PRLR нарушения. Антагонист PRLR, например, антитело против PRLR или его фрагмент, можно вводить индивидууму отдельно или в комбинации с другими способами лечения, как описано в настоящем описании.
В другом аспекте настоящая заявка относится к способу обнаружения присутствия PRLR в образце in vitro (например, биологический образец, такой как сыворотка, плазма, ткань, биоптат). Рассматриваемый способ можно использовать для диагностики нарушения, например, злокачественной опухоли. Способ включает: (i) контактирование образца или контрольного образца с антителом против PRLR или его фрагментом, как описано в настоящем описании; и (ii) обнаружение образования комплекса между антителом против PRLR или его фрагментом, и образцом или контрольным образцом, где статистически значимое изменение образования комплекса в образце относительно контрольного образца указывает на присутствие PRLR в образце.
В другом аспекте, настоящая заявка относится к способу обнаружения присутствия PRLR in vivo (например, визуализация in vivo у индивидуума). Рассматриваемый способ можно использовать для диагностики нарушения, например, ассоциированного с PRLR нарушения. Способ включает: (i) введение антитела против PRLR или его фрагмента, как описано в настоящем описании, индивидууму или контрольному индивидууму в условиях, которые позволяют связывание антитела или фрагмента с PRLR; и (ii) обнаружение образования комплекса между антителом или фрагментом и PRLR, где статистически значимое изменение образования комплекса у индивидуума относительно контрольного индивидуума указывает на присутствие PRLR.
Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие части можно использовать для лечения таких заболеваний отдельно или в комбинации. Следует понимать, что антитела по изобретению или их антигенсвязывающие части можно использовать отдельно или в комбинации с дополнительным средством, например лекарственным средством, причем дополнительное средство выбирает квалифицированный специалист для предполагаемой цели. Например, дополнительное средство может представлять собой лекарственное средство, признанное в данной области в качестве пригодного для лечения заболевания или состояния, подвергаемого лечению антителом по настоящему изобретению. Дополнительное средство также может представлять собой средство, которое придает полезное свойство терапевтической композиции, например, средство, которое влияет на вязкость композиции.
Кроме того, следует понимать, что комбинации, которые подлежат включению в это изобретение, представляют собой комбинации, пригодные для предполагаемой для них цели. Средства, указанные иже, представлены для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения. Комбинации, которые являются частью этого изобретения, могут представлять собой антитела по настоящему изобретению и по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из списков, приведенных ниже. Также комбинация может включать более одного дополнительного средства, например, два или три дополнительных средства, если комбинация является такой, что образованная композиция может выполнять предполагаемую для нее функцию.
Комбинированная терапия может включать один или несколько антагонистов PRLR, например, антител против PRLR или их фрагментов, составленных с и/или совместно введенных с одним или несколькими дополнительными лекарственными средствами, например, одним или несколькими ингибиторами цитокинов и факторов роста, иммунодепрессантами, противовоспалительными средствами (например, системные противовоспалительные средства), противофиброзными средствами, ингибиторами метаболизма, ингибиторами ферментов и/или цитотоксическими цитостатическими средствами, ингибиторами митоза, противоопухолевыми антибиотиками, иммуномодулирующими средствами, векторами для генной терапии, алкилирующими средствами, антиангиогенными средствами, антиметаболитами, борсодержащими средствами, хемопротективными средствами, гормонами, антигормональными средствами, кортикостероидами, фотоактивными лекарственными средствами, олигонуклеотидами, радионуклидными средствами, ингибиторами топоизомеразы, ингибиторами тирозинкиназы или радиосенсибилизирующими средствами, как более подробно описано в настоящем описании.
В конкретном варианте осуществления связывающие белки против PRLR, описанные в настоящем описании, например, антитела против PRLR, используют в комбинации со средством против злокачественной опухоли или антинеопластическим средством. Термины "средство против злокачественной опухоли" и "антинеопластическое средство" относятся к лекарственным средствам, используемым для лечения злокачественных опухолей, таких как злокачественный рост. Лекарственную терапию можно использовать отдельно или в комбинации с другими способами лечения, такими как хирургическая операция или лучевая терапия. Для лечения злокачественной опухоли можно использовать несколько классов лекарственных средств, в зависимости от природы вовлеченного органа. Например, рак молочной железы обычно стимулируется эстрогенами, и его можно лечить лекарственными средствами, которые инактивируют половые гормоны. Аналогично, рак предстательной железы можно лечить лекарственными средствами, которые инактивируют андрогены, мужские половые гормоны. Средства против злокачественной опухоли, которые можно использовать совместно с антителами против PRLR по настоящему изобретению, включают, среди прочих, следующие средства:
(a) антитела, отличные от антител против PRLR; и
(b) антитела против PRLR, которые связывают различные эпитопы
19D12 (полностью гуманизированное mAb)
Cp751-871 (полностью гуманизированное mAb)
H7C10 (гуманизированное mAb)
alphaIR3 (мышь)
ScFV/FC (химера мышь/человек)
EM/164 (мышь)
злокачественной опухоли
Эрбитукс® / Цетуксимаб (Imclone)
Вектибикс® /панитумумаб (Amgen)
mAb 806
Нимотуксумаб (TheraCIM)
AMG102 (Amgen)
5D5 (OA-5d5) (Genentech)
H244G11 (Pierre Fabre)
Герцептин® (трастузумаб; Genentech)
1B4C3; 2D1D12 (U3 Pharma AG)
BMS-536,924 (1H-бензоимидазол-2-ил)-1H-пиридин-2-он)
BMS-554,417
Циклолиган
TAE226
PQ401
Сверхэкспрессия или мутации, влияющие на экспрессию или активность EGFR, могут приводить к злокачественной
опухоли
CI-1033 (PD 183805) (Pfizer)
Лапатиниб (GW-572016) (GlaxoSmithKline)
Тайкерб®/Лапатиниб дитозилат (Smith Kline Beecham)
Тарцевва ®/Эрлотиниб HCL (OSI-774) (OSI Pharma)
PKI-166 (Novartis)
PD-158780
EKB-569
Тирфостин AG 1478 (4-(3-Хлоранилино)-6,7-диметоксихиназолин)
ARQ 197
Капецитабин/КСЕЛОДА® (HLR Roche)
5-Трифторметил-2'-дезоксиуридин
Метотрексат натрий (Trexall) (Barr)
Ралтитрексед/Томудекс® (AstraZeneca)
Пеметрексед/Алимта® (Lilly)
Тегафур
Цитозин арабинозид (Цитарабин, Ara-C)/Тиогуанин® (GlaxoSmithKline)
5-азацитидин
6-меркаптопурин (Меркаптопурин, 6-MP)
Азатиоприн/Азасан® (AAIPHARMA LLC)
6-тиогуанин (6-TG)/Пуринтол® (TEVA)
Пентостатин/Нипент® (Hospira Inc.)
Флударабин фосфат/Флудара® (Bayer Health Care)
Кладрибин (2-CdA, 2-хлордезоксиаденозин)/ Леустатин® (Ortho Biotech)
Циклофосфамид/Цитоксан (BMS)
Неосар (TEVA)
Ифосфамид/Митоксана® (ASTA Medica)
Тиотепа (Bedford, Abraxis, Teva)
BCNU→ 1,3-бис(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевина
CCNU→ 1, -(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозомочевина (метил CCNU)
Гексаметилмеламин (Алтретамин, HMM)/ Гексален® (MGI Pharma Inc.)
Бусульфан/Милеран (GlaxoSmithKline)
Прокарбазин HCL/ Матулан (Sigma Tau Pharmaceuticals, Inc.)
Дакарбазин (DTIC)
Хлорамбуцил/Лейкара® (SmithKline Beecham)
Мелфалан/Алкеран® (GlaxoSmithKline)
Цисплатин (Цисплатинум, CDDP)/ Платинол (Bristol Myers)
Карбоплатин/Параплатин (BMS)
Оксалиплатин/Элокситан ® (Sanofi-Aventis US)
повторного связывания фосфодиэфирного остова цепей ДНК в ходе нормального клеточного цикла.
Даунорубицин цитрат/ Дауноксом® (Gilead) Митоксантрон HCL/ Новантрон (EMD Serono)
Актиномицин D
Этопозид/Вепесид® (BMS)/Этопофос® (Hospira, Bedford, Teva Parenteral, Etc.)
Топотекан HCL/ Гикамтин®
(GlaxoSmithKline)
Тенипозид (VM-26)/ Вумон® (BMS)
Иринотекан HCL(CPT-
11)/Камптосар® (Pharmacia & Upjohn)
Винбластин сульфат/ Велбан® (прекращен) (Lilly)
Винорелбин тартрат/ Navelbine® (PierreFabre)
Виндезин сульфат/ Eldisine® (Lilly)
Паклитаксел/Таксол® (BMS)
Доцетаксел/Таксотер® (Sanofi Aventis US)
паклитаксел в форме наночастиц (ABI-007)/ Абраксан® (Abraxis BioScience, Inc.)
Икзабепилон/ИКЗЕМПРА™ (BMS)
способности протеинтирозинкиназ функционировать, эти соединения обеспечивают инструмент для контроля роста злокачественных клеток.
Сунитиниб малат/ Сутент® (Pfizer)
Сорафениб тозилат/ Нексавар® (Bayer)
Нилотиниб гидрохлорид моногидрат/Тасигна® (Novartis)
Ингибитор ангиогенеза/ Авастин® (Genentech)
IL-2→ Интерлейкин 2 (Альдеслейкин)/ Пролейкин® (Chiron)
IL-12→ Интерлейкин 12
гормонов, либо изменяет способность злокачественной опухоли использовать эти гормоны для роста и распространения.
Фулвестрант/Фаслодекс® (AstraZeneca)
Ралоксифен HCL/Эвиста® (Lilly)
Анастразол/Аримидекс® (AstraZeneca)
Лектрозол/Фемара® (Novartis)
Фадрозол (CGS 16949A )
Экземестан/Аромазин ® (Pharmacia & Upjohn)
Леупролид ацетат/ Eligard® (QTL USA)
Люпрон® (TAP Pharm)
Гозерелин ацетат/
Золадекс® (AstraZeneca)
Трипторелин памоат/ Trelstar® (Watson Labs)
Бузерелин/Суперфакт® (Sanofi Aventis)
Нафарелин
Цетрореликс/Цетротид ® (EMD Serono)
Бикалутамид/Касодекс® (AstraZeneca)
Нилутамид/Ниландрон® (Aventis Pharm.)
Магестрол ацетат/Мегейс® (BMS)
Аналоги соматостатина (Октреотид ацетат/
Сандостатин® (Novartis)
Дексаметазон/Декадрон® (Wyeth)
иммунодепрессивного средства рапамицина. Этот высоко консервативный каскад регулирует пролиферацию и метаболизм клеток в ответ на факторы внешней среды, связывая передачу сигнала рецепторов факторов роста в клетке через фосфоинозитид-3-киназу (PI-3K) с ростом клеток, пролиферацией и ангиогенезом.
Темсиролимус (CCI-779)/Торисел® (Wyeth)
Дефоролимус (AP23573)/
(Ariad Pharm.)
Эверолимус (RAD00I)/ Цертикан® (Novartis)
В дополнение к описанным выше средствам против злокачественной опухоли, антитела против PRLR, описанные в настоящем описании, можно вводить в комбинации со средствами, описанными в разделе II. Кроме того, упомянутые выше средства против злокачественной опухоли также можно использовать в ADC по изобретению.
В конкретных вариантах осуществления антитела против PRLR можно вводить отдельно или с другим средством против злокачественной опухоли, которое действует вместе или синергично с антителом для лечения заболевания, ассоциированного с активностью PRLR. Такие средства против злокачественной опухоли включают, например, средства, хорошо известные в данной области (например, цитотоксины, химиотерапевтические средства, низкомолекулярные соединение и лучевую терапию). Примеры средств против злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими, Панорекс (Glaxo-Welcome), Ритуксан (IDEC/Genentech/Hoffman la Roche), Милотарг (Wyeth), Кампат (Millennium), Зевалин (IDEC и Schering AG), Бексар (Corixa/GSK), Эрбитукс (Imclone/BMS), Авастин (Genentech) и Герцептин (Genentech/Hoffman la Roche). Другие средства против злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими, средства, описанные в патенте США № 7598028 и международной публикации № WO2008/100624, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылок. Одно или несколько средств против злокачественной опухоли можно вводить либо одновременно, либо до или после введения антитела или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению.
Следующие примеры предпочтительных дополнительных лекарственных средств, которые можно совместно вводить и/или составлять с одним или несколькими антагонистами PRLR, например, антителами против PRLR или их фрагментами, включают, но не ограничиваются ими, одно или несколько из: ингалируемых стероидов; бета-агонистов, например, бета-агонистов короткого действия или длительного действия; антагонистов лейкотриенов или рецепторов лейкотриенов; комбинированных лекарственных средств, таких как ADVAIR; ингибиторов IgE, например, антител против IgE (например, XOLAIR); ингибиторов фосфодиэстеразы (например, ингибиторы PDE4); ксантинов; антихолинергических лекарственных средств; стабилизаторов тучных клеток, таких как кромолин; ингибиторов IL-4; ингибиторов IL-5; ингибиторов эотаксина/CCR3; антагонистов гистамина или его рецепторов, включая H1, H2, H3 и H4, и антагонистов простагландина D или его рецепторов (DP1 и CRTH2). Такие комбинации можно использовать для лечения астмы и других респираторных нарушений. Дополнительные примеры лекарственных средств, которые можно совместно вводить и/или составлять с одним или несколькими антителами против PRLR или их фрагментами, включают один или несколько из: антагонистов TNF (например, растворимый фрагмент рецептора TNF, например, p55 или p75 рецептора TNF человека или их производные, например, 75 кДа TNFR-IgG (слитый белок 75-кДа рецептор TNF-IgG, ЭНБРЕЛ)); ферментных антагонистов TNF, например, ингибиторов TNF-конвертирующего фермента (TACE); антагонистов мускариновых рецепторов; антагонистов TGF-бета; интерферона-гамма; перфенидона; химиотерапевтических средств, например, метотрексата, лефлуномида или сиролимуса (рапамицин) или их аналогов, например, CCI-779; ингибиторов COX2 и cPLA2; NSAID; иммуномодуляторов; ингибиторов p38, TPL-2, ингибиторов MK-2 и NFkB, среди прочих.
Другие предпочтительные комбинации представляют собой цитокин-супрессивное противовоспалительное лекарственное средство(а) (CSAID); антитела к или антагонисты других цитокинов или факторов роста человека, например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-31, интерфероны, EMAP-II, GM-CSF, FGF, EGF, PDGF, и эндотелин-1, а также рецепторы этих цитокинов и факторов роста. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие части можно комбинировать с антителами к молекулам клеточной поверхности, таким как CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA или их лиганды, включая CD154 (gp39 или CD40L).
Предпочтительные комбинации лекарственных средств могут препятствовать различным этапам воспалительного каскада; предпочтительные примеры включают антагонисты TNF, такие как химерные, гуманизированные или человеческие антитела против TNF, адалимумаб, (HUMIRA; D2E7; публикация PCT № WO 97/29131), CA2 (РемикейдTM), CDP 571, и растворимые рецепторы p55 или p75 TNF, их производные (p75TNFR1gG (ЭнбрелTM) или p55TNFR1gG (Ленерцепт), и также ингибиторы TNF-конвертирующего фермента (TACE); аналогично ингибиторы IL-1 (ингибиторы интерлейкин-1-конвертирующего фермента, IL-1RA и т.д.) могут быть эффективными по той же причине. Другие предпочтительные комбинации включают интерлейкин 4.
Фармацевтические композиции по изобретению могут включать "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" антитела или части антитела по изобретению. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному, в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела или части антитела может определить специалист в данной области, и оно может варьировать, в зависимости от таких факторов, как болезненное состояние, возраст, пол и масса индивидуума, и способность связывающего белка вызвать желаемый ответ у индивидуума. Также терапевтически эффективное количество представляет собой количество, при котором терапевтически благоприятные эффекты перевешивают любые токсические или вредные эффекты антитела или части антитела. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному, в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, поскольку профилактическую дозу используют у индивидуумов до заболевания или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество является меньшим, чем терапевтически эффективное количество.
Режимы дозирования можно изменять для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, можно проводить однократное болюсное введение, можно вводить несколько разделенных доз с течением времени или дозу можно пропорционально снижать или увеличивать в зависимости от терапевтической ситуации. Особенно преимущественным является изготовление парентеральных композиций в виде единичной дозированной формы для простоты введения и единообразия дозировки. Единичная дозированная форма, как используют в рамках изобретения, относится к физически дискретным единицам, пригодным для однократных дозировок у млекопитающих, подлежащих лечению; причем каждая единица содержит заданное количество активного соединения, вычисленное для достижения желаемого эффекта, вместе с требуемым фармацевтическим носителем. Характеристики единичных дозированных форм по изобретению определяются и прямо зависят от (a) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, подлежащего достижению, и (b) ограничений, свойственных области изготовления такого активного соединения, для лечения чувствительности у индивидуумов.
Иллюстративный неограничивающий диапазон для терапевтически или профилактически эффективного количества антитела или части антитела по изобретению составляет 0,1-20 мг/кг, более предпочтительно 1-10 мг/кг. Следует отметить, что величины дозировок могут варьировать, в зависимости от типа и тяжести состояния, подлежащего смягчению. Кроме того, следует понимать, что для конкретного индивидуума, конкретные режимы дозирования следует корректировать в соответствии с потребностями индивидуума и профессиональным решением лица, вводящего или наблюдающего за введением композиций, и что диапазоны дозировок, указанных в настоящем описании, являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения объема или применения на практике заявленной композиции.
Специалистам в данной области понятно, что другие пригодные модификации и адаптации способов по изобретению, описанных в настоящем описании, являются очевидными, и их можно проводить с использованием пригодных эквивалентов без отклонения от объема изобретения или вариантов осуществления, описанных в настоящем описании. После подробного описания настоящего изобретения, оно станет более понятным с помощью следующих примеров, которые включены только для иллюстрации и не предназначены для ограничения изобретения.
Примеры
Пример 1: Получение и выделение моноклональных антител против PRLR человека
1. Гуманизация антител против PRLR
1.1. Отбор последовательностей эмбрионального типа человека для конструирования гуманизированных антител против PRLR с пересаженными CDR
С использованием методологии гуманизации последовательности CDR цепей VH и VL моноклональных антител Ab5, Ab6, Ab7 и Ab8 пересаживали в различные акцепторные последовательности тяжелой и легкой цепи человека следующим образом:
1.1.1. Ab6
Ab1 относится к гуманизированным антителам, происходящим из Ab6 мыши. Исходя из выравнивания с последовательностями VH и VL моноклонального антитела Ab6 по настоящему изобретению, были отобраны следующие известные последовательности человека:
1. IGHV1-69*02 и IGHJ6*01 для конструирования акцепторных последовательностей тяжелой цепи.
2. IGKV1-12*01 или IGKV3-15*01 и IGKJ4*01 для конструирования акцепторных последовательностей легкой цепи.
Путем пересадки соответствующих VH и VL CDR Ab6 в указанные акцепторные последовательности, получали последовательности VH и VL с пересаженными CDR, гуманизированные и модифицированные последовательности.
1.1.2. Ab5
Ab2 относится к гуманизированным антителам, происходящим из Ab5 мыши. Исходя из выравнивания с последовательностями VH и VL моноклонального антитела Ab5 по настоящему изобретению, были отобраны следующие известные последовательности человека:
1. IGHV1-69*01 и IGHJ4*01 для конструирования акцепторных последовательностей тяжелой цепи.
2. IGKV2-29*02 и IGKJ4*01 для конструирования акцепторных последовательностей легкой цепи.
Путем пересадки соответствующих VH и VL CDR Ab5 в указанные акцепторные последовательности получали последовательности VH и VL с пересаженными CDR, гуманизированные и модифицированные последовательности.
1.1.3. Ab8
Ab3 относится к гуманизированным антителам, происходящим из Ab8 мыши. Исходя из выравнивания с последовательностями VH и VL моноклонального антитела Ab8 по настоящему изобретению были отобраны следующие известные последовательности человека:
1. IGHV1-18*01 и IGHJ6*01 для конструирования акцепторных последовательностей тяжелой цепи.
2. IGKV1D-39*01 и IGKJ2*01 для конструирования акцепторных последовательностей легкой цепи.
Путем пересадки соответствующих VH и VL CDR Ab8 в указанные акцепторные последовательности, получали последовательности VH и VL с пересаженными CDR, гуманизированные и модифицированные последовательности.
1.1.4. Ab7
Ab4 относится к гуманизированным антителам, происходящим из Ab7 мыши. Исходя из выравнивания с последовательностями VH и VL моноклонального антитела Ab7 по настоящему изобретению, были отобраны следующие известные последовательности человека:
1. IGHV1-69*06 и IGHJ4*01 для конструирования акцепторных последовательностей тяжелой цепи.
2. IGKV2-29*02 и IGKJ4*01 для конструирования акцепторных последовательностей легкой цепи.
Путем пересадки соответствующих VH и VL CDR Ab7 в указанные акцепторные последовательности получали последовательности VH и VL с пересаженными CDR, гуманизированные и модифицированные последовательности.
1.2 Внесение потенциальных обратных мутаций каркасной области в антитела с пересаженными CDR
Для получения гуманизированного антитела с потенциальными обратными мутациями каркасной области, мутации идентифицировали и вносили в последовательности антител с пересаженными CDR посредством синтеза вариабельного домена de novo или мутагенных олигонуклеотидных праймеров и полимеразной цепной реакции, или обоих способов, хорошо известных в данной области. Различные комбинации обратных мутаций и других мутаций конструировали для каждого из антител с пересаженными CDR следующим образом. Номера остатков для этих мутаций были основаны на системе нумерации Kabat.
1.2.1. Ab1
Для тяжелых цепей Ab1VH.1z, один или несколько из следующих остатков подвергали обратной мутации следующим образом: M48→I, V67→A, I69→L и A71→V. Дополнительные мутации включали следующие: Q1→E, Y27→G, N60→A, K64→Q и D65→G.
Для легкой цепи Ab1VL.1, один или несколько из следующих остатков подвергали обратной мутации следующим образом: A43→S, G64→D и Y87→F.
1.2.2. Ab2
Для тяжелых цепей Ab2VH.1z, один или несколько из следующих остатков подвергали обратной мутации следующим образом: M48→I, V67→A, I69→L, A71→V и T75→S. Дополнительные мутации включали следующие: Q1→E, Y27→G, N60→A и K64→Q.
Для легкой цепи Ab2VL.1, один или несколько из следующих остатков подвергали обратной мутации следующим образом: I2→V и Y87→F.
1.2.3. Ab3
Для тяжелых цепей Ab3VH.1z, один или несколько из следующих остатков подвергали обратной мутации следующим образом: M48→I, V67→A, M69→L, T71→V и T73→N. Дополнительные мутации включали следующие: Q1→E, N60→A, F63→L, K64→Q и S65→G.
Для легкой цепи Ab3VL.1, один или несколько из следующих остатков подвергали обратной мутации следующим образом: A43→P и I48→V.
1.2.4 Ab4
Для тяжелых цепей Ab4 VH.1z, один или несколько из следующих остатков подвергали обратной мутации следующим образом: M48→I, V67→A, I69→L, A71→V, K73→R, T75→S и A93→G. Дополнительные мутации включали следующие: Q1→E.
Для легкой цепи Ab4 VL.1, один или несколько из следующих остатков подвергали обратной мутации следующим образом: I2→V и Y87→F.
1.3 Получение гуманизированных антител к PRLR, содержащих обратные мутации каркасной области в антителах с пересаженными CDR
Следующие гуманизированные вариабельные области моноклональных антител мыши против PRLR клонировали в экспрессирующие IgG векторы для функциональной охарактеризации.
1.3.1 Ab1
Последовательности гуманизированных вариабельных областей для антитела Ab1
- Ab1 VH.1z представляет собой гуманизированную VH Ab6 с пересаженными CDR, содержащую последовательности каркасной области IGHV1-69*02 и IGHJ6*01.
- Ab1 VH.1 основана на .1z с заменой Q1E.
- Ab1 VH.1a представляет собой гуманизированную конструкцию на основе .1, и она содержит предполагаемые обратные мутации каркасной области M48I, V67A, I69L и A71V.
- Ab1 VH.1b представляет собой промежуточную конструкцию между .1 и .1a, и она имеет только две обратных мутации: M48I и A71V. Она также имеет четыре изменения CDR эмбрионального типа человека: Y27G, N60A, K64Q и D65G.
- Ab1 VL.1 представляет собой гуманизированную VL Ab6 с пересаженными CDR, содержащую последовательности каркасной области IGKV1-12*01 и IGKJ4*01.
- Ab1 VL.1a представляет собой гуманизированную конструкцию на основе .1 с 3 предполагаемыми обратными мутациями каркасной области (A43S, G64D, и Y87F).
- Ab1 VL.2 представляет собой гуманизированную VL Ab6 с пересаженными CDR, содержащую последовательности каркасной области IGKV3-15*01 и IGKJ4*01.
- Ab1 VL.2a представляет собой гуманизированную конструкцию на основе .1 с 4 предполагаемыми обратными мутациями каркасной области (A43S, I58V, G64D и Y87F).
1.3.2 Ab2
Последовательности гуманизированных вариабельных областей для антитела Ab2
- Ab2 VH.1z представляет собой гуманизированную VH Ab5 с пересаженными CDR, содержащую последовательности каркасной области IGHV1-69*01 и IGHJ4*01.
- Ab2 VH.1 основана на .1z с заменой Q1E.
- Ab2 VH.1a представляет собой гуманизированную конструкцию на основе .1, и она содержит пять предполагаемых обратных мутаций каркасной области: M48I, V67A, I69L, A71V и T75S.
- Ab2 VH.1b представляет собой промежуточную конструкцию между .1 и .1a, и она имеет только две обратных мутации: M48I и A71V. Также она имеет три замены в CDR эмбрионального типа человека: Y27G, N60A и K64Q.
- Ab2VL.1 представляет собой гуманизированную VL Ab5 с пересаженными CDR, содержащую последовательности каркасной области IGKV2-29*02 и IGKJ4*01.
- Ab2 VL.1a представляет собой гуманизированную конструкцию на основе.1 с 2 предполагаемыми обратными мутациями каркасной области (I2V и Y87F).
- Ab2 VL.1b представляет собой промежуточную конструкцию между .1 и .1a с 1 предполагаемой обратной мутацией каркасной области I2V.
Ab3
Последовательности гуманизированных вариабельных областей для антитела Ab3
YVGDMDYWGQGTTVTVSS
- Ab3 VH.1z представляет собой гуманизированную VH Ab8 с пересаженными CDR, содержащую последовательности каркасной области IGHV1-18*01 и IGHJ6*01.
- Ab3 VH.1 основана на.1z с заменой Q1E.
- Ab3 VH.1a представляет собой гуманизированную конструкцию на основе .1, и она содержит пять предполагаемых обратных мутаций каркасной области: M48I, V67A, M69L, T71V и T73N.
- Ab3 VH.1b представляет собой промежуточную конструкцию между .1 и .1a, и она имеет только две обратных мутации: M48I и T71V. Также она имеет четыре замены в HCDR2 эмбрионального типа человека: N60A, F63L, K64Q и S65G.
- Ab3 VL.1 представляет собой гуманизированную VL Ab8 с пересаженными CDR, содержащую последовательности каркасной области IGKV1D-39*01 и IGKJ2*01.
- Ab3 VL.1a представляет собой гуманизированную конструкцию на основе .1 с 2 предполагаемыми обратными мутациями каркасной области (A43P и I48V).
- Ab3 VL.1b представляет собой промежуточную конструкцию между .1 и .1a с 1 предполагаемой обратной мутацией каркасной области I48V.
1.3.3. Ab4
Последовательности гуманизированных вариабельных областей для антитела Ab4
- Ab4 VH.1z представляет собой гуманизированную VH Ab7 с пересаженными CDR, содержащую последовательности каркасной области IGHV1-69*6 и JH4.
- Ab4 VH.1 основана на .1z с заменой Q1E.
- Ab4 VH.1a представляет собой гуманизированную конструкцию на основе .1, и она содержит семь предполагаемых обратных мутаций каркасной области: M48I, V67A, I69L, A71V, K73R, T75S и A93G.
- Ab4 VH.1b представляет собой промежуточную конструкцию между .1 и .1a, и она имеет только две обратных мутации: M48I и A71V.
- Ab4 VL.1 представляет собой гуманизированную VL Ab7 с пересаженными CDR, содержащую последовательности каркасной области IGKV2-29 и Jk4.
- Ab4 VL.1a представляет собой гуманизированную конструкцию на основе .1 с 2 предполагаемыми обратными мутациями каркасной области (I2V и Y87F).
- Ab4 VL.1b представляет собой промежуточную конструкцию между .1 и .1a с 1 предполагаемой обратной мутацией каркасной области I2V.
Пример 2: Анализ связывания и активности антител против PRLR
Связывание и активность антител против PRLR по изобретению анализировали следующим образом.
2.1 ELISA для pPRLR с T47D
Клетки T47D высевали в количестве 60000/лунка в 96-луночный планшет в среде RPMI1640, содержавшей 10% FBS, и инкубировали в течение ночи. На следующие сутки культуральную среду переключали на среду RPMI1640 без FBS. Затем клетки обрабатывали исследуемыми антителами против PRLR, разбавленными в буфере PBS, содержавшем 0,1% BSA, в концентрациях, находящихся в диапазоне от 0,001 до 10 мкг/мл, в течение 60 мин при 37°C. В конце обработки клетки стимулировали 100 нг/мл hPRL (R&D Systems) в течение 15 мин при 37°C. Затем клетки лизировали в буфере для лизиса клеток (Cell Signaling) в течение 20 мин при 4°C. Клеточные лизаты анализировали в отношении уровней фосфо-PRLR с использованием набора ELISA DuoSet IC kit для фосфо-PRLR человека от R&D System (#DYC4058). Результаты представлены в таблице 13.
Этот анализ использовали в качестве первоначального скрининга, поскольку фосфорилирование PRLR является прямым ответом на стимуляцию рецептора, и блокирование этой активности коррелирует с ингибированием передачи сигнала PRLR. Все антитела проявляли ингибирование фосфорилирования PRLR.
2.2 Анализы пролиферации клеток
2.2.1 Анализ пролиферации клеток Baf3-xPRLR
Сконструированные клеточные линии Baf3-xPRLR поддерживали в среде RPMI1640 с 10% FBS и 10 нг/мл hPRL (R&D Systems). Клетки высевали в 96-луночный планшет в количестве 10000/лунка в обычной культуральной среде, содержавшей 10 нг/мл hPRL. Затем клетки обрабатывали исследуемыми антителами против PRLR, разбавленными в буфере PBS с 0,1% BSA в концентрациях 0,001-10 мкг/мл в течение 3 суток при 37°C. После инкубации измеряли пролиферацию клеток с использованием стандартного набора CellTiter-Glo Luminescent Viability Assay kit (Promega). Результаты представлены в таблице 13.
2.2.2 Анализ пролиферации клеток Nb2-11
Клетки Nb2-11 (Sigma) поддерживали в полной среде (RPMI1640, 10% FBS, 10% сыворотка лошади, 0,05 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,075% бикарбонат натрия). Клетки переключали на стационарную среду (RPMI1640, 10% сыворотка лошади, 0,05 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,075% бикарбонат натрия) плюс 1% FBS за сутки до анализа. Для анализа PRL-зависимой пролиферации клетки Nb2-11 промывали и ресуспендировали в стационарной среде плюс 1 нг/мл hPRL (R&D Systems) в количестве 250 тысяч клеток/мл. Клетки высевали в 96-луночный планшет в количестве 90 мкл/лунка, и обрабатывали 10 мкл исследуемых антител против PRLR, разбавленных в буфере PBS с 0,1% BSA в конечных концентрациях 0,001-10 мкг/мл в течение 3 суток при 37°C. После инкубации измеряли пролиферацию клеток с использованием стандартного набора CellTiter-Glo Luminescent Viability Assay kit (Promega). Результаты представлены в таблице 13.
2.2.3 Заключения
Все клетки Nb-211 и Ba/F3 крысы, экспрессирующие PRLR мыши, яванского макака и человека, являются зависимыми от передачи сигнала PRLR для пролиферации, таким образом, этот чувствительный анализ использовали для оценки блокады передачи сигнала PRLR этих различных видов в клетках in vitro. Результаты для человека соответствовали результатам, наблюдаемым в анализе pPRLR. Активность в основном сохранялась у гуманизированных версий, например, Ab1, Ab2, Ab3 и Ab4. Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab11 и Ab13 продемонстрировали ингибирование PRLR для PRLR яванского макака и PRLR человека, причем Ab1, Ab2, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab9 и Ab13 являлись особенно эффективными. Ab2, Ab4 и Ab7 продемонстрировали особенно эффективную активность ингибирования PRLR в отношении PRLR мыши и крысы.
2.3 Анализ связывания ELISA для внеклеточных доменов (ECD)
Планшеты покрывали в течение ночи антителом против козы против Fc-области человека (1 мкг/мл) для слитых белков ECD PRLR человека, мыши и крысы с Fc, и антителом мыши против his для белка ECD PRLR яванского макака-his6 ("his6", описанный в качестве SEQ ID NO: 159) в 1x PBS (pH 7,4). Для экспериментов по связыванию ECD PRLR яванского макака с антителами мыши белок ECD PRLR яванского макака-his6 ("his6", описанный в качестве SEQ ID NO: 159) прямо связывали с планшетом для ELISA. Планшеты блокировали в течение 1 часа посредством Superblock (Pierce) и промывали (3x) буфером для промывания (1x PBS (pH 7,4), 0,05% Tween 20). Белки ECD связывали с соответствующим антителом (1 час) в буфере для связывания (буфер для промывания плюс 10% Superblock), промывали (3x, буфер для промывания), а затем инкубировали с серийными разведениями антител (1 час) в буфере для связывания. После промывания (3x, буфер для промывания), связывали вторичные антитела, конъюгированные с HRP (1 час) в буфере для связывания, промывали (3x, буфер для промывания) и инкубировали с субстратом TMB (Pierce) для формирования сигнала в течение 3-5 минут, останавливали 2 Н H2SO4 и сканировали при 450 нМ. Кривые аппроксимировали с помощью GraphPad 5 (Prizm) и EC50 определяли с помощью функции аппроксимации кривой GraphPad 5. Результаты представлены в таблице 13.
FACS (PBS + 1%FBS) в количестве 2 миллиона клеток/мл. Клетки Данные ELISA связывания коррелировали с данными ингибирования пролиферации.
2.4 Анализ связывания FACS:
Клетки Nb2-11 и Baf3-xPRLR ресуспендировали в буфере для добавляли в круглодонный 96-луночный планшет (100 мкл/лунка) и обрабатывали исследуемыми антителами против PRLR в течение 1 ч при 4C. Затем клетки промывали буфером для FACS два раза и инкубировали со 2-м антителом, конъюгированным с ALEXA488 (Invitrogen) в течение 1 ч при 4°C. После двух промываний в буфере FACS клетки ресуспендировали в 1% формальдегиде в PBS. Клетки анализировали с использованием проточного цитометра LSRII. Результаты представлены в таблице 13.
Данные FACS также коррелировали с данными пролиферации. Гуманизированные антитела не подвергали анализу связывания FACS.
2.5 Связывание Biacore
Подвижный буфер представлял собой HBS-EP+ (10 мМ Hepes, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% Tween 20). [PRLR] в концентрации 600 нМ, 66,67 нМ и 7,41 нМ (3 точки, 9-кратные серии разведений) аппроксимировали к модели связывания 1:1 (локальный Rmax, MT-терминация включена) с использованием программного обеспечения Biacore T200 Evaluation Software. Результаты представлены в таблице 14.
Данные Biacore обеспечивает более детальную биохимическую информацию о связывании. Связывание гуманизированных антител с PRLR мыши с более низкой аффинностью более точно количественно определяют с помощью этого анализа.
Анализ результатов на фиг.11 демонстрирует, что chAb7 обладает высокой аффинностью в отношении PRLR человека. Кроме того, при гуманизации химерного антитела для получения гуманизированных антител Ab36 и Ab39, аффинность снижается в ~45 раз и в ~22 раз, соответственно. Снижение аффинности в основном является результатом изменений константы koff. В то время как обратные мутации, внесенные в Ab36 (т.е. Ab53), не повышали аффинность антитела, обратные мутации, внесенные в Ab39 (т.е. Ab54 и Ab55) повышали аффинность до уровня, который был приблизительно в 4 раза и в 5 раз слабее, чем наблюдалось для chAb7. Анализ результатов на фиг.10 показал, что все mAb демонстрируют значительно и пропорционально более слабую кинетику связывания в отношении PRLR мыши.
ОБОБЩЕНИЕ ДАННЫХ ИЗ ПРИМЕРОВ 2.1 (ELISA ДЛЯ pPRLR с T47D), 2.2 (АНАЛИЗЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК Baf3-xPRLR И NB2-11), 2.3 (АНАЛИЗ СВЯЗЫВАНИЯ ELISA В ОТНОШЕНИИ ECD) И 2.4 (АНАЛИЗ СВЯЗЫВАНИЯ FACS)
ОБОБЩЕНИЕ ДАННЫХ ИЗ ПРИМЕРА 2.5 (АНАЛИЗ СВЯЗЫВАНИЯ BIACORE)
Пример 3: Анализ ингибирования роста ксенотрансплантата опухоли
Оценивали эффект антител против PRLR на рост ксенотрансплантатов опухолей лимфомы крысы Nb2-11. Один миллион злокачественных клеток, суспендированных в среде S-MEM (без кальция, без глутамина, Life Technologies Corporation), содержавших матригель (свободный от фенолового красного, Becton Dickinson Biosciences Discovery Labware) инокулировали подкожно в правую заднюю часть бока самок мышей SCID-beige (Charles Rivers Labs, 10 на группу) на 0 сутки исследования. Введение (IP) антител или носителя (нормальный солевой раствор) начинали в момент подбора по размеру на 7 сутки. Опухоли измеряли с помощью калиперов два раза в неделю, начиная в момент подбора по размеру, и объемы опухоли вычисляли по формуле V=L×W2/2 (V: объем, мм; L: длина, мм. W: ширина, мм). Объем опухоли измеряли в течение эксперимента до тех пор, пока средний объем опухоли в каждой группе не достигал конечного результата >1000 мм3. Результаты представлены на фиг.5 и в таблице 15.
Обобщение эффектов антител против PRLR в модели с ксенотрансплантатом Nb2-11
a. Ингибирование роста опухоли, %TGI = 100 - средний объем опухоли в группе введения/средний объем опухоли в контрольной группе ×100. Значения p (как указано звездочками) получены путем сравнения T-критерия Стьюдента в группе введения против контрольной группы. Исходя из 26 суток. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
b. Замедление роста опухоли, %TGD=(T-C)/C×100, где T = среднее время до конечного результата в группе введения и C = среднее время до конечного результата в контрольной группе. Значения p (как указано звездочками), полученные в результате логарифмического рангового сравнения Каплана-Мейера группы введения против контрольной группы. На основе конечного результата 1000 мм3. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
Пример 4: Группирование эпитопов против PRLR
Группирование эпитопов антител против PRLR по изобретению проводили с использованием попарного анализа связывания следующим образом.
Антитела мыши: Ab5-Ab12
Подвижный буфер представлял собой HBS-EP+ (10 мМ Hepes, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% поверхностно-активное вещество). Анализ проводили с использованием сенсорных чипов Biacore T100 и CM5 с антителом против IgG мыши (Pierce) или антителом против человека IgG (Pierce) в каждой проточной ячейке. Антитело против PRLR иммобилизовывали в проточной ячейке. Затем проточную ячейку блокировали путем инъекции контрольного антитела (50 мкг/мл) перед инъекцией антигена. Затем инъецировали второе антитело против PRLR (10 мкг/мл). Ответ связывания в качестве функции времени анализировали для каждого анализа попарного связывания. Также проводили реципрокные анализы связывания. Результаты анализов, проведенных с антителами мыши Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11 и Ab12, представлены на фиг.6.
Химерные и гуманизированные антитела
Подвижный буфер представлял собой HBS-EP+ (10 мМ Hepes, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% поверхностно-активное вещество). Анализ проводили при 12°C с использованием сенсорных чипов Biacore T200 и CM5 с антителом против IgG человека (Pierce), сопряженным с амином, во всех 4 проточных ячейках, до ~2000 RU.
Отдельные исследуемые mAb иммобилизовывали в проточных ячейках 2, 3 и 4 (проточная ячейка 1 представляла собой эталон без исследуемого mAb). Затем все 4 проточных ячейки блокировали путем инжектирования изотипического контрольного mAb к концентрации 50 мкг/мл. Затем во все 4 проточные ячейки инжектировали антиген или только буфер (только буфер в качестве двойного эталона, для каждой пары mAb индивидуально). Затем во все 4 проточные ячейки инжектировали 2-е исследуемое mAb в концентрации 10 мкг/мл. Затем все 4 проточные ячейки регенерировали посредством глицина, pH 1,5.
Ответ связывания в качестве функции времени анализировали для каждого попарного анализа связывания. Также проводили реципрокные анализы связывания. Результаты одновременных анализов связывания, проведенных с помощью chAb7, Ab39, Ab40, chAb5, Ab30, chAb6, Ab19, Ab21, chAb8, Ab48, Ab49 и LFA102, представлены на фиг.7 и фиг.8.
Эти анализы, проведенные с использованием как химерных, так и гуманизированных антител, продемонстрировали, что как химерные, так и гуманизированные антитела распознавали одну и ту же область PRLR. На фиг.7 представлены результаты анализа связывания антител, проведенного для определения того, конкурируют ли химерные и гуманизированные формы каждого среднеквадратического антитела с каждым другим антителом за связывание с PRLR. Эти результаты указывают на то, что химерные и гуманизированные формы каждого среднеквадратического антитела не конкурируют друг с другом, что, таким образом, указывает на то, что гуманизация химерного антитела не изменяла значительно центральный эпитоп для любого данного среднеквадратического антитела. Иными словами, инженерия химерных антител или гуманизация не изменяли относительное группирование эпитопов для большинства антител по сравнению с группированием эпитопов родительских антител мыши. Однако происходил небольшой сдвиг группирования эпитопов для происходящих из Ab5 mAb относительно происходящих из Ab8 mAb по сравнению с предшествующим группированием эпитопов для mAb мыши. Это отличие, более вероятно, является следствием пространственных различий между каркасными областями мыши и человека в противоположность изменениям фактического эпитопа. Для сходных результатов см. Zettlitz, K.A., et al., Mol Biotechnol (2010) 46: 265-278.
Пример 5: Кристаллизация комплекса chAb6 (Fab)-PRLR
Кристаллизацию структуры комплекса Fab-фрагмент chAb6-PRLR проводили и анализировали следующим образом.
Получение и очистка Fab-фрагмента chAb6:
Fab-фрагмент chAb6 получали путем расщепления папаином исходного mAb, как подробно описано ниже. Папаин активировали 50 мМ цистеином в буфере PBS, pH 7,4. mAb chAb6 в буфере PBS, pH 7,4, смешивали с папаином при соотношении масс папаина к mAb 1:77 и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Реакцию гасили 6,25 мМ йодацетамидом. Смесь очищали на 8 мл смолы Mab SelectSure (GE Healthcare), где Fab-фрагмент собирали в качестве прошедшей фракции. Прошедшую фракцию концентрировали с использованием центрифужного устройства Ultrafree-15 Biomax с пороговым значением молекулярной массы 30 кДа (MWCO) (Millipore). Концентрированную смесь очищали на колонке 2,6 см×60 см Sephacryl 200 HiPrep (GE Healthcare), предварительно уравновешенной в 50 мМ буфере HEPES, 50 мМ NaCl, pH 7,5. Фракции, содержавшие Fab-фрагмент (при мониторинге по УФ-поглощению при 280 нм), объединяли и замораживали при -80° C. Чистоту образца анализировали с помощью аналитической SEC, SDS-PAGE и масс-спектрометрии.
Получение комплекса Fab chAb6-PRLR:
Рекомбинантный PRLR человека экспрессировали в экспрессирующей системе млекопитающих, а затем очищали с использованием способов, хорошо известных в данной области. Рекомбинантный PRLR человека и белок Fab chAb6 смешивали в молярном соотношении 1,15:1 и инкубировали в течение 2 ч при 22°C. Комплексный образец наносили на колонку 2,6 см ×60 см Sephacryl 200 HiPrep (GE Healthcare), предварительно уравновешенную в 50 мМ буфере HEPES, 50 мМ NaCl, pH 7,5, при 1 мл/мин. Фракции, содержавшие комплекс (при мониторинге по УФ-поглощению при 280 нм) объединяли и концентрировали до 44 мг/мл с использованием центрифужного устройства Ultrafree-15 Biomax с пороговым значением молекулярной массы 30 кДа (MWCO) (Millipore). Чистоту образца оценивали с помощью аналитической SEC и SDS-PAGE. Избыток белка комплекса Fab хранили замороженным при -80°C.
Кристаллизация комплекса Fab chAb6-PRLR:
Белковый комплекс доставляли в концентрации 43,9 мг/мл в 50 мМ HEPES pH 7,5, 50 мМ NaCl, и его использовали разбавленным до 30 мг/мл для испытаний по кристаллизации. Кристаллы выращивали с использованием способа диффузии из пара при 17°C. Резервуарный раствор представлял собой 25% (масс./об.) PEG 3350, 0,1 M Bis-Tris pH 5,5, 0,1 M сульфат аммония. Кристаллизационные капли получали с использованием соотношения 1:1 белка и резервуарного раствора. Кристаллы подвергали криопротекции с использованием 10% (об./об.) пропиленгликоля. Данные дифракции получали под газообразным азотом при 100K на источнике света Canadian Light Source (Saskatoon, Канада).
Рентгеновская структура комплекса Fab chAb6-PRLR:
Данные рентгенодифракции, достигающие разрешения 1,93 Å, и полный набор данных обрабатывали с помощью HKL2000 (HKL Research, Inc). Кристаллографическая пространственная группа является орторомбической структурой P212121 с параметрами единичной ячейки a=62 Å, b=83 Å и c=135 Å. Статистика для полученных данных представлена в таблице 16.
СТАТИСТИКА РЕНТГЕНОДИФРАКЦИИ ДЛЯ КОМПЛЕКСА FAB chAb6-PRLR
Определение структуры:
Кристаллическую структуру определяли по молекулярному вытеснению. Модель частичного поиска для участков VhVl, ChCl и PRLR создавали, а затем устанавливали с использованием программы MOLREP (Vagin et al, 1997) в пакет программ CCP4 (Winn et al. 2011). Асимметричный элемент содержит один молекулярный комплекс и симметричные элементы завершали кристаллическую решетку межмолекулярными контактами. Координаты уточняли относительно данных с использованием программы autoBUSTER (Global Phasing, Ltd) и многократных раундов графического анализа и перестроения в электронную плотность с помощью программы COOT (Emsley et al, 2010). Статистика для конечной структуры представлена в таблице 17:
УТОЧНЯЮЩАЯ СТАТИСТИКА ДЛЯ КОМПЛЕКСА FAB chAb6-PRLR
Межмолекулярные контакты наблюдают между внеклеточным доменом PRLR и множеством CDR Fab chAb6. Контакты состоят из критических гидрофобных и гидрофильных взаимодействий и включают мостиковые молекулы воды. В этих контактах прямо участвуют H1, H2, H3 CDR и L2 SEQ ID NO: 104 и 113. Область контакта на антигене охватывает поверхность эпитопа на пересечении доменов PRLR, содержащих топографическую область, определяемую остатками PRLR: E8, F10, C12, R25, E43, G44, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, Y99, I100, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 и W191 SEQ ID NO:2. Указанные выше аминокислотные остатки PRLR находятся в пределах 4Å от Fab chAb6 при связывании с ним.
Иллюстрация поверхностей эпитопов, картированных на структуре тройного комплекса PRL-PRLR для Ab6 и LFA102, представлена на фиг.9.
Пример 6: Кристаллизация комплекса chAb7 (Fab)-PRLR
Кристаллизацию структуры комплекса Fab фрагмент chAb7-PRLR проводили и анализировали следующим образом.
Получение и очистка Fab-фрагмента chAb7:
Fab-фрагмент chAb7 получали путем расщепления папаином исходного mAb, как подробно описано ниже. Папаин активировали 50 мМ цистеином в буфере PBS, pH 7,4. mAb chAb6 в буфере PBS, pH 7,4, смешивали с папаином при соотношении масс папаина к mAb 1:100 и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Реакцию гасили 6 мМ йодацетамидом. Смесь очищали на 5 мл смолы Mab SelectSure (GE Healthcare), где Fab-фрагмент собирали в качестве прошедшей фракции. Прошедшую фракцию концентрировали с использованием центрифужного устройства Ultrafree-15 Biomax с пороговым значением молекулярной массы 30 кДа (MWCO) (Millipore). Концентрированную смесь очищали на колонке 2,6 см ×60 см Sephacryl 200 HiPrep (GE Healthcare), предварительно уравновешенной в 50 мМ буфере HEPES, 50 мМ NaCl, pH 7,5. Фракции, содержавшие Fab-фрагмент (при мониторинге по УФ-поглощению при 280 нм), объединяли и замораживали при -80°C. Чистоту образца анализировали с помощью аналитической SEC, SDS-PAGE и масс-спектрометрии.
Получение комплекса Fab chAb7-PRLR:
Рекомбинантный PRLR человека экспрессировали в экспрессирующей системе млекопитающих, а затем очищали с использованием способов, хорошо известных в данной области. Рекомбинантный PRLR человека и белок Fab chAb7 смешивали в молярном соотношении 2:1 и инкубировали в течение 2 ч при 4°C. Комплексный образец наносили на колонку 2,6 см ×60 см Sephacryl 200 HiPrep (GE Healthcare), предварительно уравновешенную в 50 мМ буфере HEPES, 50 мМ NaCl, pH 7,5, при 1 мл/мин. Фракции, содержавшие комплекс (при мониторинге по УФ-поглощению при 280 нм) объединяли и концентрировали до 18 мг/мл с использованием центрифужного устройства Ultrafree-15 Biomax с пороговым значением молекулярной массы 30 кДа (MWCO) (Millipore). Чистоту образца оценивали с помощью аналитической SEC и SDS-PAGE. Избыток белка комплекса Fab хранили замороженным при -80°C.
Кристаллизация комплекса Fab chAb7-PRLR:
Белковый комплекс доставляли в концентрации 17,6 мг/мл в 50 мМ HEPES pH 7,5, 50 мМ NaCl, 1 мМ азид натрия, и его использовали в доставляемой концентрации. Кристаллы выращивали с использованием способа диффузии из пара при 4°C. Резервуарный раствор представлял собой 22% (масс./об.) PEG 4000, 0,1 M ацетат натрия, 0,2 M сульфат аммония. Кристаллизационные капли получали с использованием соотношения 1:1 белка и резервуарного раствора. Кристаллы подвергали криопротекции с использованием 15% (об./об.) пропиленгликоля. Данные дифракции получали под газообразным азотом при 100K на линии пучка 17ID (IMCA-cat) на источнике фотонов Advanced Photon Source (Argonne, IL).
Рентгеновская структура комплекса Fab chAb7-PRLR:
Данные рентгенодифракции, достигающие разрешения 2,0 Å, и полный набор данных обрабатывали с помощью autoPROC (Global Phasing, Ltd). Кристаллографическая пространственная группа является моноклинической структурой P21 с параметрами единичной ячейки a=99 Å, b=85 Å, c=101 Å и бета=93°. Статистика для полученных данных представлена в таблице 18.
СТАТИСТИКА РЕНТГЕНОДИФРАКЦИИ ДЛЯ КОМПЛЕКСА FAB chAb7-PRLR
Определение структуры:
Кристаллическую структуру определяли по молекулярному вытеснению. Модель частичного поиска для участков VhVl, ChCl и PRLR создавали, а затем устанавливали с использованием программы MOLREP (Vagin et al, 1997) в пакет программ CCP4 (Winn et al. 2011). Асимметричный элемент содержит 2 молекулярных комплекса, которые расположены сходным образом, и группу симметричных элементов для завершения кристаллической решетки межмолекулярными контактами. Координаты уточняли относительно данных с использованием программы autoBUSTER (Global Phasing, Ltd) и многократных раундов графического анализа и перестроения в электронную плотность с помощью программы COOT (Emsley et al, 2010). Статистика для конечной структуры представлена в таблице 19:
УТОЧНЯЮЩАЯ СТАТИСТИКА ДЛЯ КОМПЛЕКСА FAB chAb7-PRLR
Структура комплекса PRLR/Fab chAb7:
Межмолекулярные контакты наблюдают между внеклеточным доменом PRLR и множеством CDR Fab chAb7. Площадь погруженной поверхности рецептора при связывании антитела составляет 1198 Å2. Контакты включают критические гидрофобные и гидрофильные взаимодействия и включают мостиковые молекулы воды. В этих контактах прямо участвуют CDR H1, H2, H3, L1 и L2 SEQ ID NO: 105 и 114. Площадь контакта на антигене охватывает поверхность эпитопа на пересечении доменов PRLR, содержащем топографическую область, определяемую остатками PRLR: E8, I9, F10, K11, C12, R25, E43, G44, W72, T74, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, T98, Y99, I100, W139, L143, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 и W191 SEQ ID NO:2. Указанные выше аминокислотные остатки PRLR находятся в пределах 4Å от Fab chAb7 при связывании с ним.
Положение связанного chAb7 с PRLR указывает на то, что chAb7, препятствует связыванию пролактина с PRLR.
Данные примеров 5 и 6 согласуются в отношении демонстрации того, что chAb6 и chAb7 проявляют комплементарные взаимодействия приблизительно для одного и того же эпитопа. Консервативные признаки тяжелых цепей между двумя антителами указывают на важность взаимодействий тяжелых цепей при связывании PRLR.
Пример 7: Кристаллизация комплексов chAb8 (Fab)-PRLR комплексы
Кристаллизацию структуры комплекса Fab фрагмент chAb8-PRLR проводили и анализировали следующим образом.
Получение и очистка Fab-фрагмента chAb8:
Fab-фрагмент chAb8 получали путем расщепления папаином исходного mAb, как подробно описано ниже. Папаин активировали 50 мМ цистеином в буфере PBS, pH 7,4. mAb chAb8 в буфере PBS, pH 7,4, смешивали с папаином при соотношении масс папаина к mAb 1:93 и инкубировали в течение 1 ч при 37° C. Реакцию гасили 5 мМ йодацетамидом. Смесь очищали на 5 мл смолы Mab SelectSure (GE Healthcare), где Fab-фрагмент собирали в качестве прошедшей фракции. Прошедшую фракцию концентрировали с использованием центрифужного устройства Ultrafree-15 Biomax с пороговым значением молекулярной массы 30 кДа (MWCO) (Millipore). Концентрированную смесь очищали на колонке 2,6 см ×60 см Sephacryl 200 HiPrep (GE Healthcare), предварительно уравновешенной в 50 мМ буфере HEPES, 50 мМ NaCl, pH 7,5. Фракции, содержавшие Fab-фрагмент (при мониторинге по УФ-поглощению при 280 нм), объединяли и замораживали при -80° C. Чистоту образца анализировали с помощью аналитической SEC, SDS-PAGE и масс-спектрометрии.
Получение комплекса Fab chAb8-PRLR:
Рекомбинантный PRLR человека экспрессировали в экспрессирующей системе млекопитающих, а затем очищали с использованием способов, хорошо известных в данной области. Рекомбинантный PRLR человека и белок Fab chAb8 смешивали в молярном соотношении 1,16:1 и инкубировали в течение 2 ч при 22° C. Комплексный образец наносили на колонку 2,6 см×60 см Sephacryl 200 HiPrep (GE Healthcare), предварительно уравновешенную в 50 мМ буфере HEPES, 50 мМ NaCl, pH 7,5, при 1 мл/мин. Фракции, содержавшие комплекс (при мониторинге по УФ-поглощению при 280 нм), объединяли и концентрировали до 38 мг/мл с использованием центрифужного устройства Ultrafree-15 Biomax с пороговым значением молекулярной массы 30 кДа (MWCO) (Millipore). Чистоту образца оценивали с помощью аналитической SEC и SDS-PAGE. Избыток белка комплекса Fab хранили замороженным при -80°C.
Кристаллизация комплекса Fab chAb8-PRLR:
Белковый комплекс доставляли в концентрации 38 мг/мл в 50 мМ HEPES pH 7,5, 50 мМ NaCl, и его использовали разбавленным до 30 мг/мл для испытаний по кристаллизации. Кристаллы выращивали с использованием способа диффузии из пара при 17°C. Резервуарный раствор представлял собой 25% (масс./об.) PEG 8000, 0,1 M какодилят натрия, pH 5,5, 0,2 M сульфат аммония. Кристаллизационные капли получали с использованием соотношения 1:1 белка и резервуарного раствора. Кристаллы подвергали криопротекции с использованием 10% (об./об.) пропиленгликоля. Данные дифракции получали под газообразным азотом при 100K на источнике света Canadian Light Source (Saskatoon, Канада).
Рентгеновская структура комплекса Fab chAb8-PRLR:
Данные рентгенодифракции, достигающие разрешения 2,55 Å, и полный набор данных обрабатывали с помощью HKL2000 (HKL Research, Inc). Кристаллографическая пространственная группа является орторомбической структурой P212121 с параметрами единичной ячейки a=55 Å, b=89 Å, и c=186 Å. Статистика для полученных данных представлена в таблице 20.
СТАТИСТИКА РЕНТГЕНОДИФРАКЦИИ ДЛЯ КОМПЛЕКСА chAb8 FAB-PRLR
Определение структуры:
Кристаллическую структуру определяли по молекулярному вытеснению. Модель частичного поиска для участков VhVl, ChCl и PRLR создавали, а затем устанавливали с использованием программы MOLREP (Vagin et al, 1997) в пакет программ CCP4 (Winn et al. 2011). Асимметричный элемент содержит один молекулярный комплекс и симметричные элементы завершали кристаллическую решетку межмолекулярными контактами. Координаты уточняли относительно данных с использованием программы autoBUSTER (Global Phasing, Ltd) и многократных раундов графического анализа и перестроения в электронную плотность с помощью программы COOT (Emsley et al, 2010). Статистика для конечной структуры представлена в таблице 21:
УТОЧНЯЮЩАЯ СТАТИСТИКА ДЛЯ КОМПЛЕКСА FAB chAb8-PRLR
Структура комплекса PRLR/Fab chAb8:
Межмолекулярные контакты наблюдают между внеклеточным доменом PRLR и множеством CDR Fab chAb8. Контакты содержат критические гидрофобные и гидрофильные взаимодействия и включают мостиковые молекулы воды. В этих контактах прямо участвуют CDR H1, H2, H3, L1 и L3 SEQ ID NO: 106 и 115. Область контакта на антигене охватывает поверхность эпитопа на пересечении доменов PRLR, включающем топографическую область, определяемую остатками PRLR: R25, T141, L143, E145, R147, E155, W156, E157, I158, H159, F160, A161, G162, Q163, Q164, F167, S171, R183, K185, D187, H188, W191 и W194 SEQ ID NO:2. Указанные выше аминокислотные остатки PRLR находятся в пределах 4Å от Fab chAb8 при связывании с ним.
Пример 8: Кристаллизация chAb5 (Fab)
Кристаллизацию структуры Fab-фрагмента chAb5 проводили и анализировали следующим образом.
Получение и очистка Fab-фрагмента chAb5:
Fab-фрагмент chAb5 получали путем расщепления папаином исходного mAb, как подробно описано ниже. Папаин активировали 50 мМ цистеином в буфере PBS, pH 7,4. mAb chAb6 в буфере PBS, pH 7,4, смешивали с папаином при соотношении масс папаина к mAb 1:100 и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Реакцию гасили 5,5 мМ йодацетамидом. Смесь очищали на 5 мл смолы Mab SelectSure (GE Healthcare), где Fab-фрагмент собирали в качестве прошедшей фракции. Прошедшую фракцию концентрировали с использованием центрифужного устройства Ultrafree-15 Biomax с пороговым значением молекулярной массы 30 кДа (MWCO) (Millipore). Концентрированную смесь очищали на колонке 2,6 см ×60 см Sephacryl 200 HiPrep (GE Healthcare), предварительно уравновешенной в 50 мМ буфере HEPES, 50 мМ NaCl, pH 7,5. Фракции, содержавшие Fab-фрагмент (при мониторинге по УФ-поглощению при 280 нм) объединяли и замораживали при -80°C. Чистоту образца анализировали с помощью аналитической SEC, SDS-PAGE и масс-спектрометрии.
Кристаллизация chAb5:
Белок доставляли в концентрации 31,3 мг/мл в 50 мМ HEPES, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 1 мМ азид натрия, и разбавляли до 20 мг/мл для испытаний по кристаллизации с использованием буфера для белков. Кристаллы выращивали с использованием способа диффузии из пара 4°C. Резервуарный раствор представлял собой 20% (масс./об.) PEG 3350, 0,2 M формиат натрия. Кристаллизационные капли получали с использованием соотношения белка и резервуарного раствора 1:1. Кристаллы подвергали криопротекции с использованием 15% (об./об.) пропиленгликоля. Данные дифракции получали под газообразным азотом при 100K на линии пучка 17ID (IMCA-cat) на источнике фотонов Advanced Photon Source (Argonne, IL).
Рентгеновская структура chAb5
Данные рентгенодифракции, достигающие разрешения 2,1 Å, и полный набор данных обрабатывали с помощью autoPROC (Global Phasing, Ltd). Кристаллографическая пространственная группа является моноклинической структурой P21 с параметрами единичной ячейки a=72 Å, b=66 Å, c=92 Å и бета=96°. Статистика для полученных данных представлена в таблице 22.
СТАТИСТИКА РЕНТГЕНОДИФРАКЦИИ ДЛЯ FAB chAb5
Определение структуры:
Кристаллическую структуру определяли по молекулярному вытеснению. Модель частичного поиска для участков VhVl, ChCl и PRLR создавали, а затем устанавливали с использованием программы MOLREP (Vagin et al, 1997) в пакет программ CCP4 (Winn et al. 2011). Асимметричный элемент содержит две (2) молекулы Fab со сходной конформацией и группу симметричных элементов для завершения кристаллической решетки межмолекулярными контактами. Координаты уточняли относительно данных с использованием программы autoBUSTER (Global Phasing, Ltd) и многократных раундов графического анализа и перестроения в электронную плотность с помощью программы COOT (Emsley et al, 2010). Статистика для конечной структуры представлена в таблице 23:
УТОЧНЯЮЩАЯ СТАТИСТИКА ДЛЯ FAB chAb5
Структура Fab chAb5:
Наложение chAb5 на Fab chAb7 из комплекса с PRLR демонстрирует тесное совмещение структур с получением в результате 0,67 Å RMSD для совмещенных координат C-альфа доменов VhVl. Сравнение подчеркивало ожидаемый аспект высоко сходной конформации структуры для этих близкородственных Fab, и обеспечило данные сходных конформаций в положениях различных аминокислот. Исследование поверхности контакта с PRLR для совмещенных структур не показало серьезных столкновений с конформацией chAb5.
Наложение модели chAb5 на chAb7, исходя из соответствующих кристаллических структур, указывает на то, что антитела имеют мало отличий и обладают сходными конформациями. Исходя из вышесказанного, ожидается, что chAb5 имеет сходный эпитоп с chAb7 со сходными взаимодействиями PRLR.
Пример 9: Кристаллизация комплекса LFA-102-PRLR
Кристаллизацию структуры комплекса LFA102-PRLR проводили и анализировали следующим образом.
Получение и очистка Fab-фрагмента LFA-102:
Fab-фрагмент LFA-102 получали путем расщепления папаином исходного mAb, как подробно описано ниже. Папаин активировали 50 мМ цистеином в буфере PBS, pH 7,4. mAb chAb6 в буфере PBS, pH 7,4, смешивали с папаином при соотношении масс папаина к mAb 1:100 и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Реакцию гасили 5 мМ йодацетамидом. Смесь очищали на 20 мл смолы Mab SelectSure (GE Healthcare), где Fab-фрагмент собирали в качестве прошедшей фракции. Прошедшую фракцию концентрировали с использованием центрифужного устройства Ultrafree-15 Biomax с пороговым значением молекулярной массы 30 кДа (MWCO) (Millipore). Концентрированную смесь очищали на колонке 2,6 см ×60 см Sephacryl 200 HiPrep (GE Healthcare), предварительно уравновешенной в 50 мМ буфере HEPES, 50 мМ NaCl, pH 7,5. Фракции, содержавшие Fab-фрагмент (при мониторинге по УФ-поглощению при 280 нм), объединяли и замораживали при -80°C. Чистоту образца анализировали с помощью аналитической SEC, SDS-PAGE и масс-спектрометрии.
Получение комплекса Fab LFA-102-PRLR:
Рекомбинантный PRLR человека экспрессировали в экспрессирующей системе млекопитающих, а затем очищали с использованием способов, хорошо известных в данной области. Рекомбинантный PRLR человека и белок Fab LFA-102 смешивали в молярном соотношении 1,1:1 и инкубировали в течение 3 ч при 4°C. Комплексный образец наносили на колонку 2,6 см ×60 см Sephacryl 300 HiPrep (GE Healthcare), предварительно уравновешенную в 50 мМ буфере HEPES, 50 мМ NaCl, pH 7,5, при 1 мл/мин. Фракции, содержавшие комплекс (при мониторинге по УФ-поглощению при 280 нм), объединяли и концентрировали до 18 мг/мл с использованием центрифужного устройства Ultrafree-15 Biomax с пороговым значением молекулярной массы 30 кДа (MWCO) (Millipore). Чистоту образца оценивали с помощью аналитической SEC и SDS-PAGE. Избыток белка комплекса Fab хранили замороженным при -80°C.
Кристаллизация комплекса Fab LFA-102-PRLR:
Белок доставляли в концентрации 20,7 мг/мл в 50 мМ HEPES pH 7,5, 50 мМ NaCl, 1 мМ азид натрия, и его использовали в доставляемой концентрации. Кристаллы выращивали с использованием способа диффузии из пара при 4°C, причем резервуарный раствор представлял собой 45% (масс./об.) 2-метил-2, 4-пентандиол (MPD), 0,1 M Tris-HCl pH 8,5, 0,1 M дигидрофосфат аммония. При этих условиях раствора не требовалось дополнительного криопротектора, так что кристаллы извлекали прямо из капли и подвергали криогенному охлаждению в жидком азоте. Данные дифракции получали под газообразным азотом при 100K на линии пучка 17ID (IMCA-cat) на источнике фотонов Advanced Photon Source (Argonne, IL).
Рентгеновская структура комплекса Fab LFA-102-PRLR:
Данные рентгенодифракции, достигающие разрешения 2,25 Å, и полный набор данных обрабатывали с помощью autoPROC (Global Phasing, Ltd). Кристаллографическая пространственная группа является моноклинической структурой C2 с параметрами единичной ячейки a=98 Å, b=119 Å, c=81 Å и бета=107°. Статистика для полученных данных представлена в таблице 24.
СТАТИСТИКА РЕНТГЕНОДИФРАКЦИИ ДЛЯ КОМПЛЕКСА FAB LFA-102-PRLR
Определение структуры:
Кристаллическую структуру определяли по молекулярному вытеснению. Модель частичного поиска для участков VhVl, ChCl и PRLR создавали, а затем устанавливали с использованием программы MOLREP (Vagin et al, 1997) в пакет программ CCP4 (Winn et al. 2011). Асимметричный элемент содержит 2 молекулярных комплекса, которые расположены сходным образом, и группу симметричных элементов для завершения кристаллической решетки межмолекулярными контактами. Координаты уточняли относительно данных с использованием программы autoBUSTER (Global Phasing, Ltd) и многократных раундов графического анализа и перестроения в электронную плотность с помощью программы COOT (Emsley et al, 2010). Статистика для конечной структуры представлена в таблице 25:
УТОЧНЯЮЩАЯ СТАТИСТИКА ДЛЯ КОМПЛЕКСА FAB LFA-102-PRLR
Структура комплекса PRLR / Fab chAb7:
Межмолекулярные контакты между PRLR и LFA102 вовлекают CDR L1, L3, H2 и H3 LFA102 (Seq ID No: 156 и 157). Площадь контакта на антигене охватывает эпитоп, определяемый остатками PRLR: E145, E155, W156, E157, I158, H159, F160, A161, G162, Q164, L170 и S171 SEQ ID NO:2. Указанные выше аминокислотные остатки PRLR находятся в пределах 4Å от LFA102 при связывании с ним.
Положение связанного LFA102 с PRLR указывает на то, что LFA102 ингибирует димеризацию PRLR, но, по-видимому, практически позволяет одновременное связывание пролактина с PRLR.
Пример 10: Связывание антител против PRLR с cyPRLR и muPRLR
Анализы проводили для оценки связывания определенных антител против PRLR с cyPRLR и muPRLR следующим образом.
Подвижный буфер представлял собой HBS-EP+ (10 мМ Hepes, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% P20). Анализ проводили с использованием сенсорных чипов Biacore T200 и CM5 с антителом против Fc мыши (Pierce 31170) или против Fc человека (Pierce 31125), спряженным с амином, во всех 4 проточных ячейках, до ~8000.
mAb иммобилизовывали на проточных ячейках 2, 3 или 4. Инъецировали антиген (2 мин при 80 мкл/мин). Концентрации представляли собой серии 9-кратных разведений из 3 точек в диапазоне 500 нМ - 7,4 нМ, и только буфер. Мониторинг диссоциации проводили в течение 15 минут. Регенерацию проводили посредством 2 последовательных инъекций (60 и 10 с 60 мкл/мин) 10 мМ глицина, pH 1,5.
Результаты представлены на фиг.10. Кинетика связывания PRLR яванского макака и человека была практически идентичной для исследованных антител. Однако каждое исследованное антитело демонстрирует значительно и пропорционально более слабую кинетику связывания в отношении muPRLR.
Список последовательностей
21/28 и JH4 FR1
VH1-46 и JH6 FR1
VH1-46 и JH6 FR2
VH2-26 и JH6 FR4
VH1-46 и JH6 FR4
M60 и JH4 FR4
III-3R и JK4 FR1
III-3R и JK4 FR2
III-3R и JK4 FR4
A1 и JK4 FR4
01 и JK2 FR3
Ab1 VH.1 CDRH1
Ab1 VH.1a CDRH1
Ab1 VH.1 CDRH2
Ab1 VH.1a CDRH2
Ab1 VH.1 CDRH3
Ab1 VH.1a CDRH3
Ab1 VH.1b CDRH3
Ab1 VL.1a CDRL1
Ab1 VL.2 CDRL1
Ab1 VL.2a CDRL1
Ab1 VL.1a CDRL2
Ab1 VL.2 CDRL2
Ab1 VL.2a CDRL2
Ab1 VL.1a CDRL3
Ab1 VL.2 CDRL3
Ab1 VL.2a CDRL3
Ab2 VH.1 CDRH1
Ab2 VH.1a CDRH1
Ab2 VH.1 CDRH2
Ab2 VH.1a CDRH2
Ab2 VH.1 CDRH3
Ab2 VH.1a CDRH3
Ab2 VH.1b CDRH3
Ab2 VL.1a CDRL1
Ab2 VL.1b CDRL1
Ab2 VL.1a CDRL2
Ab2 VL.1b CDRL2
Ab2 VL.1a CDRL3
Ab2 VL.1b CDRL3
Ab3 VH.1 CDRH1
Ab3 VH.1a CDRH1
Ab3 VH.1 CDRH2
Ab3 VH.1a CDRH2
Ab3 VH.1 CDRH3
Ab3 VH.1a CDRH3
Ab3 VH.1b CDRH3
Ab3 VL.1a CDRL1
Ab3 VL.1b CDRL1
Ab3 VL.1a CDRL2
Ab3 VL.1b CDRL2
Ab3 VL.1a CDRL3
Ab3 VL.1b CDRL3
Ab4 VH.1 CDRH1
Ab4 VH.1a CDRH1
Ab4 VH.1a.2 CDRH1
Ab4 VH.1a.3 CDRH1
Ab4 VH.1b.2 CDRH1
Ab4 VH.1 CDRH2
Ab4 VH.1a CDRH2
Ab4 VH.1a.2 CDRH2
Ab4v VH.1a.3 CDRH2
Ab4 VH.1b.2 CDRH2
Ab4 VH.1 CDRH3
Ab4 VH.1a CDRH3
Ab4 VH.1a.2 CDRH3
Ab4 VH.1a.3 CDRH3
Ab4 VH.1b CDRH3
Ab4 VH.1b.2 CDRH3
Ab4 VL.1a CDRH1
Ab4 VL.1b CDRH1
Ab4 VL.1a CDRH2
Ab4 VL.1b CDRH2
Ab4 VL.1a CDRH3
Ab4 VL.1b CDRH3
WMHWVRQAPGQGLEWMGEIDPSDSYSNYNQKF
KDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC
ARNGGLGPAWFSYWGQGTLVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS
WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI
SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK
EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY
TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW
ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
GK
VAWYQQKPGKAPKLLIYSASNRYTGVPSRFSG
SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPW
TFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG
TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY
ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
VAWYQQKPGKSPKLLIYSASNRYTGVPSRFSD
SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYSSYPW
TFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG
TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY
ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
VAWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYTGIPARFSG
SGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYSSYPW
TFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG
TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY
ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
VAWYQQKPGQSPRLLIYSASNRYTGVPARFSD
SGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYFCQQYSSYPW
TFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG
TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY
ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
WMHWVRQAPGQGLEWIGEIDPSDSYSNYNQKF
KDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC
ARNGGLGPAWFSYWGQGTLVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS
WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI
SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK
EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY
TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW
ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
GK
WMHWVRQAPGQGLEWIGEIDPSDSYSNYAQKF
ARNGGLGPAWFSYWGQGTLVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS
WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI
SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK
EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY
TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW
ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
GK
WMHWVRQAPGQGLEWMGVIDPSDTYTNYNQKF
KGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC
ARGDYSNWFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP
LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS
SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT
HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR
TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY
KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS
SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT
HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR
TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY
KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
GK
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ВИДЫ КОМБИНИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ РАКА, НАЦЕЛИВАЮЩИЕСЯ НА CD38 И TGF-БЕТА | 2019 |
|
RU2808632C2 |
| АНТИТЕЛА К CD40 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2016 |
|
RU2715597C2 |
| АНТИТЕЛА, НАЦЕЛЕННЫЕ НА РЕЦЕПТОР, СВЯЗАННЫЙ С G-БЕЛКАМИ, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2725819C2 |
| АНТИТЕЛА К РЕЦЕПТУ ГЛЮКАГОНА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ | 2009 |
|
RU2562110C2 |
| СПОСОБ ОЧИСТКИ ДЛЯ УДАЛЕНИЯ ВАРИАНТОВ АНТИТЕЛ С СУЛЬФАТИРОВАНИЕМ ТИРОЗИНА; ОЧИЩЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ | 2017 |
|
RU2793400C2 |
| ИНТЕРЛЕЙКИН-13-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ | 2016 |
|
RU2650767C2 |
| ИНТЕРЛЕЙКИН-13-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ | 2012 |
|
RU2605327C2 |
| ИНТЕРЛЕЙКИН-13-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ | 2007 |
|
RU2472807C2 |
| АНТИТЕЛА, НАЦЕЛЕННЫЕ НА АНТИГЕН СОЗРЕВАНИЯ В-КЛЕТОК, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2766094C2 |
| МОЛЕКУЛЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ BCMA, И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2812322C2 |
Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено антитело, способное связывать рецептор пролактина (PRLR). Также описаны кодирующая его нуклеиновая кислота, экспрессионный вектор и клетка-хозяин для получения указанного антитела. Кроме того, рассмотрены фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело, и конъюгат антитела с лекарственным средством. Антитело по настоящему изобретению пригодно для обнаружения PRLR и для ингибирования активности PRLR у человека, страдающего нарушением, при котором активность PRLR является вредоносной. 6 н. и 5 з.п. ф-лы, 11 ил., 26 табл., 10 пр.
1. Антитело, способное связывать рецептор пролактина (PRLR), содержащее:
(i) набор CDR вариабельной области тяжелой цепи, включающий SEQ ID NO:40, 41 и 42; и
(ii) набор CDR вариабельной области легкой цепи, включающий SEQ ID NO: 49, 50 и 51.
2. Антитело по п.1, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи, который включает SEQ ID NO:44, и вариабельный домен легкой цепи, который включает SEQ ID NO:52.
3. Антитело по п.1, отличающееся тем, что антитело включает константную область тяжелой цепи, которая представляет собой константную область IgG1.
4. Антитело по п.1, отличающееся тем, что антитело содержит константную область легкой цепи, которая представляет собой константную область каппа.
5. Антитело по п.1, отличающееся тем, что антитело представляет собой гуманизированное антитело.
6. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая аминокислотную последовательность антитела по п.1.
7. Экспрессирующий вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту по п.6.
8. Клетка-хозяин для получения антитела по п.1, содержащая вектор по п.7.
9. Фармацевтическая композиция для лечения у индивидуума заболевания или нарушения, при котором активность PRLR является вредоносной, содержащая эффективное количество антитела по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
10. Конъюгат антитело-лекарственное средство, содержащий антитело по п.1, конъюгированное с по меньшей мере одним лекарственным средством.
11. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.10, где лекарственное средство представляет собой димер пирролобензодиазепина (PBD).
| Способ приготовления лака | 1924 |
|
SU2011A1 |
| Станок для изготовления деревянных ниточных катушек из цилиндрических, снабженных осевым отверстием, заготовок | 1923 |
|
SU2008A1 |
| Пресс для выдавливания из деревянных дисков заготовок для ниточных катушек | 1923 |
|
SU2007A1 |
| СЫРЬЕВАЯ СМЕСЬ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ТЕПЛОИЗОЛЯЦИОННОГО СЛОЯ | 2013 |
|
RU2530089C1 |
| GALSGAARD E.D | |||
| et al | |||
| "Re-evaluation of the prolactin receptor expression in human breast cancer." Journal of Endocrinology, 2009, 201(1): 115-128. | |||
