Мутантный штамм Corynebacterium glutamicum, продуцирующий L-глутамин (варианты), и способ получения L-глутамина Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 C12P13/14 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к микроорганизму, продуцирующему L-глутамин, и к способу получения L-глутамина с использованием этого микроорганизма.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

L-глутамин как аминокислоту, которую широко применяют в лекарственных средствах, косметических средствах и продуктах здорового питания, получали главным образом с использованием микроорганизмов, устойчивых к соединениям или чувствительных к соединениям. Для этих целей применяли, например, штамм, устойчивый к сульфагуанидину (JP 1978-017675), микроорганизм, устойчивый к азасерину (JP 1980-148094), микроорганизм, чувствительный к пенициллину (JP 1992-088994), и штамм, устойчивый к тирозину/глутаминовой кислоте (tyr-glu) (JP 1990-186994).

В этих обстоятельствах в исследовании по разработке штаммов с улучшенной продуктивностью по L-глутамину авторы настоящего изобретения обнаружили мутанты, обладающие устойчивостью к высоким концентрациям L-глутамина, и способ продуцирования L-глутамина с высоким выходом путем использования этих мутантов, тем самым создав настоящее изобретение.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

В настоящем изобретении предложен мутант Corynebacterium glutamicum с улучшенной продуктивностью по L-глутамину.

В настоящем изобретении предложен способ продуцирования L-глутамина путем использования этого мутанта Corynebacterium glutamicum.

Техническое решение

В одном аспекте настоящего изобретения предложен L-глутамин-продуцирующий мутант Corynebactehum glutamicum, который является устойчивым к L-глутамину.

Как его используют здесь, термин "L-глутамин" относится к моноамиду глутаминовой кислоты, который является аминокислотой, входящей в состав белков, и L-аминокислотой, имеющей формулу H₂NCO-CH₂CH₂CH(NH₂)COOH.

Как его используют здесь, выражение "устойчивый к L-глутамину" относится к микроорганизму, обладающему свойствами, которые заключаются в способности расти или способности поддерживать или повышать активность по продуцированию L-глутамина в окружающей среде, имеющей высокую концентрацию L-глутамина.

Когда L-глутамин накапливается в клетках в определенной концентрации или в более высокой концентрации, это может вызывать ингибирование путем регуляции по типу обратной связи, приводить к ингибированию или подавлению активности глутаминсинтетазы и, следовательно, ингибировать биосинтез L-глутамина. Регуляция по типу обратной связи L-глутамином размыкается, и ингибирование синтеза L-глутамина не происходит в штамме, устойчивом к L-глутамину, таким образом штамм, устойчивый к L-глутамину, может продуцировать L-глутамин в условиях высоких концентраций L-глутамина.

Мутант может представлять собой Corynebacterium glutamicum КССМ 11553Р или Corynebacterium glutamicum КССМ11554Р.

Мутант может обладать устойчивостью к высоким концентрациям L-глутамина. Например, мутант может обладать устойчивостью к L-глутамину в концентрации от примерно 5 г/л до примерно 30 г/л L-глутамина и, в некоторых воплощениях, от примерно 15 г/л до примерно 30 г/л L-глутамина, и в некоторых других воплощениях от примерно 20 г/л до примерно 25 г/л L-глутамина.

Этот мутант может выживать в минимальной среде, содержащей от примерно 15 г/л до примерно 25 г/л L-глутамина в течение примерно 6 суток или дольше. Например, мутант может выживать в течение примерно 6 суток или дольше в минимальной среде (рН 7,0), содержащей от примерно 15 г/л до примерно 25 г/л L-глутамина, 0,1% глюкозы, 0,04% сульфата магния (MgSO₄⋅7H₂O), 0,1% дигидрофосфата калия (KH₂PO₄), 0,0001% тиамин⋅HCl, 200 мкг/л биотина и агар, при инкубации при примерно 30°С.

Как его используют здесь, термин "L-глутамин-продуцирующий микроорганизм" может относиться к микроорганизму, обладающему способностью по своей природе продуцировать L-глутамин, или к микроорганизму с приобретенной продуктивностью по глутамину несмотря на то, что его родительский штамм не обладает способностью продуцировать L-глутамин.

В некоторых воплощениях мутант Corynebacterium glutamicum с улучшенной способностью продуцировать L-глутамин может представлять собой мутант, полученный путем мутагенеза родительского штамма. Мутацию у микроорганизмов можно получить любым из разнообразных способов, широко известных в данной области техники, например, физическим мутагенезом или химическим мутагенезом. Например, в настоящем изобретении подходящие химические факторы, индуцирующие мутации, могут включать N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG), диэпоксибутан, этилметансульфонат, соединения иприта, гидразин и нитрит. Однако воплощения не ограничиваются этим. Неограничивающие примеры физических факторов, индуцирующих мутации, могут включать ультрафиолетовые лучи и гамма-радиоактивные лучи.

В некоторых воплощениях для создания мутанта с улучшенной способностью продуцировать L-глутамин может быть использован традиционный глутамин-продуцирующий штамм Corynebacterium glutamicum KFCC 10680 (раскрыт в KR 10-0048440) в качестве родительского штамма. После введения случайной мутации в родительский штамм Corynebacterium glutamicum KFCC 10680 с помощью NTG, полученный в результате штамм культивировали в среде, содержащей L-глутамин, и различные штаммы сравнивали друг с другом по их способности продуцировать L-глутамин для отбора двух мутантов, обладающих устойчивостью к L-глутамину. Эти два мутанта получили названия Gln096 (КССМ 11553Р) и Gln265 (КССМ 11554Р), соответственно. Было обнаружено, что эти мутанты Corynebacterium glutamicum Gln096 и Gln265 обладают улучшенной способностью продуцировать L-глутамин с выходом более высоким примерно на 10% или больше, чем таковой у родительского штамма.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ продуцирования L-глутамина, включающий культивирование мутанта Corynebacterium glutamicum в среде в соответствии с любым из вышеописанных воплощений.

Мутант Corynebacterium glutamicum может быть тем же, как описано выше, и не будет описан здесь.

Культивирование может быть выполнено с использованием подходящей культуральной среды в подходящих условиях культивирования, которые хорошо известны в данной области техники. Культуральная среда и условия культивирования могут варьироваться специалистом в данной области техники. Например, культуральная среда может представлять собой жидкую среду. Однако воплощения не ограничены этим. Примеры способов культивирования могут включать периодическую культуру, непрерывную культуру, периодическую культуру с подпиткой или их комбинацию. Однако воплощения не ограничены ими.

Культуральная среда необходима для создания подходящих условий для конкретного выбранного штамма и также может быть соответствующим образом изменена специалистом в данной области техники. Например, культуральная среда может быть выбрана из различных культуральных сред для штаммов Corynebacterium, раскрытых, например, в "Manual of Methods for General Bacteriology" (Американское Бактериологическое Общество, Washington D.C., USA, 1981). Однако воплощения не ограничены этим. Культуральная среда может включать различные источники углерода, источники азота и микроэлементы. Неограничивающие примеры источников углерода, доступные для использования в культуральной среде, могут включать сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как гликоль и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота, причем эти источники углерода могут быть использованы по отдельности или в комбинации. Неограничивающие примеры источников азота, доступных для использования в культуральной среде, представляют собой органические соединения, такие как пептоны, дрожжевой экстракт, экстракт из мяса, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт (CSL), соевую муку и мочевину; и неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония, причем эти источники азота могут быть использованы по отдельности или в комбинации. Неограничивающие примеры источников фосфора, доступных для использования в культуральной среде, могут включать дигидрофосфат калия, гидроортофосфат калия и соответствующие натрий-содержащие соли. В некоторых воплощениях, культуральная среда может включать соли металлов, необходимые для роста, такие как сульфат магния или сульфат железа. Однако воплощения не ограничены этим. В некоторых воплощениях культуральная среда может дополнительно содержать аминокислоты и витамины, которые необходимы для роста, в дополнение к перечисленным выше компонентам. В некоторых воплощениях культуральная среда также может включать подходящие предшественники. Культуральная среда или отдельные компоненты могут быть добавлены в культуральный раствор подходящим способом, например периодически или непрерывно. Однако воплощения не ограничены этим.

В некоторых воплощениях во время культивирования значение рН культурального раствора может быть подведено путем добавления соединения, например гидроксида аммония, гидроксида калия, аммиака, фосфорной кислоты или серной кислоты, в культуральный раствор для выбранного микроорганизма подходящим способом. В некоторых воплощениях во время культивирования образование пены в культуральном растворе можно подавить с помощью пеногасителя, такого как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты. Для поддержания аэробных условий в культуральном растворе в культуральный раствор может быть введен кислород или газ, содержащий кислород (например воздух). Например, температуру культурального раствора можно поддерживать в диапазоне от примерно 20°С до примерно 45°С, и в некоторых воплощениях температура может составлять от примерно 25°С до примерно 40°С. Например, культивирование можно осуществлять до тех пор, пока не будет получено целевое количество L-глутамина, например, при продолжительности культивирования от примерно 10 часов до 160 часов.

Культивирование может быть осуществлено в культуральной среде, содержащей L-глутамин в высокой концентрации, например, от примерно 15 г/л до примерно 25 г/л L-глутамина, и в некоторых воплощениях, от примерно 20 г/л до примерно 25 г/л L-глутамина.

Способ получения L-глутамина может включать выделение L-глутамина из культивируемого микроорганизма или из культуральной среды. Выделение L-глутамина из микроорганизма или из среды можно проводить с использованием подходящего способа, известного в данной области техники, в соответствии с используемым способом культивирования, тем самым собирая или выделяя продуцированный L-глутамин из среды. Неограничивающие примеры способа выделения продуцированного L-глутамина могут включать центрифугирование, фильтрование, анионообменную хроматографию, кристаллизацию и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как описано выше, согласно одному или более чем одному воплощению мутант Corynebacterium glutamicum может продуцировать L-глутамин даже в среде, содержащей L-глутамин в высокой концентрации. Следовательно, L-глутамин может быть получен с высоким выходом с высокой эффективностью в промышленном масштабе.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одно или более чем одно воплощение настоящего изобретения далее будет описано подробно со ссылкой на следующие примеры. Однако эти примеры предназначены исключительно для иллюстративных целей и не предназначены ограничивать объем одного или более чем одного воплощения настоящего изобретения.

Пример 1: Скрининг мутантов, продуцирующих L-глутамин

Для получения мутантов микроорганизма с улучшенной способностью продуцировать глутамин мутацию индуцировали в микроорганизме следующим образом.

В частности, Corynebacterium glutamicum KFCC 10680 (Corynebacterium glutamicum KFCC 10680, см. KR10-0048440) в качестве родительского штамма культивировали в активирующей среде в течение примерно 16 часов (активирующая среда содержала 1% экстракта из говядины, 1% полипептона, 0,5% хлорида натрия (NaCl), 0,5% дрожжевого экстракта и 2% агара и имела рН 7,2, причем каждая активирующая среда, используемая в примерах, имела такой же состав, как используемая в этом примере, и процентная единица (%) представляет собой масс./об. %, что применимо ко всем примерам). Полученный в результате активированный штамм культивировали в течение примерно 14 часов в посевной культуре, предварительно стерилизованной при примерно 121°С в течение 15 минут, где посевная культура (рН 7,0) содержала 5,0% глюкозы, 1% бактопептона, 0,25% хлорида натрия (NaCl), 1% дрожжевого экстракта, 3 мкг/л биотина и 0,4% мочевины, причем каждая "посевная культура", используемая в этих примерах, имела такой же состав, как используемая в этом примере. 5 мл культурального раствора добавляли в культуру в пробирке и центрифугировали при примерно 8000 об/мин в течение примерно 5 минут и супернатант удаляли. Затем добавляли 100-мМ цитратный буфер в культуру в пробирке для ресуспендирования клеточного осадка и затем культуру в пробирке центрифугировали в тех же условиях, как описано выше, и супернатант удаляли из нее, с тем чтобы таким образом отмыть клетки. 5 мл 100-мМ цитратного буфера добавляли в культуру в пробирке для ресуспендирования клеточного осадка и затем туда добавляли N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) до конечной концентрации примерно 200 мг/л и оставляли при комнатной температуре примерно на 20 минут.Затем клетки, обработанные NTG, центрифугировали при примерно 8000 об/мин в течение примерно 5 минут, супернатант удаляли, добавляли 100-мМ фосфатный буфер для ресуспендирования клеточного осадка, затем проводили центрифугирование в тех же условиях, как описано выше, и супернатант удаляли, с тем чтобы таким образом отмыть клетки. Затем 5 мл посевной культуры добавляли к полученному осадку клеток, обработанных NTG, для их ресуспендирования. Эту суспензию наносили на чашку Петри, содержащую минимальную среду (рН 7,0), содержащую 0,1% глюкозы, 0,04% сульфата магния (MgSO₄⋅7H₂O), 0,1% дигидрофосфата калия (KH₂PO₄), 0,0001% тиамин-HCI, 200 мкг/л биотина и 1,5% агара, причем каждая "минимальная среда", используемая в примерах, имела такой же состав, как используемая в этом примере, и культивировали при примерно 30°С в течение примерно 6 суток. Затем определяли значение оптической плотности ОП₆₀₀ жизнеспособных клеток. В результате подсчета числа клеток было обнаружено, что показатель клеточной гибели составил примерно 85%.

Промытый штамм, обработанный NTG, наносили на чашку Петри, содержащую минимальную среду, содержащую L-глутамин (конечная концентрация 15 г/л), и культивировали при примерно 30°С в течение примерно 6 суток. Колонии жизнеспособных клеток отбирали для скрининга мутантов, устойчивых к L-глутамину. Отобранные мутанты, устойчивые к L-глутамину, инокулировали с помощью инокуляционной петли в 25 мл среды для продуцирования глутамина (рН 6,8) (содержащей 4,0% глюкозы, 3,0% хлорида аммония (NH₄Cl), 0,3% кислотного гидролизата соевого белка, 5% карбоната кальция (СаСО₃), 0,1% хлорида кальция (CaCl₂), 0,05% сульфата магния (MgSO₄⋅7H₂O), 0,15% дигидрофосфата калия (KH₂PO₄), 0,15% гидроортофосфата калия (K₂HPO₄), 0,3% мочевины, 2 мг/л тиамина (тиамин⋅HCl), 5 мкг/л биотина, 20 мг/л сульфата железа (FeSO₄⋅7H₂O), 20 мг/л сульфата марганца (MnSO₄⋅H₂O) и 12 мг/л сульфата цинка (ZnSO₄⋅7H₂O), причем каждая "среда для продуцирования глутамина", используемая в этих примерах, имела указанный один и тот же состав) в колбе Эрленмейера для встряхивания и затем культивировали при примерно 30°С в течение примерно 48 часов при встряхивании примерно при 200 об/мин. В качестве контрольной группы родительский штамм культивировали в таких же условиях. Два типа мутантов, устойчивых к L-глутамину, которые продуцировали глутамин с выходом на 10% или больше по сравнению с таковым родительского штамма Corynebacterium glutamicum KFCC-10680, были выбраны исходя из культивированного продукта.

Выбранные мутанты получили названия Corynebacterium glutamicum Gln096 и Corynebacterium glutamicum Gln265, соответственно, и были депонированы в Корейском Центре Культур Микроорганизмов (КССМ) 3 июля 2014 года с номерами доступа КССМ11553Р и КССМ11554Р.

Пример 2: Сравнение устойчивости к L-глутамину среди мутантов, продуцирующих L-глутамин

Для сравнения устойчивости к L-глутамину среди мутантов, выбранных в Примере 1, каждый из родительского штамма (KFCC 10680), Corynebacterium glutamicum Gln096 (KCCM11553P) и Corynebacterium glutamicum Gln265 (KCCM11554P) наносили на чашки Петри, содержащие минимальную среду, содержащую соответственно 2,5 г/л, 10 г/л, 15 г/л, 20 г/л и 25 г/л L-глутамина (на основании конечной концентрации) и инкубировали при примерно 30°С в течение примерно 6 суток.

В результате, как показано в Таблице 1, родительский штамм демонстрировал слабый рост при концентрации L-глутамина 15 г/л и отсутствие роста при концентрации L-глутамина 20 г/л или больше, в то время как мутанты Corynebacterium glutamicum Gln096 (КССМ11553Р) и Corynebacterium glutamicum Gln265 (KCCM11554P) все еще демонстрировали быстрый рост при концентрации L-глутамина 15 г/л и росли даже при концентрации L-глутамина 20 г/л или выше, указывая на устойчивость этих мутантов к высоким концентрациям L-глутамина.

⁺ был рост/ - не было роста; после инкубирования при примерно 30°С в течение 6 суток

Пример 3: Оценка продуктивности по L-глутамину мутантов, продуцирующих L-глутамин

Для оценки продуктивности по L-глутамину мутантов Corynebacterium glutamicum Gln265 (КССМ11554Р) и Corynebacterium glutamicum Gln096 (KCCM11553P), полученных в Примере 1, этих мутантов культивировали следующим образом для продуцирования L-глутамина.

20 мл ферментационной среды (рН 6,8) (содержащей 10% глюкозы, 4,5% хлорида аммония (NH₄Cl), 0,5% кислотного гидролизата соевого белка, 5% карбоната кальция (СаСО₃), 0,1% хлорида кальция (CaCl₂), 0,05% сульфата магния (MgSO₄⋅7H₂O), 0,15% дигидрофосфата калия (KH₂PO₄), 0,15% гидроортофосфата калия (K₂HPO₄), 0,3% мочевины, 2 мг/л тиамина (тиамин⋅HCl), 5 мкг/л биотина, 20 мг/л сульфата железа (FeSO₄⋅7H₂O), 20 мг/л сульфата марганца (MnSO₄⋅H₂O) и 12 мг/л сульфата цинка (ZnSO₄⋅7H₂O), причем каждая "ферментационная среда", используемая в примерах, имела такой же состав) добавляли в колбу Эрленмейера на 250 мл для встряхивания и стерилизовали при примерно 121°С в течение 15 минут. Родительский штамм Corynebacterium glutamicum KFCC10680 и мутанты Corynebacterium glutamicum Gln265 (KCCM11554P) и Corynebacterium glutamicum Gln096 (KCCM11553P) культивировали в активирующей среде при примерно 30°С в течение примерно 16 часов, соответственно. Каждый из полученных в результате активированных штаммов (KFCC10680, Gln096 и Gln265) инокулировали в ферментационную среду при помощи инокуляционной петли и культивировали при примерно 30°С в течение примерно 48 часов при встряхивании примерно при 200 об/мин. После завершения культивирования концентрацию L-глутамина, присутствующего в супернатанте каждой из сред, из которых клетки были удалены, измеряли с использованием YSI 7100 Мультипараметрической Биоаналитической Системы (доступной от YSI Inc.). Результаты представлены в Таблице 2.

Если обратиться к Таблице 2 видно, что родительский штамм Corynebacterium glutamicum KFCC10680 продуцировал примерно 12,6 г/л L-глутамина, в то время как мутант Corynebacterium glutamicum Gln096 продуцировал примерно 13,8 г/л L-глутамина, согласно одному воплощению, с продуктивностью по L-глутамину, увеличенной примерно на 9,5% или больше по сравнению с таковой родительского штамма. Мутант Corynebacterium glutamicum Gln265 продуцировал примерно 14,1 г/л L-глутамина согласно одному воплощению с продуктивностью по L-глутамину, увеличенной примерно на 11% или больше по сравнению с таковой родительского штамма.

Орган депонирования: Корейский Центр Культур Микроорганизмов (КССМ) (Международный Орган по Депонированию)

Номер доступа: КССМ11553Р

Дата депонирования: 20140703

Орган депонирования: Корейский Центр Культур Микроорганизмов (КССМ) (Международный Орган по Депонированию)

Номер доступа: КССМ11554Р

Дата депонирования: 20140703

Следует понимать, что описанные здесь воплощения следует рассматривать исключительно в описательном смысле, а не с целью ограничения. Описания признаков или аспектов в рамках каждого воплощения обычно следует рассматривать как доступные для других подобных признаков или аспектов в других воплощениях.

В то время как одно или более чем одно воплощение было описано со ссылкой на графические материалы, специалист в данной области техники поймет, что в них можно делать различные изменения в форме и деталях, не отклоняясь от идеи и не выходя за пределы объема, как определено в прилагаемой формуле изобретения.

Предложена группа изобретений: мутантные штаммы Corynebacterium glutamicum КССМ11553Р, Corynebacterium glutamicum КССМ11554Р, продуцирующие L-глутамин и способ получения L-глутамина. Способ получения L-глутамина предусматривает культивирование мутантного штамма Corynebacterium glutamicum КССМ11553Р или Corynebacterium glutamicum КССМ11554Р на питательной среде с последующим выделением L-глутамина из мутантного штамма или среды. Группа изобретений позволяет повысить выход L-глутамина. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр.

1. Мутант Corynebacterium glutamicum КССМ11553Р, продуцирующий L-глутамин и обладающий устойчивостью к L-глутамину.

2. Мутант Corynebacterium glutamicum КССМ11553Р по п. 1, обладающий способностью выживать в культуральной среде, содержащей от примерно 15 г/л до примерно 25 г/л L-глутамина, в течение примерно 6 суток или дольше.

3. Мутант Corynebacterium glutamicum КССМ11554Р, продуцирующий L-глутамин и обладающий устойчивостью к L-глутамину.

4. Мутант Corynebacterium glutamicum КССМ11554Р по п. 3, обладающий способностью выживать в культуральной среде, содержащей от примерно 15 г/л до примерно 25 г/л L-глутамина, в течение примерно 6 суток или дольше.

5. Способ продуцирования L-глутамина, включающий культивирование мутанта Corynebacterium glutamicum по любому из пп. 1-4 в среде и выделение L-глутамина из указанного мутанта или указанной среды.