Способ получения диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного антигенного сухого Российский патент 2023 года по МПК G01N33/531 G01N33/556 A61K39/07 

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии и может быть использовано для количественного определения уровня сибиреязвенных антител в биологических жидкостях больных и/или вакцинированных людей и животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Сибирская язва - особо опасная антропозоонозная инфекция, возбудитель которой за счет формирования чрезвычайно устойчивых спор может сохраняться во внешней среде неограниченно долгое время. Определение сывороточных сибиреязвенных антител может служить основой как иммунодиагностики сибиреязвенной инфекции, так и определения уровня поствакцинального иммунитета. При этом использование РНГА позволяет проводить выявление антител независимо от видовых особенностей специфических иммуноглобулинов.

РНГА до настоящего времени остается не потерявшим своей актуальности [1, 2, 3] иммунологическим методом, регламентированным для использования как с целью индикации патогенных биологических агентов (ПБА) [4], так и для диагностики многих заболеваний [5]. РНГА отличают такие значимые в практической работе характеристики, как экспрессность, специфичность, экономичность, методическая простота выполнения [6]. При этом результат РНГА напрямую зависит от качества используемого эритроцитарного диагностикума, представляющего собой носитель, химически связанный с иммунореагентом (антигеном или антителом).

Известно, что биологические носители (как, например, эритроциты барана) с высокой эффективностью адсорбируют на своей поверхности белковые и белково-полисахаридные комплексы. В отличие от синтетических частиц (латекса, бентонита, древесного и активированного угля, магносорбентов и т.д.), эритроциты представляют собой эластичные безъядерные двояковогнутые клетки, мембрана которых отличается особой химической структурой и выраженной складчатостью, что в целом сохраняет целостность клетки при различных воздействиях, а также обеспечивает значительное увеличение площади связывающей поверхности бионосителя [7]. При этом, с одной стороны, способность мембранных белков менять молекулярную упорядоченность и распределение липидов (фосфолипидов, сфингомиелина, полиненасыщенных жирных кислот, холестерола и др.) в клеточной стенке, а с другой - возможность липидного бислоя изменять подвижность и активность внутримембранных белков - влияет на состояние динамического равновесия химических веществ в мембране эритроцита, что позволяет ей длительное время существовать в равновесном ненатяженном состоянии, сохранять как определенные микровязкостные свойства, так и оптимальный уровень текучести.

Более того, структурной особенностью эритроцитарной мембраны является наличие эластичной белковой сети цитоскелета, локализованной на внутренней поверхности липидного матрикса, и ее связь с интегральными мембранными белками. В большинстве случаев белки имеют ориентацию в направлении, перпендикулярном плоскости липидного бислоя, - иными словами мембрана представляет собой упорядоченную векторную структуру. В целом, белковый цитоскелет обусловливает поведение мембраны эритроцита как упругого твердого тела, отличающегося особой стабильностью. Кроме того, крупные размеры и естественный цвет эритроцитарных клеток позволяют четко визуализировать результаты реакций, где осуществляется их использование. Все это в целом позволяет эритроцитарной клетке как биологическому носителю стать уникальным и не имеющим себе равных объектом исследования.

При конструировании РНГА-диагностикумов эритроцитарные клетки традиционно стабилизируют и консервируют 1% раствором нейтрального формалина, а затем поверхность эритроцитов модифицируют различными препаратами - такими, как, например, танин [8, 9], а также алкилсульфат натрия [10, 11], глутаровый альдегид и др. [12, 13].

Танин - фенольное соединение растительного происхождения, которое приобрело наиболее широкое распространение в практике. Танин обладает выраженным дубящим действием, так как он за счет большого количества гидроксильных групп формирует прочные химические связи с различными биополимерами, в том числе осаждает белки, что, в конечном итоге, уплотняет и стабилизирует клеточную мембрану.

При конструировании эритроцитарных диагностикумов с целью еще большего повышения сорбционной емкости сорбента и последующего формирования высокоаффинных связей между иммунореагентами также используют различные поверхностно-активные вещества (алкилсульфат натрия, додецилсульфат натрия (SDS), глутаровый альдегид, гидрохинон и др.), отличающиеся способностью дестабилизировать билипидный слой клеток, что делает мембрану более подвижной, и за счет своей высокой молекулярной массы обеспечивающие более термодинамически устойчивую систему носитель-сенситин.

Прототипом данного изобретения является патент RU 2410699 [13], где описан способ производства эритроцитарного сибиреязвенного антигенного диагностикума, при котором нативные эритроциты фиксируют формалином, а затем активируют раствором алкилсульфата натрия, после чего производят сенсибилизацию носителя сибиреязвенным антигеном, выделенным из токсинпродуцирующего штамма Bacillus anthracis СТИ. Сенситин получают путем сложной многоступенчатой очистки, этапы которой включают в себя: получение бесклеточного фильтрата среды культивирования В. anthracis, концентрирование его на ультрафильтрах, а затем хроматографическую очистку на сверхтонком сефакриле, что является чрезвычайно трудоемким и для препаративного накопления сенситина экономически нецелесообразным. При этом сконструированный диагностикум, по данным авторов, выявляет сибиреязвенные антитела в иммунных овечьих сыворотках в РНГА в титрах 1:160-1:640 [13].

Источником алкилсульфата натрия, по отдельным наблюдениям, может служить концентрированное жидкое моющее средство «Прогресс» (ООО АМС «Медиа», г. Лосино-Петровский, Московской обл., ТУ 2383-018-52662802-2002) в смеси с 0,25% раствором очищенного додецилсульфата натрия. Использование данного метода при производстве бруцеллезного эритроцитарного антигенного диагностикума позволяет выявить специфические антитела в стандартном образце сыворотки в титре РНГА 1:1600 [14].

Согласно литературным данным, также разработан способ получения диагностикума, при котором эритроциты барана после отмывания и консервирования нейтральным формалином обрабатывают обладающим выраженным дубящим действием раствором танина (1:20000), после чего нагружают антигенным комплексом Bacillus anthracis 55. Полученный препарат выявлял в РНГА антитела к В. anthracis в сыворотках кроликов в титре 1:4096 [15].

Как следует из представленных данных, при конструировании эритроцитарного сибиреязвенного диагностикума этап многоступенчатой очистки сенситина оказывается необязательным, а принципиальным для повышения чувствительности полученного препарата является эффективная обработка носителя.

Целью настоящего изобретения является повышение чувствительности эритроцитарного диагностикума для количественного определения уровня сибиреязвенных антител в сыворотках людей и животных методом РНГА за счет увеличения сорбционной емкости носителя.

Поставленная цель достигается тем, что для повышения чувствительности сибиреязвенного антигенного РНГА-диагностикума осуществляют работу по увеличению сорбционной емкости эритроцитов путем подбора в оптимальном соотношении двухкомпонентного активатора, состоящего из раствора алкилсульфата натрия и свежеприготовленного раствора танина в фосфатно-буферном растворе рН 7,2 (ФБР) в конечных концентрациях 1:40 (2,5%) и Г.40000 (0,0025%), соответственно.

В отличие от представленных выше прототипов, предлагаемый способ основан на том, что эти компоненты имеют разнонаправленный на мембранные структуры эритроцитов механизм действия (связывают белки и билипиды соответственно), в связи с чем их совместное применение должно вызывать синхронизированный в пространстве и времени химический эффект интерференции. Данная композиция активирующего раствора подобрана впервые.

Танин (таниновая кислота) при взаимодействии с водой образует коллоидные растворы, в связи с чем должен использоваться после растворения немедленно (ex tempore).

Источником соединений из группы алкилсульфатов натрия могут служить как высокоочищенный препарат додецилсульфата натрия (SDS) (СН₃(СН₂)₁₁OS₃Na), так и алкилсульфатные детергенты жидкого поверхностно-активного моющего средства «Прогресс» (ООО АМС Медиа, г. Лосино-Петровский, Московская обл.; ТУ 2383-018-52662802-2002; ГОСТ Р51696-2000) [14, 15].

Антиген для сенсибилизации получают из фильтрата жидкой среды культивирования токсигенного вакцинного штамма Bacillus anthracis 55. Методом ультрафильтрации из культуральной среды отделяют фракцию с молекулярной массой более 10 кДа, затем ее концентрируют путем лиофильного высушивания и последующего растворения в дистиллированной воде в 1/4 от первоначального объема, после чего полученным антигенным комплексом осуществляют сенсибилизацию формалинизированных и обработанных двухкомпонентным активатором эритроцитов.

Для получения диагностикума один объем 2,5% взвеси эритроцитов барана, стабилизированных формалином, смешивают с равным объемом комплексного раствора активатора, состоящего из двух компонентов: алкилсульфата натрия (ТУ 2383-018-52662802-2002) и свежеприготовленного раствора танина в конечных концентрациях 2,5% и 1:40000, соответственно, инкубируют с периодическим перемешиванием на водяной бане при 45°С в течение 20 мин, затем эритроциты путем центрифугирования (2500 об/мин - 10 мин, 3х-кратно) отмывают фосфатно-буферным раствором рН 7,2 (ФБР), после чего к осадку, суспендированному в фосфатно-солевом буфере с низкой ионной силой рН 5,9 (буфере Зеренсена), добавляют равный объем подготовленного культурального фильтрата, содержащего антигенный комплекс В. anthracis 55 с концентрацией белка 0,125-0,5 мг/мл, полученную взвесь инкубируют с периодическим перемешиванием при 45°С в течение 40 мин, вслед за этим вновь добавляют формалин до конечной концентрации 1%, оставляют в условиях бытового холодильника при 4°С на 18 ч, далее сенсибилизированные эритроциты отмывают трехкратным центрифугированием при 1500 об/мин по 10 мин в фосфатно-буферном растворе рН 7,2, содержащем формалин в конечной концентрации 1%, после чего полученный диагностикум суспендируют в среде высушивания [16] до 5% концентрации и лиофилизируют по специальному режиму - на первоначальном этапе высушивания давление в рабочей камере снижают до уровня 25-35 Ра, далее в течение 18-20 часов в соответствии с разработанной ранее программой лиофилизации вакуум постепенно увеличивают до 10 Ра [9, 17].

Следует отметить, что предлагаемый нами способ исключает трудоемкий этап хроматографической очистки сенситина, а концентрирование антигена, проводимое путем его лиофильного высушивания, дает дополнительные преимущества - возможность точного дозирования и длительного хранения сырья. Это делает производство препарата более эффективным и экономически выгодным.

Полученный эритроцитарный антигенный сибиреязвенный диагностикум характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и при этом стабильностью и высоким уровнем воспроизводимости результатов и может использоваться для количественного определения титра сибиреязвенных антител в биологических жидкостях организма методом РНГА.

Критерий полезности. В данном изобретении нами предложен способ, позволяющий максимально использовать емкость поверхности эритроцита за счет унифицированного активирующего комплекса, состоящего из двух активаторов, ранее не применявшихся одновременно в качестве единого реагента, который позволяет получить совокупный эффект, значительно превышающий (в 2-4 раза) отдельно используемые компоненты (таблица 1), упростить технологию, исключив этап хроматографической очистки антигена и заменив трудоемкое ультрафильтрационное концентрирование на лиофилизацию культурального фильтрата.

Применение данного изобретения уменьшает зависимость аналитических характеристик отдельных серий эритроцитарного диагностикума от варьирующих концентраций сенситина, позволяя в широком диапазоне антигенной нагрузки за счет максимального использования поверхностных структур эритроцитарной мембраны и, соответственно, увеличения сорбционной емкости носителя получать конечный продукт, с равной эффективностью выявляющий сибиреязвенные антитела при различных сенсибилизирующих дозах антигена (таблица 2).

Как следует из данных таблицы 2, чувствительность диагностикума, сконструированного с применением предлагаемого комплексного активатора, становится в 2-4 раза выше по сравнению с использованием каждого из компонентов в отдельности. Стабильность отрицательных контролей демонстрирует отсутствие спонтанной агглютинации при всех концентрациях сенситина, что свидетельствует о полноценном использовании поверхности эритроцитарной мембраны и формировании высокоаффинных связей с антигенным комплексом культурального фильтрата.

Использованные в изобретении реактивы позволяют, наряду с дорогостоящими высокоочищенными алкилсульфатами (додецилсульфатом натрия/лаурилсульфатом натрия - SDS), использовать его аналог - средство «Прогресс» производства ООО АМС Медиа, г. Лосино-Петровский, Московская обл.; ТУ 2383-018-52662802-2002; ГОСТ Р51696-2000, в состав которого, наряду с поверхностно-активными веществами алкилсульфатного ряда, входят в минимальных концентрациях загуститель, отдушка и консервант, которые не только не снижают качество используемых алкилсульфатных солей натрия, но, по-видимому, делают их действие на эритроцитарную мембрану более мягким и щадящим.

Критерий новизны. Ранее использование при конструировании и производстве эритроцитарных диагностикумов комплексных активаторов, состоящих из 2-х и более компонентов разного принципа действия, не описано.

Основным предметом изобретения является использование при обработке поверхности эритроцитов в ходе производства эритроцитарного диагностикума комплексного активатора, в состав которого входят алкилсульфат натрия (ТУ 2383-018-52662802-2002) и свежеприготовленный раствор танина - в конечных концентрациях 2,5% и 1:40000 в фосфатно-буферном растворе рН 7,2 (ФБР).

Примеры конкретного применения

Пример №1. Приготовление разводящей жидкости. Постановка реакций РНГА и РТНГА.

Приготовление разводящей жидкости (РЖ). К 100 мл фосфатно-солевого буферного раствора рН 7,2±0,2 (ФБР) добавляли 0,05 мл детергента твин-20 «Serva» (ФБРТ). Бычий сывороточный альбумин (БСА) (ТУ 644-2-278-79) 2 г растворяли в 20 мл ФБР (100 мг/мл), после чего добавляли к ФБРТ в соотношении 1:20.

РЖ использовалась для разведения диагностикума и постановки реакций РНГА и РТНГА.

Для постановки РНГА и РТНГА в микроварианте 5% эритроцитарный диагностикум с помощью РЖ, содержащей 1% формалина, разводили до 1% концентрации. Реакции ставили в микропланшете в объеме 50 мкл.

При постановке РНГА сыворотки вносили в первые лунки каждого ряда в объеме 50 мкл и титровали двукратным шагом до лунки 11, из которой 50 мкл раствора после перемешивания удаляли, оставляя равный с другими объем 50 мкл. Лунка 12 каждого ряда являлась контрольной и содержала 50 мкл РЖ. Затем во все лунки планшета вносили по 25 мкл 1% эритроцитарного диагностикума. Планшет инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин, далее при комнатной температуре в течение 1,5-2 ч, после чего проводили учет РНГА.

При постановке РТНГА сыворотки титровали как в РНГА, затем во все лунки добавляли 25 мкл раствора сибиреязвенного антигена (РЖ, содержащую культуральный фильтрат (КФ) в концентрации 10 мкг/мл). После инкубации при 37°С в течение 40 мин во все лунки добавляли по 25 мкл 1% взвеси эритроцитарного диагностикума, повторно оставляли в термостате при 37°С на 40 мин, затем при комнатной температуре в течение 1,5 ч, далее учитывали результат РТНГА. Окончательный результат РНГА и РТНГА анализировали через 24 часа.

При положительном результате РНГА эритроциты выпадали на дне лунки тонким слоем в виде «зонтика», иногда с фестончатыми оползающими краями. «Зонтик» мог выстилать все дно лунки (4+) или 2/3 его поверхности (3+). При отрицательном результате РНГА и в контроле эритроциты скапливались на дне лунки в виде «пуговки» или кольца. Снижение титра на 3-4 лунки в РТНГА по сравнению с РНГА подтверждало специфичность реакции.

Пример №2. Проведение пробной сенсибилизации эритроцитов с различными активаторами для определения оптимальной сенсибилизирующей дозы (ОСД) антигена.

Для определения эффективного действия нескольких активаторов нами проводился опыт по обработке поверхности эритроцитов в 3 вариантах - с использованием в качестве активирующих агентов как танина или алкилсульфата натрия как монореагентов, так и в виде предложенного нами комплексного активатора, состоящего из тех же двух компонентов (применяемых как последовательно, так и одновременно, что в последнем случае дает существенный выигрыш во времени) в концентрациях: танин 1:40000; алкилсульфат 2,5%.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Согласно полученным данным, предложенный комплексный активатор, состоящий из комплекса двух реагентов - алкилсульфата натрия и танина, позволяет не только повысить чувствительность РНГА на 1-2 разведения (то есть в 2-4 раза), но и не вызывать спонтанной агглютинации нагруженных эритроцитов при всех изученных разведениях сенситина (отрицательные контроли), что свидетельствовало в пользу максимально эффективного использования емкости поверхности эритроцитарного носителя.

Следует отметить, что предложенные концентрации реагентов в составе комплексного активатора являются оптимальными: увеличение содержания алкилсульфата натрия более 2,5% и танина более чем 1:40000 приводит к опасности разрушения эритроцитов и потере контролен в РНГА, в то время как снижение концентраций компонентов не давало максимального уровня возможной активации эритроцитов и снижало чувствительность диагностикума, а также требовало увеличения времени инкубации, что отражалось на эффективности метода в условиях производства.

Пример №3. Получение диагностикума.

Для получения диагностикума один объем 2,5% взвеси эритроцитов барана, стабилизированных формалином, смешивали с равным объемом комплексного раствора активатора, состоявшего из двух компонентов: алкилсульфата натрия и свежеприготовленного раствора танина в конечных концентрациях 2,5% (1:40) и 0,0025% (1:40000) соответственно и инкубировали с периодическим перемешиванием на водяной бане при 45°С в течение 20 мин. К осадку эритроцитов, отмытых фосфатно-буферным раствором рН 7,2 (ФБР) и суспендированных в фосфатно-солевом растворе рН 5,9 (буфере Зеренсена), добавляли КФ с концентрацией белка, соответствующей оптимальной сенсибилизирующей дозе (в диапазоне от 0,5 до 0,125 мг/мл). Взвесь эритроцитов инкубировали с периодическим перемешиванием при 45°С в течение 40 мин, добавляли формалин до 1%, затем помещали в холодильник при 4°С на 18 ч. Эритроциты отмывали многократным центрифугированием при 1500 об/мин по 10 мин в фосфатно-буферном растворе рН 7,2 с 1% формалина. Отмытые эритроциты ресуспендировали в среде высушивания до 5% концентрации и подвергали лиофилизации.

Чувствительность трех серий диагностикума в пяти повторностях определяли в РНГА с положительной контрольной иммунной козьей сывороткой серии 31-7, содержащей антитела к КФ. Она соответствовала разведению сыворотки 1:100000 - 1:200000 при 100% воспроизводимости теста.

Специфичность РНГА подтверждали путем постановки РТНГА.

Пример №4. Активация эритроцитов комплексным активатором, содержащим неочищенный алкилсульфат натрия и танин.

Серия опытов показала, что для антигенного препарата значительные различия между активацией химически чистым додецилсульфатом натрия и его неочищенным аналогом в виде алкилсульфатов натрия отсутствуют. В связи с этим мы провели пробную сенсибилизацию с использованием сибиреязвенного антигена (культурального фильтрата В. anthracis) в концентрациях 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,125 мг/мл, 0,063 мг/мл. В качестве активатора эритроцитов применяли совместно неочищенный вторичный алкилсульфат натрия (средство «Прогресс» производства ООО АМС Медиа, г. Лосино-Петровский, Московская обл.; ТУ 2383-018-52662802-2002; ГОСТ Р51696-2000) и танин (Tannic acid, Fluka) в конечных концентрациях 2,5% (1:40) и 0,0025% (1:40000) соответственно. Результаты РНГА с диагностической сибиреязвенной иммунной козьей сывороткой серии 31-7 представлены в таблице 2.

В соответствии с результатами реакции (таблица 2) был сделан вывод о возможности эффективного использования при производстве эритроцитарного антигенного диагностикума в составе комплексного активатора, модифицирующего поверхность эритроцитов, как высокоочищенного препарата додецилсульфата натрия (SDS), так и его неочищенного аналога -вторичного алкилсульфата натрия в составе моющего средства «Прогресс» (ТУ 2383-018-52662802-2002; ГОСТ Р51696-2000), что позволяет выполнить Государственную программу импортозамещения и делает производство эритроцитарного сибиреязвенного диагностикума экономически более выгодным.

Пример 5. Получение культурального фильтрата Bacillus anthracis (КФ). Культуру вакцинного штамма В. anthracis ВНИИВМиМ-55 выращивали в R-среде, используемой для получения протективного антигена сибиреязвенного микроба [1]. В колбы объемом 500 мл, содержащие по 200 мл жидкой питательной среды, вносили выращенную на кровяном агаре в течение 18 ч при 37°С культуру Bacillus anthracis в концентрации 1×10³-1×10⁴ м.к./мл - по 1 мл. Колбы закрывали парафильмом и шуттелировали со скоростью 75 об/мин при 37°С в течение 21-22 ч. Среду культивирования стерилизовали фильтрованием через фильтр ДР-045, получая культуральный фильтрат (КФ), который проверяли на стерильность, после чего концентрировали методом лиофилизации в условиях вакуума.

Пример №6. Лиофильное высушивание полученного диагностикума.

Лиофилизацию диагностикума с концентрацией эритроцитов 5% осуществляли в среде высушивания, состоящей из реополиглюкина (15%) и сахарозы (7,5%) в дистиллированной воде [11]. Сушку проводили на лиофильной установке «COOLSAFE-100-9» с блоком регулировки вакуума по разработанному нами режиму.

Чтобы избежать потери активности препаратов, нами была снижена скорость сублимации. Для этого на первоначальном этапе сушки, пока температура не прошла порог эвтектики, вакуум в камере установки уменьшали до уровня 35 Ра. Далее вакуум постепенно увеличивали, причем время выхода препарата на температуру 0°С не должно было быть менее 12 часов. Для обеспечения такого режима сушки на установке «COOLSAFE-100-9» нами была использована специально разработанная программа лиофилизации из 10 шагов (таблица 3).

Использование представленной схемы лиофилизации позволило получать качественно высушенные препараты с длительным сроком хранения (срок наблюдения - более 3 лет) без потери активности и физико-химических свойств эритроцитарных диагностикумов.

Таким образом, использованные в изобретении реактивы позволяли наряду с химически чистым препаратом додецилсульфата натрия (SDS) использовать его неочищенный аналог - средство «Прогресс» производства ООО АМС Медиа, г. Лосино-Петровский, Московская обл.; ТУ 2383-018-52662802-2002; ГОСТ Р51696-2000.

Учитывая высокие аналитические характеристики полученного для определения титра антител к Bacillus anthracis в сыворотках людей и животных эритроцитарного диагностикума, технологичность и экономическую целесообразность его производства, простоту постановки и учета РНГА и РТНГА, не требующих для их выполнения специального оборудования, а также эпидемиологическую значимость сибиреязвенной инфекции, исследования по усовершенствованию производства РНГА-диагностических препаратов, несомненно заслуживают особого внимания и в современных условиях, с нашей точки зрения, приобретают приоритетный характер.

Список использованной литературы.

1. Артемьева Е.А., Мельникова Л.А., Родионов А.П. Испытание «Набора определения титра антител в сыворотке крупного рогатого скота, вакцинированного против сибирской язвы, в РНГА» на соответствие Техническим условиям // Ветеринарный врач. 2020. - №6. - С. 5-11.

2. P. Chaichana. Antibodies in Melioidosis: The Role of the Indirect Hemagglutination Assay in Evaluating Patients and Exposed Populations / P. Chaichana, K. Jenjaroen, P. Amornchai, S. Chumseng, S. Langla, P. Rongkard // Am. J. Trop.Med. Hyg., 99(6), 2018, pp. 1378-1385.

3. Zait H., Hamrioui B. Human cystic echinococcosis: Serological diagnosis by indirect hemagglutination test, enzyme-linked immunosorbent assay, Immunoelectrophoresis, and immunoblotting in surgically confirmed patients versus cases diagnosed by imaging techniques // Medecine et Maladies Infectieuses. - 2020. - V. 50. - №8. - P. 676-683.

4. Онищенко Г.Г., редактор. Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. М.: Медицина, МП Гигиена; 2006. 288 с.

5. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М., Медицина, Шико; 2013. 560 с.

6. Васина Н.К. Серологический мониторинг эффективности специфической профилактики сибирской язвы в ЦФО РФ / Н.К. Васина, Ю.О. Селянинов, И.Ю. Егорова// Ветеринарная патология. - 2012. - №1. - С. 36-40.

7. Крюкова Е.И., Мельник Р.Н., Гринь С.А., Клюшинцева Н.С. Эритроцитарные диагностикумы и применение в ветеринарии // Ветеринария Кубани. - 2017. - №3. - С. 15-17.

8. Патент RU 1698782. Способ изготовления сибиреязвенного эритроцитарного диагностикума / Бакулов И.А., Котляров В.М., Николайчук Л.Ф. // Опубл. 15.12.91. - Бюл. №46.

9. Патент RU 2658434. Способ получения диагностикума эритроцитарного сапного иммуноглобулинового моноклонального / Савина Е.В., Новицкая И.В., Храпова Н.П., Кулаков М.Я., Топорков А.В., Викторов Д.В.// Опубл. 21.06.2018. - Бюл. №18.

10. Патент RU 2484481. Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе / Дегтяренко Л.В., Карлова М.Ю., Скляров О.Д. // Опубл. 10.06.2013. - Бюл. №16.

11. Патент RU 2747420. Способ приготовления эритроцитарного диагностикума иммуноглобулинового туляремийного / Жарникова И.В., Кошкидько А.Г., Курчева С.А., Жданова Е.В. и др. // Опубл. 04.05.2021. - Бюл. №13.

12. Иванова С. В., Мельникова Л.А., Макаев Х.Н., Родионов А.П. Получение эритроцитарного сибиреязвенного антигена // Ветеринарный врач. 2019. №2. - С.22-25.

13. Патент RU 2410699. Способ получения диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного антигенного для обнаружения антител к протективному антигену / Баркова И.А., Барков A.M., Алексеев В.В., Липницкий А.В. // Опубл. 27.01.2011. - Бюл. №3.

14. Патент RU 2667121. Способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) / Юсупов О.Ю., Микаилов М.М., Халиков А.А., Шехилалиева Г.М. и др. // Опубл. 14.09.2018. - Бюл. №26.

15. Патент RU 1239922. Способ получения эритроцитарного сибиреязвенного диагностикума / Жанузаков Н.Ж., Жиглов В.И., Шамардин В.А., Кузьмин Ю.А., Герт М.В. // Опубл. 05.07.84. - Бюл. №14.

16. Патент SU 1207006. Защитная среда для лиофилизации эритроцитарных диагностикумов / Волков Е.А., Рыбкин B.C., Локтионов A.M., Петрова Л.С., Поляков И.И. // Опубл. 10.05.1999.

17. Патент RU 2476791. Способ лиофильной сушки эритроцитарного диагностикума / Пушкарь В.Г., Новицкая И.В., Кулаков М.Я., Павлова К.А., Степурина A.M. // Опубл. 27.02.2013. - Бюл. №6.

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии. Предложен способ получения диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного антигенного, включающий активирование формалинизированных эритроцитов барана конъюгирующим препаратом, состоящим из алкилсульфата натрия и свежеприготовленного раствора танина в фосфатно-буферном растворе (ФБР) рН 7,2 в конечных концентрациях 2,5% (1:40) и 0,0025% (1:40000) соответственно; затем эритроциты инкубируют 20 мин на водяной бане при 45°С, отмывают ФБР рН 7,2, суспендируют в фосфатно-солевом буфере Зеренсена рН 5,9, добавляют концентрированную фракцию культурального фильтрата вакцинного штамма Bacillus anthracis 55 с молекулярной массой более 10 кДа и содержанием белка от 0,5 до 0,125 мг/мл и инкубируют 40 мин при 45°С, добавляют формалин до конечной концентрации 1%, затем помещают в холодильник при 4°С на 18 ч, далее отмывают трехкратным центрифугированием при 1500 об/мин по 10 мин в ФБР рН 7,2, содержащем 1% формалина, отмытые эритроциты суспендируют в среде высушивания до 5% концентрации и лиофилизируют в соответствии с предложенным режимом. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов получения диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного антигенного для количественного определения уровня сибиреязвенных антител в сыворотках людей и животных. 3 табл., 6 пр.

Способ получения диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного антигенного, включающий получение антигенного комплекса из культурального фильтрата вакцинного штамма Bacillus anthracis 55, обработку формалинизированных эритроцитов барана конъюгирующим препаратом с последующей сенсибилизацией эритроцитов сибиреязвенным антигеном, отличающийся тем, что для активирования эритроцитов барана применяют двухкомпонентный активатор, состоящий из алкилсульфата натрия и свежеприготовленного раствора танина в фосфатно-буферном растворе (ФБР) рН 7,2 в конечных концентрациях 2,5% (1:40) и 0,0025% (1:40000) соответственно, после чего эритроциты инкубируют при периодическом перемешивании на водяной бане при 45°С в течение 20 мин, затем к осадку эритроцитов, отмытых фосфатно-буферным раствором (ФБР) рН 7,2 и суспендированных в фосфатно-солевом буфере Зеренсена рН 5,9, добавляют концентрированную методом ультрафильтрации фракцию культурального фильтрата вакцинного штамма Bacillus anthracis 55 с молекулярной массой более 10 кДа и содержанием белка от 0,5 до 0,125 мг/мл, взвесь эритроцитов инкубируют при периодическом перемешивании при 45°С в течение 40 мин, добавляют формалин до конечной концентрации 1%, затем помещают в холодильник при 4°С на 18 ч, далее отмывают трехкратным центрифугированием при 1500 об/мин по 10 мин в фосфатно-буферном растворе рН 7,2, содержащем 1% формалина, отмытые эритроциты суспендируют в среде высушивания до 5% концентрации и лиофилизируют в соответствии с режимом: на первоначальном этапе сушки уменьшают вакуум в рабочей камере до уровня 25-35 Па, далее вакуум ступенчато увеличивают до 10 Па.