СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ПОЛИСОРБАТА-80 С ПРИМЕНЕНИЕМ ЩЕЛОЧНОГО ГИДРОЛИЗА ОБРАЗЦА С ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ВЭЖХ Российский патент 2018 года по МПК G01N30/74 

Изобретение относится к способам количественного определения полисорбата-80 в растворах терапевтических белков и к способам быстрой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Предложенный способ позволяет значительно сократить время проведения анализа и повысить его чувствительность за счет применения изократической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Полисорбат-80 - один из самых популярных детергентов, предотвращающий агрегацию белка и обладающий выраженной противовирусной активностью. По этой причине его часто добавляют в полупродукты и готовые формы препаратов на основе терапевтических белков. Содержание полисорбата-80 в составе лекарственного средства должно тщательно контролироваться в связи с его склонностью к деградации.

Из уровня техники известны следующие способы решения задачи контроля содержания полисорбата-80 в продуктах: документы WO 2012119724, CN 103403544 и ЕР 2681553 раскрывают способы, включающие проведение щелочного гидролиза проб, дериватизацию продуктов гидролиза полисорбата-80 путем присоединения хромофорных меток, и последующего количественного определения полисорбата-80 оптическими способами (например, спектрофотометрией). Недостатком данного подхода можно считать необходимость предварительного осаждения белковой фракции, длительность и сложность пробоподготовки, а также высокую погрешность метода. Документ CN 101943684 раскрывает количественный анализ полисорбата-80 без гидролиза и дериватизации путем обращенно-фазовой ВЭЖХ с УФ-детектированием сигнала. Недостатками метода являются низкие специфичность и чувствительность, а также относительно большая длительность хроматографии. Если принять во внимание необходимость проведения щелочного гидролиза образца, наиболее близким к предлагаемому способу может быть назван способ, раскрытый в документе WO 2012119724. От известного способа предложенный в настоящей заявке метод отличается тем, что после проведения щелочного гидролиза проводят анализ образца методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в изократическом режиме, детекция аналита ведется с помощью УФ-детектора, и идентификация продукта реакции производится путем хроматографирования аналитического стандарта олеиновой кислоты с регистрацией времени удерживания ее пика.

В целом, известные подходы, основанные на хроматографическом анализе интактного полисорбата-80, характеризуются недостатками, связанными с необходимостью предварительного осаждения белковой фракции, а также необходимостью использования дополнительных детекторов: испарительного светорассеяния, заряженного аэрозоля; невысокой чувствительностью, нелинейной зависимостью между количеством введенного вещества и откликом детектора. Недостатки подходов, связанных с предварительным проведением щелочного гидролиза полисорбата-80 с последующим присоединением хромофорной метки и

спектрофотометрическим анализом, заключаются в необходимости проведения стадий предварительного осаждения белковой фракции и присоединения метки, что отрицательно сказывается на длительности пробоподготовки и всего анализа.

Основными проблемами в количественном анализе полисорбата-80 является его полимерная природа и отсутствие хромофорных групп, что, во-первых, требует большой длительности применяемых методик хроматографического анализа как для самого полисорбата-80, так и для его характеристических производных, а во-вторых, ведет к высокому уровню ошибок при определении концентрации полисорбата-80 спектрофотометрическим методом.

Для решения проблем количественного анализа полисорбата-80 автор изобретения взял за основу способ щелочного гидролиза, совместив его с высокоэффективной жидкостной хроматографией, во время которой проводится определение количества аналита с помощью УФ-детектора. Тем самым удалось избавиться от стадий осаждения белковой фракции и дериватизации гидролизата. Применение изократического элюирования и короткой колонки позволило сократить время хроматографического анализа, повысить его чувствительность, снизить требования к хроматографической системе и расход подвижной фазы. Применение УФ-детектора в предложенном способе дает значительные преимущества в чувствительности и производительности по сравнению с применением метода ВЭЖХ в сочетании с ELS-детектором: ориентировочный предел детектирования в случае ELS-детектора составляет порядка 1.2 мкг полисорбата-80 против 25 нг в предложенном способе; общая длительность пробоподготовки составляет порядка 1,5 часов против 6 часов для ELS-детектора, а время получения одной хроматограммы составляет 5 минут (против диапазона от 13 до 30 минут, в зависимости от колонки, для ELS). Нелинейное изменение отклика ELS-детектора на ввод разных количеств полисорбата-80 усложняет построение калибровочной кривой и сужает аналитический диапазон метода. Требуется также большее количество образца для анализа: порядка 1 мл (против 0,2 мл у предложенного способа).

Снижение нижнего предела детектирования (LOD) и нижнего предела количественного обнаружения (LLOQ) было достигнуто, прежде всего, за счет минимального дрейфа базовой линии при изократическом режиме хроматографии. Высокая скорость потока и использование колонки с небольшим размером пор сорбента (в диапазоне от 1,7 до 5,0 мкм) позволяет получить узкую хроматографическую фракцию целевого компонента, а, следовательно, увеличить высоту пика, что также снижает пределы LOD и LLOQ. Установка длины волны УФ-детектора для снятия сигнала на уровне 200 нм определяет максимальное соотношение «сигнал : шум» в диапазоне от 190 до 210 нм, таким образом также улучшая параметры LOD и LLOQ.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Построение калибровочной линии на растворе стандартного образца полисорбата-80, конценрация 1 мг/мл.

Фиг. 2. Определение концентрации полисорбата-80 в испытуемых образцах.

Фиг. 3. Хроматографические профили 6 повторных инжекций Экулизумаба серии Р0002701 в разведении 1/10. Отмечены пики олеиновой кислоты.

Фиг. 4. Хроматографические профили 6 повторных инжекций Адалимумаба серии 011115 в разведении 1/100. Отмечены пики олеиновой кислоты.

Фиг. 5. Хроматографические профили первых инжекций модельных образцов полисорбата-80 в концентрации 0,025 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,75 мг/мл, 1,0 мг/мл, 1,25 мг/мл, 1,5 мг/мл. Отмечены пики олеиновой кислоты.

Материалы и методы.

Щелочной гидролиз.

Гидролиз полисорбата-80 проводят добавлением к 0,2 мл образца 0,2 мл 5М раствора КОН с последующей инкубацией в течение 30 минут при 85°C с получением характеристического продукта - олеиновой кислоты. По окончании инкубации к образцу дополнительно добавляют 0,1 мл 5М раствора KOH и 0,4 мл ацетонитрила. Смесь тщательно перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 минут на скорости 9300g. Затем отбирают 0,1 мл жидкости из верхнего слоя, добавляют к 0,0235 мл воды и перемешивают. Экстракт используют свежеприготовленным.

Хроматографический анализ проб

Анализ проводят с использованием хроматографической колонки с сорбентом на основе бутилсилана, пентилсилана, октилсилана или октодецилсилана, оптимально - октодецилсилана; размером пор от 1,7 до 5,0 мкм, предпочтительно от 1,7 до 3,5 мкм, оптимально - 1,8 мкм; внутренним диаметром 0,5-5,0 мм, предпочтительно - 1,0-3,0 мм, оптимально - 2,1 мм; длиной 30-300 мм, предпочтительно 30-75 мм, оптимально - 50 мм; с использованием водно-ацетонитрильной подвижной фазы с объемным соотношением компонентов в диапазоне от 30/70 до 15/95, соответственно, предпочтительно - 25/74-20/80, оптимально - 19/81; с добавкой объемной доли ион-парного реагента (дифторуксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, муравьиной кислоты, уксусной кислоты, пропионовой кислоты; предпочтительно - дифторуксусной или трифторуксусной кислоты, оптимально - трифторуксусной кислоты) в диапазоне 0,01-2%, предпочтительно - 0,05-0,5%, оптимально - 0,1% при скорости потока фазы 0,02-5,0 мл/мин; предпочтительно - 0,2-1,0 мл/мин, оптимально - 0,5 мл/мин; температуре термостата колонок от +15 до +50°C, предпочтительно - от +25 до +35°C, оптимально - при +30°C; временем регистрации хроматограммы от 1,0 до 20 минут, предпочтительно - 3,0-10,0 минут, оптимально - 5,0 минут на детекторе УФ/видимой области или диодной матрице в диапазоне длин волн 190-240 нм, предпочтительно - 195-205 нм, оптимально - 200 нм.

Идентификация целевого компонента (олеиновой кислоты).

Идентификация продукта реакции производится путем хроматографирования аналитического стандарта олеиновой кислоты с регистрацией времени удерживания ее пика и последующим сравнением его с временами удерживания хроматографических пиков в испытуемых образцах. Установление концентрации полисорбата-80 в исследуемом образце производят по методу внешней калибровки. Для этого вводят в хроматограф различные количества гидролизата полисорбата-80 того же производителя, что и в исследуемом образце, и строят линейную зависимость площади пика олеиновой кислоты от количества введенного гидролизата. Затем вводят значение площади пика олеиновой кислоты хроматограммы анализируемого образца в полученное уравнение зависимости и получают массовую концентрацию полисорбата-80 в пробе.

По результатам валидации методики была установлена следующая характеристика способа:

Нижний предел детектирования составляет 25 нг полисорбата-80 (125 ppb); нижний предел количественного определения - 100 нг полисорбата-80 (500 ppb).

Аналитический диапазон методики находится в границах 0,025-1,5 мг/мл полисорбата-80.

Степень извлечения находится в диапазоне 92,1-107,5%.

Максимальное значение коэффициента вариации (CV) 18 повторных определений, выполненных в течение 3 дней двумя различными операторами, характеризующего воспроизводимость методики, составляет 2,69%.

Пример 1. Количественное определение полисорбата-80 в образцах с различным содержанием модифицированного антигемофильного глобулина.

Оборудование: Система ВЭЖХ Alliance е2695, с детектором UV/Visible Detector 2489

Колонка: Zorbax Extend-C18 RRHT 2.1×50 mm 1.8 micron №USHBD05592

Параметры: Vкол=0.17 мл, Рmax=8700 psi; рН=2.0-11.5

Условия: Скорость потока: 0,5 мл/мин

Время и параметры регистрации хроматограммы: 5 мин

температура колонки = 30°C; температура образца = 25°C; □=200 нм

Подвижная фаза: 0,1% ТФУ в 81% ацетонитриле

Реагенты: 5М раствор KOH, исходный раствор полисорбата-80 с концентрацией 200,0 мг/мл, стандартный раствор полисорбата-80 с концентрацией 1,0 мг/мл.

Приготовление подвижной фазы: Смешать 202.5 мл ацетонитрила, 250 мкл трифторуксусной кислоты и довести до 250 мл водой очищенной.

Раствор олеиновой кислоты с концентрацией 1 мг/мл: 0,1 г олеиновой кислоты растворить в 90 мл смеси ацетонитрил : вода в соотношении 1:1, довести объем раствора до 100 мл смесью ацетонитрил : вода в соотношении 1:1

Испытуемый раствор / Стандартный раствор полисорбата-80. 0,2 мл испытуемого образца / стандартного раствора полисорбата-80 с концентрацией 1,0 мг/мл поместить в центрифужную микропробирку вместимостью 1,5 мл, добавить 0,2 мл 5 М раствора гидроксида калия, перемешать и инкубировать в течение 30±2 мин в термошейкере при температуре (85±0,2)°C.

По окончании инкубации к полученному раствору добавить 100 мкл 5 М раствора гидроксида калия, 400 мкл ацетонитрила, тщательно (в течение 20 секунд) перемешать на Вортекс V-1 plus и центрифугировать полученный раствор в течение 5 мин со скоростью 9300 g при температуре (22±0,1)°C. Далее, из приготовленных растворов перенести 100 мкл жидкости из верхнего слоя в пробирку вместимостью 1,5 мл, добавить 23,5 мкл воды и перемешать. Полученные таким образом холостой раствор / испытуемый раствор / Калибровочный раствор полисорбата-80 перенести в соответствующим образом промаркированные флаконы.

Процесс построения калибровочной линии проиллюстрирован на Фиг. 1. Определение концентрации полисорбата-80 в опытных образцах проиллюстрировано на Фиг. 2.

Пример 2. Определение предела количественного определения пика олеиновой кислоты

Анализировались разведения 1 серии лекарственного препарата (далее ЛП) Экулизумаб и 1 серии ЛП Адалимумаб по 6 инжекций каждого, начиная от 2 мкг/мл до рабочей концентрации ЛП.

Критерий оценки:

- Соотношение уровня сигнала к уровню шума для пика олеиновой кислоты должно быть ≥10:1 по крайней мере 5 раз из 6 повторов.

- RSD шести определений для ЛП Экулизумаб должно быть меньше или равно 7,5%, для ЛП Адалимумаб - меньше или равно 10,7%.

Результат:

Предел количественного определения пика олеиновой кислоты был определен как концентрации белков в ЛП Экулизумаб - 20 мкг/мл, что составляет 10% от рабочей концентрации, и в ЛП Адалимумаб - 10 мкг/мл, что составляет 1% от рабочей концентрации. Эти концентрации дают сигнал приблизительно в 10 раза больше, чем уровень шума.

Пример 3. Проверка линейности аналитического диапазона

Анализировались модельные образцы полисорбата-80 по 6 инжекций каждого, начиная от 0,025 до 1,5 мг/мл. По итогам эксперимента строили график зависимости заданной концентрации полисорбата-80 в модельных образцах от площади пика олеиновой кислоты и аппроксимировали его линейной функцией.

Критерий оценки:

Коэффициент детерминации (R²) линейной зависимости концентрации полисорбата-80 от площади пика олеиновой кислоты должен составлять ≥0,98 (что соответствует значениям модуля коэффициента корреляции r≥0,99).

Результаты представлены на Фиг. 5.

Полученное уравнение линейной функции: у=992428х-10538,

Коэффициент детерминации: 0.9998.

Вывод:

Зависимость заданной концентрации полисорбата-80 в модельных образцах от полученной площади пика олеиновой кислоты линейна, результаты соответствуют критериям оценки.

Пример 4. Проверка правильности метода.

Анализировались модельные образцы полисорбата-80 в диапазоне концентраций от 0,025 мг/мл до 1,5 мг/мл по 6 инжекций каждого. По полученным результатам рассчитывали коэффициент вариации (%R)

Анализировались модельные образцы полисорбата-80 по 6 инжекций каждого, начиная от 0,025 до 1,5 мг/мл. По калибровочной кривой, построенной с помощью стоковых растворов полисорбата-80 (0,2 мг/мл и 1,0 мг/мл) рассчитывали концентрацию полисорбата-80 в модельных образцах. По итогам определяли коэффициент вариации. Результаты представлены на Фиг. 5 и Таблице 6.

Для расчета концентрации полисорбата-80 в образце использовались калибровочные кривые, построенные с использованием стоковых растворов полисорбата-80 (0,2 и 1,0 мг/мл).

Степень извлечения, характеризующую способ, вычисляли по формуле

где R (Recovery) - выход, А - измеренное содержание, В - заданный (фактический) уровень.

Изобретение относится к способам количественного определения полисорбата-80 в растворах терапевтических белков и к способам быстрой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Способ определения концентрации полисорбата-80 в образце, содержащем белок или гликопротеин, включающий проведение щелочного гидролиза проб, отличается тем, что после проведения щелочного гидролиза проводят анализ образца методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в изократическом режиме в течение 13-30 минут, при скорости потока фазы 0,02-5,0 мл/мин, с объемным соотношением компонентов водно-ацетонитрильной подвижной фазы в диапазоне от 30/70 до 15/95, длина колонки составляет от 30 до 300 мм, размер пор сорбента составляет от 1,7 до 5,0 мкм, детектирование аналита ведется в УФ-области спектра в диапазоне длин волн 190-220 нм, и идентификация продукта реакции производится путем хроматографирования аналитического стандарта олеиновой кислоты с регистрацией времени удерживания ее пика. 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 6 табл., 4 пр.

1. Способ определения концентрации полисорбата-80 в образце, содержащем белок или гликопротеин, включающий проведение щелочного гидролиза проб, отличающийся тем, что после проведения щелочного гидролиза проводят анализ образца методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в изократическом режиме в течение 13-30 минут, при скорости потока фазы 0,02-5,0 мл/мин, с объемным соотношением компонентов водно-ацетонитрильной подвижной фазы в диапазоне от 30/70 до 15/95, длина колонки составляет от 30 до 300 мм, размер пор сорбента составляет от 1,7 до 5,0 мкм, детектирование аналита ведется в УФ-области спектра в диапазоне длин волн 190-220 нм, и идентификация продукта реакции производится путем хроматографирования аналитического стандарта олеиновой кислоты с регистрацией времени удерживания ее пика.

2. Способ по п. 1, где используемый сорбент выбран из бутилсилана, пентилсилана, октилсилана или октодецилсилана, предпочтительно октодецилсилана.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, где размер пор сорбента составляет предпочтительно от 1,7 до 3,5 мкм, оптимально 1,8 мкм.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где внутренний диаметр колонки составляет от 0,5 до 5,0 мм, предпочтительно от 1,0 до 3,0 мм, оптимально до 2,1 мм.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где длина колонки составляет предпочтительно от 30 до 75 мм, оптимально 50 мм.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где используют водно-ацетонитрильную подвижную фазу с объемным соотношением компонентов предпочтительно в диапазоне от 25/74 до 20/80, оптимально 19/81.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где к подвижной фазе добавляют ион-парный реагент, выбранный из дифторуксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, муравьиной кислоты, уксусной кислоты, пропионовой кислоты в объемной доле 0,01-2%, предпочтительно 0,05-0,5%, оптимально 0,1%.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где хроматография ведется при скорости потока фазы предпочтительно 0,2-1,0 мл/мин, оптимально 0,5 мл/мин.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где температура термостата колонок составляет от +15 до +50°С, предпочтительно от +25 до +35°С, оптимально при +30°С.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где время регистрации хроматограммы составляет от 1 до 20 минут, предпочтительно от 3 до 10 минут, оптимально 5 минут.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где детектирование проводят на детекторе УФ видимой области или диодной матрице предпочтительно в диапазоне волн 195-205 нм, оптимально 200 нм.