Способ количественного определения амиодарона в плазме крови человека Российский патент 2025 года по МПК G01N33/94 G01N33/49 G01N30/02 G01N30/06 

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано в лечении амиодароном пациентов с нарушениями ритма сердца.

Амиодарон является высокоэффективным средством для лечения и профилактики аритмий и относится к III классу антиаритмических препаратов. На сегодняшний день при необходимости назначения антиаритмической терапии свой выбор в пользу амиодарона делают 24,1% врачей в США, 34,5% - в Европе и 73,8% - в Латинской Америке. В России по результатам проведенного опроса при органическом поражении миокарда в тактике удержания синусового ритма при фибрилляции предсердий амиодарон назначается в 41,2% случаев в качестве препарата первой линии и 51,9% - в качестве терапии второй линии [1]. По результатам систематического обзора эффективность амиодарона в удержании синусового ритма варьирует от 30 до 95,2% [2].

Фармакокинетика амиодарона уникальна и непроста, обусловлена его высокой липофильностью и практически полным связыванием с белками плазмы, а также большим распределением его в ткани (жировой ткани, печени, легких, надпочечниках, яичках, лимфатических узлах, коже) [3, 4]. Метаболизируется амиодарон в печени с участием цитохрома P450 с образованием основного метаболита дезэтиламиодарона. Последний, в свою очередь, является фармакологически активным и способен усиливать терапевтические эффекты основного соединения [5].

Попытки персонализировать терапию амиодароном и выявить корреляцию его концентрации с эффективностью и безопасность терапии предпринимались неоднократно. Способ определения амиодарона методом инверсионной вольтамперометрии описан в патенте [6]. Несмотря на то, что методика является достаточно чувствительной и позволяет определять содержание амиодарона на уровне 0,01 мг/мл, существенным ее недостатком является тот факт, что условия разработаны для растворов субстанции и не учитывают присутствие компонентов крови в образце, следовательно, методика не может быть использована для определения амиодарона в плазме крови. В другом патенте [7] описан способ количественного определения амиодарона, основанный на спектрофотометрическом анализе хлороформных экстрактов ионного ассоциата амиодарона и метилового оранжевого из ацетатного буферного раствора с рН 3 при длине волны 430 нм. Недостатком способа является его непригодность для исследования биологических образцов, так как методика не учитывает матричное влияние компонентов плазмы крови и возможность образования ионных ассоциатов с иными малыми молекулами, обладающими положительно заряженными функциональными группами. Помимо этого, предел количественного определения амиодарона для описанной в патенте методики анализа равен 0,34 мг/мл, что более чем в 100 раз выше терапевтической концентрации амиодарона в плазме крови (1,0-2,5 мкг/мл). Способ определения амиодарона в сыворотке крови методом жидкостной тандемной хромато-масс-спектрометрии [8] является более селективным и чувствительным в сравнении с фотометрическим и амперометрическим. Тем не менее, данный способ является дорогим из-за высокой стоимости реактивов, стандартов и прибора. Недостатком является и время пробоподготовки: время приготовления одного образца составляет более 20 минут. Способ, описанный в статье Pérez-Ruiz Т. et al [9], основан на определении амиодарона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием хемилюминесцентного детектора. Данный способ позволяет определять амиодарон в биологических образцах, но предполагает использование хемилюминесцентного детектора, не входящего в базовую комплектацию хроматографа, а также использование дорогостоящих реактивов, что является существенным ограничением для его рутинного использования.

Прототип описанного в данном патенте способа определения амиодарона описан в статье Márcio Rodrigues с соавт. [10]. Для количественного анализа использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора. Методика пробоподготовки включает добавление внутреннего стандарта и фосфатного буфера pH 5 с последующей трехкратной экстракцией амиодарона н-гексаном, полным осушением объединенного экстракта в токе азота при 60°С и перерастворением сухого остатка в метаноле. Хроматографическое разделение проводится на колонке Purospher Star C18 геометрии 55×4 мм; 4 мкм в изократическом режиме смесью 0,1% раствор муравьиной кислоты/метанол/ацетонитрил (45:5:50, v/v/v) при потоке 1,2 мл/мин. Длина волны детектирования - 254 нм, объем инжекции - 20 мкл. Предел количественного определения компонентов - 0,1 мкг/мл. Данный способ наиболее близкий к заявленному по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа. Недостатком способа является длительная пробоподготовка и использование дополнительного оборудования: концентратора азота и жидкостного хроматографа, насос которого рассчитан на работу при давлении в диапазоне 700-1000 бар.

Целью изобретения является разработка простого, материально и время не затратного способа, позволяющего определять концентрацию амиодарона в плазме человека, для контролируемого подхода к терапии с повышением ее эффективности и безопасности у пациентов с нарушениями ритма сердца.

Поставленная цель достигается путем использования метода жидкостной хроматографии, характеризующегося тем, что венозную кровь, содержащую амиодарон, центрифугируют. Затем 500 мкл супернатанта переносят в эппендорф и проводят пробоподготовку по модифицированному методу QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe - Быстрый, Простой, Дешевый, Эффективный, Точный и Надежный). После этого хроматографируют образец в условиях градиентного элюирования с использованием проприетарной колонки Tsunami C18 Pharm при скорости потока 1,2 мл/мин, объеме инжекции 80 мкл, длине волны детектирования 241 нм при общем времени анализа 18 минут. Определение содержания амиодарона проводят по градуировочной зависимости в диапазоне от 40% до 200% от средней терапевтической концентрации (0,0125 мг/мл). Использование валидирующих методик позволяет постановить пригодность способа для анализа концентрации амиодарона в плазме крови человека.

Новым в предлагаемом изобретении являются особенности пробоподготовки, основанной на методе QuEChERS, обеспечивающей устранение значительного влияния белков плазмы на хроматографический анализ; специфика хроматографических условий градиентного элюирования с использованием проприетарной колонки Tsunami C18 Pharm при скорости потока 1,2 мл/мин, объеме инжекции 80 мкл, длине волны детектирования 241 нм при общем времени анализа 18 минут. Применение новых условий обеспечивает устранение мешающего влияния белков плазмы крови, что подтверждает возможность количественного определения амиодарона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии-ультрафильтрации, без использования масс-спектрометрического детектора. Отсутствие аналога предлагаемого способа в рутинной клинической практике при сравнительно высокой скорости реализации анализа позволит рассматривать вопрос о проведении клинического исследования оценки концентрации амиодарона в терапии нарушений ритма сердца с последующим внедрением его в деятельность учреждений здравоохранения. Это создаст перспективы изучения закономерностей развития эффектов амиодарона у пациентов с нарушениями ритма сердца, а также формирования контролируемого и персонализированного подхода к терапии пациентов аритмологического профиля.

Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не являющиеся очевидными для специалиста.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научно-медицинской литературы.

Данное изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении для персонификации подхода к контролю эффективности и безопасности терапии амиодароном у пациентов с нарушениями ритма сердца.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом.

Подготовку рабочего раствора осуществляют по методу QuEChERS. После забора крови из периферической вены пробирки центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 3000 об/мин с последующим отбором 450 мкл плазмы крови и переносом в эппендорф на 1,5 мл. Для приготовления модельной смеси используют раствор амиодарона (C = 0,0125 мкг/мл). Для приготовления раствора в эппендорф объемом 1,5 мл последовательно добавляют 450 мкл плазмы крови, 50 мкл раствора амиодарона (С=0,0125 мг/мл), 0,33 ± 0,04 г хлорида натрия. К раствору добавляют 500 мкл экстрагента ацетонитрила с последующим вортексированием в течение 10 секунд на максимальной частоте и центрифугированием эппендорфа в течение 5 минут на максимальных оборотах (15 тысяч в минуту) и отбором супернатанта (находится над слоем осевшего на границе расслоения жидкостей белка; при отсутствии расслоения отбирают всю жидкость). Анализ проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием диодно-матричного детектора на экспериментальном образце колонки Tsunami C₁₈ Pharm.

Используемое оборудование

1. Хроматограф Agilent 1260 Infinity (DAD-детектор);

2. Предколонка Agilent Zorbax SB C₈ (9,4×15 мм, 7 мкм);

3. Колонка Tsunami C₁₈ Pharm (250×4,6 мм, 5 мкм);

4. Весы неавтоматического действия GR-200 (57514-14) №14247280;

5. Центрифуга СМ-50;

6. Ультразвуковая ванна Elmasonic P;

7. Механический дозатор на 200-1000 мкл;

8. Вортекс IKA Vortex Genius 3;

9. Ложка кюретажная Lukas, прямая, 3,0 мм.

Реактивы

1. Хлорид натрия, хч;

2. Ацетонитрил для градиентной хроматографии (Carlo Erba Reagents, Италия) - «экстрагент».

Расходные материалы

1. Эппендорфы на 1,5 мл, 100 шт. (2 шт. на пробу);

2. Виалы Interlab из прозрачного стекла для хроматографии 9-425, 2 мл.

Условия хроматографического анализа:

1. Температура термостата - 30 °C;

2. Скорость потока - 1,2 мл/мин;

3. Объем инжекции - 80 мкл;

4. Длина волны детектирования - 241 нм;

5. Подвижная фаза А - фосфатный буфер (pH 3, 7,5 мМ), подвижная фаза B - ACN;

Режим элюирования градиентный, состав подвижной фазы представлен в таблице 1.

6. Общее время анализа составляет 18 минут; RT = 6,63±0,04 минут (RSD = 0,56 %).

Таблица 1. Программа градиента

Время, мин Подвижная фаза B, % 0,00…7,00 50 7,00…15,00 50 → 85 7,15…15,00 85 15,00…15,10 85 → 50 15,10…18,00 50

Образцы для валидации

1. Образцы лекарственного препарата «Амиодарон», концентрат для приготовления раствора для внутривенного введения 50 мг/мл»;

2. Модельные растворы, приготовленные из стандартного образца амиодарона, кофеина, ибупрофена и дротаверина гидрохлорида;

3. Плацебо (образцы плазмы крови человека, не принимающего амиодарон);

4. Первичный стандартный образец (СО) амиодарона, 50 мг.

Валидацию проводят на основе с ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик» по следующим параметрам: селективность, эффект матрицы (посредством построения калибровочной кривой относительно содержания амиодарона в плазме после пробоподготовки (для разных уровней концентрации)), калибровочная кривая, точность (на уровнях внутри цикла, между циклов), прецизионность (на уровнях внутри цикла, между циклов), степень извлечения, нижний предел количественного определения (минимальная концентрация, которую можно определить количественно, соответствует соотношению сигнала к шуму (S/N), равному 10. В нашем исследовании предел количественного обнаружения равен 0,00105 (80% от средней терапевтической концентрации (0,00125)). Методику считают пригодной для определения соответствующего показателя лекарственного препарата, если выполняются приведенные критерии пригодности, т.е. выполняются требования к значению валидационных показателей (параметров).

Валидация

1. Специфичность

Оценивают специфичность методики по отношению к лекарственным веществам, наиболее распространенным в медицинской практике. В эту группу входят нестероидные противовоспалительные средства (Ибупрофен), стимулятор нервной системы (Кофеин), а также спазмолитическое средство (Дротаверин).

Разрешение (R_S) между пиком амиодарона и пиком ибупрофена на хроматограмме - 50,1. Полученное значение входит в диапазон допустимых, таким образом, по показателю специфичности разработанную методику можно считать пригодной. Фактор отклика для амиодарона составил 0,999.

2. Линейность

В ходе проверки методики по критерию линейности проводят построение градуировочной зависимости для стандартных растворов амиодарона с концентрациями 0,5; 0,8; 1,0; 1,25; 2,5; 3,0 мкг/мл. Согласно полученным данным, методику считают линейной в диапазоне концентраций от 0,5 до 3 мкг/мл (от 40 до 240% от средней терапевтической концентрации). Величина коэффициента корреляции (R²) составляет 0,9936 в диапазоне концентраций 0,5 - 3,0 мкг/мл.

Линейность методики оценивают также по аналитическому сигналу, детектированному при анализе модельных смесей плазмы с различными концентрациями амиодарона (0,5; 0,8; 1,25; 1,6; 2,5 мкг/мл). При построении градуировочной зависимости для модельной смеси амиодарона после пробоподготовки коэффициент корреляции (R²) составляет 0,9934. Таким образом, поскольку величины R² удовлетворяют условию R² > 0,9, методику считают пригодной по критерию линейности. На основании доказанной линейности методики рассчитывают предел количественного определения и предел обнаружения. Величина предела обнаружения составляет 0,030 мкг/мл (S/N = 3), предела количественного обнаружения - 0,082 мкг/мл.

3. Воспроизводимость (повторяемость и промежуточная прецизионность)

Проверку повторяемости проводят посредством измерения аналитического сигнала для трех проб, по трем параллельным измерениям для каждой. Измерения проводят в течение короткого промежутка времени, с использованием одинакового оборудования и реактивов, одним аналитиком.

Промежуточную (внутрилабораторную) прецизионность оценивают для трех образцов, по три параллельных измерения для каждого, в течение трех дней. Измерения проводят на одинаковом оборудовании, с использованием одинаковых реактивов, одним аналитиком, но с широким временным разбросом.

Для проверки однородности дисперсий (среднеквадратичное отклонение (СКО) повторяемости) используют G-критерий Кохрена.

G_ЭКСП (RT) = 0,393;

G_ЭКСП (S) = 0,463;

G_ТАБЛ = 0,871.

Таблица 2. Показатели повторяемости и промежуточной прецизионности методики

RT, мин S, мВ×с День 1 День 2 День 3 День 1 День 2 День 3 Проба 1 6,595 6,571 6,629 61,51 59,3 58,67 Проба 2 6,627 6,602 6,678 61,56 59,42 58,05 Проба 3 6,665 6,642 6,673 59,93 60,92 58,87 СКО повторяемости, мин (мВ×с) 0,035 0,035 0,027 0,928 0,903 0,428 RSD повторяемости, % 0,53 0,54 0,40 1,52 1,51 0,73 Gэксп 0,393 0,463 Gтабл 0,871 СКО повторяемости методики, мин (мВ×с) 0,033 0,787 RSD повторяемости методики, % 0,49 1,32 СКО промежуточной прецизионности, мин (мВ×с) 0,028 1,238 RSD промежуточной прецизионности, мин (мВ×с) 0,42 2,07

Примечание. СКО - среднеквадратичное отклонение; RSD - относительное стандартное отклонение; Gэксп - экспериментальные значения G критерия Кохрена; Gтабл - табличные значения G критерия Кохрена.

Как видно из результатов расчета (таблица 2), экспериментальные значения G критерия меньше табличного, следовательно, дисперсии считают однородными и усредняют для расчета среднеквадратичного отклонения повторяемости методики. Значения относительного стандартного отклонения повторяемости и промежуточной прецизионности соответствуют установленным требованиям (10% и 15% соответственно), следовательно, разработанную методику считают пригодной в пределах аналитической области.

4. Правильность

Оценку методики по критерию правильности проводят методом введено - найдено. Полученные величины отклонений расчетных концентраций от номинального значения в диапазоне от 40% до 200% от терапевтической концентрации входят в диапазон приемлемых (восстановление от 70% до 130% для уровня предела репортирования; от 85% до 115% - для остальных точек). Согласно полученным результатам (таблица 3), отклонения полученных значений от эталонного (метод введено-найдено), находятся в пределах допустимых значений. Таким образом, разработанную методику считают правильной в рассматриваемом диапазоне концентраций.

Таблица 3. Правильность в условиях повторяемости

% от средней терапевтической концентрации Номинальная концентрация, мг/мл Среднее значение расчётной концентрации, мг/мл Отклонение от номинальной концентрации, % RSD, % Восстановление, % 40 0,00050 0,00042 15,98 3,49 84,02 100 0,00125 0,00115 6,24 2,07 91,92 130 0,00160 0,00146 9,02 3,54 90,97 200 0,00250 0,00213 14,94 0,70 85,06

5. Стабильность

Оценку стабильности стандартного раствора амиодарона проводят в течение 6 часов с выявлением величины относительного стандартного отклонения. Результаты оценки стабильности раствора амиодарона представлена в таблице 4.

Таблица 4. Стабильность стандартного раствора амиодарона (С=0,8 мкг/мл)

Время 0 часов 1 час 2 часа 6 часов RSD, % S, мВхс 51,50 54,34 53,30 49,54 4,04

6. Робастность

Влияние массы навески NaCl

Расчетные данные свидетельствуют об изменении степени извлечения анализируемого вещества при изменении массы используемой соли на 0,05 г, причем извлечение увеличивается с увеличением массы. Результаты представлены в таблице 5.

Оценку робастности проводят также при изменении pH подвижной фазы. Анализ образцов плазмы проводят при значениях pH, равных 2,5 и 3,5. Результаты анализа демонстрируют наложение пика амиодарона на пик компонента биологической матрицы для pH 2,5, а также изменение времени удерживания (RT = 6,22); при значении pH 3,5, пик анализируемого вещества характеризуется увеличением времени удерживания (RT = 8,16) и уширением. Таким образом, методика характеризуется низкими значениями робастности по ряду хроматографических параметров, требует точного соблюдения методики пробоподготовки и приготовления подвижных фаз.

Таблица 5. Влияние массы NaCl на извлечение амиодарона

m (NaCl), г Sсред, мВ×с %, от исходной S 0,33 59,80 100 0,28 57,88 96,79 0,38 61,59 102,99

Разработанный способ соответствует всем критериям валидации, простой в использовании и быстрый в исполнении, что при отсутствии аналога в рутинной клинической практике позволит рассматривать вопрос о внедрении его в деятельность учреждений здравоохранения. Это создаст перспективы продолжения клинического исследования и изучения закономерностей развития эффектов амиодарона у пациентов с нарушениями ритма сердца, а также формирования контролируемого и персонализированного подхода к терапии пациентов аритмологического профиля.

Таким образом, способ определения концентрации амиодарона в плазме человека заключается в следующем: у пациента производят забор периферической крови с последующей пробоподготовкой по методу QuEChERS, добавлением к плазме амиодарона для создания рабочего раствора, забором супернатанта и последующим определением концентрации амиодарона в плазме методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в условиях градиентного элюирования с использованием проприетарной колонки Tsunami C18 Pharm при скорости потока 1,2 мл/мин, объеме инжекции 80 мкл, длине волны детектирования 241 нм при общем времени анализа 18 минут. Определение содержания амиодарона проводят по градуировочной зависимости в диапазоне от 40% до 200% от средней терапевтической концентрации (0,0125 мг/мл). Оценка пригодности разработанной методики для количественного определения препарата в плазме крови осуществляется по критериям специфичности, правильности, линейности, повторяемости и промежуточной прецизионности.

Пример

Реальный образец

Определение концентрации амиодарона в плазме крови пациента, принимающего исследуемый препарат, проводят согласно описанным условиям. Пробоподготовку осуществляют по методу QuEChERS. После забора крови из периферической вены образцы центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 3000 об/мин с последующим отбором 500 мкл плазмы крови и переносом в эппендорф на 1,5 мл. Далее производят последовательное добавление к плазме 8 ложек хлорида натрия (0,33±0,04 г), 500 мкл экстрагента - ацетонитрила с последующим вортексированием в течение 10 секунд на максимальной частоте и центрифугированием эппендорфа в течение 5 минут на максимальных оборотах (15 тысяч в минуту) и отбором супернатанта (находится над слоем осевшего на границе расслоения жидкостей белка; при отсутствии расслоения отбирается вся жидкость).

Анализ проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием диодно-матричного детектора на экспериментальном образце колонки Tsunami C₁₈ Pharm.

Условия хроматографического анализа:

1. Температура термостата - 30°C;

2. Скорость потока - 1,2 мл/мин;

3. Объем инжекции - 80 мкл;

4. Длина волны детектирования - 241 нм;

5. Подвижная фаза А - фосфатный буфер (pH 3, 7,5 мМ), подвижная фаза B - ACN.

Расчет концентрации амиодарона в реальном образце плазмы крови проводят с помощью построения калибровочной кривой в диапазоне концентраций от 40% до 240% от средней терапевтической концентрации. Для расчета реальной концентрации амиодарона используют уравнение линейной регрессии. Результаты расчета представлены в Таблице 6.

Таблица 6. Концентрация амиодарона в образце

Анализируемое вещество S, мВ×с RT, мин С, мг/л Амиодарон 42,04 7,907 0,51

Заключение: Предлагаемый в качестве изобретения способ при отсутствии аналога позволяет технически просто, материально и время- незатратно определять концентрацию амиодарона в плазме человека для реализации контролируемого подхода к терапии с повышением ее эффективности и безопасности у пациентов с нарушениями ритма сердца.

Источники информации:

1. Шубик Ю.В., Медведев М.М., Михайлов Е.Н. и др. Лечение фибрилляции предсердий в России: реальная клиническая практика и рекомендации. Вестник аритмологии. 2021. Т. 28. № 2 (104). С. 55-63.

2. Недоступ А., Благова О. Лечение нарушений ритма сердца кордароном. Ответы на актуальные вопросы // Врач. 2005. № 8.

3. Nul D.R., Doval H.C., Grancelli H.O., Varini S.D, Soifer S., Perrone S.V, Prieto N., Scapin O. The GESICA-GEMA Investigators. Grupo de Estudio de la Sobrevida en la Insuficiencia Cardiaca en Argentina-Grupo de Estudios Multicéntricos en Argentina.Heart rate is a marker of amiodarone mortality reduction in severe heart failure. J Am Coll Cardiol. 1997 May; 29 (6): 1199-205. doi: 10.1016/s0735-1097(97)00066-1

4. Doval H.C., Nul D.R., Grancelli H.O., Perrone S.V., Bortman G.R., Curiel R. Randomised trial of low-dose amiodarone in severe congestive heart failure. Grupo de Estudio de la Sobrevida en la Insuficiencia Cardiaca en Argentina (GESICA)Lancet. 1994 Aug 20; 344 (8921): 493-8. doi: 10.1016/s0140-6736(94)91895-3

5. Claro J.C., Candia R., Rada G., Baraona F., Larrondo F., Letelier L.M. Amiodarone versus other pharmacological interventions for prevention of sudden cardiac death. Review Cochrane Database Syst Rev. 2015 Dec 8; 2015 (12): CD008093.doi:10.1002/14651858.CD008093.pub2

6. Пат. № 2246722 Российская Федерация «Способ определения амиодарона (кордарона) методом инверсионной вольтамперометрии» [Текст] / Терентьева С.В., Ивановская Е.А., Автунич Е.В., заявитель и патентообладатель: Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра Сибирского отделения Академии медицинских наук (RU) - 2003132623, заявл. 06.11.2003; опубл. 20.02.2005, Бюл. № 5.

7. Пат. № 2413937 Российская Федерация «Способ количественного определения амиодарона» [Текст] / Алыков Н.М., Павлова А.В., заявитель и патентообладатель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Астраханский государственный университет" (АГУ) (RU) - 2009138083, заявл. 14.10.2009; опубл. 10.03.2011, Бюл. № 7.

8. Пат. № 2749566 Российская Федерация «Способ определения амиодарона и его основного метаболита дезэтиламиодарона в сыворотке крови человека» [Текст] / Разина Т.А., Мельников Е.С., Прокофьев А.Б., Красных А.М. с соавт., заявитель и патентообладатель: ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения Минздрава России» (RU) - 2020138877, заявл. 27.11.2020; опубл. 15.06.2021, Бюл. № 17.

9. Pérez-Ruiz T., Martínez-Lozano C., García-Martínez M.D. Simultaneous determination of amiodarone and its metabolite desethylamiodarone by high-performance liquid chromatography with chemiluminescent detection. Anal Chim Acta. 2008 Aug 8; 623 (1): 89-95. doi: 10.1016/j.aca.2008.06.003. Epub 2008 Jun 8. PMID: 18611462.

10. Márcio Rodrigues et al. A Rapid HPLC Method for the Simultaneous Determination of Amiodarone and its Major Metabolite in Rat Plasma and Tissues: A Useful Tool for Pharmacokinetic Studies, Journal of Chromatographic Science, Volume 51, Issue 4, April 2013, Pages 361-370, https://doi.org/10.1093/chromsci/bms149

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для количественного определения амиодарона в плазме крови человека методом жидкостной хроматографии. У пациента, принимающего амиодарон, производят забор периферической венозной крови, которую центрифугируют, супернатант переносят в эппендорф для получения плазмы крови. Проводят пробоподготовку по модифицированному методу QuEChERS - Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe, заключающемуся в подготовке рабочего калибровочного раствора, для чего отбирают 450 мкл плазмы крови, далее последовательно добавляют к плазме 50 мкл раствора амиодарона с концентрацией 0,0125 мг/мл - средней терапевтической концентрацией, 0,33±0,04 г хлорида натрия. К полученному раствору добавляют 500 мкл ацетонитрила, центрифугируют, отбирают супернатант. Для подготовки исследуемого образца отбирают 500 мкл плазмы крови, далее производят последовательное добавление к плазме 8 навесок хлорида натрия - 0,33±0,04 г, 500 мкл ацетонитрила, центрифугируют, отбирают супернатант. После чего хроматографируют исследуемый и калибровочный образцы в условиях градиентного элюирования с использованием колонки Tsunami C18 Pharm при скорости потока 1,2 мл/мин, объеме инжекции 80 мкл, длине волны детектирования 241 нм при общем времени анализа 18 минут. Определение содержания амиодарона в образце плазмы крови пациента проводят с помощью построения калибровочной кривой в диапазоне концентраций от 40% до 200% от концентрации амиодарона 0,0125 мг/мл. Способ обеспечивает возможность простого, материально и времянезатратного определения концентрации амиодарона в плазме человека для контролируемого подхода к терапии с повышением ее эффективности и безопасности у пациентов с нарушениями ритма сердца за счет особенностей пробоподготовки, основанной на методе QuEChERS, обеспечивающей устранение значительного влияния белков плазмы на хроматографический анализ, и специфики хроматографических условий градиентного элюирования, что подтверждает возможность количественного определения амиодарона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии-ультрафильтрации без использования масс-спектрометрического детектора. 6 табл., 1 пр.

Способ количественного определения амиодарона в плазме крови человека методом жидкостной хроматографии, характеризующийся тем, что у пациента, принимающего амиодарон, производят забор периферической венозной крови, которую центрифугируют, супернатант переносят в эппендорф для получения плазмы крови, проводят пробоподготовку по модифицированному методу QuEChERS - Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe, заключающемуся в подготовке рабочего калибровочного раствора, для чего отбирают 450 мкл плазмы крови, далее последовательно добавляют к плазме 50 мкл раствора амиодарона с концентрацией 0,0125 мг/мл - средней терапевтической концентрацией, 0,33±0,04 г хлорида натрия, к полученному раствору добавляют 500 мкл ацетонитрила, центрифугируют, отбирают супернатант; для подготовки исследуемого образца отбирают 500 мкл плазмы крови, далее производят последовательное добавление к плазме 8 навесок хлорида натрия - 0,33±0,04 г, 500 мкл ацетонитрила, центрифугируют, отбирают супернатант, после чего хроматографируют исследуемый и калибровочный образцы в условиях градиентного элюирования с использованием колонки Tsunami C18 Pharm при скорости потока 1,2 мл/мин, объеме инжекции 80 мкл, длине волны детектирования 241 нм при общем времени анализа 18 минут; определение содержания амиодарона в образце плазмы крови пациента проводят с помощью построения калибровочной кривой в диапазоне концентраций от 40% до 200% от концентрации амиодарона 0,0125 мг/мл.