СПОСОБ ПОВЕРХНОСТНОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ ЭКСПЛАНТОВ ОСИНЫ IN VITRO Российский патент 2018 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к культивированию тканей и органов растений, и может быть использовано в лесном хозяйстве для повышения эффективности клонального микроразмножения хозяйственно-ценных форм осины с целью массового получения посадочного материала и сохранения генофонда ценных и редких сортов и гибридов.

Известны работы по получению асептических культур осины, включающие, обработку хлорсодержащими агентами (хлорамин [1], гипохлорит натрия [2]) и дезинфицирующими средствами на их основе, а также ртутьсодержащими веществами (сулема [3, 4], нитрат ртути [5]). К числу недостатков использования указанных способов относятся низкая эффективность стерилизации тканей взрослых сильно инфицированных деревьев и высокая токсичность ртутьсодержащих средств.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является «Способ выращивания посадочного материала» (Патент России №2485755) [6], в котором отрезки изолированных в июне неодревесневших побегов тополя подвергают поэтапной стерилизации: 2% раствором «Domestos» в течение 15 минут с последующей промывкой в проточной водопроводной воде, в асептических условиях (в условиях ламинар-бокса) 0,025% раствором мертиолята в сочетании с жидким дезинфицирующим раствором "Белизна" (7% раствор) и средством «Твин» (0,08…0,12%) в течение 15 мин, с последующей 5-кратной промывкой стерильной дистиллированной водой.

Недостатком данного способа (прототипа) является использование мертиолята - высокотоксичного ртутьсодержащего соединения (I класс опасности), оказывающего мутагенное и канцерогенное действие.

Задача изобретения - обеспечение безопасного для здоровья исследователей и при этом эффективного способа стерилизации первичных эксплантов при введении в культуру in vitro сильно инфицированных тканей и органов взрослых древесных растений.

Технический результат достигается путем использования в качестве основного стерилизатора средства «Аламинол», действующим веществом которого является алкилдиметилбензиламмония хлорид - низкотоксичное соединение, относящееся к IV классу малоопасных веществ при нанесении на кожу и при ингаляционном воздействии. «Аламинол» применяется для дезинфекции помещений, поверхностей, мебели, а также инструментов, предметов, оборудования медицинского назначения при инфекциях бактериальной, вирусной, грибковой этиологии. Однако случаи использования «Аламинол» для стерилизации растительного материала in vitro неизвестны.

Новым в предложенном способе является то, что «Аламинол» впервые применяется в качестве стерилизатора в культуре тканей растений.

Способ реализуется следующим образом:

1. Заготовленные в марте - апреле месяце одревесневшие побеги взрослых деревьев осины помещают в лабораторных условиях в сосуды с водой и в течение 1-3 недель выгоняют из них молодые растущие побеги.

2. Молодые побеги размером 3-5 см выдерживают в проточной воде в течение 15-20 мин, а затем в нестерильных условиях проводят предварительную стерилизацию 2% раствором средства «Domestos» в течение 8 мин с последующим промыванием в проточной воде 15-20 мин;

3. Основную стерилизацию побегов осуществляют в условиях ламинар-бокса» 10% раствором дезинфицирующего средства «Аламинол» (действующее вещество - алкилдиметилбензиламмония хлорид) в течение 10 мин с последующей 3х кратной промывкой стерильной дистиллированной водой.

4. Простерилизованные побеги в стерильных чашках Петри разрезают на экспланты размером 1,5-2 см с одной - двумя пазушными почками и помещают на питательные среды, содержащие 1/2 концентрации макросолей Woody Plant Medium (WPM), полный состав микросолей, витаминов и органических добавок среды WPM, 20 мг/л сахарозы, 0,2-0,5 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП). Эффективность стерилизации оценивается долей асептических жизнеспособных культур от общего числа исходных эксплантов, учет проводится через 4 недели.

В таблицах 1-2 представлена эффективность различных режимов стерилизации побегов осины.

Как следует из приведенных данных, наиболее эффективным является способ стерилизации эксплантов, полученных выгонкой в лабораторных условиях в марте-апреле, включающий предварительную стерилизацию 2% раствором «Domestos» в течение 8 мин и основную стерилизацию 10% раствором «Аламинол» в течение 10 мин, позволивший получить до 90% асептических жизнеспособных культур (фиг. 1).

Таким образом, способ получения асептических жизнеспособных культур осины в условиях in vitro отличается эффективной обработкой эксплантов, более безопасен для здоровья исследователей по сравнению с ранее применяемыми способами. Способ позволяет получить достаточное количество жизнеспособных стерильных культур для их последующего клонального микроразмножения и массового получения посадочного материала, сохранения представителей ценного генофонда в коллекциях in vitro.

Источники информации:

1. Авторское свидетельство №1581741 А1, Способ микроклонального размножения гибридов осины // Байбурина Р.К. [и др.]. - 4472702/31-13, заяв. 10.08.1988, опуб. 30.07.1990., Бюл. №28. - 5 с.

2. Зонтиков Д.Н. и др. Оценка способа стерилизации и минерального состава питательных сред на эффективность культивирования Populus tremula L. в условиях in vitro. Научный журнал КубГАУ. №91(07). 2013.

3. Королева Ю.А. Микроклональное размножение видов рода Populus / Ю.А. Королева [и др.] // Вестник Удмуртского Университета. 2012. Вып. 3. С. 50-54.

4. Исхакова Д.Я. Экспериментальный морфогенез в культуре ткани осины триплоидной (Populus tremula L.) // Вестник КазНУ. 2014. №1/2 (60). С. 364-366.

5. Гарипов Н.Р. "Отбор и выращивание триплоидной осины (Populus tremula L.) с применением методов молекулярной генетики и биотехнологии в Республике Татарстан": дис. … канд. с.-х. наук. Пушкино, 2014. 128 с.

6. Патент РФ №2485755 С1,. Способ выращивания посадочного материала // Сиволапов А.И. [и др.]. - 2011143443/13, заяв. 28.10.2011, опуб. 27.06.2013., Бюл. №18. - 3 с.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ стерилизации эксплантов осины in vitro, включающий заготовку одревесневших побегов взрослых деревьев в марте-апреле, выгонку молодых растущих побегов, их поэтапную экспозицию в хлорсодержащих агентах, таких как 2% раствор «Domestos» в течение 8 минут и 10% раствор «Аламинол» в течение 10 минут. Изобретение позволяет получить высокую долю асептических жизнеспособных культур до 90%. 1 ил., 2 табл.

Способ стерилизации эксплантов осины in vitro, включающий заготовку одревесневших побегов взрослых деревьев в марте-апреле, выгонку молодых растущих побегов, их поэтапную экспозицию в хлорсодержащих агентах, таких как 2% раствор «Domestos» в течение 8 минут и 10% раствор «Аламинол» в течение 10 минут.