Способ клонального микроразмножения тополя корейского (Populus koreana Render) Российский патент 2019 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии древесных растений, лесному хозяйству и плантационному выращиванию древесных видов, в частности к выращиванию тополя корейского (Populus koreana Render).

Тополь корейский – одна из быстрорастущих древесных пород Дальнего Востока. Высота дерева может достигать 30-35 м, а диаметр 1,5 м. Эта древесная порода - перспективный вид для создания в будущем быстрорастущих промышленных плантаций тополя на Дальнем Востоке России.

Известен способ выращивания посадочного материала для древесных пород, который включает заготовку побегов, их стерилизацию, индукцию развития основного пазушного побега на первичных эксплантах. Укоренение изолированных побегов, их мультипликацию в условиях in vitro. Перевод побегов в нестерильные условия и высадку в почву. Микрочеренкование осуществляют на питательной среде WPM - Woody Plant Medium, со сниженным содержанием БАП - бензиламинопурин 0,2 мг/л и добавлением ГК - гиббереллиновой кислоты 0,2 мг/л. Высадку пробирочных микрорастений в нестерильные условия проводят без их предварительной адаптации к условиям климатической камеры (Патент РФ № 2485755, МПК A01G 1/00, опубл. 27.06.2013).

Однако условия выращивания посадочного материала, используемые в данном способе не применимы для клонального микроразмножения тополя корейского.

Существуют методики клонального микроразмножения хозяйственно-ценных форм тополя, осины, березы (Рекомендации по сохранению и воспроизведению методами биотехнологии ценных генотипов карельской березы, осины и тополя белого и сереющего, составители: Машкина О.С., Табацкая Т.М., изд-во НИИЛГ Воронеж, 2005, 30 с.[1]; Шабанова Е.А. и Машкина О.С., Клональное микроразмножение хозяйственно-ценных форм тополя, Лесная генетика, 2015, № 4, с. 74-81,[2]).

Регенерация растений, согласно рекомендациям, осуществляется авторами (Машкина, Табацкая, 2005 [1]) на основе пролиферации пазушных меристем (прямой выгонки пазушных побегов), их укоренения и мультипликации полученных микрорастений, т.е. с помощью модели размножения, исключающей этап каллусообразования. При этом в качестве эксплантов используют узловые сегменты активно растущих летних не одревесневших побегов, которые заготавливают в июле.

В работе [2] авторами были изучено клональное микроразмножение 7 хозяйственно-ценных форм тополя, однако среди изученных форм не присутствовал тополь корейский (Populus koreana Render). Известная методика включала стерилизацию, культивирование по общепринятой методике, регенерацию побегов, элонгацию побегов первичных эксплантов.

К недостаткам известных методик микроклонирования тополя следует отнести следующее:

- заготовку летних побегов тополя, что недопустимо для тополя корейского, поскольку только побеги, полученные в лабораторных условиях весной (путем культивирования из покоящихся почек) оказываются менее инфицированными;

- использование простого способа стерилизации (Машкина, Табацкая, 2005, [1]) применение которого не обеспечивает получение стерильных эксплантов тополя корейского, поскольку для данного вида характерна высокая зараженность поверхностной и внутренней инфекцией;

- применение безгормональных сред (Шабанова, Машкина, 2015, [2]) для выращивания побегов и их укоренения ведет к образованию слаборазвитой корневой системы, что в результате, не позволяет получить большого количества хорошо развитых регенерантов;

- регенерация растений путем пролиферации пазушных меристем позволяет сохранить свойства исходного растения в виде клонов, которые подвергают черенкованию и укоренению. Поскольку в этих методах размножения (Шабанова, Машкина, 2015, [2]) исключен этап каллусообразования, получить большое количество разнородных по изменчивости регенерантов не представляется возможным.

Наиболее близким по количеству существенных признаков и достигаемому результату к заявляемому техническому решению является способ клонального микроразмножения тополя, включающий несколько этапов: заготовку веток, выгонку молодых побегов из почек, отбор экспланта, промывку водой, стерилизацию в ламинарном боксе, посадку стерилизованных эксплантов на питательную среду, культивирование побегов, с последующими размножением, удлинением, укоренением и адаптацией к почвогрунту культивированных растений, выращивание клонов и селекционный отбор на скорость роста. В качестве экспериментального материала использовали ветви трехлетних растений тополя (Рopulus х berolinensis Dipp), их нарезали в конце марта и культивировали в лабораторных условиях до появления молодых побегов из почек. Полученные побеги с листовыми пластинками промывали с 0,1% раствором Твина-80 в проточной воде в течение 30 мин и затем растительный материал стерилизовали в несколько этапов в ламинарном боксе:

1.70% этанолом – 1 мин;

2. промывка стерильной водой;

3. 1% раствором NaOCl +1 капля Твин -20 в течение 15 мин;

4. промывание в стерильной воде 3 раза по 3 мин.

Для индукция развития побегов на эксплантах брали часть побега длиной 5 мм из черешка и стебля (без пазушных и верхушечных почек), а также часть листовой пластинки размером 5 х 5 мм. Эти экспланты помещали в плаcтиковые бутылочки «Sarstedt» c 10 мл питательной среды, которая способствовала индукции регенерантов, состояла из среды состава: ½ MS (с половинным содержанием макроэлементов) (Murashige T and Skoog F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant, 1962, v.15, № 3, р. 473-497), ммикроэлементы среда MS, а также тиамина – НCl 1 мг/л, пиридоксина - НCl 0,5 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, DEDTC – Na- диэтилдитиокарбамата 5 мг/л, сахарозы 20000 мг/л и гормоны: 0,02 мг/л TDZ тридиазурона, 0,2 мг/л ВА (N ⁶ бензиламинопурина), 0,01 мг /л и NAA (нафтолаленацетиновая кислота), а также агара 7000 мг/л. Пузырьки с эксплантами культивируют в ростовой комнате при температуре 23⁰С с освещением в течение 16 часов флюоресцентными лампами.

После 2-3 субкультур, длившихся 25-30 дней каждая, регенеранты (экспланты) переносили в баночки из под детского питания (объем 200 мл) с полипропиленовыми крышками (Sigma-Aldrich) и 30 мл среды для размножения регенерантов на той же среде ½ MS, но с другими гормонами: ВА (N ⁶ бензиламинопурина) - 0,5 мг/л и 0,1 мг/л IBA (3–индолилмасляная кислота). Последующее размножение и удлинение побегов тополя проводили на среде ½ MS, при этом использовали гормон роста кинетин в концентрации 0,1 мг/л.

Укоренение побегов и адаптацию культивируемых растений к грунту вели следующим образом: удлиненные до 2-3 см растения переносили в сосуды объемом 25х150 мм для укоренения, содержащей ту же среду ½ МS, и содержащей следующие гормоны: 0,1 мг/л кинетина и 0,25 мг/л IBA (3-индолил масляная кислота).

Растения культивировали 4 дня в темноте при 23⁰С, а затем при флюоресцентном освещении 20-25 дней. Последующее сохранение и размножение побегов осуществляли двумя способами: верхушечные сегменты по 2-3 см отсекали и укореняли, оставшуюся часть культивировали до появления побегов из пазушной почки до размеров 2-3 см. Затем их снова отделяли, растили и укореняли. Растения с удаленными верхушками продолжали культивировать до появления новых побегов из пазушных почек размером до 2-3 см. Затем их отделяли, укореняли и растили.

Укорененные всходы переносили в пластиковые контейнеры с субстратом, состоящим из почвы смешанной с песком и вермикулитом, с минеральными удобрениями и доращивали клоны в теплице. Первые 10-12 дней поверхность сосудов покрывали пленкой, чтобы избежать сильной транспирации. Из подросших растений путем селекционного отбора брали подходящие растения для дальнейшего размножения (Gamburg K.Z., VoinikovV.K. Somaclonal variation as a mean for obtaining regenerants with different growth rates in poplar (Populus x berolinesis Dipp.) / Natural Science, 2013, Vol. 5, № 5, P.1-9).

Однако данный способ разработан только для гибридного вида тополя, требующего более высоких трудозатрат при выращивании регенерантов, пригодных для плантационного выращивания и не подходит для дальневосточных видов тополей. Более того, методика стерилизации не обеспечивает достаточную степень стерильности эксплантов, а также при выращивании и размножении использована среда с минимальным содержанием основных аминокислот и витаминов, она также предусматривает использовать низкое содержание гормона TDZ тидиазурона (0,02 мг/л), что не обеспечивает активного процесса каллусобразования и массового побегообразования у тополя корейского.

Таким образом, анализ литературных источников по клональному размножению видов Populus позволяет сделать вывод, что для его различных форм и даже генотипов необходимы специфические условия для индукции, регенерации побегов, их доращивания, укоренения и адаптации к почвенным условиям.

Техническая проблема, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, решается путем разработки мало затратного, ускоренного метода получения большого количества регенерантов тополя корейского, различающихся по скорости роста, за счет проявления сомаклональной изменчивости растений при культивировании in vitro, а также за счет наиболее эффективных условий инициации, развития и укоренения побегов при микроразмножении тополя корейского.

Поставленная техническая проблема решается известным способом микроразмножения эксплантов тополя, включающим заготовку веток, выгонку молодых побегов из почек, отбор экспланта, промывку водой, стерилизацию в ламинарном боксе, посадку стерилизованных эксплантов на питательную среду, культивирование эксплантов, с последующими размножением, удлинением, укоренением и адаптацией к почвогрунту культивированных растений, выращивание клонов и селекционный отбор на скорость роста, в котором согласно изобретению, в качестве экспланта используют среднюю часть зеленого побега плюсового дерева тополя корейского (Populus koreana Render) мужского генотипа с пазушной почкой листа. Перед стерилизацией в ламинарном боксе дополнительно ведут поверхностную стерилизацию в нестерильных условиях, для чего сначала побеги промывают в проточной воде 30 мин, затем помещают в 1% раствор с Твин - 80 не менее чем на 20 мин, после чего отмывают побеги в проточной водопроводной воде не менее 10 мин, затем их помещают в 2% раствор хлорсодержащего «Доместоса» не менее чем на 20 мин, с последующим промыванием 5 раз (по 2 мин) в дистиллированной воде. А основную стерилизацию в ламинарном боксе ведут не более 10 сек в растворе 70% этилового спирта, после чего побеги промывают не более 5 раз (по 2 мин) стерильной водой, затем подготовленные побеги помещают в 0,1% раствор диацида на 3-5 мин, после чего с побегов удаляют раствор диацида, промывая побеги не менее 5 раз стерильной водой в течение 2 мин, затем помещают отмытые побеги в 0,66 % раствор цефотаксима на 30 мин.

В качестве питательной среды для активации пазушной меристемы и побегообразования используют питательную среду ½ MS, в которую вводят: инозитол 100 мг/л, глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, тиамин-НCl 1,0 мг/л, пиридоксин-НCl 0,5 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, сахарозы 20000 мг/л, агара 7000 мг/л, цефотаксима 800 мг/л и следующие гормоны: тидиазурон 0,05-0,1 мг/л (TDZ), N⁶-бензиламинопурин 0,2 мг/л (BA) и нафтолаленацетиновая кислота 0,01 мг /л, культивируют экспланты на этой питательной среде для активации пазушной меристемы и роста побегов в течение 15-20 дней при температуре 25⁰С и освещении люминесцентными лампами в течение 16 ч, с пересадкой побегов на ту же питательную среду 2-3 раза через каждые 15-20 дней. и культивированием при тех же условиях.

Размножение культивированных эксплантов с тронувшейся в рост почкой, ведут на питательной среде для размножения эксплантов, приготовленную на основе питательной среды ½ MS, в которую вводят: инозитол 100 мг/л, глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, тиамин-НCl 1,0 мг/л, пиридоксин-НCl 0,5 мг/л, никотиновая кислота 0,5 мг/л, аскорбиновая кислота 1 мг/л, сахароза 20000 мг/л, агар 7000 мг/л, цефотаксим 600 мг/л а также гормоны: BA 0,4 - 0,6 мг/л и 3-индолил масляной кислоты 0,1 мг/л, культивируют в течение 15-20 дней при температуре 25⁰С и 16-ти часовом освещении люминесцентными

Появившиеся побеги размером 1-2 см пересаживают на питательную среду для роста и удлинения побегов, приготовленную на основе питательной среде ½ MS, в которую вводят инозитол 100 мг/л, глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, тиамин-НCl 1,0 мг/л, пиридоксин-НCl 0,5 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, сахарозу 20000 мг/л, агар 7000 мг/л и цефотаксим 400 мг/л и гормон для роста побегов кинетин в количестве 0,1 мг/л и культивируют в течение 15-20 дней при 25⁰С и 16-ти часовом освещении люминесцентными лампами.

Дальнейшее увеличение числа побегов осуществляют путем переноса основного конгломерата каллуса с зачатками побегов на среду для размножения и культивируют в течение 15-20 дней при температуре 25⁰С и освещении люминесцентными лампами в течение 16 ч, новые побеги пересаживают на среду для роста и удлинения побегов в те же условия культивирования, культивируют до высоты побегов до 3-4 см, затем их разделяют в ламинарном боксе. Все побеги, полученные побеги как после первого, так и повторного культивирования сажают на питательную среду для укоренения.

Питательную среду для укоренения готовят на основе среды ½ MS, содержащей: глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, тиамин-НCl 1,0 мг/л, пиридоксин-НCl 0,5 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, инозитол 100 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, сахарозу 10000 мг/л, агар 7000 мг/л и цефатоксим 400 мг/л и гормоны: кинетин 0,1 мг/л и 3-индолил масляной кислоты в концентрациях 0,25-0,5 мг/л. Побеги культивируют в темном помещении при комнатной температуре в течение 5 дней, а затем при температуре 25⁰С и 16-ти часовом люминесцентном освещении 15-20 дней, после чего укоренившиеся побеги для адаптации к почвенному грунту пересаживают в стерилизованный субстрат, состоящий из равных частей песка, вермикулита и лесной почвы, обильно поливают дистиллированной водой и прикрывают сосуды пищевой пленкой для сохранения влажности субстрата. Адаптацию ведут при комнатной температуре в течение 10-15 дней, затем сосуды открывают и продолжают выращивать растения до высоты 15-30 см. Подросшие растения вместе с субстратом, не нарушая корневую систему, переносят в контейнер большего объема, содержащий смесь песка и лесной почвы в соотношении 1:1. Выращивание растений продолжают при обычном освещении в условиях теплицы. Подкормку растений проводят каждые 10 дней удобрениями (cмесью солей азота, фосфора и калия). На этапе выращивания в почвенном субстрате активно проявляется сомаклональная изменчивость растений тополя.

Использование в качестве экспланта средней части зеленого побега плюсового дерева тополя корейского (Populus koreana Render) мужского генотипа с пазушной почкой листа обеспечивает активный рост пазушной меристемы и ускоренное появление побега. Следует отметить, что ранее отбора плюсовых деревьев и селекции на скорость роста не проводилось. Кроме того, размножение плюсового дерева мужского генотипа тополя корейского исключает нежелательное цветение взрослых растений, как источника аллергических реакций, а также дает регенеранты с хорошими ростовыми признаками.

Введение дополнительной поверхностной стерилизации в нестерильных условиях, включающих сначала промывку побегов водопроводной проточной водой 30 мин, затем помещение в 1% раствор с Твин - 80 не менее чем на 20 мин, отмывку побегов дистиллированной водой не менее 10 мин, с последующим их помещением в 2% раствор хлорсодержащего «Доместоса» не менее чем на 20 мин и промыванием 5 раз (по 2 мин.) дистиллированной водой позволяет избавиться от поверхностной инфекции и получить большее количество стерильных эксплантов. Обработка Твин - 80 и «Доместосом» менее 20 мин не позволяет полностью освободиться от поверхностной инфекции, а промывка побегов между этими обработками менее 10 мин не обеспечивает полное освобождение от поверхностно-активного вещества Твин – 80.

Проведение основной стерилизации в ламинарном боксе не более 10 сек в растворе 70% этилового спирта, промывкой побегов не более 5 раз (по 2 мин.) стерильной водой с последующей обработкой побегов раствором диацида в концентрации не выше 0,1 % и в течение 3-5 мин., удалением раствора диацида с побегов, промыванием побегов не менее 5 раз по 2 мин, стерильной водой и помещением побегов в 0,66 % раствор цефотаксима на 30 мин позволяет получить максимальное количество живых стерилизованных эксплантов.

Экспериментальная обработка побегов раствором диацида в концентрациях 0,15 - 0,2% в течение 3 мин приводит к ожогу и гибели эксплантов. В тоже время, обработка эксплантов раствором диацида в концентрации не выше 0,1 % в течение 5 мин обеспечивает получение максимального количества (94%) живых эксплантов. А увеличение времени обработки раствором 0,1% диацида более 5 мин приводит к почернению и гибели тканей эксплантов. Проведение стерилизации побегов в два этапа (поверхностная и основная) позволяет избавиться от большей части бактериальных и грибковых инфекций, характерных для дальневосточного тополя.

Использование в качестве питательной среды для индукции пазушной меристемы и роста побегов питательной среды ½ MS, в которую дополнительно, по сравнению с прототипом, вводят глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, инозитол 100 мг/л, тиамин 1мг/л, пиридоксин Н-Cl -0,5 мг/л, сахарозу 20000 мг/л, агар 7000 мг/л, цефотаксим 800 мг/л и гормоны: тидиазурон 0,05-0,1мг/л, BA 0,2 мг/л, нафтолаленоцетиновой кислоты 0,01 мг /л. Применение смеси гормонов, например в прототипе, в соотношении (TDZ 0,02 мг/л, BA 0,2 мг/л, нафтолаленоцетиновой кислоты 0,01 мг/л) позволяет получить только у 62 % эксплантов индукцию пазушной меристемы и появление каллуса. Увеличение же концентрации TDZ в среде до 0,05 мг/л позволяет добиться положительного эффекта у 89% эксплантов. При увеличении концентрации TDZ до 0,1 мг/л рост пазушной меристемы и каллуса наблюдали у 72% эксплантов. Поэтому повышение в среде концентрации TDZ свыше 0,1 мг/л нецелесообрано из-за высокой стоимости реактива. Заявленные концентрации гормонов способствуют сначала ускоренному (через 8-10 дней) отрастанию пазушной почки, затем появлению побега и нарастанию каллусной массы, за счет совместного применения 3-х гормонов.

Размножение культивированных эксплантов с тронувшейся в рост почкой, ведут на питательной среде для размножения регенерантов, приготовленной на основе питательной среды ½ MS, в которую вводят: глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, а также аскорбиновую кислоту 1 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л тиамин 1мг/л, пиридоксин Н-Cl -0,5 мг/л, инозитол 100 мг/л, сахарозу 20000 мг/л, агар 7000 мг/л, цефотаксим 600 мг/л. и гормоны: BA 0,4-0,6 мг/л, 3-индолил масляной кислоты 0,1 мг/л. Предлагаемая питательная среда обеспечивает длительное появление множественных побегов на образующемся конгломерате каллусной массы. Дополнительное увеличение числа побегов осуществляют путем переноса конгломерата каллуса с зачатками побегов повторно на среду для размножения и культивируют при температуре 25⁰С и освещении люминесцентными лампами в течение 16 ч.

Использование BA в концентрации ниже 0,4 мг/л не обеспечивает образования множественных побегов, а повышение концентрации более 0,6 мг/л нецелесообразно, поскольку приводит к излишним затратам на приобретение дорогостоящего реактива.

Введение в среду для размножения дополнительно аминокислоты глютамина, а также аскорбиновой кислоты, по сравнению с прототипом, в присутствии 3-индолил масляной кислоты способствовало более активному росту побегов. При этом аскорбиновая кислота действует в качестве антиоксиданта соединений, выделяемых тополем в среду в процессе культивирования.

Применение для роста и удлинения размноженных эксплантов питательной среды для роста и удлинения побегов, приготовленной на основе питательной среде ½ MS, которая содержит глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, тиамин Н-Cl 1мг/л, пиридоксин Н-Cl 0,5 мг/л, инозитол 100 мг/л, сахарозу 20000 мг/л, агар 7000 мг/л, цефотаксим 400 мг/л и ростовой гормон - кинетин 0,1 мг/л.

В отличие от среды прототипа, в предложенной среде присутствует важная аминокислота - глютамин и витамины (никотиновая и аскорбиновая кислоты), все эти компоненты способствуют ускорению ростовых процессов при культивировании регенерантов. В данной среде уменьшена концентрация цефотаксима до 400 мг/л. Уменьшение цефотаксима до минимальной концентрации на данном этапе культивирования считается возможным, поскольку эта среда не позволяет развиваться внутренней бактериальной инфекции, которая долго сохраняется в тканях экспланта. Культивирование на данной среде с использованием кинетина в течение 15-20 дней обеспечивает активный рост и удлинение побегов тополя до 3-4 см.

Для укоренения побегов используют питательную среду, приготовленную на основе ½ MS среду, которая дополнена компонентами: глицином 2 мг/л, глютамином 20 мг/л, никотиновой 0,5 мг/л и аскорбиновой кислотой 1 мг/л, а также содержит тиамин Н-Cl 1мг/л, пиридоксин Н-Cl 0,5 мг/л, инозитол 100 мг/л, сахарозу 10000 мг/л, агар 7000 мг/л, цефотаксим 400 мг/л и гормоны: кинетин 0,1 мг/л и 3-индолил масляную кислоту в концентрациях 0,25-0,5 мг/л. Данная среда способствует активному корнеобразованию, что позволяет получить большое количество регенерантов тополя корейского.

Использование в среде концентрации 3-индолил масляной кислоты в количестве менее 0,25 мг/л не приводит к достаточному корнеобразованию, а увеличение концентрации 3-индолил масляной кислоты выше 0,5 мг/л нецелесообразно, поскольку уже в заявленных интервалах идет активное укоренение от 82 до 91% побегов. Уменьшение в 2 раза содержания в среде сахарозы, также положительно влияло на активизацию процесса ризогенеза.

Для достижения заявленного результата культивирование побегов для получения регенерантов тополя корейского целесообразно вести в темном помещении при комнатной температуре в течение 5 дней, а затем культивировать при 25⁰С и 16-ти часовом люминесцентном освещении в течение 15-20 дней.

Включение цефотаксима (от 800 до 400 мг/л) при культивировании тополя корейского в состав питательных сред: для индукции пазушной меристемы и побегообразования, размножения эксплантов, роста и удлинения побегов и укоренения побегов, препятствует развитию внутренней бактериальной инфекции. В питательных средах без антибиотика, например, активное развитие внутренней бактериальной инфекции наблюдается на 5-10 день культивирования. Применение антибиотика в заявленных средах позволяет получить стерильные растения тополя, лишенные внешней и внутренней инфекции, которая замедляет активный рост и развитие растений.

Применение выше перечисленных модифицированных, по сравнению с прототипом, сред для индукции пазушных меристем эксплантов, побегообразования, мультипликации, роста и укоренения побегов позволяет получить большее количество стерильных растений тополя корейского, различающихся по скорости роста. Проявление сомаклональной изменчивости во время культивирования растений тополя in vitro позволяет провести отбор уникальных особей с высокой скоростью роста для дальнейшего их размножения в практических целях.

Изобретение иллюстрируется следующими таблицами: табл. 1 - Состав сред для культивирования эксплантов тополя корейского, табл. 2 - Изменение высоты растений тополя корейского в результате сомаклональной изменчивости при культивировании in vitro».

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения регенерантов тополя корейского в начале марта 1-2 летние одревесневшие ветки нарезают с плюсового дерева тополя корейского мужского генотипа. Выгонку молодых побегов проводят путем выращивания ветвей тополя в водном растворе в лабораторных условиях при температуре 25⁰С. Через 2 месяца молодые побеги достигают длины 10-15 см и формируют по 3-5 листьев.

Пример 1

В качестве эксплантов используют среднюю часть зеленого побега длиной 1,5-2 см (без верхней его части и без листьев) с пазушной почкой у основания листа. На первом этапе поверхностную стерилизацию молодых побегов проводят в нестерильных условиях. Сначала их промывают в проточной водопроводной воде 30 мин, затем помещают в 1% раствор Твин - 80 на 25 мин, после чего отмывают растения в дистиллированной воде 10 мин, затем помещают в 2% раствор хлорсодержащего «Доместоса» на 20 мин, с последующим промыванием 5 раз (по 2 мин.) в дистиллированной воде. Далее приступают к основной стерилизации в ламинарном боксе, для чего промытые экспланты обрабатывают в течение 10 сек. раствором 70% этилового спирта, затем побеги промывают 5 раз (по 2 мин.) стерильной водой, после чего побеги стерилизуют в течение 3 мин в 0,1 % растворе диацида. Стерилизованные побеги отмывают от раствора диацида, промывая их 5 раз (по 2 мин.) стерильной водой. На последнем этапе стерилизации побеги погружают в 0,66 % раствор цефотаксима на 30 мин. Стерилизованные экспланты используют для дальнейшего культивирования.

Питательную среду для активации пазушной меристемы и роста побега готовят на основе макро и микросолей среды ½ MS, (см табл. 1), в которую вводят следующие компоненты: глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, никотиновую кислоту 1 мг/л, тиамин H-Cl 1мг/л, пиридоксин H-Cl 0,5 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, инозитол 100 мг/л, сахарозу 20000 мг/л, агар 7000 мг/л, цефотаксим в количестве 800 мг/л. Среду дополняют гормонами: тидиазуроном в концентрации 0,1 мг/л, N⁶-бензиламинопурином - 0,2 мг/л и нафтолаленоцетиновой кислотой в количестве 0,01 мг /л. Экспланты помещают в лабораторные пробирки в вертикальном положении и культивируют, проводя 3 пассажа в течение 15 дней каждый, при температуре 25⁰С и 16-ти часовом освещении люминесцентными лампами.

По мере увеличения размера побегов их переносят в круглодонные колбы объемом 100 мл для размножения. Размножение культивируемых эксплантов ведут на питательной среде для размножения эксплантов (табл. 1), приготовленной на основе питательной среде ½ MS, в состав которой вводят: глицина 2 мг/л, глютамина 20 мг/л, тиамина H-Cl 1мг/л, пиридоксина H-Cl 0,5 мг/л, аскорбиновой кислоты 1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, инозитола 100 мг/л, сахарозы 20000 мг/л, агара 7000 мг/л, цефотаксима в количестве 600 мг/л, а также гормоны - N⁶-бензиламинопурин 0,6 мг/л и 3-индолил масляную кислоту 0,1 мг/л. В результате культивирования на этой среде в течение 20 дней при температуре 25⁰С и 16-ти часовом искусственном освещении на конгломерате каллуса происходит появление множественных побегов тополя.

Образовавшиеся побеги высотой 1-2 см переносят в питательную среду для роста и удлинения побегов (табл. 1), приготовленную на основе питательной среды ½ MS, в которую вводят: глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, тиамин H-Cl 1мг/л, пиридоксин H-Cl 0,5 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, никотиновую кислоту 1 мг/л, инозитол 100 мг/л, сахарозы 20000 мг/л, агар 7000 мг/л, цефотаксим 400 мг/л и кинетин в концентрации 0,1 мг/л. Побеги на этой среде культивируют в течение 15 дней при температуре 25⁰С и 16-ти часовом освещении люминесцентными лампами. Растения хорошо развиваются под действием кинетина и значительно увеличиваются в размерах.

Для дальнейшего увеличение числа микропобегов оставшийся конгломерат каллуса с зачатками побегов переносят повторно на среду для размножения в те же условия культивирования, а затем, появившиеся новые побеги, переносят на среду для роста и удлинения и культивируют в течение 15 дней при температуре 25⁰С и 16-ти часовом люминесцентном освещении

Все побеги, достигшие размеров 3-4 см, разделяют в ламинарном боксе и высаживают на среду для укоренения (табл.1). Эту среду готовят на основе питательной среды ½ MS, в которую вводят компоненты: глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, тиамин H-Cl 1мг/л, пиридоксин H-Cl 0,5 мг/л, никотиновую кислоту 1 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, инозитол 100 мг/л, сахарозу 10000 мг/л, агар 7000 мг/л, цефотаксим 400 мг/л, кинетин 0,1 мг/л и 3-индолил масляную кислоту в количестве 0,25 мг/л. Культивируют побеги в темном помещении при комнатной температуре в течение 5 дней, а затем выращивают 15 дней при температуре 25⁰С и 16 часовом люминесцентном освещении.

Укоренившиеся побеги постепенно адаптируют к почвенным условиям. Для этого корни растений тополя тщательно очищают от агара, промывают в стерильной воде, а затем высаживают в пластиковые сосуды на стерилизованный субстрат, состоящий из равных частей песка, вермикулита и лесной почвы, при этом обильно поливают дистиллированной водой и прикрывают сосуд пищевой пленкой для сохранения высокой влажности. Адаптацию ведут при обычном освещении при комнатной температуре в течение 10 дней, затем сосуд открывают и продолжают выращивать растения до высоты 15-30 см в лабораторных условиях. Подросшие растения вместе с субстратом (не нарушая корневую систему) пересаживают в контейнер большего объема, содержащий смесь песка и лесной почвы в соотношении 1:1. Выращивание растений продолжают при обычном освещении в условиях теплицы. Подкормку растений проводят каждые 10 дней удобрениями (cмесью солей азота, фосфора и калия). На этапе выращивания в почвенном субстрате активно проявляется сомаклональная изменчивость растений тополя.

В результате микроразмножения эксплантов за короткий период времени (от 12 до 14 месяцев) получают стерильные растения тополя корейского, которые различаются по высоте и скорости роста, в результате проявления самоклональной изменчивости растений при их культивировании in vitro (табл. 2) Это позволяет провести селекционный отбор на скорость роста растений еще при выращивании в теплице.

Пример № 2

В качестве эксплантов используют среднюю часть зеленого побега длиной 1,5-2 см без верхней его части и без листьев, но с пазушной почкой у основания листа. На первом этапе поверхностную стерилизацию молодых побегов сначала проводят в нестерильных условиях. Промывают побеги в проточной водопроводной воде 30 мин, затем помещают в 1% раствор Твин - 80 на 20 мин, после чего отмывают побеги в дистиллированной воде в течение 12 мин, затем помещают в 2% раствор хлорсодержащего «Доместоса» на 25 мин, с последующим промыванием 5 раз (по 2 мин) в дистиллированной воде.

Основная стерилизация проходит в ламинарном боксе: сначала в течение 8 сек обрабатывают 70%-ым раствором этилового спирта, после чего побеги промывают 5 раз стерильной водой в течение 10 мин (время каждой промывки 2 мин). Промытые побеги выдерживают в течение 5 мин. в 0,1 % растворе диацида. Затем диацид с побегов удаляют, промывая их 5 раз (по 2 мин.) стерильной водой. На последнем этапе стерилизации побеги погружают в 0,66 % раствор цефатоксима на 30 мин. Стерилизованные побеги используют для дальнейшего культивирования.

Питательную среду для активации пазушной меристемы и роста побега готовят на основе макро и микросолей среды ½ MS, (табл. 1) в которую дополнительно вводят следующие компоненты: глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, тиамин H-Cl 1мг/л, пиридоксин H-Cl 0,5 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, инозитол 100 мг/л, сахарозу 20000 мг/л, и агар 7000 мг/л. Среду дополняют гормонами: тидиазуроном в концентрации 0,05 мг/л, N⁶-бензиламинопурином - 0,2 мг/л, нафтолаленоцетиновой кислотой 0,01 мг /л и цефотаксимом в количестве 800 мг/л.

Экспланты сажают на питательную среду в лабораторные пробирки в вертикальном положении и культивируют в течение 20 дней при температуре 25⁰С и 16 часовом освещении люминесцентными лампами. Пересадка на ту же питательную проводится через каждые 20 дней 3 раза. В течение первого пассажа активизация пазушных меристем у отдельных эксплантов наступает на 10-12 день, а первые побеги формируются в течение второго пассажа.

Экспланты с побегами, переносят для размножения в колбы объемом 100 мл. Размножение ведут на питательной среде для размножения эксплантов (табл.1), приготовленной на основе питательной среды ½ MS, в которую вводят следующие компоненты: глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, тиамин H-Cl 1мг/л, пиридоксин H-Cl 0,5 мг/л, инозитол 100 мг/л, сахарозу 20000 мг/л, агар 7000 мг/л, цефотаксим в количестве 600 мг/л и гормоны: N⁶-бензиламинопурин 0,5 мг/л и 3-индолил масляную кислоту 0,1 мг/л и культивируют в течение 15 дней при температуре 25⁰С и 16 часовом освещении люминесцентными лампами. Через 15 дней наблюдается активное появление многочисленных побегов.

Далее побеги перемещают в питательную среду для роста и удлинения (табл. 1), приготовленную на основе питательной среды ½ MS, в которую дополнительно вводят: глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, тиамин H-Cl 1мг/л, пиридоксин H-Cl 0,5 мг/л, инозитол 100 мг/л, сахарозу 20000 мг/л, агар 7000 мг/л, цефотаксим в количестве 400 мг/л и ростовой гормон - кинетин в концентрации 0,1 мг/л. Побеги на этой среде культивируют в течение 20 дней, при температуре 25⁰С и 16 часовом освещении люминесцентными лампами. На данной среде происходит активное развитие растений и их значительное увеличение в размерах.

Для увеличения числа культивируемых побегов осуществляют перенос исходного конгломерата каллуса с зачатками побегов повторно на среду для размножения на 15 дней при температуре 25⁰С и 16 часовом освещении люминесцентными лампами, а затем новые побеги сажают на среду для роста и удлинения.

Все удлиненные побеги высотой 3-4 см отделяют в ламинарном шкафу от конгломерата побегов и высаживают в колбы объемом 100 мл с питательной средой для укоренения побегов (табл. 1). В питательную среду для укоренения побегов вводят макро и микроэлементы питательной среды ½ MS, а также глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, тиамин H-Cl 1мг/л, пиридоксин H-Cl 0,5 мг/л, инозитол 100 мг/л, сахарозу 10000 мг/л, агар 7000 г/л, цефотаксим 400 мг/л, кинетин 0,1 мг/л и 3-индолил масляную кислоту в количестве 0,5 мг/л. Культивируют побеги сначала в темном помещении в течение 5 дней при комнатной температуре, а затем выращивают 20 дней при люминесцентном освещении.

Побеги с развитыми корнями постепенно адаптируют к почвенным условиям. Для этого корни растений тополя сначала очищают от агара, промывая в стерильной воде, а затем высаживают в пластиковые сосуды в стерильный субстрат, состоящий из равных частей песка, вермикулита и лесной почвы. При этом растения обильно поливают дистиллированной водой и прикрывают сосуд пищевой пленкой для сохранения высокой влажности. Адаптацию ведут при обычном освещении при комнатной температуре в течение 15 дней, затем сосуд открывают и продолжают выращивать растения до высоты 15-30 см в лабораторных условиях. Подросшие растения вместе с субстратом пересаживают в контейнер большего объема, содержащий смесь песка и лесной почвы в соотношении 1:1. Выращивание растений продолжают при обычном освещении в условиях теплицы. Каждые 10 дней проводят подкормку растений удобрениями (cмесью солей азота, фосфора, калия).

Проявление среди полученных микроразмножением растений сомаклональной изменчивости позволяет получать большое количество растений с различными ростовыми характеристиками. Одна часть растений отличалась быстрым ростом в высоту, другие растения - развивались медленно. При этом морфологических нарушений в развитии всех полученных микроразмножением растений тополя корейского не отмечено. Варьирование высоты растений тополя представлено в таблице 2. Например, высота растений клона 1/1 изменялась в очень широких пределах от 1,5 до 30 см. У этого клона отмечено появление и самых высоких (от 14 до 30 см), быстрорастущих экземпляров тополя корейского. В среднем высота регенерантов (эксплантов) тополя находилась в пределах от 10 до 20 см. При микроразмножении тополя корейского предложенным методом от 1 экспланта плюсового дерева мужского генотипа было получено от 60 до 267 растений регенерантов. Коэффициент размножения растений равен от 60 до 200.

Предложенный способ микроразмножения тополя корейского имеет ряд практических преимуществ:

- среди растений тополя корейского возможен отбор на скорость роста растений в условиях их еще тепличного выращивания за более короткий срок, по сравнению с проведением селекционного отбора при выращивании в открытом грунте в питомнике;

- цикл получения растений по предложенному методу (от момента обрезки побегов тополя корейского до получения регенерантов, выращенных в горшках с закрытой корневой системой) составляет от 12 до 14 месяцев;

- закрытая корневая система микроразмноженных растений, растущих в горшках, позволяет повысить их приживаемость в полевых условиях;

- полученные размножением in vitro растения тополя корейского не имеют грибных, бактериальных и вирусных инфекций, которыми заражены растущие в природе дальневосточные древесные растения;

- размножение плюсового дерева тополя корейского мужского генотипа исключает в дальнейшем нежелательное цветение взрослых растений, как источника аллергических реакций, а также дает регенеранты с хорошими родительскими признаками;

- отобранные быстрорастущие экземпляры тополя корейского способны размножаться обычным черенкованием, в отличие от трудно размножаемых гибридов и различных сортов тополя.

Таким образом, применяя предложенный способ размножения и отбора, появляется возможность ускоренного получения (в течение 1 года) уникальных, быстрорастущих экземпляров тополя корейского для последующего их размножения с целью создания промышленных плантаций на Российском Дальнем Востоке, не используя дорогостоящие методы гибридизации и генной модификации этого вида.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения тополя корейского, включает: заготовку 1-2 летних побегов, использование в качестве экспланта среднюю часть зеленого побега плюсового дерева тополя корейского (Populus koreana Render) мужского генотипа с пазушной почкой листа, выгонку в лабораторных условиях молодых побегов, их стерилизацию, получение стерильной культуры in vitro, индукцию побегообразования, доращивание побегов, их отделение с последующим корнеобразованием и адаптацией сначала к стерильным почвенным условиям, а затем к обычной почве. Изобретение позволяет получить быстрорастущие экземпляры тополя корейского. 2 табл.

Способ клонального микроразмножения тополя, включающий заготовку веток, выгонку молодых побегов из почек, отбор экспланта, промывку водой, стерилизацию в ламинарном боксе, посадку стерилизованных эксплантов на питательную среду, культивирование эксплантов с последующими размножением, удлинением, укоренением и адаптацией к почвогрунту культивированных эксплантов, выращивание клонов и селекционный отбор на скорость роста, отличающийся тем, что в качестве экспланта используют среднюю часть зеленого побега плюсового дерева тополя корейского (Populus koreana Render) мужского генотипа с пазушной почкой, перед стерилизацией в ламинарном боксе дополнительно ведут поверхностную стерилизацию в нестерильных условиях, для чего сначала побеги промывают в проточной воде 30 мин, затем помещают в 1% раствор с Твин-80 не менее чем на 20 мин, после чего отмывают побеги в дистиллированной воде не менее 10 мин, затем их помещают в 2% раствор хлорсодержащего «Доместоса» не менее чем на 20 мин, с последующим промыванием в дистиллированной воде не более 5 раз, каждый раз в течение 2 мин, а стерилизацию в ламинарном боксе ведут не более 10 сек в растворе 70% этилового спирта, после чего побеги промывают стерильной водой не более 5 раз, каждый раз в течение 2 мин, затем подготовленные побеги помещают в 0,1% раствор диацида не более чем на 5 мин, после чего с побегов удаляют раствор диацида, промывая побеги стерильной водой не менее 5 раз, каждый раз в течение 2 мин, затем отмытые побеги помещают в 0,66 % раствор цефотаксима на 30 мин; в качестве питательной среды для активации пазушной меристемы и побегообразования используют питательную среду ½ MS, в которую дополнительно вводят глицина 2 мг/л, глютамина 20 мг/л, аскорбиновой кислоты 1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, тиамина-HCl 1 мг/л, пиридоксина-HCl 0,5 мг/л, инозитола 100 мг/л, сахарозы 20000 мг/л, агара 7000 мг/л, цефотаксима 800 мг/л и гормоны: тидиазурона 0,05-0,1 мг/л, N⁶-бензиламинопурина 0,2 мг/л, нафтолаленацетиновой кислоты 0,01 мг/л, и культивируют экспланты на этой питательной среде в течение 15-20 дней при 25^°С и 16-часовом освещении люминесцентными лампами, с пересадкой на ту же питательную среду 2-3 раза и культивированием по 15-20 дней при 25^°С и 16-часовом освещении люминесцентными лампами; размножение культивированных эксплантов с тронувшейся в рост почкой ведут на питательной среде для размножения эксплантов, приготовленной на основе питательной среды ½ MS, в которую дополнительно вводят следующие компоненты: глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, тиамина-HCl 1 мг/л, пиридоксин-HCl 0,5мг/л, инозитол 100 мг/л, сахарозу 20000 мг/л, агар 7000 мг/л, цефотаксим 600 мг/л и гормоны: N⁶-бензиламинопурина 0,4-0,6 мг/л и 3-индолил масляной кислоты 0,1 мг/л, культивируют в течение 15-20 дней при температуре 25^°С и 16-часовом освещении люминесцентными лампами; размноженные экспланты переносят в питательную среду для роста и удлинения побегов, приготовленную на питательной среде ½ MS, в которую дополнительно вводят: глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, тиамин-HCl 1 мг/л, пиридоксин-HCl 0,5 мг/л, инозитол 100 мг/л, сахарозу 20000 мг/л, агар 7000 г/л, цефотаксим 400 мг/л и кинетин 0,1 мг/л, и культивируют в течение 15-20 дней при 25^°С и 16-часовом освещении люминесцентными лампами, после переноса размноженных эксплантов на питательную среду для роста и удлинения побегов оставшийся конгломерат каллуса с зачатками побегов помещают повторно на среду для размножения и культивируют в течение 15-20 дней при 25^°С и 16-часовом освещении люминесцентными лампами; образовавшиеся новые побеги переносят на среду для роста и удлинения побегов в те же условия культивирования; затем все удлиненные экспланты перемещают в питательную среду для укоренения побегов, приготовленную на основе питательной среды ½ MS, дополнительно содержащей: глицин 2 мг/л, глютамин 20 мг/л, аскорбиновую кислоту 1 мг/л, никотиновую кислоту 0,5 мг/л, тиамин-HCl 1 мг/л, пиридоксин-HCl 0,5 мг/л, инозитол 100 мг/л, сахарозу 10000 мг/л, агар 7000 мг/л, цефотаксим 400 мг/л, кинетин 0,1 мг/л и 3-индолил масляную кислоту 0,25-0,5 мг/л, и культивируют побеги в темном помещении при комнатной температуре в течение 5 дней, а затем при температуре 25^°С и 16-часовом люминесцентном освещении 15-20 дней, после чего укоренившиеся побеги для адаптации к почвенному грунту пересаживают в стерилизованный субстрат, состоящий из равных частей песка, вермикулита и лесной почвы, обильно поливают дистиллированной водой и закрывают сосуд, адаптацию ведут при комнатной температуре в течение 10-15 дней, затем сосуд открывают и продолжают выращивать растения до высоты 15-30 см; подросшие растения переносят в емкость большего объема со смесью песка и лесной почвы в соотношении 1:1.