Способ стерилизации эксплантов березы in vitro с использованием наночастиц оксида меди Российский патент 2022 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологий, в частности к культивированию тканей и органов растений, и может быть использовано в сельском и лесном хозяйстве для получения качественного посадочного материала.

Известны способы, направленные на решение проблемы стерилизации эксплантов в культуре in vitro, включающие стерилизацию первичных эксплантов при введении в культуру in vitro с использованием стерилизующего средства «Аламинол» на основе алкилдиметилбензиламмония хлорида (Пат. РФ № 2675510; МПК А01Н 4/00; опубл. 19.12.2018) или последовательное использование водных растворов этанола и препарата «Дезавид+», содержащего полигексаметиленгуанидин гидрохлорид и алкилдиметилбензиламмоний хлорид (Пат. РФ № 2720916; А01Н 4/00; опубл. 14.05.2019).

Недостатками данных способов является токсичность алкилдиметилбензиламмония хлорида для кожных покровов человека и тканей растений (Regulatory Toxicology and Pharmacology. 2020. Т. 116. С. 104717).

Известен способ стерилизации с помощью обработки 95%-ным этанолом в течение 30 с и раствором наночастиц серебра в концентрации 1, 5, 10 и 15 мг/л в течение 10, 15, 20 мин (IET nanobiotechnology. 2015. Т. 9. № 4. С. 239-245).

Данный способ позволяет проводить эффективную стерилизацию листовых эксплантов табака, однако он является затратным по времени, а разовая обработка наночастицами серебра не имеет пролонгированного действия.

Известны способы стимуляции ростовых процессов микроклонов путем введения наночастиц серебра и оксида меди в концентрации от 0,1 до 0,0001 мг/л (Лесотехнический журнал. 2018. Т. 8. № 4 (32). С. 6-11) и наночастиц железа в концентрации 3,0, 0,3, 0,06 мг/л, цинка - 0,4, 0,16, 0,08 мг/л и меди - 0,004, 0,0008, 0,00016 мг/л (Российские нанотехнологии. 2018. Т. 13. № 3-4. С. 57-63) в питательную среду Мурасиге-Скуга (МС).

Известные способы позволяют стимулировать ростовые процессы у микроклонов, но не учитывают стерилизующее действие наночастиц.

Известен способ поддержания стерильности микроклонов березы в культуре in vitro путем использования антибиотиков цефотаксима, карбенициллина, гентомицина в составе питательной среды WPM (Woody plant medium) (Достижения науки и образования. 2018. № 4 (26). C. 4-7).

Недостатком этого способа является возможное негативное влияние антибиотиков на процессы роста и развития микроклонов (Ecotoxicology. 2021. Т. 30. № 8. С. 1598-1609).

Известен способ дезинфекции эксплантов альдрованды путем использования наночастиц серебра в концентрации 5 мг/л в 1/5 питательной среды МС (Applied Sciences. 2021. Т. 11. № 8. С. 3653).

Данный способ позволяет снизить инфекционную нагрузку на экспланты альдрованды, но негативно влияет на их регенерационную способность и скорость роста.

Известен способ использования наночастиц оксида меди (IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. IOP Publishing. 2020. Т. 595. № 1. С. 012001), включающий стадии отмывки молодых побегов в воде с добавлением поверхностно-активных веществ, их разрезки на сегменты длиной 3-5 см, стерилизации в течение 35 мин в растворе, состоящем из 200 мл дистиллированной воды и 200 мкл 5%-ного раствора гипохлорита натрия, с последующей промывкой в дистиллированной воде, основной стерилизации побегов в ламинар-боксе в растворе, содержащем 15 мл 5%-ного раствора гипохлорита натрия и 85 мл стерильной дистиллированной воды, в течение 15 мин, промывки стерильной водой и разрезки стерильных побегов в асептических условиях на сегменты длиной 1,5-2 см с одной пазушной почкой - экспланты, которые впоследствии высаживают на модифицированную питательную среду. Способ применяют для стерилизации эксплантов гибрида тополя×осину. В качестве модифицированной питательной среды используют безгормональную питательную среду Мурасиге-Скуга (МС0), содержащую пластинчатые наночастицы оксида меди длиной 500 нм, шириной 300 нм, толщиной 50 нм, в концентрации 0,75, 1,5, 3, 6 и 15 мкг/л. Принят за прототип.

Недостатками данного способа являются его неотработаннность на эксплантах древесных растений с высоким процентом обсемененности микроорганизмами (40 и более % контаминированных эксплантов), а также сложность подбора концентрации наночастиц оксида меди (1,5-3 мкг/л) из-за их узкого диапазона воздействия.

Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в разработке способа стерилизации эксплантов березы на стадии введения в культуру in vitro.

Это достигается тем, что в способе стерилизации эксплантов березы in vitro с использованием наночастиц оксида меди, включающем стадии отмывки молодых побегов в воде с добавлением поверхностно-активных веществ, их разрезки на сегменты длиной 3-5 см, стерилизации в течение 35 мин в растворе, состоящем из 200 мл дистиллированной воды и 200 мкл 5%-ного раствора гипохлорита натрия, с последующей промывкой в дистиллированной воде, основной стерилизации побегов в ламинар-боксе в растворе, содержащем 15 мл 5%-ного раствора гипохлорита натрия и 85 мл стерильной дистиллированной воды, в течение 15 мин, промывки стерильной водой и разрезки стерильных побегов в асептических условиях на сегменты длиной 1,5-2 см с одной пазушной почкой - экспланты, которые впоследствии высаживают на модифицированную питательную среду, согласно изобретению, в качестве модифицированной питательной среды используют питательную среду WPM, оптимизированную для введения в культуру in vitro эксплантов березы и содержащую сферические наночастицы оксида меди диаметром 30-80 нм в концентрации 0,1 мг/л, что позволяет пролонгировать действие санирующего эффекта, а также сократить сроки получения и увеличить количество стерильных эксплантов.

Наночастицы оксида меди применяются в качестве стимуляторов роста (Лесотехнический журнал. 2018. Т. 8. № 4 (32). С. 6-11); Российские нанотехнологии. 2018. Т. 13. № 3-4. С. 57-63), поверхностного стерилизующего агента семян растений (J Anim Plant Sci. 2019. Т. 29. № 2. С. 453-460), промывочного раствора (IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. IOP Publishing, 2019. Т. 392. № 1. С. 012024) и компонента питательной среды для стерилизации эксплантов при введении в культуру in vitro (Applied Sciences. 2021. Т. 11. № 8. С. 3653).

Технический результат, заключающийся в увеличении количества стерильных эксплантов березы in vitro более чем на 20%, достигается за счет воздействия наночастиц оксида меди на патогенную микрофлору бактериального и грибкового происхождения, которые относятся к III классу опасности - малоопасные вещества, и обладают выраженным стерилизующим действием, являясь альтернативой использованию антибиотиков, и, в то же время, не снижают жизнеспособность эксплантов. Введение наночастиц оксида меди непосредственно в среду культивирования позволяет пролонгировать санирующий эффект, а их низкая концентрация в культивационной среде способствует уменьшению их агломерации и предотвращает токсический эффект от воздействия на микроклоны и кожные покровы человека.

Способ стерилизации эксплантов березы in vitro с использованием наночастиц оксида меди осуществляют следующим образом.

1. Молодые побеги березы предварительно отмывают в воде с добавлением поверхностно-активных веществ (ПАВ) - стеарата калия, разрезают на сегменты длиной 3-5 см, после чего стерилизуют в течение 35 мин в растворе, состоящем из 200 мл дистиллированной воды и 200 мкл 5%-ного раствора гипохлорита натрия, с последующей промывкой в дистиллированной воде.

2. Проводят основную стерилизацию побегов березы в ламинар-боксе в растворе, содержащем 15 мл 5%-ного раствора гипохлорита натрия и 85 мл стерильной дистиллированной воды, в течение 15 мин Последующую промывку также проводят стерильной водой.

3. Разрезают стерильные побеги березы в асептических условиях на сегменты длиной 1,5-2 см с одной пазушной почкой - экспланты, которые впоследствии высаживают на питательную среду WPM, оптимизированную для введения в культуру in vitro эксплантов березы и содержащую сферические наночастицы оксида меди диаметром 30-80 нм в концентрации 0,1 мг/л.

Состав питательной среды WPM, модифицированной наночастицами оксида меди и используемой на стадии введения в культуру березы in vitro, представлен в таблице 1.

Эффективность стерилизации с использованием наночастиц оксида меди представлена в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, число стерильных эксплантов березы увеличивалось на 11,7-26,7% с одновременным сохранением жизнеспособности при использовании наночастиц оксида меди в среде культивирования.

Таким образом, способ стерилизации эксплантов березы in vitro с использованием наночастиц оксида меди отличается повышенной безопасностью и эффективностью по сравнению с известными способами и позволяет пролонгировать санирующее воздействие наночастиц оксида меди в составе модифицированной питательной среды WPM при введении в культуру in vitro, а также сократить сроки получения и увеличить количество стерильных эксплантов.

Таблица 1
Состав питательной среды WPM, модифицированной наночастицами оксида меди и используемой на стадии введения в культуру березы in vitro Компоненты Содержание, мг/л Макросоли Нитрат аммония NH₄NO₃ 400,0 Калий дигидрофосфат KH₂PO₄ 170,0 Сульфат калия K₂SO₄ 990,0 Сульфат магния MgSO₄×7H₂O 370,0 Нитрат кальция Ca(NO₃)₂ 556,0 Хлорид кальция CaCl₂ 96,0 Микросоли Борная кислота H₃BO₃ 6,2 Сульфат марганца (II) MnSO₄×H₂O 22,3 Хлорид кобальта CoCl₂×6H₂O 0,025 Сульфат меди (II) CuSO₄×5H₂O 0,025 Сульфат цинка ZnSO₄×7H₂O 8,6 Fe-хелат Сульфат железа (II) FeSO₄×7H₂O 37,3 Натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты Na₂EDTA×2H₂O 27,8 Инозитол 100,0 Глицин 2,0 Тиамин-HCl 0,1 Пиридоксин-HCl 0,5 Никотиновая кислота 0,5 Сахароза 20000,0 Наночастицы оксида меди CuO 0,1 Агар 6000,0-7000,0 рН 5,6-5,8

Таблица 2
Влияние наночастиц оксида меди в составе модифицированной питательной среды WPM на основные показатели эксплантов березы на стадии введения в культуру in vitro Концентрация наночастиц, мг/л Число стерильных эксплантов, % Число жизнеспособных эксплантов, % 0,1 86,7±4,4 100,0±0,0 1 76,7±6,0 98,3±1,7 5 71,7±3,3 95,0±2,9 10 81,7±4,4 90,0±2,9 Контроль (без наночастиц оксида меди) 60,0±5,0 95,0±2,9

Изобретение относится к области биотехнологий, в частности к культивированию тканей и органов растений, и может быть использовано в сельском и лесном хозяйстве для получения качественного посадочного материала. Способ стерилизации эксплантов березы in vitro с использованием наночастиц оксида меди осуществляют следующим образом. Молодые побеги березы предварительно отмывают в воде с добавлением поверхностно-активных веществ (ПАВ) – стеарата калия, разрезают на сегменты длиной 3-5 см, после чего стерилизуют в течение 35 мин в растворе, состоящем из 200 мл дистиллированной воды и 200 мкл 5%-ного раствора гипохлорита натрия, с последующей промывкой в дистиллированной воде. Проводят основную стерилизацию побегов березы в ламинар-боксе в растворе, содержащем 15 мл 5%-ного раствора гипохлорита натрия и 85 мл стерильной дистиллированной воды, в течение 15 мин. Последующую промывку также проводят стерильной водой. Разрезают стерильные побеги березы в асептических условиях на сегменты длиной 1,5-2 см с одной пазушной почкой – экспланты, которые впоследствии высаживают на питательную среду WPM, оптимизированную для введения в культуру in vitro эксплантов березы и содержащую сферические наночастицы оксида меди диаметром 30-80 нм в концентрации 0,1 мг/л. Способ стерилизации эксплантов березы in vitro с использованием наночастиц оксида меди отличается повышенной безопасностью и эффективностью по сравнению с известными способами и позволяет пролонгировать санирующее воздействие наночастиц оксида меди в составе модифицированной питательной среды WPM при введении в культуру in vitro, а также сократить сроки получения и увеличить количество стерильных эксплантов.

Способ стерилизации эксплантов березы in vitro с использованием наночастиц оксида меди, включающий стадии отмывки молодых побегов в воде с добавлением поверхностно-активных веществ, их разрезки на сегменты длиной 3-5 см, стерилизации в течение 35 мин в растворе, состоящем из 200 мл дистиллированной воды и 200 мкл 5%-ного раствора гипохлорита натрия, с последующей промывкой в дистиллированной воде, основной стерилизации побегов в ламинар-боксе в растворе, содержащем 15 мл 5%-ного раствора гипохлорита натрия и 85 мл стерильной дистиллированной воды, в течение 15 мин, промывки стерильной водой и разрезки стерильных побегов в асептических условиях на сегменты длиной 1,5-2 см с одной пазушной почкой – экспланты, которые впоследствии высаживают на модифицированную питательную среду, отличающийся тем, что в качестве модифицированной питательной среды используют питательную среду WPM, оптимизированную для введения в культуру in vitro эксплантов березы и содержащую сферические наночастицы оксида меди диаметром 30-80 нм в концентрации 0,1 мг/л, что позволяет пролонгировать действие санирующего эффекта, а также сократить сроки получения и увеличить количество стерильных эксплантов.