Способ многоступенчатой поверхностной стерилизации верхних частей генеративных побегов Beta vulgaris L. перед введением в культуру in vitro Российский патент 2023 года по МПК A01H4/00 

Основная часть

Изобретение относится к области биотехнологии, сельского хозяйства, селекции и может способствовать сохранению ценного растительного материала, повышению эффективности клонального микроразмножения в целях ускорения селекционного процесса по созданию новых гибридов сахарной свеклы.

Известен способ стерилизации соцветий сахарной свеклы, выращенных на донорских растениях в условиях теплицы. Стерилизация осуществлялась погружением цветоносов длиной 1-1,5 см в 70% этанол на 30 секунд и в 2% раствор гипохлорита натрия на 20 минут с последующей промывкой в стерильной дистиллированной воде [1].

Известен способ стерилизации эксплантов от материнских растений сахарной свеклы, выращенных в контролируемых условиях среды, свободной от патогенов. Был использован коммерческий отбеливатель в концентрации 70% или гипохолорит натрия 3% в течение 5 минут с последующим промыванием соцветий в нескольких объемах стерильной дистиллированной водой [2].

Еще один способ представляет собой одноступенчатую стерилизацию соцветий Beta vulgaris раствором гипохлорита натрия с более высокой концентрацией 6-14% активного хлора, по сравнению с предыдущими вариантами. В ходе стерилизации 23 мл NaOCl разводили в 77 мл дистиллированной воды с добавлением 2 капель Tween 20 на 100 мл раствора. Встряхивание производили вручную в течение 30 минут, после чего экспланты трижды промывали дистиллированной водой [3]. Данный способ был применен для стерилизации растительного материала Beta vulgaris в целях извлечения яйцеклеток (которые стерильны) из закрытых бутонов для дальнейшего культивирования в условиях in vitro.

Помимо известных способов стерилизации эксплантов сахарной свеклы, существуют способы стерилизации растительных объектов с применением других хлорсодержащих веществ. Известен способ стерилизации растительных эксплантов земляники садовой, винограда, хурмы перед введением в культуру in vitro [4], при котором проводят одноступенчатую обработку 0,5% раствором хлоргексидина в течение 5 минут и промыванием 5-6 раз стерильной дистиллированной водой в течение 1 часа. Существует способ стерлизации эксплантов гороха 15% раствором Domestos в течение 30 минут и 8% хлорамин Б в течение 25 минут [5]. Другим близким способом является обработка этиолированных ростков картофеля препаратом «Белизна», разбавленного 1:4 в течение 10 минут с последующей двукратной промывкой стерильной дистиллированной водой и ополаскиванием раствором антибиотика цефотаксим, 4% перед высадкой в пробирки [6]. В исследовании Л.И. Тихомировой показано, что введение антибиотиков в агаризованные питательные среды может быть эффективно для введения в культуру in vitro вегетативных почек ириса. При этом необходимо предварительно определить чувствительность микроорганизмов к противомикробным средствам. Добавление в питательную среду антибиотика левомицетин в концентрации 100 мг/л (0,01%) позволило снизить долю инфицированных эксплантов ириса (I. hybrida) на 20% [7].

Недостатком данных способов является невысокая эффективность стерилизации эксплантов, собранных в полевых условиях, которые отличаются сильной микробной и грибковой зараженностью. Также при использовании данных методов стерилизации было отмечено поражение тканей и снижение жизнеспособности меристем некоторых генотипов после воздействия этанола и высоких концентраций стерилизующих веществ.

Способ многоступенчатой стерилизации одревесневших почек побегов красной малины (Rubusidaeus L.) включает промывку в проточной воде с хозяйственным мылом, предварительную стерилизацию побегов 3% раствором хлорамина в течение 5 минут, трехкратную промывку в стерильной воде и основную стерилизацию 0,025% раствором мертиолята Na в сочетании с 7% Белизной в течение 10 минут с последующей трехкратной промывкой в стерильной дистиллированной воде [8]. При использовании данного метода выход стерильных эксплантов находился в пределах 91%. Необходимо отметить, что в качестве стерилизуемого материала использовались одревесневшие почки. Известен способ получения растений-регенерантов земляники, который включает стерилизацию фрагментов цветоложа 0,1% раствором сулемы в течение 10 минут и трехкратное промывание стерильной дистиллированной водой [9].

Недостатком данных способов является использование ртутьсодержащего соединения, чрезвычайно токсичного как для растений, так и для человека. Особые условия утилизации так же создают трудности для частого использования метода.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа эффективной стерилизации эксплантов верхних частей генеративных побегов Beta vulgaris L., отобранных в полевых условиях, перед введением в культуру in vitro, повышение надежности стерилизации побегов без нарушения регенерационной способности растительных тканей.

Пример осуществления способа

Сбор материала в полевых условиях осуществляется в момент начала цветения донорских растений в утренние часы при отсутствии осадков и росы. Верхние части соцветий центрального побега Beta vulgaris размером 7-10 см срезают, оборачивают влажной ватой, каждый генотип упаковывают в индивидуальный пакет с этикеткой, транспортируют при температуре 4-8°С. В условиях лаборатории производят предварительную промывку отобранного растительного материала в мыльном растворе, а затем в дистиллированной воде. Далее промытые соцветия нарезают на части размером 2-2,5 см, укладывают в чистые сосуды объемом 250 мл по 10-15 штук, накрывают крышками. Первый этап многоступенчатой стерилизации проводят в 100 мл раствора NaOCl (0,008-0,011%) с добавлением 1 капли Tween 20 в течение 15 минут. Промывку от стерилизующего раствора производят стерильной дистиллированной водой двукратно по 5 минут. На втором этапе используют растворы антибиотиков (тетрациклин 0,008-0,011%, цефтриаксон 0,020-0,030%) в течение 15-30 минут. На третьем этапе экспланты стерилизуют в течение 40-45 минут в растворе NaOCl (0,8-1,1%), с добавлением Tween 20 (2 капли на 1 л стерилизующего раствора). После каждого этапа стерилизации следует промывка эксплантов в стерильной дистиллированной воде. Все этапы многоступенчатой стерилизации, в том числе и промывку, проводят с использованием орбитального шейкера. Интенсивность встряхивания должна быть умеренной для предотвращения механического повреждения растительного материала.

В таблице 1 представлены данные по эффективности различных способов стерилизации верхних частей генеративных побегов сахарной свеклы, выращенных в условиях открытого грунта. Для каждого варианта стерилизации количество отобранных эксплантов составило 100 шт.

Варианты обработки:

А: 1. Промывка в проточной воде с мылом;

2. Предварительная обработка NaOCl (0,008-0,011%) + Tween 20 (2 капли на 1 литр стерилизующего раствора), рекомендуемый объем стерилизующего раствора - 100 мл для 10-15 эксплантов, 15 минут;

3. Обработка в растворе тетрациклина 0,008-0,011% и цефтриаксона 0,020-0,030% в течение 15-30 минут;

4. NaOCl, (0,8-1,1%) + Tween 20 (2 капли на 1 литр стерилизующего раствора), 40 минут.

Б: Обработка в растворе NaOCl (0,008-0,011%), 30 минут;

В: Обработка в растворе C6H5ClNNaO2S (8-10%), 30 минут;

Г: Погружение эксплантов в 70% этанол в течение 30 секунд и обработка в 2% растворе гипохлорита натрия в течение 20 минут с последующей промывкой в стерильной дистиллированной воде.

Д: Обработка раствором гипохолорита натрия (3%) в течение 5 минут с последующим промыванием стерильной дистиллированной водой.

Как следует из полученных данных, наиболее эффективным способом стерилизации эксплантов являлся способ А. Заявляемый способ многоступенчатой поверхностной стерилизации (А) верхних частей генеративных побегов, собранных с донорских растений сахарной свеклы в полевых условиях, соответствует критерию изобретения «промышленное применение». Экспериментальные данные, полученные при реализации способа в отделе биотехнологии ООО «СоюзСемСвекла», подтверждают эффективность многоступенчатой стерилизации апикальных меристем с применением NaOCl, Tween 20 и раствора антибиотиков (тетрациклин, цефтриаксон) с использованием орбитального шейкера при наличии бактерицидного рециркулятора в помещении. Данный способ позволяет получить из растений-доноров, выращенных в полевых условиях, до 93% стерильных меристем в культуре in vitro.

В настоящее время отсутствуют аналоги способу многоступенчатой стерилизации верхних частей генеративных побегов, отобранных в полевых условиях, с использованием в качестве стерилизующих веществ NaOCl, Tween 20 и антибиотиков (тетрациклин, цефтриаксон). Случаи использования хлорсодержащих веществ в комплексе с антибиотиками для стерилизации апикальных меристем Beta vulgaris из полевых условий неизвестны, что позволяет сделать вывод о соответствии заявленного способа критерию «новизна».

Преимуществом заявленного способа многоступенчатой стерилизации является:

1. Эффективность стерилизации материала, отобранного в полевых условиях. Использование антибиотиков и стерилизующих веществ (NaOCl) позволяет снизить контаминацию растительного материала различными бактериальными и грибковыми организмами;

2. Возможность стерилизации большого количества верхних частей генеративных побегов в масштабах, соответствующих коммерческим задачам;

3. Сохранение регенерационной способности растительного материала без химического и температурного повреждения тканей.

Список документов, цитированных в отчете о поиске:

1. Mikami, Т., Kinoshita, Т., Saito, H. Clonal propagation of sugar beet plants by apical meristem culture. T. Mikami, T. Kinoshita, H. Saito // Journal of the Faculty of Agriculture. - 1985. №62. - P. 325-331;

2. Weich, E.W., Levall, M.W. Doubled haploid production of sugar beet (Beta vulgaris L.). In: Maluszynski, M., Kasha, K.J., Forster, B.P., Szarejko, I., eds. Doubled haploid production in crop plants // Springer. - 2003. - P. 255-263. DPI: doi.org/10.1007/978-94-017-1293-4_38;

3. Pazuki, A. Gynogenesis Induction in Sugar Beet (Beta vulgaris) Improved by 6-Benzylaminopurine (BAP) and Synergized with Cold Pretreatment / A. Pazuki, F. Aflaki, E. Gürel, A. Ergül, S. Gürel // Sugar Tech. - 2018. - Vol. 20. - pp. 69-77. DOI: 10.1007/s12355-017-0522-x https://doi.org/10.1007/s12355-017-0522-x;

4. Патент №2490871, Российская Федерация, МПК А01Н 4/00 (2006.01). Способ поверхностной стерилизации эксплантов и апикальных почек земляники садовой, винограда, хурмы сорта «Королек» in vitro»: №2012113619/10: заявлен 06.04.2012: опубликован 27.08.2013 / Холопцов В.Ф., Простенко А.Н., Навальнева И.А.; заявитель ФГБОУ ВПО БелГСХА им. В.Я. Горина. - 8 с. - 5 ил;

5. Ермоленко, Н.Л. Особенности введения в культуру in vitro гороха посевного с целью последующего микроклонального размножения / Н.Л. Ермоленко, И.Н. Синица, Е.Н. Кулинкович // Земледелие и селекция в Беларуси: сборник научных трудов. - 2020. - Вып. 56. - С. 388-394;

6. Чураков А.А., Попова Н.М., Халипский А.Н., Пирятенец Ю.А. Способ получения асептических эксплантов картофеля в культуре in vitro / А.А. Чураков, Н.М. Попова, А.Н. Халипский, Ю.А Пирятенец // Вестник Красноярского государственного аграрного университета. - 2019. №5. - С. 16-21;

7. Тихомирова Л.И. Получение стерильной активно пролиферирующей культуры ириса в условиях in vitro // Достижения науки и техники АПК, - 2010. №8, - 37-39;

8. Оразбаева Г.К. Клональное размножение растений красной малины (Rubusidaeus L.) in vitro / Оразбаева Г.К., Майсупова И.Л., Хасанов В. Т., Швидченко В.К. // Вестник науки КазАТУ им. С.Сейфуллина. - 2012. - №1 (72). - С. 140-149;

9. Патент RU 2516341, Российская Федерация, МПК А01Н 4/00 (2006.01). Способ получения растений-регенерантов земляники in vitro: №2012117407/10: заявлен 26.04.2012: опубликован 20.05.2014 / Тихомирова Л.И.; заявитель ФГБОУ ВПО АГУ. - 6 с. - 3 ил.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Жизнеспособные экспланты верхних частей цветоносных побегов В. vilgaris L. в культуре in vitro после стерилизации заявляемым способом.

Фиг. 2. Нежизнеспособные и инфицированные экспланты верхних частей цветоносных побегов В. vilgaris в культуре in vitro.

Фиг. 3. Вегетативный геммогенез из верхних частей цветоносных побегов in vitro.

Фиг. 4. Развитый микроклон В. vulgaris в условиях in vitro.

Фиг. 5. Асептические микроклоны В. vulgaris, полученные из верхних частей цветоносных побегов заявляемым способом.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ поверхностной стерилизации верхних частей генеративных побегов Beta vulgaris, отобранных в условиях поля в целях получения асептической культуры ценных экземпляров и повышения эффективности клонального микроразмножения сахарной свеклы. Способ включает многоступенчатую стерилизацию верхних частей центральных соцветий Beta vulgaris. Проводится отбор растительного материала длиной 7-10 см. Предобработка материала проводится в мыльном растворе с последующей нарезкой эксплантов на части размером 2-2,5 см. Первый этап стерилизации проводят в растворе NaOCl (0,008-0,011%) с добавлением Tween 20 (2 капли на 1 л стерилизующего раствора) в течение 15-20 минут. На втором этапе проводят обработку эксплантов в растворе антибиотиков (тетрациклин 0,008-0,011%, цефтриаксон 0,020-0,030%) в течение 15-20 минут. Третий этап - основная обработка в растворе хлорсодержащего соединения - NaOCl (0,8-1,1%) с добавлением Tween 20 (2 капли на 1 л стерилизующего раствора) в течение 40 минут. После каждого этапа стерилизации следует промывка эксплантов стерильной водой. Все растворы готовят на основе стерильной воды, каждый этап стерилизации и промывки проводят на орбитальном шейкере при умеренной интенсивности встряхивания для предотвращения механического повреждения растительного материала. Изобретение позволяет улучшить качество процесса стерилизации верхних частей генеративных побегов Beta vulgaris за счет снижения контаминации микроорганизмами и грибами с сохранением высокого уровня жизнеспособности эксплантов при введении в культуру in vitro. 5 ил., 1 табл.

Способ многоступенчатой поверхностной стерилизации растительного материала, отличающийся тем, что многоступенчатой поверхностной стерилизации подвергают верхние части генеративных побегов Beta vulgaris L., проводят предварительную промывку отобранного растительного материала в мыльном растворе, а затем в дистиллированной воде, обработку в 0,008-0,011% растворе NaOCl с добавлением двух капель Tween 20 на литр стерилизующего раствора в течение 15-20 минут, далее проводят обработку в растворе антибиотиков тетрациклина 0,008-0,011%, цефтриаксона 0,020-0,030% в течение 15-30 минут, затем проводят обработку в 0,8-1,1% растворе NaOCl с добавлением двух капель Tween 20 на литр стерилизующего раствора в течение 40-45 минут, с последующей четырехкратной промывкой эксплантов стерильной водой, после каждого этапа стерилизации проводят промывку эксплантов в стерильной воде, при этом все этапы многоступенчатой стерилизации, в том числе и промывку, проводят с использованием орбитального шейкера.