СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКИ КРИОУСТОЙЧИВОСТИ СПЕРМЫ ЖЕРЕБЦОВ Российский патент 2018 года по МПК A61D19/02 

Описание патента на изобретение RU2675947C1

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к экспресс способам оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известны способы оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию, имеющие высокую корреляцию с ее оплодотворяющей способностью после замораживания-оттаивания и поэтому используемые для прогноза ее криоустойчивости. При этом оценивают подвижность и выживаемость спермиев, целостность мембран, акросом и ферментов после холодового удара, показатели стимуляции дыхания, время редукции метиленового синего или определяют коэффициент осмотической устойчивости (Курбатов, А.Д. Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных [Текст] / А.Д. Курбатов, Е.М. Платов, Н.Б. Корбан, Л.Г. Мороз, В.А. Наук - Л,: Агропромиздат, 1988. - 255 с.; Осташко, Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей [Текст] / Ф.И. Осташко. - Киев: Урожай, 1978. - 255 с.; Милованов, В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение животных [Текст] / В.К. Милованов. - М., 1962. - 695 с.)

Наиболее близким к изобретению является способ определения резистентности спермиев жеребцов к холодовому шоку, который позволяет провести относительно быстро оценку спермы перед криоконсервацией (Сперма жеребцов неразбавленная свежеполученная [Текст]: ГОСТ 23681-79. - Введ. 1980-07-01. - М.: Изд-во стандартов, 1979 - 6 с).

Сущность способа определения резистентности спермиев к холодовому шоку (далее - резистентность) заключается в определении их выживаемости после резкого охлаждения до нулевой температуры. Резистентность вычисляется по формуле:

, где

П1 - подвижность спермиев после холодового шока, т.е. после 20 минут выдержки пробы спермы при нулевой температуре;

П2 - подвижность спермиев после выдержки пробы спермы при температуре 37°С в течение 5 мин в термостате и 20 мин при комнатной температуре.

Сперма, предназначенная для замораживания, должна иметь резистентность к холодовому шоку не ниже 0,1.

Как видим прежде, чем определять резистентность, необходимо знать подвижность спермиев, которая выражается в баллах и вычисляется по формуле:

, где

n - общее число подсчитанных спермиев;

n1 - число подсчитанных спермиев с прямолинейным поступательным движением;

10 - постоянный коэффициент.

Минимальной подвижностью спермиев принято считать подвижность, равную 0,5 балла (Сперма быков неразбавленная [Текст]: ГОСТ 20909.4-75. - Введ. 1976-07-01. - М.: Изд-во стандартов, 1976 - 11 с.).

Главным недостатком этого способа является трудоемкость и поэтому его рекомендовано проводить при первой проверке семени на холодоустойчивость, а затем периодически - один раз в квартал.

Сперма жеребцов отличается тем, что в нее попадает большое количество секретов придаточных половых желез, и их выделение происходит неравномерно. Очень часто разные эякуляты от одного и того же жеребца отличаются по объему, концентрации, подвижности спермиев. Различия по биохимическим свойствам, неоднородность ферментного и микроэлементного состава плазмы влияют на устойчивость спермы к глубокому охлаждению. Поэтому прогноз криоустойчивости спермиев желательно проводить для каждого эякулята.

В производственных условиях очень часто не хватает оборудования и условий для применения данного способа, т.е. для практики до сих пор не разработан быстрый, простой и дешевый способ оценки криоустойчивости спермы.

Свежеполученная неразбавленная сперма жеребцов должна соответствовать известным требованиям и нормам (Рекомендации по взятию, разбавлению и замораживанию спермы жеребцов [Текст]. - Дивово, 2006. - 23 с.; Инструкция по искусственному осеменению и трансплантации эмбрионов лошадей [Текст]. - Дивово, 2012. - 72 с.). Но не всегда хорошее качество семени после получения является гарантией его хорошего состояния после замораживания и последующего оттаивания. Как правило, большой процент спермодоз приходится выбраковывать из-за низкой подвижности или плохой выживаемости спермиев после размораживания. Только около 50% замороженного материала остается для хранения и использования. Поэтому перед нами стояла задача найти простой и дешевый способ, позволяющий быстро оценить криоустойчивость спермиев каждого эякулята.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предлагаемый способ позволяет быстро оценить устойчивость спермы жеребцов к замораживанию, влияние на нее глубокого охлаждения, избавить от необходимости последующей выбраковки замороженного семенного материала, повысить эффективность проводимых работ без дополнительных вложений и затрат на оборудование и материалы, без сложной подготовки и обучения персонала, сократить время общего анализа и обработки результатов до 15 минут.

Для решения этих задач был подобран оптимальный режим ускоренной подготовки разбавленной спермы к замораживанию с таким условием, чтобы подвижность спермиев после деконсервации совпадала или была близка к показателям после обычного замораживания. Были испытаны параметры, которые могли повлиять на подвижность спермиев после процедуры замораживания-оттаивания - это объем дозы, формы фасовки спермы, режим предварительного охлаждения и режим процедуры криоконсервации и оттаивания.

В результате испытания разных объемов дозы и формы фасовки выяснилось, что подвижность спермиев практически не зависит ни от объема дозы (1,5 мл - 0,5 мл), ни от формы фасовки (пробирки Эппендорфа, соломины или тубы). С целью экономии спермы, для дальнейших исследований, мы выбрали самый маленький объем, равный 0,5 мл в любой из имеющихся фасовочных форм (Изучить возможность быстрой оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию [Текст]: отчет о НИР (промежуточный): 4-7 / ФГБНУ «ВНИИ коневодства»; рук. Лебедева Л.Ф.; исполн. Науменкова В.А. - Дивово, 2016. - 3 с. - №0640-2014-0007).

Нами были проведены опыты по сокращению времени предварительной выдержки спермы в холодильнике при рекомендуемой температуре 4°С - 5°С, а также при более низкой - 1°С - 0°С.

Данный опыт показал, что сокращение времени выдержки спермы в условиях холодильника при 4°С - 5°С до 1,5 часа не приводит к снижению подвижности спермиев. При уменьшении времени выдержки в холодильнике до 1 часа, наблюдается небольшое снижение подвижности (на 0,2 балла или 8,7%). Таким образом, чем меньше время выдержки перед замораживанием, тем большие расхождения с контрольным вариантом наблюдались и тем больший поправочный коэффициент нужно применять

Так же выяснилось, что снижение температуры предварительного охлаждения разбавленной спермы перед криоконсервацией до 0°С не привело к желаемому результату, увеличив разницу между вариантами. Подвижность спермиев в таких пробах достоверно отличалась от контрольного варианта с обычным режимом подготовки к замораживанию. Разница составила 0,4-0,5 балла (Р>0,95) (Изучить возможность быстрой оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию [Текст]: отчет о НИР (промежуточный): 4-7 / ФГБНУ «ВНИИ коневодства»; рук. Лебедева Л.Ф.; исполн. Науменкова В.А. - Дивово, 2016. - 3 с. - №0640-2014-0007).

Изучив зависимость подвижности спермиев после оттаивания от времени нахождения дозы в парах азота в процессе замораживания, мы установили, что оптимальное время нахождения мини-дозы (0,5 мл) в парах азота оказалось равным 5 минутам (Изучить возможность быстрой оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию [Текст]: отчет о НИР (промежуточный): 4-7 / ФГБНУ «ВНИИ коневодства»; рук. Лебедева Л.Ф.; исполн. Науменкова В.А. - Дивово, 2016. - 3 с. - №0640-2014-0007), т.е. таким же как для дозы объемом 5 мл. (Инструкция по искусственному осеменению и трансплантации эмбрионов лошадей [Текст]. - Дивово, 2012. - 72 с.).

При обычном способе замораживания-оттаивания после выдержки спермы в парах азота, дозы опускаются в жидкий азот и процесс замораживания продолжается непосредственно в нем не менее суток с целью стабилизации кристаллов льда. Только после этого проводится контрольное оттаивание.

Для ускорения оценки мы проводили оттаивание, выдерживая сперму в азоте в течение 5, 10, 15 минут. Опытным путем было доказано, что подвижность спермиев во всех этих случаях была одинаковой. Мы считаем возможным выдерживать сперму в азоте в течение 5 минут (Изучить возможность быстрой оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию [Текст]: отчет о НИР (промежуточный): 4-7 / ФГБНУ «ВНИИ коневодства»; рук. Лебедева Л.Ф.; исполн. Науменкова В.А. - Дивово, 2016. - 3 с. - №0640-2014-0007).

По результатам испытаний подобран оптимальный режим быстрой подготовки спермы к замораживанию в мини-объеме для проведения экспресс-оценки криоустойчивости спермы жеребцов с результативностью, получаемой при обычном способе замораживания-оттаивания. Совпадение оценки подвижности спермиев контрольных и опытных образцов отмечено в 99% случаев.

Применение данного способа экспресс-оценки дает возможность заранее спрогнозировать и определить результативность применения глубокого охлаждения семени без последующей выбраковки замороженного семенного материала. Способ отличается простотой и быстротой исполнения в ходе проведения плановых работ по криоконсервации, без сложных манипуляций, без дополнительных затрат на дорогостоящие реактивы и оборудование и на специальную подготовку работников.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, чтобы оценить криоустойчивость спермы жеребца, осуществляют следующие действия:

1 сперму после получения и разбавления ЛХЦЖ-средой ставят для предварительного охлаждения и эквилибрации в холодильник, согласно «Рекомендациям по взятию, разбавлению и замораживанию спермы жеребцов» (Рекомендации по взятию, разбавлению и замораживанию спермы жеребцов [Текст]. - Дивово, 2006. - 23 с.). От общего объема разбавленной спермы отливают 0,5 мл и помещают в соломину для ее фасовки или в пробирку Эппендорфа;

2 выдерживают соломину или пробирку в холодильнике при температуре 4°С - 5°С в течение 1 или 1,5 часа.

3 переносят дозу для замораживания в охладитель с жидким азотом на поплавок. Выдерживают в парах жидкого азота в течение 5 минут и опускают непосредственно в азот на 5 минут;

4 сперму извлекают из жидкого азота с помощью пинцета и сразу переносят в водяную баню с температурой 38°С на 30 секунд, если это соломина, и на 60 секунд, если это пробирка Эппендорфа, вынимают из воды, обсушивают и раскупоривают;

5 после оттаивания, определяют подвижность спермиев известным способом, выражая ее в баллах.

Похожие патенты RU2675947C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ОЦЕНКИ КРИОУСТОЙЧИВОСТИ СПЕРМЫ ЖЕРЕБЦОВ ПО УРОВНЮ АКТИВНОСТИ ЛИПАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ 2022
  • Атрощенко Михаил Михайлович
  • Романова Алина Игоревна
  • Зайцев Александр Михайлович
  • Калашников Валерий Васильевич
  • Енгалычева Мария Германовна
  • Шитикова Анна Михайловна
  • Широкова Ольга Владимировна
  • Фролова Наталья Александровна
RU2788451C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ КРИОУСТОЙЧИВОСТИ СПЕРМЫ ЖЕРЕБЦОВ ПО КОНЦЕНТРАЦИИ ФИБРИНОГЕНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ 2021
  • Атрощенко Михаил Михайлович
  • Романова Алина Игоревна
  • Зайцев Александр Михайлович
  • Калашников Валерий Васильевич
  • Бородкина Елена Юрьевна
  • Фролова Наталья Александровна
  • Енгалычева Мария Германовна
  • Шитикова Анна Михайловна
  • Широкова Ольга Владимировна
RU2768602C1
СПОСОБ ОТБОРА ЖЕРЕБЦОВ АРАБСКОЙ ЧИСТОКРОВНОЙ ПОРОДЫ С ВЫСОКОЙ КРИОУСТОЙЧИВОСТЬЮ СПЕРМЫ ПО КОНЦЕНТРАЦИИ КАДМИЯ В ВОЛОСАХ С ГРИВЫ 2019
  • Калашников Валерий Васильевич
  • Зайцев Александр Михайлович
  • Атрощенко Михаил Михайлович
  • Мирошников Сергей Александрович
  • Завьялов Олег Александрович
  • Фролов Алексей Николаевич
  • Курилкина Марина Яковлевна
  • Калинкова Лилия Владимировна
  • Калашникова Татьяна Валерьевна
  • Блохина Нина Васильевна
RU2723951C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ КРИОУСТОЙЧИВОСТИ СПЕРМЫ ЖЕРЕБЦОВ ПО КОНЦЕНТРАЦИИ ЭСТРАДИОЛА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ 2024
  • Атрощенко Михаил Михайлович
  • Романова Алина Игоревна
  • Широкова Ольга Владимировна
  • Фролова Наталья Александровна
RU2823682C1
СПОСОБ ОТБОРА ЖЕРЕБЦОВ АРАБСКОЙ ЧИСТОКРОВНОЙ ПОРОДЫ С ВЫСОКОЙ ВЫЖИВАЕМОСТЬЮ СПЕРМАТОЗОИДОВ ДО И ПОСЛЕ КРИОКОНСЕРВАЦИИ ПО ЭЛЕМЕНТНОМУ СОСТАВУ ВОЛОС 2019
  • Калашников Валерий Васильевич
  • Зайцев Александр Михайлович
  • Атрощенко Михаил Михайлович
  • Мирошников Сергей Александрович
  • Завьялов Олег Александрович
  • Фролов Алексей Николаевич
  • Калинкова Лилия Владимировна
  • Калашникова Татьяна Валерьевна
  • Блохина Нина Васильевна
RU2723622C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА КРИОКОНСЕРВИРОВАННОЙ СПЕРМЫ ЖЕРЕБЦОВ ПО КОНЦЕНТРАЦИИ ХОЛЕСТЕРИНА В СЕМЕННОЙ ПЛАЗМЕ 2022
  • Атрощенко Михаил Михайлович
  • Романова Алина Игоревна
  • Зайцев Александр Михайлович
  • Калашников Валерий Васильевич
  • Енгалычева Мария Германовна
  • Шитикова Анна Михайловна
  • Широкова Ольга Владимировна
  • Фролова Наталья Александровна
RU2783972C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА СПЕРМЫ ЖЕРЕБЦОВ ПО КОНЦЕНТРАЦИИ ДИГИДРОТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ 2024
  • Атрощенко Михаил Михайлович
  • Романова Алина Игоревна
  • Фролова Наталья Александровна
  • Широкова Ольга Владимировна
RU2823683C1
СПОСОБ РАЗБАВЛЕНИЯ СПЕРМЫ ЖЕРЕБЦОВ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ В ОХЛАЖДЕННОМ И ЗАМОРОЖЕННОМ СОСТОЯНИИ С УЧЕТОМ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ЭЯКУЛЯТА 2023
  • Науменкова Валентина Алексеевна
  • Атрощенко Михаил Михайлович
RU2824208C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА СПЕРМЫ ЖЕРЕБЦОВ ПО АКТИВНОСТИ КРЕАТИНФОСФОКИНАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ 2021
  • Атрощенко Михаил Михайлович
  • Романова Алина Игоревна
  • Зайцев Александр Михайлович
  • Калашников Валерий Васильевич
  • Енгалычева Мария Германовна
  • Шитикова Анна Михайловна
  • Широкова Ольга Владимировна
  • Фролова Наталья Александровна
RU2770741C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА СПЕРМЫ ЖЕРЕБЦОВ ПО КОНЦЕНТРАЦИИ ТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ 2023
  • Атрощенко Михаил Михайлович
  • Романова Алина Игоревна
  • Фролова Наталья Александровна
  • Широкова Ольга Владимировна
RU2815908C1

Реферат патента 2018 года СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКИ КРИОУСТОЙЧИВОСТИ СПЕРМЫ ЖЕРЕБЦОВ

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способу экспресс-оценки криоустойчивости спермы жеребцов. Способ включает подготовку дозы спермы к замораживанию - оттаиванию и оценку подвижности спермиев. Для оценки используют мини-дозу спермы - 0,5 мл, которую замораживают в жидком азоте в течение 5 минут. Использование изобретения позволит сократить время общего анализа и обработки результатов. 1 табл.

Формула изобретения RU 2 675 947 C1

Способ экспресс-оценки криоустойчивости спермы жеребцов, включающий подготовку дозы спермы к замораживанию - оттаиванию и оценку подвижности спермиев, отличающийся тем, что для оценки используют мини-дозу спермы - 0,5 мл, которую замораживают в жидком азоте в течение 5 минут.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2018 года RU2675947C1

Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению с.-х
животных
М.: Колос, 1981, с
Разборное приспособление для накатки на рельсы сошедших с них колес подвижного состава 1920
  • Манаров М.М.
SU65A1
Способ определения оплодотворяющей способности спермы жеребца 1980
  • Лебедев Станислав Юрьевич
SU959775A1
Способ оценки качества спермы быков 1991
  • Ерохин Анатолий Сергеевич
  • Деряженцев Виктор Иванович
  • Кучкина Капитолина Дмитриевна
  • Мурза Леонид Иванович
  • Сергеев Андрей Иванович
  • Турбин Вадим Феодосиевич
SU1813424A1

RU 2 675 947 C1

Авторы

Науменкова Валентина Алексеевна

Даты

2018-12-25Публикация

2017-08-01Подача